Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

FOXM1 on raportoitu olevan tärkeitä taudin alkamisen ja etenemisen eri kasvaimia. Kuitenkin onko FOXM1 on mitään viitteitä ennusteen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä potilaita jää epäselväksi.

Menetelmät /Principal Havainnot

Tässä tutkimuksessa FOXM1 ilmentyminen kasvainsoluissa tutkittiin ensin immunohistokemiallisesti 175 NSCLC yksilöitä, jonka tulos osoitti, että FOXM1 yliekspressio oli merkitsevästi yhteydessä positiivinen tupakoinnista (P = 0,001), köyhempi kudosten erilaistumiseen (P = 0,0052), korkeampi TNM (P 0,0001), imusolmuke etäpesäke (P 0,0001), kehittynyt kasvain vaiheessa (P 0,0001), ja huonompi ennuste (P 0,0001). Monimuuttujalähettimet analyysi osoitti, että FOXM1 ilmaisua lisääntynyt vaara kuoleman (riskisuhde 1,899; 95% CI, 1,016-3,551). Lisäksi erilaisilla

in vitro

ja

in vivo

kokeissa osoitimme, että kohdennettuja knockdovvn FOXM1 ilmaisun voi estää muuttavien ja invasiivisia kykyjä NSCLC-solujen, kun taas täytäntöön ilmaus FOXM1 voisi kasvatti hyökkäys ja migraatio NSCLC soluja. Lopulta huomasimme, että yksi solun mekanismeja, joilla FOXM1 edistää kasvainten etäpesäkkeiden kautta asiakkuutta epiteeli- mesenkymaalitransitioon (EMT) ohjelma.

Johtopäätökset

Nämä tulokset viittaavat siihen, FOXM1 yliekspressio kasvainkudoksissa merkittävästi liittyy huonoon ennusteeseen NSCLC potilaiden edistämällä kasvainmetastaasit.

Citation: Xu N, Jia D, Chen W, Wang H, Liu F, Ge H, et al. (2013) FOXM1 liittyy huono prognoosi ei-pienisoluinen keuhkosyöpä Potilaat kautta edistäminen kasvainmetastaasit. PLoS ONE 8 (3): e59412. doi: 10,1371 /journal.pone.0059412

Editor: John D. Minna, Univesity Texas Southwestern Medical Center at Dallas, Yhdysvallat

vastaanotettu: 18 elokuu 2012; Hyväksytty: 14 helmikuu 2013; Julkaistu 25 maaliskuuta 2013

Copyright: © 2013 Xu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Shanghai Leading Academic Discipline Project, projektin numero B115 ja Kiinan kansallinen ”985” projekti (faasi III). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on pysynyt suurin syy syöpään liittyvät kuolemat maailmanlaajuisesti useita vuosia. Huono ennuste keuhkosyöpään lähinnä vähän oireita varhaisessa vaiheessa ja kun diagnosoidaan, tuumorisolut ovat aina metastasized muihin elimiin [1]. Epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) on merkittävä kasvainsolun etäpesäke ja ominaista liukeneminen välisissä liitoksissa kautta sisäistämisen ja alas-säätely eri proteiinien läsnä tiukka liittymissä, kuten Zonula occludens (ZO) -1, ja vyöliitos, kuten E-kadheriinin [2], [3].

Forkhead laatikko M1 (FOXM1), jäsen Fox perheen transkriptiotekijöitä, on osoitettu olevan olennainen solusyklin etenemisen ja on tärkeä solusyklin säädin valvontaan siirtymisen G1: stä S-vaiheeseen, sekä tuloa ja valmistumisen mitoosin [4],. Sen on raportoitu olevan yli-ilmentynyt eri kasvaimia, mukaan lukien keuhkot, maksa ja rintasyöpiä [8], [9], [10], [11], [12], [13], ja sillä oli olennainen rooli kehittymisessä ja etenemisessä eri pahanlaatuisia kasvaimia [11], [14], [15], [16]. Äskettäin FOXM1 ilmoitettiin ajamaan maksan fibroosi ja etäpesäkkeiden HCC [17], ja se on hyvin dokumentoitu, että hedgehog-signalointireitin aktivoitiin NSCLCs, ja useat molekyylit osallistuvat tämän reitin, kuten PTCH1, SMO, GLI1, havaittiin korreloivan useiden ennustetekijöitä parametrien NSCLCs. Erityisesti, nämä molekyylit havaittiin myös korreloivan lisääntyneen ilmentymisen FOXM1 [18]. Kuitenkin myös FOXM1 voisi käyttää suoraa vaikutusta ennustetta NSCLCs potilaita on vielä selvittämättä. Yang ja työtovereiden raportoi äskettäin, että FOXM1 yli-ilmentyminen korreloi köyhien potilaiden selviytymiseen käyttäen immunohistokemiaa analyysit 69 tapausta okasolusyöpä yksilöt [19]. Kuitenkin, prognostisia rooli FOXM1 ilmentymisen muun tyyppisiä NSCLCs ei ole määritetty. Liu et ai. todettu, että ilmaisu asema FOXM1 NSCLC on itsenäinen ennustetekijä ja korreloi negatiivisesti ennusteeseen., mutta niiden tutkimus ei löytänyt suhdetta FOXM1 ilmaisun ja muiden kriittisten kliinisten parametrien [20]. Samaan aikaan kaikissa tutkimuksissa yllä ei osoittanut potentiaalia taustalla olevien mekanismien. Aiemmissa tutkimuksessa olemme osoittaneet, että FOXM1 edistetään

in vitro

metastaattisen kyvyn pienisoluisen keuhkosyövän [21]. Nykyisessä tutkimuksessa, pyrimme määrittämään ennustetekijöiden roolit FOXM1 yli-ilmentymisen NSCLCs ja edelleen tutkia mekanismia, jolla FOXM1 voisi edistää etäpesäkkeiden NSCLCs.

Tulokset

Potilastiedot ja suhteet välillä FOXM1 ilmentäminen ja ennusteeseen viittaavia ominaisuudet

ennusteeseen viittaavia ominaisuuksia potilaista on esitetty taulukossa S1. Yleinen seurantaa kestot vaihtelivat 1-84 kuukautta (mediaani, 42 kuukautta). Tutkia, onko lisääntyneen ilmentymisen FOXM1 liittyi erilaisiin ennustetekijät, potilaat luokiteltiin kahteen ryhmään suhteen immunohistokemiallisella värjäyksellä FOXM1 (kuvio 1A, a-d): negatiivinen /heikko ilme ja voimakas ilme. Kuten on esitetty taulukossa S2, potilailla, joiden imusolmuke etäpesäke (kuvio 1A, e) oli merkitsevästi korkeampi ilmentyminen FOXM1 verrattuna potilaisiin, joilla ei imusolmuke etäpesäke (kuvio 1A, f) (P 0,0001). Samaan aikaan vahvempi FOXM1 ilmentyminen korreloi positiivinen tupakoinnista (P = 0,001), köyhempi eriyttäminen (P = 0,0209), kehittynyt kasvain vaiheessa (P 0,0001) ja korkeampi TNM vaiheissa (P 0,0001), kun taas mitään merkittävää eroa ei havaittu potilaiden ikä, sukupuoli ja histologia aikaan diagnoosi korkean ja matalan tason FOXM1.

(A) edustaja tulokset FOXM1 värjäyksen NSCLC tuumorikudoksissa analysoitiin immunohistokemiallisesti (a, negatiivinen, b, heikko; c, kohtalainen, d, voimakas, vastaavasti). Edustavia tuloksia FOXM1 ekspressiotasoja välillä imusolmuke positiivinen (e) ja imusolmukkeesta negatiivinen (f) (a-f, vasen, suurennus: × 100; oikea, suurennus: × 400). (B) Kokonaiselossaoloaika analysoi kaikkien potilaiden (a), potilailla, joilla on vaiheen I /II (b) ja potilailla, joilla on vaiheen III /IV (c) tulosten mukaan Immunohistokemian analyysin. Log-rank-testi käytettiin testaamaan kaksi elossapysymisaikajakaumat. P 0,05 katsottiin olevan tilastollista merkittävyyttä.

FOXM1 Expression korreloi positiivisesti kasvainprogression Poor Survival of ei-pienisoluinen keuhkosyöpä Potilaat

Ensinnäkin eloonjäämiseen analyysiä käytettiin tutkia korrelaatio FOXM1 ilmaisun ja ennustetta. Ennuste sellaisille potilaille, joilla on vahva kasvaimen ilmaus FOXM1 oli merkittävästi heikompi kuin potilailla, joilla on negatiivinen tai heikko kasvain FOXM1 lauseke (P 0,0001) (Figure1B, a). Jatkotutkimuksissa FOXM1 ilmentyminen liittyi huonompi potilaiden elinaikaa vaiheen I /II syöpä (P = 0,049) (kuvio 1 B, b) ja potilaille, joilla on vaiheen III /IV syöpä (P = 0,095) (kuvio 1 B, c) , vaikka tulos vaiheen III /IV ei saavuttanut merkitystä. Univariate analyysi osoitti, että kasvain vaiheessa (P 0,0001), imusolmukkeesta tila (P 0,0001), TNM (P 0,0001) ja FOXM1 lauseke (P 0,0001), jokainen ennusti merkitsevästi huonompi ennusteen pienisoluista keuhkosyöpää (taulukko 1 ). Kliiniset ennuste oli, ei kuitenkaan liittynyt ikä, sukupuoli, tupakointi, histologian ja erilaistumista.

Lisäksi Coxin suhteellisten riskien mallia sovellettiin vaikutusten arvioimiseksi FOXM1 ilmaisun eloonjäämiseen. Raaka riskisuhde (HR) on FOXM1 vahvan ilmaisun verrattuna FOXM1 negatiivinen tai heikko ilmentyminen oli 1,899 (95% CI, 1,016-3,551, P 0,05), mikä osoitti, että vahva FOXM1 tila lisääntynyt vaara sairastua keuhkosyöpään liittyvien kuolemaan lähes kaksi kertaa niin suuri negatiivinen tai heikko FOXM1 tila. Jossa monimuuttuja-analyysi, FOXM1 ilme, imusolmuke etäpesäke ja ikä liittyivät merkittävästi eloonjäämisen (taulukko 2). Nämä havainnot viittaavat siihen, että FOXM1 näyttää olevan riippumaton ja merkittävä ennustaja huonompi selviytymisen.

Kohdennetut knockdovvn FOXM1 Expression Inhibioitu

in vitro

Metastasoitunut potentiaalit NSCLC Cells

edellä esitetyt tulokset paljastivat, että korkea FOXM1 ilmentyminen liittyi huonoon ennusteeseen NSCLC potilaiden, mutta taustalla olevien mekanismien edelleen epäselviä. Aiemmissa tutkimuksessa olemme osoittaneet, että FOXM1 voisi välittää leviämisen SCLC solulinjoja, jotka voivat liittyä kehittynyt kasvain vaiheessa [21]. Mutta roolit FOXM1 ilmaisun NSCLC solumigraatioon ja invaasiota ovat suurelta osin tuntemattomia. Siten selvittää FOXM1 sovittelee ennusteen keuhkosyövän edistämällä etäpesäke, haimme lenti-virustransduktio kaataa FOXM1 lausekkeen vaeltavia ja invasiivisia kyky H1299 ja PC-9 solua (kuvio 2A ja B). Tulokset viittasivat siihen, että häiriöt FOXM1 ilmaisun voisi merkittävästi estää muuttavien ja invasiivisia kyvyt NSCLC solujen trans- hyvin migraatiokokeessa (kuvio 2C ja D). Lisäksi olemme havainneet, että eri kahdessa solulinjassa, knockdovvn FOXM1 ilmaisun voisi merkittävästi inhiboimaan nopeuden 48 ja 72 tuntia (kuvio S1A), ja yliekspressio FOXM1 edistetään kasvaimen leviämisen 72 tunnin jälkeen nude-hiirissä (kuvio S1B), jotka kaikki olivat yhdenmukaisia ​​aiempien tulosten.

(A, B) havaitseminen lentivirusta-välitteisen knockdovvn FOXM1 PC-9 ja H1299 soluihin WB ja Q-PCR, vastaavasti. (C, D) edustaja tulos laajuisen hyvin muuttoliike määritykset vaikutukset FOXM1 on

in vitro

muuttavien ja invasiivisia kyvyt PC-9 ja H1299 soluja. Tulokset esitetään keskiarvona ± sd, *

p

0,05.

pakotettu ilmentymä FOXM1 Lisääntynyt

in vitro

ja

vuonna vivo

Metastasoitunut kyvyt NSCLC Cells

edelleen todistaa rooli NSCLC etäpesäkkeitä, me vakaasti yli-ilmentynyt FOXM1 ilmentymistä PC-9 ja H292 solulinjoissa (kuvio 3A ja B). Ensinnäkin käyttämällä Trans-hyvin määritykset, osoitimme, että yliekspressio FOXM1 voisi merkittävästi lisätä muuttavien ja invasiivisia potentiaalit NSCLC-solujen (kuvio 3C ja D). Edelleen vahvistaa roolia FOXM1, että etäpesäkkeiden ei-pienisoluinen keuhkosyöpä, olemme kehittäneet hiirimallissa häntälaskimoinjektiona PC-9 FOXM1 yli-ilmentävät (PC-9-FOXM1) ja ohjaus (PC-9-Vector) solut . Viisi viikkoa soluinokulaation jälkeen, hiiret tapettiin, jolloin saatiin keuhkoissa (kuvio 4A), ja seurattiin fluoresenssin kuvantamisen, jonka tulokset osoittivat, että PC-9-FOXM1 soluilla paljon vahvempi fluoresenssisignaalit keuhkoihin kuin kontrollisolut ( kuvio 4B). Lisäksi histologiset tutkimus osoitti, että etäpesäkenystyröiden määrä keuhkoissa FOXM1 yli-ilmentymisen ryhmässä oli merkittävästi suurempi kuin verrokkiryhmässä (kuva 4C ja D). Yhdessä nämä havainnot tukevat hypoteesia, että FOXM1 tärkeä rooli tuumorimetastaasissa NSCLC.

(A, B) havaitseminen lentivirusta välittämää yliekspressio FOXM1 PC-9 ja H292-soluihin WB ja q-PCR, vastaavasti. (C, D) edustaja tulos laajuisen hyvin muuttoliike määritykset vaikutukset FOXM1 on

in vitro

muuttavien ja invasiivisia kyvyt PC-9 ja H292-soluissa. Tulokset esitetään keskiarvona ± sd, *

p

0,05.

(A, B) silmämääräinen tarkastus ja fluoresenssikuvantamisella analyysi keuhkojen etäpesäkenystyröiden kahteen ryhmään ( PC-9-vektori ja PC-9-FOXM1) hiirimalleissa häntälaskimoinjektiona kasvainsolujen, vastaavasti. (C) vaikutukset

FOXM1

in vivo

metastaattisen kyvyt PC-9 solua ksenograftimalleissa nude-hiirten (n = 6) määritettynä tutkimisen hiiren keuhkoissa mikroskooppisen kyhmyt. Edustavia tuloksia Histologian hiiren keuhkoissa etäpesäkenystyröiden (vasemmalla). Määrä keuhkojen metastaattisen noudels kahdessa ryhmässä hiiren malleissa (oikealla). Tulokset esitetään keskiarvona ± sd, *

p

0,05.

FOXM1 aiheuttama epiteelin-mesenkymaalitransitioon NSCLC Solut ja Tuumorikudoksen Näytteitä

Olemme edelleen havaittu solujen korkea FOXM1 ilme, joka todettiin fenotyyppisiä muutoksia muistuttaa EMT. Kuten on esitetty kuviossa 5A, erillinen morfologiset erot H292-FOXM1 solulinjaa ja sen vanhempien H292-vektori-solulinja havaittiin soluviljelmässä. Kun taas H292-soluissa ovat monikulmainen ja kasvaa klustereita, H292-FOXM1 solut ovat pitkänomaisia ​​ja kara-muotoinen, ja kasvaa sironta malli yhtymäkohta. Tutkimaan edelleen mekanismeja, jotka liittyvät lisääntynyt etäpesäkkeitä potentiaali, testasimme joitakin keskeisiä tekijöitä, jotka liittyvät EMT, joka edistää etäpesäkkeitä syövissä. Olemme havainneet, että H292-FOXM1 solut ilmensivät pienempi mRNA: ta ja proteiinia tasoa E-kadheriinin ja ZO-1, kun taas saatu korkeampi mRNA: ta ja proteiinia tasot mesenkymaalisten markkereita, kuten vimentiinistä ja N-kadheriinin (kuvio 5B ja C). Slug on transkriptio repressori, joka on voimakas induktori EMT. Olemme havainneet lisääntynyt Slug ilmentymistä FOXM1-yliekspressio soluissa (kuvio 5D). Meidän havainnot viittaavat siihen, että FOXM1 indusoi etäpesäke kautta EMT.

(A) edustaja vaihe-kontrastin kuvia H292-vektorin ja H292-FOXM1 soluja (Suurennus: 200 x). (B) kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR-analyysi suhteellisen ilmentymisen EMT markkereita, kuten on ilmoitettu. GADPH käytettiin latauskontrollina. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± S.D., *

p

0,05. (C) Suhteellinen ilmentyminen EMT merkkiaineiden kuten määritettiin immunoblottauksella (vasemmalla), ja jonka tulokset oli edelleen määrällisesti (oikealla). β-aktiini toimi latauskontrollina. (D) suhteellinen ekspressio Slug kuten määritettiin immunoblottauksella (vasemmalla), ja tulokset, jotka on edelleen määrällistä (oikealla). β-aktiini toimi latauskontrollina.

osoittavat lisäksi suhdetta FOXM1 ilmaisun ja EMT markkereita, immunohistokemia värjäys suoritettiin E-kadheriinin, vimentiinistä ja Slug kasvaimissa näytteissä. Ihmisen keuhkosyöpä näytteitä, lisääntynyt vimentiinistä ja etana ilmaisun ja laski E-kadheriinin ilmentymisen havaittiin ryhmissä korkean FOXM1 ilme, kun taas vähentynyt vimentiinistä ja Slug ilmaisun ja lisääntynyt E-kadheriinin ilmentymisen ryhmissä alhainen FOXM1 ilme (kuvio 6A) . Lisäksi olemme laatineet ihonalainen kiinteä kasvain malleja. 4 viikon injektion PC-9-FOXM1 ja PC-9-vektorin soluihin, kiinteät kasvaimet kerättiin, upotettu paraffarin ja värjättiin EMT markkereita. Kuten kuviossa 6B on esitetty, kun kasvaimia, jotka ovat peräisin PC-9-vektori-solujen kasvaimia, jotka ovat peräisin PC-9-FOXM1 soluissa paljasti lisääntyneen ilmentymisen vimentiinista ja Slug ja vähentynyttä ilmentymistä E-kadheriinin (kuvio 6B). Meidän havainnot morfologisten ja molekyylitason muutokset viittaavat siihen, että FOXM1 yliekspressio indusoi EMT-kaltainen fenotyyppi kautta lisäävä säätely Slug in NSCLC soluissa.

(A) Suhteellinen ilmentyminen E-kadheriinin, vimentiinistä ja Slug kuten oli määräytyy immunohistokemiallisella värjäyksellä ihmisen kasvainten näytteissä korkea (edellä) ja matala (alla) FOXM1 ilme. (B) suhteellisen ilmentyminen E-kadheriinin, vimentiinistä ja Slug kuten määritettiin immunohistokemiallisella värjäyksellä nude-hiirissä kasvaimia, jotka ovat peräisin PC-9-vektori-solut (edellä) ja PC-9-FOXM1-soluja (jäljempänä).

keskustelu

tässä tutkimuksessa arvioimme ekspressiotasot FOXM1 käyttää IHC värjäystä kohortin 175 kiinalaisen NSCLC potilaiden ja ensimmäisen kerran osoittaneet, että kohonnut ilmentyminen FOXM1 korreloi useiden kliinis tekijät ja ennusti epäsuotuisa ennusteen NSCLC potilaalla, joista SCC ja AC. Lisäksi olemme havainneet, että sääntelyn purkaminen FOXM1 ilmentyminen oli merkitsevästi yhteydessä korkeampaan metastaattinen kykyjä asiakkuutta EMT.

Kun otetaan huomioon rooli FOXM1 kasvaimen solujen kasvua, jotkut tutkimukset ovat arvioineet mahdollisuutta FOXM1 ilmaisun biomarkkerina ennustaa kliininen tulos NSCLC potilaiden. Yang et al havaitsivat, että FOXM1 liittyvät kliiniset tekijät ja pelaa kriittinen rooli ennusteen 69 potilaalla on SCC, ei AC. ja Liu et ai osoittaa FOXM1 voisi olla itsenäinen tekijä ennusteen 68 NSCLC potilaalla, joista 37 AC ja 19 SCC, mutta suhde FOXM1 ilmaisun ja muut clinicoparameters testattiin mitään suhdetta. Nämä paradoksaalinen tulokset voivat johtua niiden eri tutkimuspopulaatiossa, pieni otoskoko ja monipuolinen kliinisten tietojen laatua. Tutkimuksessamme havaitsimme, että FOXM1 ilmaisun tuumorinäytesylinterin positiivisesti liittyy useita kliinis parametreja, kuten TNM vaiheessa kasvain vaiheessa ja imusolmuke etäpesäke. Lisäksi korkeampi FOXM1 ilmentyminen korreloi huonoon ennusteeseen NSCLC potilaiden. Nämä tulokset osoittivat, että FOXM1 oli liittyvät NSCLC etenemisen ja ennusteen. Kuitenkin mekanismit on edelleen selvitettävä.

Etäpesäke liittyy sarja monimutkaisia ​​vaiheita [22], mukaan lukien vähentynyt tarttuvuus, lisääntynyt liikkuvuus, soluunkiinnittymisaktiivisuutta, matriisi liukeneminen, ja muuttoliike [23]. Aikana syövän etenemiseen, syövän solut käyvät läpi dramaattisia muutoksia solun tukirangan organisaation hyväksymään invasiivisia fenotyyppiin ja lopulta etäispesäkkeitä muihin elimiin. EMT on keskeinen prosessi tuumorimetastaasissa [24], [25], [26], joka liittyy alentunut solun pinnan ilmentyminen E-kadheriinin, lisäsi N-kadheriinin [27], [28] ja muuttunut ilmentyminen useiden cyto -skeletal proteiineja, osallistua merkittävästi kohti muuttavia aktiivisuutta kasvainsolujen [29].

paljastivat, että esto FOXM1 hillitsevän metastaattinen kyky, kun taas sääteli ekspressiotason FOXM1 keuhkosyövän solut tehosti muuttavien ja invasiivisia ominaisuuksia in vitro ja in vivo. Tasot E-kadheriinin, ZO-1 olivat koholla ja vimentiinin, N-kadheriinin pelkistettiin korkeampi FOXM1 ilme. Myös FOXM1 säännelty Slug lauseke, joka on induktori EMT. Nämä tulokset viittaavat siihen, että FOXM1 liittyi ennusteen edistämällä etäpesäkkeiden kasvainten solujen läpi asiakkuutta EMT. Hyun JP et ai. osoittivat myös, että HCC, FOXM1 voisi aktivoida Akt-Snail1 polku ja osalliseksi EMT siirtyminen [17]. Lisäksi on olemassa joitakin muita tutkimukset osoittivat, että MMP: t ovat nousseet keskeisiksi tekijöiksi sekä paikallisessa kasvun ja etäpesäkkeiden kasvaimissa [30], [31], ja FOXM1 voisi myös säädellä MMP edistää OSCLC etäpesäkkeitä. Yhdessä FOXM1 voi olla useita merkittäviä tehtäviä kasvainsoluissa. Sen täydellinen rooli koulutusjakson koskevat etäpesäkkeitä worths lisätutkimuksia.

Yhteenvetona havaintomme osoittavat, että FOXM1 ylössäätöä voi olla vaikutusta NSCLC ennusteeseen ja etenemiseen. Osoitimme, että FOXM1 yliekspressio liittyi vähentyneeseen eloonjäämiseen ja nopea kasvaimen etenemistä pienisoluista keuhkosyöpää. Lisäksi yli-ilmentyminen FOXM1 voisi lisätä muuttavien ja invasiivisia kyvyt NSCLC soluja. Nämä tulokset viittaavat siihen, että FOXM1 lauseke on kriittinen invasiivisuus pahanlaatuisten NSCLC-solujen, ja tämä vaikutus oli ainakin osittain kautta epithelial- mechenmychal siirtyminen. Siksi havaintomme tekee FOXM1 houkutteleva kohde keuhkosyövän hoidossa, ja sitä voitaisiin käyttää biomarkkerina ennustamiseen ennustetta.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Human osallistujat mukana tässä tutkimuksessa, jos niiden kirjallinen suostumus periaatteiden mukaisesti ilmaistu Helsingin julistus. Lääketieteen etiikka ja ihmisen kliinisiin tutkimuksiin komitean Zhongshan sairaala, Fudanin yliopistossa on hyväksynyt tämän tutkimuksen sekä lupamenettely (Luvan numero: 2011-221). Kaikki eläin protokollat ​​hyväksyttiin eettinen komitea eläinkokeille yliopiston Fudanin Animal Care komitea, Shanghai, Kiina (Luvan numero: SYXK: 2008-0039). Kaikki pyrittiin minimoida kärsimyksen.

Potilaille ja kasvain näytteet

yhteensä 232 histologisesti varmennettu NSCLC potilasta peräkkäin rekrytoitiin välillä tammikuussa 2005 ja helmikuussa 2008 hoitoon ei-pienisoluisen keuhkosyövän (NSCLC) Zhongshan sairaala, Fudanin yliopistossa. Neljä potilasta suljettiin pois, jos he aiemmin saaneet sädehoitoa ja /tai kemoterapiaa. Rintakehän röntgenkuva ja tietokonetomografiaa tehtiin kaikille potilaille ennen käyttöä. On 142 potilaalle tehtiin parantava kirurginen resektio. Kemoterapia, jossa sisplatiinin perustuvaa järjestelmää sovellettiin useimmille potilaille suurilla vaiheessa (mukaan lukien III B ja IV) tai joilla on suuri riski toistumista ja etäpesäke mukaan hoidon suuntaviivat NSCLC tällä kirurgisen aikaan. Tätä tutkimusta varten 53 potilasta jätettiin analyysin ulkopuolelle, mukaan lukien 38 potilasta, joilla on huono laatu ja /tai määrä kudosnäytteitä, 11 potilaalla on epätäydellinen kliiniset tiedot ja 4 potilasta kuoli muista syistä on alunperin jätetty analyysimme. Lopuksi, yhteensä 175 potilasta osallistui tähän tutkimukseen (taulukko S1). Kaikkiaan 122 miestä ja 53 naista olivat mukana, mukaan lukien 97 tupakoitsijoita ja 78 tupakoimattomien, jossa iät vaihtelevat 30-77 vuotta, joista 89 oli alle 55-vuotias. Oli 76 vaiheessa I, 23 vaihe II, 51 vaiheen III ja 25 vaiheessa IV sairaudet, mukaan lukien 91 potilasta, joilla ei ole solmukohtien etäpesäkkeitä ja 84patients kanssa imusolmuke etäpesäke. Siellä oli 36 potilasta, joilla kasvain vaiheen 1, 75, vaihe 2, 25 vaiheen 3 ja 39 vaiheen 4 ja 118 potilasta, joilla adenokarsinooma (AC), kun taas 57 kanssa levyepiteelisyöpä (SCC). Mitä erilaistuminen oli 93 potilasta, joilla on hyvin ja kohtalaisen erilaistumista ja 82 huonosti erilaistumista. Kaikkiaan 74 potilasta oli elossa lopussa seurannan, 101 potilasta kuoli keuhkosyöpään, ja potilasta kuoli muista syistä tai kadonnut seuranta jätettiin pois tutkimuksesta.

kliinis tietoa kunkin potilaan, kuten sukupuoli, ikä, tupakointi, kasvain vaiheessa imusolmukestatuksesta, TNM, histologisia laatu ja kokonaiselossaolo, saatiin takautuvasti kliiniset tiedot ja patologinen raportit. Elinaika määriteltiin ajaksi alkaen diagnoosi kuolinpäivästä tai lopussa seurannan. TNM asema määräytyi 7. painos lavastus järjestelmä NSCLC [32].

Immunohischemistry Pitoisuus

Vasta-aine FOXM1 (Sigma Aldrich Inc., MO, USA) ja vakioimmunohistokemiallisia tekniikkaa on käytetty havaitsemaan FOXM1 ilmentymisen, kuten aiemmin on kuvattu [19], [20]. FOXM1 havaittiin soluliman tai soluliman ja ydinvoiman solujen. Värjäys arvioitiin viidessä suurtehokaiuttimissa kentät 200 x suurennus. Värjäytyminen pisteet luokiteltiin neljään ryhmään negatiivisina = 0, heikko = 1, kohtalainen = 2 ja voimakas = 3 [20]. Prosenttiosuus alueella värjättiin positiivinen luokiteltiin neljään ryhmään: alle 25% tuumorisolujen positiivinen = 0; 25%: sta 50%: kasvainsoluja positiivinen = 1; 50%: sta 75%: kasvainsoluja positiivinen = 2; yli 75% kasvainsoluja positiivinen = 3. Leimaus pisteet määritettiin kertomalla intensiteetti pistemäärä prosentuaalinen alue petsattu positiivista, mikä tulokset kuin 0, 1, 2, 3, 4, 6 ja 9.Sapotaceae värjäys pisteet luokiteltiin kahteen ryhmään heikkoina /negatiivinen värjäystä (pisteet 4) ja vahva värjäytyminen (pisteet ≥4). Tämä kynnys määritettiin visuaalisesti määrittämällä selvä positiivinen tahra tukee histogrammit alueella tulokset [20], [33], [34]. Korkeimmat merkinnät pisteet kolmesta kudosleikkeiden merkittiin tilastollisia analyysejä. Patologit suorittaneen immunohistokemiallinen arviointi FOXM1 oli sokaissut potilaiden histopatologisia ja seurantatietoja.

Epidemiologiset ja kliiniset Tiedonkeruun

Potilaiden demografiset muuttujat ja tupakointihistoria saatiin läpi -person haastattelu aikaan käynnin, seuranta klinikoilla tai lääketieteellisen kaavio tarkastelu. Henkilö, joka polttaa enemmän kuin 100 savuketta historiassa määriteltiin yhä tupakoitsija, toisin kuin koskaan tupakoitsija [35]. Follow-up tietoa potilaan kuoleman ja selviytymisen päivitettiin 3 kuukauden välein läpi paikan päällä haastattelussa, suora soittaa tai lääketieteen kaavio tarkastelu. Uusin seurantaa tässä tutkimuksessa tehtiin toukokuussa 2012.

Cell Lines, Cell Culture ja Kemoterapia reagenssit

Ihmisen keuhkon adenokarsinoomasolulinja PC-9 ja ihmisen keuhkosyövän solulinjassa NCI-H292, NCI-H1299 olivat kaikki saatu Cellular Institute of Chinese Academy of Science (Shanghai, Kiina) [36]. Nämä solut viljeltiin 37 ° C: ssa 5% CO2-atmosfäärissä Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine (DMEM), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS, Hyclone Inc., UT, USA), 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä. Solut säännöllisesti sertifioitu vapaaksi Mycoplasma saastumista.

shRNA Kokeet

lenti-virus shRNA vektori rakennettiin kuten aiemmin on kuvattu [37]. Lyhyesti, FOXM1 ja negatiivinen kontrolli shRNA subkloonattiin MluI /Clal-kohtien väliin pLVTHM vektorin (Addgene) seuraavien oligonukleotidien vastaavasti: 5′-CGCGTCGGCCGGAACATGACCATC AATTCAAGAGATTGATGGTCATGTTCCGGCTTTTTTCCAT-3’and 5′-CGATGGAAAAAAGCCGGAACATGACCATCAATCTCTTGAATTGATGGTCATGTTCCGGCCGA-3’for FOXM1, ja 5 ’ -CGCGTCGGT AGCGACTAAACACATCAATTCAAGAGATTGATGTGTTTAGTCGCTACTTTTTTCCAT-3’and 5’-CGATGGAAAAAAGTAGCGACTAAAC ACATCAATCTCTTGAATTGATGTGTTTAGTCGCTACCGA-3’for negatiivisen kontrollin. Lenti-viruksen syntymisen ja infektio H1299 ja PC-9-soluja, kuten edellä kuvataan.

transduktio kasvainsolujen

Plasmidi (EX-Z5438-LV135) ja Lenti-Pac ™ HIV Expression pakkaus Kit ostettiin Gene Copoeia Inc. (Gene Copoeia Inc., Guangzhou, Kiina) Transductions sekä H292 ja PC-9-soluja suoritettiin ohjeiden mukaisesti toimittamien valmistaa. Vakaa transfektantit edelleen varmistettiin RT-PCR ja immunoblottaus perusteella niiden FOXM1 ilmaisun.

Kasvainsolun Migration and Invasion Analyysit

Analyysit mitata kasvaimen solujen vaeltamiseen suoritettiin muunnettua Boyden kammion (TranswellTM, Corning Costar, MA, USA), joka sisältää gelatiinipäällystetyille polykarbonaattikalvosuodatinta (8 um huokoskoko). Bio-Coat matrigeeliin (BD Biosciences, Bedford, MA, USA), joka liuottaa tyvikalvon, käytettiin arvioimaan soluinvaasiota. Aste kasvainsolun muuttoliikettä ja invaasiota arvioitiin mukaan aiempiin pöytäkirjoihin [38]. Ei-siirretyn solut poistettiin ylemmältä puolelta kalvon pesemällä. Cell laskenta suoritettiin Coomassie blue -värjäyksellä ja soluja tarkasteltiin mikroskoopilla (Leica Inc., Solms, Saksa) sen jälkeen.

Eläinkokeet

Four- viiteen viikkoa vanhoja BALB /CA nude-hiirten (ostettu Shanghai Institute of Material Medicine, kiinalainen Academy of Science, Shanghai, Kiina) ylläpidettiin spesifisissä taudinaiheuttajista vapaat (SPF) olosuhteissa. Käytetty menetelmä on sama kuin aiemmin on kuvattu tuottaa rintasyövän malli [39]. PC-9-FOXM1-soluja (2 x 10

6 per hiiri), jotka ekspressoivat stabiilisti FOXM1 tai vektorin injektoitiin häntälaskimoon nude-hiirten (n = 6). Viisi viikkoa myöhemmin hiiret lopetettiin ja keuhkot poistettiin. Sen jälkeen nämä keuhkot käsiteltiin histologista tutkimusta ja seurata mahdollisten keuhkojen kasvainetäispesäkkeiden by fluoresenssikuvantamisella [40]. Etäpesäkeleesioita tunnistettiin fluoresenssisignaalien (Night Owl LB 981

In vivo

Imaging System, Berthold, Saksa) ja analysoitiin WinLight32 ohjelmisto. Histologista analyysiä, keuhkot kerättiin ruumiinavauksessa ja kiinnitettiin 10% formaliinilla. Kiinteän jälkeen näytteet upotettiin parafiiniin, ja kolme ei-peräkkäisiä leikesarjojen saatiin eläintä kohti. Leikkeet värjättiin H Monimuuttujalähettimet analyysi suoritettiin Coxin suhteellisten riskien regressiomallia tutkimaan riippumatonta ennustetekijöiden vaikutus FOXM1 eloonjäämiseen säätämällä varten sekoittavat tekijät. P-arvo 0,05 katsottiin merkittäväksi kaikissa analyyseissä. SPSS 17.0 käytettiin tekemään tilastolliset analyysit tässä asiakirjassa.

tukeminen Information

Kuva S1.

Vaikutukset muuttuneen FOXM1 ilmaisun proliferaationopeus

in vitro

ja

in vivo

. (A) leviämisen nopeus FOXM1 SPC-A-1 sh-FOXM1 (vasemmalla) ja H1299 sh-FOXM1 (oikealla) soluja. FOXM1 ilmentyminen ensin stabiilisti tippuu alas by lenti-virustaudin SPC-A-1 ja H1299-soluissa. Proliferaationopeudet solujen ryhmien transfektoitu shRNAs vastaan ​​FOXM1 (sh-FOXM1) (punainen viiva) laski merkittävästi, verrattuna shRNA kohdistaminen negatiivinen kontrolli (sh-NC) (sininen viiva). Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. (B) leviämisen nopeus kasvaimista peräisin PC-9-FoxM1cells in vivo. PC-9-vektorin ja PC-9-FOXM1 solut injektoidaan subkutaani- nude-hiiriin. Kasvaimen halkaisija mitattiin ilmoitettuina ajankohtina. Lisääntymisnopeus kasvaimista peräisin PC-9-FOXM1 soluja (sininen viiva) kasvoi merkittävästi verrattuna että PC-9-vektorin soluihin (punainen viiva). Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0059412.s001

(JPG)

Taulukko S1.

ominaisuudet, joilla on ei-pienisoluinen keuhkosyöpä.

doi: 10,1371 /journal.pone.0059412.s002

(DOCX)

Taulukko S2.

Kliiniset profiilin ja korrelaatio kliinis ja ilmaus FOXM1.

doi: 10,1371 /journal.pone.0059412.s003

(DOCX) B

Kiitokset

kiitos tohtori Qun Wang (Department of thoracology, Zhongshan sairaala) avustasi kanssa seurannan potilaista ja Dr Deming Hän (Department of Pathology, Zhongshan sairaala) ja auttamassa näytteenotossa ei-pienisoluinen keuhkosyöpä.