Krooninen sairaus

tiivistelmä

Munasarjasyöpä on yleisin kuolinsyy peräisin gynekologiset maligniteetti. Vapauttaminen p53 ja /tai p73-liittyvä apoptoottisia reittejä edistää platinapohjaiseen vastustusta munasarjasyöpä. NOXA, pro-apoptoottisten BH3 vain proteiinia, tunnistetaan transkription kohteena p53 ja /tai p73. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että geneettistä vaihtelua on Bcl-2-proteiinien ole yksimielisiä sisplatiini-herkkä ja kestävä munasarjasyöpäsoluja, ja vastaukset NOXA ja Bax sisplatiiniin säännellään pääasiassa p53. Arvioimme lisäksi vaikutus NOXA sisplatiinilla. NOXA aiheuttaman apoptoosin ja herkistyneet A2780s ja SKOV3- solujen sisplatiiniin

in vitro

ja

in vivo

. Vaikutuksia välittämä kohonnut Bax ilme, parannettu kaspaasin aktivaatio, vapautumista Cyt C ja Smac sytosoliin. Lisäksi geenien Bax tai Smac merkittävästi heikennetty NOXA ja /tai sisplatiinin aiheuttama apoptoosin chemosensitive A2780s soluissa, kun taas yli-ilmentyminen Bax tai lisäämällä Smac-N7 peptidi lisäsi merkittävästi NOXA ja /tai sisplatiinin aiheuttama apoptoosin solunsalpaajaresistentti SKOV3- soluissa. Tietääksemme, nämä tiedot viittaavat siihen, että uusi mekanismi, jolla NOXA chemosensitized munasarjasyöpäsoluja sisplatiinin indusoimalla muutoksia Bax /smac akselilla. Yhdessä meidän havainnot osoittavat, että NOXA on potentiaalisesti käyttökelpoinen chemosensitizer munasarjasyövän hoidossa.

Citation: Lin C, Zhao X-y, Li L, Liu H-y, Cao K, Wan Y, et ai. (2012) NOXA-indusoidut muutokset Bax /Smac Axis paranna herkkyys munasarjasyöpäsoluja sisplatiinia. PLoS ONE 7 (5): e36722. doi: 10,1371 /journal.pone.0036722

Editor: Subhash Gautam, Henry Ford Health System, Yhdysvallat

vastaanotettu: 28 maaliskuu 2012; Hyväksytty: 10 huhtikuu 2012; Julkaistu: 09 toukokuu 2012

Copyright: © 2012 Lin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Key Basic Research Program of China (2010CB529900) ja Natural Science Foundation of China (30900744; 81071817 /H1609, 81001010). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Munasarjasyöpä on yleisin kuolinsyy peräisin gynecologic maligniteetti [1]. Vaikka on olemassa joitakin parannuksia, pitkän aikavälin selviytyminen on edelleen heikko johtuen annoksesta riippuvaista toksisuutta, lopulta kasvaimen uusiutumisen ja syntyminen lääkeaineresistenttien tauti. Voittaa nämä esteet, tutkimukset on keskittynyt yhä enemmän uusia hoitostrategioita: modulaatio solun kemosensitiivisyys, käännetään kasvain vastus, ja lisäämällä terapeuttisia vaikutuksia kemoterapiaa [2]. Kehittyvät todisteita viittaa siihen, että sääntelemätön apoptoosireitin on merkittävä tekijä kasvaimen aloittamista, etenemistä ja kehittymistä kehittynyt resistenssi syöpähoitoihin [3], [4].

Koska yhteinen geneettinen tapahtuma munasarjasyövän p53-mutaatio liittyy vastustuskykyä platinapohjaiseen kemoterapiaan [5]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että p73, jäsen p53 proteiinit, on keskeinen säätelijä apoptoosin herkkyys sisplatiini (Cis) A2780 munasarjasyöpäsoluja [6], [7], ja että p73-riippuvaisen transkription ohjelma on tärkeä tekijä että kemosensitiivisyys väylän BRCA1-puutosta munasarjakarsinoomasolut [8], mikä osoittaa jotkut mekanismit vaikuttavat p73 ilmaisuja ja toiminnot voivat myötävaikuttaa vastustuskyvyn sisplatiinin aiheuttaman apoptoosin munasarjasyöpäsoluja [7]. Kaikki nämä havainnot viittaavat siihen, että vapauttaminen p53-riippuvaisten ja /tai p73-liittyvä apoptoottisia reittejä voi myötävaikuttaa platinapohjaiseen vastustusta munasarjasyöpä. Siten palauttaminen p53 ja /tai p73-reitin aktivoimalla itse tai heidän loppupään tavoitteet voivat olla houkutteleva avenue vaikutuksen tehokkuuden syöpähoitoihin.

NOXA ensin tunnistettu transkription kohteena p53 [9], ja viime aikoina se oli myös osoittanut säädellä transkriptionaalisesti mukaan p73 [8]. Kuten monet Bcl-2-perheen proteiineja, jotka siirtävät ja mitokondrioita ja moduloivat mitokondrioiden toimintaa, NOXA translokoituu mitokondrioita ja johtaa sitten sytokromi C (Cyt C) vapautumisen ja kaspaasi-9 aktivointi, ja lopulta johtaa solun kuolemaan [10], [ ,,,0],11]. NOXA toimintojen kautta Bax ja /tai Bak apoptoosin indusoimiseksi joissakin syöpäsoluissa, kuten Hela-ihmisen epiteelin kohdunkaulan syövän soluihin [9], melanoomasoluja [11], ihmisen MCF-7 rintasyöpäsolujen [12], jne. Lisäksi, äskettäin raportti osoitti terapeuttista potentiaalia NOXA hoidettaessa ihmisen rintasyövän [12]. Kuitenkin rooli NOXA terapeuttisessa vasteita munasarjasyöpäsoluja platinapohjaisen syöpälääkkeiden jää epäselväksi.

Tässä työssä olemme ensimmäinen valittu sisplatiini-herkän (A2780s, IGROV1 ja OAW42) ja kestävä ( A2780cp, OVCAR-3 ja SKOV3) ihmisen munasarjasyövän solulinjoissa testata ekspression vaihtelut prosurvival ja proapoptoottiset Bcl-2-perheen proteiineihin. Sitten tutkimme sisplatiinin aiheuttama ekspressiotasot p53, p73, p21

waf1 /CIP1, NOXA ja Bax useissa ihmisen munasarjasyövän solulinjoissa erilaisilla, p53: mukaan lukien A2780s (p53 villityypin p53 WT), SKOV3 ( p53 kaksinkertainen deleetiomutantti, p53 – /-), OVCAR-3 (kätkeminen mutantti p53 R248Q) ja A2780cp (jotka sisältävät p53 villityypin geenin sekvenssin kanssa, mutta esittää menetys p53-toiminto) [13], [14]. Olemme havainneet, että p53, p73, p21

waf1 /CIP1, NOXA ja Bax merkittävästi indusoi sisplatiinin p53-villityypin A2780s solulinja, mutta muut kolme p53-mutantin munasarjasyövän solulinjoissa, ilmaukset p73, p21

waf1 /CIP1, NOXA ja Bax pysyi ennallaan. Lisäksi vastaukset NOXA ja Bax sisplatiiniin säännellään pääasiassa p53 muiden kuin p73 munasarjasyövän solulinjoissa. Kun otetaan huomioon suuret sääntelyyn p53 NOXA ja Bax, kaksi p53 ja /tai p73 alavirran kohdegeenien, me edelleen valittu p53 kaksoishäviämämutantti SKOV3 solulinja mallina luontainen resistenssi [15] – [17], ja p53 -wild tyyppi A2780s solulinjaa, joka oli peräisin käsittelemättömän potilaan primaarista munasarjasyöpäpotilailla [17], [18], mallina luontaisia ​​kemosensitiivisyys, arvioida vaikutus NOXA annetun kemoterapeuttisen sisplatiinin tehoa in A2780s ja SKOV3 munasarjojen syöpä mallit

in vitro

ja

in vivo

. Huomasimme, että NOXA indusoi apoptoosin riippumatta p53 sekä A2780s ja SKOV3- soluja, ja että kohonnut ilmentyminen NOXA voi parantaa herkkyyttä munasarjasyöpäsoluja sisplatiiniin läpi muutoksia Bax /Smac akselilla. Tietääksemme tarjoamme uusia todisteita potentiaalinen sovellus NOXA kuin chemosensitizer munasarjasyövän hoidossa.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kaikki tutkimuksia hiiriä hyväksymä Institutional Animal Care ja hoito komitea valtion Key Laboratory of Biotherapy, Sichuanin yliopistossa.

Materiaalit

Smac-N7 peptidi (AVPIAQKPRQIKIWFQNRRMKWKK) hankittiin Calbiochem, Inc. (San Diego , CA). Se muutettiin olevan solun läpäisevä kytkemällä COOH-terminaalin lysiinin että arginiini sellaisen Antennapedian homeodomain 16-meerinen peptidi kautta proliini linkkerin. Ensisijainen vasta-aineiden Western blot ovat seuraavat: Anti-Bcl-2 (sc-130307), anti-Bcl-x

L (sc-8392), anti-Mcl-1 (sc-69839), anti-NOXA (sc-30209), anti-p53 (DO-1), anti-p73 (H-79), anti-p21

Waf1 /CIP1 ja anti-β-aktiini (Santa Cruz, CA); anti-Bax N-20 (sc-493); anti-kaspaasi-3, anti-lohkaista kaspaasi-3, anti-kaspaasi-9 ja sen katkaistun muodon (Cell Signaling Technology, Danvers, MA); anti-Smac (klooni FKE02, R anti-Cyt C (sc-13156), sytokromi-oksidaasi-alayksikön IV (Molecular Probes).

Plasmidit

Sekä pcDNA3.1 (pc3.1) ja pcDNA3.1-plasmidi, joka koodaa Human NOXA geeniä (pcDNA3.1-hNOXA, pc3.1-hNoxa) puhdistettiin kaksi kierrosta passage yli EndoFree sarakkeet (Qiagen, Chatsworth, CA), kuten on raportoitu aiemmin [19]. pc3.1-Bax konstruktit tuotetaan mukaan edellisessä menetelmiin [20].

geenien pieniä häiritseviä RNA: ita

Sirna (siRNA) oligonukleotidit ostettiin Dharmacon (Lafayette, CO ), joiden sekvenssit on kohdistettu Bax (5′-AACUGAUCAGA ACCAUCAUGG-3 ’) ja smac (5′-AACCCUGUGUGCGGUUCCUAU-3’). Sillä Bax ja Smac shRNA rakentaminen, Bax ja Smac siRNA kloonattiin pSilencer 2.1-U6 hygro plasmidi.

Soluviljely ja transfektio

A2780s, IGROV1, OAW42, A2780cp, OVCAR-3 ja SKOV3 ihmisen munasarjasyövän solulinjoissa ostettiin ATCC: ltä (Manassas, VA) ja niitä kasvatettiin DMEM: ssä tai RPMI 1640, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS), vastaavasti, 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2. Transfektio suoritettiin Lipofectamine ™ 2000 mukaan valmistajan ohjeiden.

Hoidot solujen

in vitro

kokeita

A2780s ja SKOV3- soluja käsiteltiin seuraavasti: ohjaus, solut jätettiin käsittelemättä, ja kerätään, kun viljeltiin 72 tuntia. pc3.1 (tyhjä vektori), solut transfektoitiin pc3.1, ja sitten kerättiin 48 h transfektion jälkeen. hNOXA, transfektoidut solut pc3.1-hNOXA kerättiin 48 h transfektion jälkeen. Sisplatiini, sisplatiini (5 ug /ml) lisättiin, kun soluja viljeltiin 48 tunnin ajan. 24 tuntia myöhemmin, solut kerättiin. hNOXA plus sisplatiini, transfektoidut solut pc3.1-hNOXA lisättiin sisplatiinia (5 ug /ml) 24 h transfektion jälkeen. Kaksikymmentäneljä tuntia myöhemmin, solut kerättiin.

geenien tai yliekspressio Bax ja Smac, vastaava siRNA: t tai plasmidit transfektoitiin yhdessä pc3.1 /pc3.1-NOXA plasmidit A2780s tai SKOV3 solut. Soluja käsitellään edellä lisättiin sisplatiinia vielä 12 tuntia 12 tuntia transfektion jälkeen, ja sen jälkeen talteen 24 h transfektion jälkeen.

Detection of hNOXA ilmaisun

in vitro

ja

in vivo

havaitsemiseksi hNOXA ilmaisun

in vitro

, A2780s solut käsiteltiin mukainen aikataulujen edellä on kuvattu. Kerätyt solut käytettiin havaitsemaan hNOXA ilmentymisen RT-PCR: llä ja western blot, vastaavasti. Kasvainkudoksessa kerättiin havaitsemiseksi hNOXA ilmaisun

in vivo

RT-PCR: llä. Käytetyt alukkeet monistamiseksi hNOXA ja GAPDH olivat seuraavat: NOXA-F 5′-AAGAACGCTCAACCGAGC-3’and NOXA-R 5′-GGTTCCTGAGCAGAAGAGT-3 ’; GAPDH-F 5’-AATCCCATCACCATCTTCC-3 ’ja GAPDH-R 5′-CAT CACGCCACAGTTTCC-3’.

Solujen elinkelpoisuus ja apoptoosin määrityksiä

Solujen elinkelpoisuus arvioitiin MTT-määrityksellä [21] . Apoptoosi arvioitiin seuraavasti: havaitseminen DNA: n fragmentoituminen kanssa Cell Death Detection ELISA-kittiä (Roche Diagnostics), western blot-analyysi kaspaasin aktivaation mittaaminen apoptoottisten solujen virtaussytometrialla (PI-värjäys osa-G1) ja Hoechst 33258-värjäyksellä. The Cell Death Detection ELISA määrällisesti apoptoottisten solujen ilmaisemalla histoni liittyvä DNA-fragmentteja (mono- ja oligo-nukleosomeissa) tuottama apoptoottisten solujen [20], [22].

virtaussytometrianalyysin ja Hoechst 33258 värjäämällä

virtaussytometrinen analyysi suoritettiin tunnistaa sub-G1 solua /apoptoottisia soluja ja mitata prosenttiosuus sub-G1-solut hypotoniseen puskuriin kuten aiemmin on kuvattu [23]. Hoechst 33258 värjäys suoritettiin accordingto valmistajan ohjeita.

semikvantitatiivinen RT-PCR

Kokonais-RNA eristettiin käyttämällä Trizol-reagenssia (Invitrogen). Semikvantitatiivinen RT-PCR tehtiin monistamiseen NOXA ja GAPDH.

Subsellulaariset ja western blot

Subsellulaariset tehtiin saamiseksi mitokondrioiden ja solulimafraktiot kuten aikaisemmin on kuvattu [24]. Kokosoluliuotteista valmistettiin kuten aiemmin on kuvattu [25]. Kokosoluliuotteista ja alafraktiointi lysaatit käytettiin western blot -analyysiin.

eläinten kasvainmalleissa ja hoito

A2780s ja SKOV3-soluja (2 x 10

6 solua) istutettiin s.c. oikeaan kyljet 6- 8-viikkoisen naaras-nude-hiiriin, vastaavasti. Tutkia terapeuttinen teho NOXA plus sisplatiini, käsittelimme hiirissä päivänä 10 implantoinnin jälkeen kasvainsolujen, kun kasvaimen halkaisija saavutti -5 mm halkaisijaltaan. Hiiret jaettiin satunnaisesti 5 ryhmään (5 hiirtä per ryhmä) ja käsiteltiin: (a) 0,100 ui PBS: ää; (B) 0,10 ug pc3.1 plasmidia /30 mikrog liposomikomplekseja 100 ul PBS; (C) 0,10 ug pc3.1 -hNoxa plasmidia /30 ug liposomikomplekseja 100 ui PBS: ää; (D) 0,100 ui 0,1 mg sisplatiinia (5 mg /kg ruumiinpainoa); (E) 0,10 ug pc3.1-hNoxa plasmidi /30 ug liposomikomplekseja 100 ul: ssa PBS: ää ja 100 ui 0,1 mg sisplatiinia. Hiiriä käsiteltiin DNA-liposomi- kompleksin laskimoon

kautta

häntälaskimoon kahdesti viikossa, ja sisplatiini intraperitoneaalisesti reittiä kerran viikossa 4 viikon ajan. Kasvaintilavuudet lasketaan seuraavalla kaavalla: kasvaimen tilavuus (mm

3) = 0,52 x pituus (mm) x leveys (mm) x leveys (mm) [26]. Kasvain kudokset kerättiin TUNEL kokeita.

Terminal deoksinukleotidyyli–välittämällä dUTP nick end merkinnät (TUNEL) analyysi

TUNEL suoritettiin In situ Cell Death Detection Kit (Roche). Solujen apoptoosin kvantitoitiin määrittämällä prosenttiosuus positiivisesti värjäytyneiden solujen kaikkien ydinten 20 satunnaisesti valittua kenttää /osiossa 200 x suurennus. Kalvot apoptoosin tutkimuksia määrällisesti sokea tavalla kaksi itsenäistä arvioijat kahdesta eri aikoina.

Tilastolliset analyysit

Tilastollinen analyysi suoritettiin SPSS-ohjelmiston (versio 17.0 for Windows). Kaikki arvot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SD. ANOVA ja Tukey-Kramer monivertailukoetta käytettiin vertailuissa. Survival konstruoitiin mukaisesti Kaplan-Meier-menetelmää. Tilastollinen merkittävyys määritettiin log-rank-testi.

p

arvo 0,05 pidettiin merkittävinä. Virhepalkit edustavat SEM, ellei toisin ole ilmoitettu.

Tulokset

Geneettiset variantit joukossa sisplatiini-herkkä ja kestävä munasarjasyöpäsoluja

Western blotting -analyysi osoitti, että sisplatiini-herkkiä ( A2780s, IGROV1 ja OAW42) solulinjat ilmentävät suhteellisen alhainen endogeenisten tasojen Bcl-2, Bcl-x

L ja Mcl-1, kun taas sisplatiini-resistenttejä (A2780cp, OVCAR-3 ja SKOV3) solulinjat olivat päinvastoin. Toisin kuin prosurvival Bcl-2-perheen proteiinien tasot proapoptoottiset Bak ja Bax in A2780s, IGROV1 ja OAW42 solulinjoja ovat korkeammat kuin A2780cp, OVCAR-3 ja SKOV3-solulinjoja (kuvio 1A).

(A) Western blottaus suoritettiin ilmaisua vaihtelut prosurvival Bcl-2, Bcl-x

L ja Mcl-1 ja proapoptoottiset Bak ja Bax proteiinien joukossa sisplatiini-herkän (A2780s, IGROV1 ja OAW42) ja kestävä ( A2780cp, OVCAR-3 ja SKOV3) munasarjasyöpä soluja. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. (B) A2780s (p53 WT), ja SKOV3 (p53 – /-) soluja käsiteltiin sisplatiinin (5 ug /ml) 24 tunnin ajan ja analysoitiin p53, p73, p21

waf1 /CIP1, NOXA ja Bax Western blottauksella. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. (C) OVCAR3 (kätkeminen mutantti p53 R248Q) ja A2780cp (jotka sisältävät p53 villityypin geenin sekvenssin kanssa, mutta esittää menetys p53-toiminto) soluja käsiteltiin sisplatiinin (5 ug /ml) 24 tunnin ajan ja analysoitiin p53, p73 , p21

waf1 /CIP1, NOXA ja Bax Western-blottauksella. β-aktiini käytettiin latauskontrollina.

tutkitaan edelleen sisplatiinin aiheuttama ekspressiotasot p53, p73, p21

waf1 /CIP1, NOXA ja Bax useissa ihmisen munasarjasyövän solulinjoissa eri p53 status, mukaan lukien A2780s (p53 WT), SKOV3 (p53 – /-), OVCAR-3 (kätkeminen mutantti p53 R248Q) ja A2780cp (jotka sisältävät p53 villityypin geenin sekvenssin kanssa, mutta esittää menetys p53-toiminto). Kaikilla mainituilla soluja käsiteltiin 5 ug /ml sisplatiinia 24 tunnin ajan. Kuten kuviossa 1B ja C, p53, p73, p21

waf1 /CIP1, NOXA ja Bax todettiin merkittävästi indusoida sisplatiinin p53-villityypin A2780s solulinjassa, mutta muut kolme p53-mutantti sisplatiini vastustuskykyisten OVCAR-3, A2780cp ja SKOV3 solulinjat, ilmaukset p73, p21

waf1 /CIP1, NOXA ja Bax pysyi ennallaan. Lisäksi endogeenisen Bax sisplatiini- kestävä OVCAR-3, A2780cp ja SKOV3 solulinjoissa on hyvin alhainen (kuva 1 B ja C). Nämä tulokset osoittavat, että vastaukset NOXA ja Bax sisplatiiniin säännellään pääasiassa p53 muiden kuin p73 munasarjasyövän solulinjoissa.

Alennettu elinkelpoisuuden munasarjasyöpäsoluja

in vitro

mukaan hNOXA ja sisplatiinin

pro-apoptoottisen funktion NOXA ja puute NOXA induktion luontaisesti sisplatiinille resistenttejä SKOV3 (p53 – /-) munasarjojen solut sai meidät tutkimaan, onko yliekspressio NOXA estää munasarjojen syöpäsolujen kasvua. Yliekspressio hNOXA transfektoiduissa A2780s soluissa varmistettiin RT-PCR: llä (kuvio 2A) ja western blotting-analyysi (kuvio 2B), vastaavasti. Ottaen huomioon, että NOXA toimii alavirtaan p53-välitteisen apoptoottisen reitin, ja että sytotoksista vaikutusta sisplatiinin välittävät DNA-vaurioita, mikä puolestaan, transaktivoi kohdegeenien (egp53AIP, PUMA, NOXA) aiheuttaa apoptoosia, me ennustaa, että kohonnut NOXA ilmentyminen voi herkistää munasarjasyöpäsoluja sisplatiinia. Tämän hypoteesin testaamiseksi, ensin käsitelty A2780s soluja sisplatiinin ilmoitettuina pitoisuuksina, joiden 24- tai 48-tunnin välein, ja totesi, että annos IC

50 Sisplatiinin vaihtelivat 5 ug /ml 10 ug /ml (kuvio 2C). Sitten, käsittelimme solut sisplatiinia optimaalisella annoksella (5 ug /ml), jossa on 24/48-tunnin välein, mukaan eri aikataulut, kuten on kuvattu Aineet ja menetelmät. Käsittelyn jälkeen Solujen elinkelpoisuus määritettiin MTT-määrityksellä. Kuten kuviossa 2D, kontrolliin verrattuna, joko hNOXA tai sisplatiinia vähensi A2780s solujen elinkelpoisuuden 41% /47% (P 0,001) ja 43% /49% (P 0,001), vastaavasti. hNOXA plus sisplatiini erittäin merkittävästi vähentää A2780s solujen elinkelpoisuutta 68% /76% (P 0,001). P53-puutteellisia SKOV3- soluissa, verrattuna pc3.1 ohjaus, hNOXA vähensi myös merkittävästi solujen elinkykyä (P 0,001), kun taas sisplatiinin osoitti vain hieman, mutta ei tilastollisesti merkittävä vaikutus SKOV3 solujen kasvuun (24 h, p = 0,874; 48 h, p = 0,921). Kuitenkin yhdistelmä hNOXA ja sisplatiinin erittäin merkittävästi vähentynyt SKOV3 solujen elinkelpoisuutta 65% /68% (P 0,001) (kuvio 2E).

(A) RT-PCR-analyysi hNOXA ilmaisun

vuonna vitro

transfektion jälkeen A2780s soluja. GAPDH: ta käytettiin latauskontrollina. (B) Western blotting-analyysi hNOXA ilmaisun

in vitro

transfektion jälkeen A2780s soluja. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. (C) käsittely sisplatiinin ilmoitettuina pitoisuuksina ja aikoja vähentää A2780s solujen elinkykyä, joka osoittaa, että annos IC

50 vaihteli välillä 5 ug /ml 10 ug /ml. (D) hoito hNOXA plus sisplatiinin pienentää A2780s solujen elinkelpoisuus merkittävämmin kuin hoidossa hNOXA yksin tai sisplatiinia yksinään teki. Merkittäviä eroja verrattuna verrokkiryhmään (24 h, ** P 0,001; 48 h,

## P 0,001). (E) hoito sisplatiinilla yksinään oli vain vähän vaikutusta eloonjäämiseen SKOV3- soluja, ja yhdistelmä hNOXA plus sisplatiinin pienentää SKOV3 solujen elinkelpoisuus merkittävämmin kuin hoidossa hNOXA yksin tai sisplatiinia yksinään teki. Merkittäviä eroja verrattuna verrokkiryhmään (24 h, ** P 0,001; 48 h,

## P 0,001). Prosenttiosuus selviytymisen laskettiin. Tulokset on esitetty keskiarvoina ± SD kolmesta kuoppiin ja rinnakkaisessa kokeessa. Kussakin kokeessa keskipitkän ainoa hoito (käsittelemätön) osoittaa 100% solujen elävyyttä.

Apoptoosin munasarjasyövän solujen

in vitro

mukaan hNOXA ja sisplatiinin

kvantitatiivinen arviointi sub-G1 solujen virtaussytometrialla käytettiin lukumäärän arvioimiseksi apoptoottisten solujen. Kuten kuviossa 3A, sisplatiini- herkkien A2780s solut, apoptoottiset solut oli 34,6% vuonna hNOXA saaneessa ryhmässä vs. 15,6% vuonna pcDNA3.1-hoidetussa ryhmässä ja 8,7% verrokkiryhmässä. Apoptoottisten solujen osuus oli 63,6% vuonna yhdistelmäryhmä vs. 48,3% vuonna sisplatiinia saaneessa ryhmässä. Nämä tulokset viittaavat siihen, että sisplatiinia tai hNOXA yksin merkittävästi indusoi apoptoosia A2780s soluja, ja hNOXA ja sisplatiinin lisättiin vielä apoptoosin. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin luontaisesti resistenttejä SKOV3- soluja, paitsi että sisplatiinilla yksinään havaittiin vain vähän kyky indusoida apoptoosia SKOV3- soluja (kuvio 3B).

(A) edustaja DNA fluoresenssin histogrammeja PI-värjättyjen solujen. A2780s soluja käsiteltiin hNOXA 24 tunnin ajan, sitten 5 ug /ml sisplatiinia vielä 24 tuntia. A2780s soluja käsiteltiin pcDNA3.1 tai hNOXA, sisplatiini yksin tai hNOXA plus sisplatiinin ja ryhmien Ctrl, pc3.1, hNOXA, cis- ja hNOXA + Cis vastaavat näitä viittä hoidot (samat kuin on esitetty seuraavassa paneelit), 8,7 % (Ctrl), 15,6% (pc3.1), 34,6% (hNOXA), 48,3% (cis) ja 63,6% (hNOXA + cis) sub-G1 solut (apoptoottisia soluja), vastaavasti, joka arvioidaan virtaussytometrialla. (B) SKOV3- soluja käsiteltiin hNOXA 24 tunnin ajan, sitten 5 ug /ml sisplatiinia vielä 24 tuntia. SKOV3- solut olivat käsittelemättömiä, käsiteltiin tyhjän vektorin tai hNOXA, sisplatiinia yksinään tai hNOXA plus sisplatiini, 4,9% (Ctrl), 6,4% (pc3.1), 38,4% (hNOXA), 9,1% (cis) ja 52,3% (hNOXA + cis) sub-G1 solut (apoptoottisia soluja), vastaavasti, joka arvioidaan virtaussytometrialla. (C) Normaali ja apoptoottinen ydin- morfologia A2780s solujen analysoitiin Hoechst 33258 värjäystä. A2780s soluja käsiteltiin samoissa olosuhteissa kuin edellä on kuvattu. (D) Normaali ja apoptoottinen ydin- morfologia SKOV3- solujen analysoitiin Hoechst 33258 värjäystä. SKOV3- soluja käsiteltiin samoissa olosuhteissa kuin edellä on mainittu.

Apoptoosi arvioitiin edelleen Hoechst 33258 värjäystä. Samanlainen kuin edellä tuloksia, sekä A2780s ja SKOV3-soluja, lukumäärä kondensoidaan ytimet (ehjä tai hajanaiset), jotka ovat tunnusomaisia ​​apoptoosin, yhdistelmässä ryhmässä havaittiin kuin että hNOXA- tai sisplatiini-käsitellyt solut. Ei ollut merkittävästi kondensoidaan ytimien väliaineessa vain- ja pc3.1 hoidetuissa ryhmissä. On kuitenkin syytä huomata, että sisplatiini-käsiteltyjen SKOV3- solut osoittivat vastaavaa ei apoptoottisten merkkejä (kuvio 3C ja D).

herkistävän vaikutukset NOXA välittyvät vapautumisen Cyt C ja smac sytosoliin

NOXA indusoi apoptoosin aktivoitumisen kautta Bax ja /tai Bak laukaisemaan mitokondriohäiriöitä ja kaspaasi-9 aktivointi [10], [11], [27]. Kuten odotettua, sisplatiini- herkkien A2780s soluja, joko hNOXA tai sisplatiinia yksinään aiheutti merkittäviä lisäävä säätely Bax ja kaspaasien aktivaatio 3 ja 9, ja niiden yhdistelmä entisestään ylös-säätely Bax ja aktivointi caspases (kuva 4A ). Lisäksi apoptoosi liittyy vapautumista Cyt C ja smac sytosoliin (kuvio 4B). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin myös luontaisesti resistenttejä SKOV3- soluja, paitsi että sisplatiinia yksinään ei havaittu aiheuttavan ylös-säätely Bax ja aktivointi caspases ja vapauttamaan Cyt C ja Smac (kuvio 4A ja B).

(A) A2780s ja SKOV3-solut altistettiin asianomaiset hoidot, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Kaspaasin aktivaatio analysoitiin Western-blottauksella. Nuolet osoittavat aktiivisia muotoja kaspaasien. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. (B) A2780s ja SKOV3-solut altistettiin asianomaiset hoidot, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Vapautumista Cyt C ja smac sytosoliin analysoitiin Western-blottauksella. Cox-IV blotit osoittavat mitokondrioiden lastaus valvonta taas β-aktiini käytettiin latauskontrollina varten sytosolifraktion.

Muutokset Bax /Smac akseli määrittää herkkyyttä munasarjasyöpäsoluja sisplatiiniin

Havaitsimme, että säätely ylöspäin Bax ja vapautumisen Smac sytosoliin in NOXA saaneilla A2780s ja SKOV3- soluja (kuvio 4), ja että sisplatiini myös johtanut Bax ylössäätöä ja Smac vapautumista A2780s soluissa (kuvio 4 ), mutta SKOV3- soluissa, se ei aiheuttanut säätely ylöspäin Bax (kuva 1 ja 4) ja vapautumista Smac sytosoliin (kuva 4). Nämä havainnot sai meidät spekuloida, että Bax /smac akseli voi olla yksi keskeinen tekijöitä kemosensi- sisplatiinin kestävä munasarjasyöpäsoluja, ja että NOXA-indusoidut muutokset Bax /smac Axis voi parantaa herkkyyttä munasarjasyöpäsoluja sisplatiinia. Testaa spekulointia, päätimme tutkia NOXA ja /tai sisplatiinin aiheuttama apoptoosi heikennettyjä sisplatiinin herkkien A2780s soluja käsiteltiin siRNA kohdistamista Bax tai Smac, ja onko NOXA ja /tai sisplatiinin indusoiman apoptoosin parannettiin sisplatiinipohjaisen resistenttejä SKOV3- soluja esikäsiteltiin Bax rakentaa tai Smac N7 peptidi, vastaavasti.

Kuten odotettua, Bax siRNA vaimensi merkittävästi NOXA ja /tai sisplatiinin aiheuttama apoptoosin A2780s soluissa (kuvio 5A). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin myös A2780s soluissa hoidon jälkeen siRNA kohdistaminen smac (kuvio 5B). Spesifisyys Bax ja smac siRNA dupleksit arvioitiin analysoimalla Bax ja smac proteiinin ilmentymisen A2780s transfektoitujen solujen vastaavaa shRNA rakentaminen (kuvio 5C). In pc3.1-Bax-transfektoitujen SKOV3- soluja, yliekspressio Bax, joka vahvistettiin western blotting -analyysi (kuvio 5D), lisäsi merkittävästi NOXA ja /tai sisplatiinin indusoiman apoptoosin (kuvio 5E). Vastaavasti lisäämällä NH2-pään Smac heptapeptidiksi (Smac-N7) myös huomattavasti parannettu NOXA ja /tai sisplatiinin indusoiman apoptoosin (kuvio 5F).

(A) siRNA kohdistaminen Bax merkittävästi heikennetty NOXA ja /tai sisplatiinin indusoimaan apoptoosin chemosensitive A2780s soluissa (* P 0,01; ** P 0,001). (B) siRNA kohdistaminen Smac merkittävästi heikennetty NOXA ja /tai sisplatiinin aiheuttama apoptoosin chemosensitive A2780s soluissa (

# P 0,05; * P 0,01; ** P 0,001). (C) Down-regulation Bax tai Smac Bax siRNA tai Smac siRNA varmistettiin Western blot. (D) yli-ilmentyminen Bax varmistettiin Western blot. (E) SKOV3- solut kotransfektoitiin NOXA ja pc3.1-Bax plasmidit 12 tuntia, minkä jälkeen 5 ug /ml sisplatiinia hoitoa vielä 12 tuntia. Yliekspressio Bax huomattavasti NOXA ja /tai sisplatiinin aiheuttama apoptoosin solunsalpaajaresistentti SKOV3- soluissa (* P 0,01). (F) SKOV3- soluja käsiteltiin NOXA ja /tai sisplatiinin, kuten edellä on kuvattu, sitten 20 umol /L smac-N7-peptidin vielä 3 tuntia. SMAC-N7 peptidi lisäsi merkittävästi NOXA ja /tai sisplatiinin aiheuttama apoptoosin solunsalpaajaresistentti SKOV3- soluissa (

# P 0,05; * P 0,01).

Tehostettu tuumorin vastaista tehokkuutta yhdistelmän hNOXA ja sisplatiinin in vivo

Perustuu

in vitro

kasvua estävää ja pro-apoptoottinen vaikutus hNOXA ja sisplatiinin, me vielä tarkasteltava antineoplastisen vaikutuksen hNOXA plus sisplatiinin päälle A2780s ja SKOV3 kasvaimia

in vivo

. Kuten kuviossa 6A ja B, päivänä 34 implantoinnin jälkeen A2780s ja SKOV3 kasvaimia käsiteltyjen hiirien PBS saavuttanut 1174,28 ± 70,43 ja 823,82 ± 73,27 mm

3 tilavuudessa, vastaavasti. A2780s ja SKOV3 kasvaimia käsiteltiin hNOXA olivat merkitsevästi (A2780s malli,

P

0,001; SKOV3 malli,

P

0,001) pienempi kuin niillä, joita hoidettiin PBS: llä, oli vain 686,06 ± 81,39 ja 429,38 ± 22,9 mm

3 tilavuudessa, vastaavasti. Yhdistelmä hNOXA ja sisplatiinin tukahduttamaan kasvaimen kasvua siten, että A2780s ja SKOV3 kasvaimet saavuttivat 342,84 ± 38,8 ja 279,27 ± 47,16 mm

3 tilavuudessa, vastaavasti, mikä oli merkitsevästi (A2780s malli,

P

SKOV3 malli,

P

0,001) pienempi kuin ohjaus kasvaimia, ja huomattavasti pienempi kuin kasvaimia käsiteltiin hNOXA (A2780s malli,

P

0,001; SKOV3 malli, p 0,05; SKOV3 malli,

P

0,001). Sisplatiini myös johti merkittävään vähenemiseen kasvaimen tilavuuden (577,08 ± 77,04 mm

3) kuin verrokkiryhmän kasvaimet (

P

0,001) A2780s mallissa. Kuitenkin SKOV3 mallissa, ei merkittävää eroa kasvaimen tilavuus (605,44 ± 80,51 mm

3) havaittiin sisplatiinin hoidetussa ryhmässä verrattuna pc3.1 käsitellyn ryhmän (695,57 ± 79,28 mm

3) (

P

= 0,222).

tuumorisuppressiogeeneksi ja selviytymisen etu hiirillä. A2780s soluja (A, C) tai SKOV3- soluja (B, D) on 2 × 10

6 istutettiin ihonalaisesti naispuolinen nude-hiiriin 6-8 viikon iässä. -Hiiret (viisi per ryhmä) käsiteltiin PBS: llä, pcDNA3.1, pcDNA3.1-hNOXA, sisplatiini ja pcDNA3.1-hNOXA + sisplatiini. Vuonna A2780s kasvainmuoto, merkittäviä eroja kasvaimen tukahduttaminen (** P 0,001) ja elinaika (

AP 0,05) hiirillä, joille hNOXA tai sisplatiinin versus PBS ja pcDNA3.1 valvontaa; merkitsevä ero käsitellyt kasvaimet hNOXA + sisplatiini versus PBS ja pcDNA3.1 valvonta (** P 0,001;

ΔΔP 0,01), ja merkittävä ero yhdistelmähoitoa versus hNOXA tai sisplatiinin monoterapiassa (

# P 0,05;

† P 0,05). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin myös SKOV3 mallissa, paitsi että ei ole merkittäviä eroja kasvaimen tukahduttaminen (

P

= 0,222) ja elinaika (

P

= 0,433) välillä sisplatiinipohjaisen ja pcDNA3.1- käsitellyt tuumorit havaittiin. (E-F) TUNEL värjäys tuumorikudoksissa. Edustaja osat otettiin A2780s (E) ja SKOV3 (F) kasvain kudoksissa hiiret, jotka saivat PBS: ää, pcDNA3.1, hNOXA, sisplatiinin ja hNOXA + sisplatiini. (G) Apoptotic indeksin sisällä A2780s ja SKOV3 kasvainten kudokset laskettiin. Vuonna A2780s malli, tilastollisesti merkittävää eroa apoptoottisten indeksi käsitellyt kasvaimet hNOXA tai sisplatiini versus PBS ja pcDNA3.1 valvonta (** P 0,001); merkittävä ero kasvaimia käsiteltiin hNOXA + sisplatiini versus kahden kontrollin (** P 0,001); ja merkittävä ero yhdistelmähoitoa versus hNOXA tai sisplatiinin monoterapiassa (

## P 0,001). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin myös SKOV3 mallissa, paitsi että ei ole merkittäviä eroja apoptoottisten indeksin välinen sisplatiini-kasvaimen ja pcDNA3.1-kasvaimen (P = 0,981) tai PBS-käsiteltyjen kasvaimen (P = 0,705) havaittiin. Apoptoottiset indeksi laskettiin suhde apoptoottisten solujen määrä kokonaismäärään solujen määrä kussakin kentässä. (H) RT-PCR-analyysi ulkosyntyisen hNOXA in vivo.

Survival käyrä analyysi (kuvio 6C) osoitti, että A2780s kasvaimen hiirillä, PBS tai pc3.1-käsiteltyjen ryhmien selvisi alle 65 päivää keskimäärin. Sen sijaan, joko hNOXA tai sisplatiinin johti merkittävään (

P

0,05) elinajan lisääntymisenä verrattuna kahteen kontrolliryhmää, jossa keskimääräinen säilymiseen toistaiseksi 74 ja 80 päivää, vastaavasti. Yhdistelmä hNOXA ja sisplatiinin edelleen parannettu selviytymisen suuremmassa määrin kuin kaksi kontrolliryhmää (

P

0,01), jossa keskimääräinen elinaika oli 87 päivää.