Krooninen sairaus

tiivistelmä

tavoite

Ihmisen eturauhasen syöpä soluja, selektiivinen Epac agonisti, 8-CPT-2Me-cAMP, ylössäätelee solujen lisääntymisen ja eloonjäämisen aktivoimalla Ras-MAPK ja PI-3-kinaasi-Akt-mTOR signalointi porrastetusti. Tässä tarkastellaan rooli tulehduksellisten välittäjien Epac1-indusoidun solujen lisääntymistä määrittämällä ilmentymisen proinflammatoristen markkereita p-cPLA2, COX-2, ja PGE

2 eturauhassyövän soluissa, joita käsiteltiin 8-CPT-2Me- cAMP.

Methods

palveluksessa estäjät COX-2, mTORC1 ja mTORC2 koetin syklisen AMP-riippuvaista reittejä ihmisen eturauhasen syöpäsoluja. RNAi kohdistaminen Epac1, Raptor, ja Rictor käytettiin myös näissä tutkimuksissa.

Tulokset

8-CPT-2Me-cAMP hoito aiheutti 2-2,5-kertainen p-cPLA2

S505, COX-2, ja PGE

2 tasossa ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa. Solujen esikäsittely COX-2-estäjän SC-58125 tai EP4-antagonistin AH-23848, tai estäjä mTORC1 ja mTORC2, Torin1, vähensi merkitsevästi Epac1 riippuvainen lisäys p-cPLA2: n ja COX-2, s-S6 -kinase

T389, ja p-AKT

S473. Lisäksi, Epac1 aiheuttama proteiinin ja DNA-synteesi väheni suuresti, kun solujen esikäsittely joko COX-2, EP4, tai mTOR-inhibiittorit. Transfektio eturauhasen syöpäsolujen kanssa Epac1 dsRNA, Raptor dsRNA tai Rictor dsRNA vähensi täysin Epac1 riippuvaisia ​​nousuja p-cPLA2 ja COX-2.

Johtopäätös

osoittavat, että Epac1, alavirran efektori cAMP toimii tulehdusta modulaattori eturauhassyöpäsoluissa ja edistää solujen lisääntymistä ja selviytymistä säätelemällä Ras-MAPK, ja PI-3-kinaasi-Akt-mTOR signalointia.

Citation: Misra UK, Pizzo SV (2013) Todisteet Pro-Proliferative Palaute Loop in Eturauhassyöpä: The Role of Epac1 ja COX-2-Dependent Pathways. PLoS ONE 8 (4): e63150. doi: 10,1371 /journal.pone.0063150

Editor: Irina U. Agoulnik, Florida International University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 9. tammikuuta 2013 Hyväksytty: 29 maaliskuu 2013; Julkaistu: 30 huhtikuu 2013

Copyright: © 2013 Misra, Pizzo. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole rahoitusta tai tukea raportti.

Kilpailevat edut: SVP on PLoS One Editorial hallituksen jäsen. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Eturauhassyöpä on yleisimmin diagnosoitu maligniteetin miesten [1]. Eri tekijät edistävät kasvua ja etenemistä eturauhassyöpää. On hyvin tunnettua yhdistyksen välillä hankinnan androgeenistä riippumattomaan kasvuun ja mahdollisesti suurempi todennäköisyys etäpesäkkeiden [2]. On myös yhä enemmän näyttöä, että tulehduksellinen muutokset eturauhasen kasvaimet voivat edistää kasvua [3] – [8]. Noin 15-20% kaikista syöpäkuolemista maailmanlaajuisesti liittyvät infektioon ja [9]. Vaikka nämä kuolemat voivat ensisijaisesti johtua näihin prosesseihin, patologisen, molekyyli, ja epidemiologiset tutkimukset tukevat olettamusta, että krooninen tulehdus liittyy syövän etenemisessä [10]. Tulehduksellinen microenvironment kasvaimia on ominaista läsnäolo isännän leukosyyttien sekä tukemalla strooman ja kasvaimen alueella [11]. Lisäksi kasvaimen miljöö sisältää tulehduksellisten välittäjäaineiden, kuten kemokiinien, sytokiinien, reaktiivisia happiradikaaleja, ja prostaglandiinien [3] – [8]. Syövän kehittymisen läsnä kroonisen tulehduksen liittyy syklo-oksigenaasi-2 (COX-2), ja aktivointi useiden transkriptiotekijöiden, mukaan lukien NFKB: n, STAT3, aktivaattori proteiini-1, ja hypoksian indusoima tekijä 1α [3] – [8].

Prostaglandiinit ja leukotrieenit ovat keskeisiä modulaattoreita, jotka välittävät ylikuuluminen välillä epiteelisolujen ja niitä ympäröivien stroomasolujen [3] – [7]. Arakidonihappo (AA) on tärkeä ainesosa eläinrasvaa ja biologisesti aktiivisia lipidejä johdetut alustaan ​​on ratkaiseva rooli kroonisen tulehduksen ja syövän. Kun solu stimulaatio, AA vapautuu membraanifosfolipidien p-cPLA2 ja muutetaan sitten eri prostaglandiineja (PG) erityisiä entsyymit [6], [12]. COX-2 on indusoituva isoformi nopeutta rajoittava entsyymi, joka muuntaa AA esitulehduksellisiin prostaglandiineja. Näistä PGE

2: lla on hallitseva rooli edistettäessä kasvaimen kasvua. PGE

2 nostaa ilmentymisen antiapoptoottisten proteiinin Bcl2 ja aktivoi cAMP sukupolvi [13]. PGE

2 kasvaa Epac ilme, Rap1 aktivointi, ja Akt fosfory- [14], [15]. Normaaleissa olosuhteissa, COX-2: n ilmentymisen on matala tai ei havaita useimmissa kudoksissa; kuitenkin, sen yliekspressio yhdessä aktivointi sytosolin PLA2 fosforylaatio on ominaisuus tulehdusreaktioiden [16]. Useat signaalitransduktioteitä säännellä COX-2-geenin ilmentyminen, mukaan lukien Ras-MAPK, PKA, PKC: n ja [17] – [20]. Yliekspressio COX-2 esiintyy rinta-, keuhko-, paksusuoli-, ja eturauhasen syövät [3] – [8].

In vitro

, ihmisen eturauhassyövän linjat PC-3, DU145 ja LNCaP ilmaista COX-2 [6], [12]. COX-2 hidastaa lisääntymistä ja /tai ylössäätelee apoptoosia sekä androgeeni-riippumaton ja riippuvainen ihmisen eturauhassyövän soluviljelmissä. Hoito LNCaP-solujen COX-2-estäjän NS398 tai selekoksibia indusoi apoptoosia ja vähentää ilmentymistä Bcl2,

in vivo,

ja COX-2 estää invasiivisuus ja DU-145 ja PC-3-solut [12 ]. Hoito PC-3 kasvain hiirten NS-398 estää kasvainsolujen proliferaatiota ja indusoi kasvaimen regressio [21]. Lisäksi vaikutus on, että COX-2-estäjät tukahduttaa säätelyä VEGF, joka on tärkeää kasvaimen angiogeneesin [3] – [7], [12]. Tulehdukseen liittyvä histologisia aggressiivisuus eturauhassyövissä korreloi nousu PSA tasoilla [22]. Kliinisissä tutkimuksissa eturauhassyövän potilailla, COX-2-estäjät alentavan prostataspesifisen antigeenin (PSA) tasot ja kasvainsolun kaksinkertaistaa aikaa. Lisäksi COX-2-aktivaation ja kohonneeseen PGE

2 esiintyvät syöpäpotilaiden [23] – [26]. PGE

2 toimii neljän solun pinnan reseptorit tunnetaan EP1, EP2, EP3 ja EP4 [27] – [31].

PGE

2-reseptorien ilmaiseman ihmisen eturauhassyövän linjat ovat sitä EP2 ja EP4 alatyyppejä [28]. Sitovat PGE

2 EP2 on kytketty G-proteiinit, jotka aktivoivat adenylaattisyklaasia, joka johtaa solunsisäisen cAMP. Tämä aktivoi, kuten PKA, Epacs, PI-3-kinaasi, ja GSKβ3. PGE

2 lisää EP2-reseptori mRNA, lisää cAMP-tasoja, ja lisää solujen lisääntymistä. Expression of EP2 ja EP4-reseptoreita on lisääntynyt merkittävästi etenemisen eturauhassyöpä ja ektooppinen ilmentyminen näiden reseptorien LNCaP tehostaa PSA tuotantoa [32].

nisäkkään rapamysiinin kohde (mTOR) on Ser /Thr kinaasi, joka yhdistää signaalit ulkoisia ärsykkeitä [33] – [39] säännellään monissa prosesseissa kuten solujen lisääntymisen. mTOR olemassa kaksi erillistä komplekseja, mTOR1 ja mTORC2. Useat viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että PGE

2 ylössäätelee mTORC1 ja mTORC2 signalointi. Esimerkiksi PGE

2-välitteistä endoteelisolujen selviytymisen säädellään mTORC2 [40]. PGE

2-välitteinen kemotaksista ja kemokiinin vapautumista syöttösoluista säädellään mTORC2 aktivointia ja tämä vähennetään solujen esikäsittely aktiivisen paikan mTOR-estäjä Torin1 [41]. Lisäksi COX-2 ja mTOR näyttää suoran ja epäsuoran antituumorivaikutuksia syövissä, ja sekä selekoksibi ja rapamysiini aiheuttaa merkittävää kasvaimen kasvun estäminen [42]. mTORC1 lisäksi mTOR, sisältää sääntelyyn liittyvä proteiini mTOR (Raptor), ja klusterin muiden säätelevien proteiinien [33] – [39]. Raptor säätelee kokoonpanoon mTORC1, rekrytointi kinaasin substraatteja, ja solunosasijaintia mTORC1. Akt aktivoi mTORC1 suoraan fosforyloimalla TSC1 /TSC2 kompleksin mikä rajoitti sen GAP aktiivisuutta ja vapauttamalla GTP-sidottu Rheb aktivoida mTORC1 [33] – [39]. Aktivoituna mTORC1 fosforyloi kaksi sääntelyviranomaisten mRNA käännös ja ribosomaalisen genesis, p70 S6-kinaasi (S6-kinaasi) ja 4EBP1, mikä puolestaan ​​edistää proteiinisynteesiä [33] – [39]. MTORC2 monimutkainen, lisäksi mTOR sisältää Raptor riippumaton kumppani mTOR (Rictor) ja muiden sääntelyyn proteiineja. mTORC1 ja mTORC2 fosforyloivan erilaisia ​​alustoja säännellä erillisiä solutoiminnoille. mTORC1 stimuloi solujen lisääntymistä lisäämällä cap-riippuvaisten translaation aloituksen mikä välittyy sen kaksi suurta alas stream tavoitteet S6-kinaasi ja 4EBP. mTORC2 on herkkä akuuttiin hoitoon rapamysiinin ja säätelee monia prosesseja, kuten solujen lisääntymisen ja eloonjäämisen, fosforyloimalla kinaasien kuten Akt, SG-kinaasi, ja PKC [33] – [39]. Menetys tai inaktivoida tuumorisuppressorien kuten p53, LKB1, PTEN, ja TSC1 /2, jotka antagonisoivat PI 3-kinaasi-riippuvaista aktivoitumista mTORC1, voi edistää kasvaimen kehittymisen kautta lisääntynyt signalointi [33] – [39]. Kohonnut ja /tai fosforylaatio alavirtaan tavoitteet mTORC1 esiintyvät erilaisissa ihmisen maligniteettien ja korreloi aggressiivinen kasvain käytös ja huono ennuste [33] – [39]. mTORC2 toiminta on välttämätöntä kehittämiseen eturauhassyövän aiheuttamia PTEN poistetaan [43].

cAMP säätelee erilaisia ​​prosesseja, kuten solujen lisääntymisen ja apoptoosin kautta alavirran efektoreja kuten PKA. Vaikutus cAMP on omaleimaista ja voi joko estää tai stimuloida soluproliferaatiota PKA-riippuvaisen tai PKA-riippumattomalla tavalla [44], [45]. Soluissa, joissa cAMP stimuloi soluproliferaatiota PKA-riippumattomalla tavalla, cAMP aktivoi Rap1 kautta Epac [45] – [48]. Tässä vaikutukset cAMP välittävät PI-3-kinaasi /Akt signalointi [45] – [48]. Eturauhassyövän hoitoon solujen Epac agonistin 8-CPT-2Me-cAMP säätelee lisäävästi Epac1 ilmaisu, Rap1 aktivointi, MAPK: n aktivointi, Akt fosforylaation T308 ja S473 on PI-3-kinaasi riippuvia ja mTORC1 ja mTORC2 aktivointi arvioituna fosforylaatio S6 -kinase at T389, 4EBP1 at T37 /36 ja Akt at S473 jäämiä, vastaavasti [47],. Hiljentäminen Epac1 ilmentymistä RNAi tai esikäsittely PI 3-kinaasi tai mTOR-inhibiittorit vaimentaa 8-CPT-2Me-cAMP aiheuttama ylössäätely Epac1 MAPK, mTORC1, ja mTORC2 signalointi, ja lopulta DNA ja proteiinisynteesi [47], [48 ]. Epac parit cAMP tuotannon Rap1 ja PI 3-kinaasin aktivaation. Rap1, joka on usein koholla erittäin metastaattinen eturauhassyöpä solulinjoissa, säätelee signaaleja osallistuvat solujen lisääntymistä, eloonjääntiä ja etäpesäkkeiden [49]. Epac1 ylössäädellään jälkeen tulehduksen ja sillä on kriittinen rooli PKC: n aktivaation riippuvaisten PGE

2 signalointi aktivoimalla Rap1 [50].

Kuten edellä käsiteltyjen, krooninen tulehdus edistää kasvaimen aloittamista, leviämisen, ja etäpesäke säätelemällä COX-2-PGE

2-cAMP signalointiryöpyn. 8-CPT-2Me-cAMP, erityinen analoginen cAMP, sitoutuu Epac1, mutta ei PKA. Eturauhasen syöpäsoluja, tämä analoginen aiheuttaa säätelyä Epac1, Rap1GTP, proteiinisynteesiä, DNA-synteesiä, ja MAPK: n ja PI-3-kinaasi-Akt-mTORC1-mTORC2 signalointia. Tämän seurauksena, proteiini ja DNA-synteesi stimuloi. Nämä vaikutukset ovat alas säätelevät solujen esikäsittely estäjien MAPK, PI-3-kinaasi, mTORC1 tai RNAis jotka kohdistuvat Epac1, Raptor tai Rictor [47], [48]. Tässä ajatellaan hypoteesia, että Epac1 toimii tulehduksellinen välittäjänä eturauhassyövän edistämällä solujen lisääntymisen ja eloonjäämisen. Olemme tutkineet sääntelyn proinflammatoristen markkereita p-cPLA2, COX-2, ja PGE

2 kolmessa ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa, jotka saivat 8-CPT-2Me-cAMP. Solujen esikäsittely COX-2-estäjät, joka on mTORC1 ja mTORC2 estäjä, tai solujen transfektio Epac1 dsRNA, Raptor dsRNA tai Rictor dsRNA säädeltiin 8-CPT-2Me-cAMP induktio p-cPLA2, ja COX-2. Syöpäsolujen proliferaatiota myös tukahdutetaan. Näin taas PGE

2 säätelee cAMP-tuotantoa ja Epac-aktivointi, Epac aktivointi johtaa myös COX-2-riippuvaista PGE

2 tuotantoa. Lopputuloksena on autokriini kaltainen syklinen prosessi ajo eturauhassyövän solujen lisääntymisen kautta ylössäätely Ras-MAPK ja PI 3-kinaasi-Akt-mTOR signalointi.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

Kasvualustat ostettiin Invitrogen. 8-CPT-2Me-cAMP hankittiin Axxora LLC (San Diego, CA). Vasta-aineita mTOR, p-Akt

S473, Akt1, S6-kinaasi, p-S6-kinaasi

T389, p-cPLA2

Ser505 ja cPLA2 ostettiin Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Vasta-aineet Epac1, COX-2, Raptor, Rictor, EP2, ja EP4 ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Anti-aktiini-vasta-aineita saatiin Sigmalta (St. Louis, MO). [

3H] tymidiiniä (ominaisaktiivisuus 174 Ci /mmol ja [

3H] leusiinilla (spesifinen aktiivisuus 115,4 Ci /mmol) saatiin Perkin-Elmer Life Sciences. Kaikki muut materiaalit olivat analyyttistä laatua ja hankittiin paikallisesti. COX-2-estäjän SC-58125 tai EP4-antagonistin AH23848 hankittiin Caymon (Ann Arbor, MI) ja Torin1 hankittiin Tocris Biosciences (Minneapolis, MN).

Ihmisen eturauhasen syöpäsolulinjoissa

tässä tutkimuksessa käytimme kolme ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa, 1-LN, DU145, ja PC-3. Kuten aikaisemmin on kuvattu [51], erittäin metastaattinen 1-LN eturauhassyövän solulinja saatiin tällä toimielin alkaen etäpesäke vähemmän metastaattisen PC-3-solut nude-hiirissä ja oli ystävällinen lahja Dr. Philip Walther (Duke University Medical Center, Durham, NC). Nämä solut ovat saatavilla pyynnöstä. DU-145 ja PC-3-solujen hankittiin ATCC: ltä. Ne kasvatettiin 6, 12, tai 48-kuoppaisilla levyillä RPMI 1640 -alustassa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää, 2 mM glutamiinia, 12,5 yksikköä /ml penisilliiniä, 6,5 ug /ml streptomysiiniä ja 10 nM insuliinia (RPMI-S ) käytettäessä kosteutetussa CO

2-inkubaattorissa 37 ° C: ssa. Saavuttamisen jälkeen 90% konfluenssiin, väliaine aspiroitiin ja uusi tilavuus RPMI-S-elatusaineeseen lisättiin ja soluja käytettiin alla kuvatuissa kokeissa.

laadulliset PCR COX-2, EP2, ja EP4 eturauhasen syöpäsolut stimuloidaan 8-CPT-2Me-cAMP

1-LN, PC-3, ja DU145 eturauhassyövän solut kasvatettiin kuten edellä. Saavuttamisen jälkeen 90% konfluenssiin, solut pestiin kahdesti Hanks ’Balanced Salt, joka sisälsi 10 mM HEPES, pH 7,4, ja 3,5 mM NaHCO

3 (HHBSS). Tilavuus tuoretta RPMI-S-elatusaineeseen lisättiin sitten ja soluja inkuboitiin 5 min lämpötila on tasaantunut. Solut altistettiin joko puskurin tai 8-CPT-2Me-cAMP (100 uM) 30 minuutin ajan ja inkuboitiin kuten yllä. Reaktio lopetettiin imemällä väliaine. Kokonais-RNA soluista uutettiin käyttäen RNeasy Minikits (QIAGEN, Valentia, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. RNA kvantitoitiin absorbanssilla 260 nM. Kokonais-RNA käänteiskopioitiin 1 ug RNA: ta 20 ui reaktiossa käyttäen Moloney-hiiren leukemiaviruksen käänteistranskriptaasia (200 yksikköä) ja oligo (dT) alukkeena 1 h 40 ° C: ssa. Saatu cDNA (5 ug) käytettiin templaattina, ja 225 emäsparin segmentin cDNA: COX-2, EP2 ja EP4 monistettiin käyttäen 20-mer ylävirran alukkeet (1) COX-2-eteenpäin; (5′-TGG TCT GGT GCC TGG TCT G -3 ’) ja COX-2-reverse (5’AGT ATT AGC CTG CTT GTC TGG AAC -3’); (2) EP2-eteenpäin: (5’TTC ATC CGG CAC GGG CGG ACC GC -3 ’) ja EP2-reverse (5’CCT CCT GAG AAA GAC AGT GCT -3’); ja (3) EP4-eteenpäin: (5’CCT CCT GAG AAA GAC AGT GCT -3 ’) ja EP4-reverse (5’AAG ACA CTC TCT GAG TCCT -3’). 302 emäsparin segmentti hiiren β-aktiini (konstitutiivinen sisäinen kontrolli) cDNA oli co-monistettiin käyttämällä alukkeiden sarja annetaan R (2) 8-CPT-2Me-cAMP (100 uM /16 h); (3) (AH23848 1 uM /3 h); (4) AH23848 1 uM /3 h) jälkeen 8 CPT-2Me-cAMP; (5) SC58125 (1 uM /3 h); (6) SC58125 1 uM /3 h) jälkeen 8-CPT-2Me-cAMP; (7) Torin1 (250 nM /3 h); tai (8) Torin1 (250 nM /3 h) jälkeen 8-CPT-2Me-cAMP. [

3H] leusiinia (2 uCi /ml) lisättiin sitten, ja soluja inkuboitiin yön yli kuten edellä. Reaktiot lopetettiin imemällä väliaine ja yksisolukerrokset pestiin kahdesti jääkylmällä 5% TCA: ta, ja solut pestiin kolme kertaa jääkylmällä PBS: llä. Solut hajotettiin tilavuuteen 1 N NaOH: a (40 ° C: ssa 2 h), proteiinipitoisuus arvioitiin ja lysaatit laskettiin neste-tuikelaskimella [47], [48].

Measurement DNA-synteesin in 1-LN-solujen stimuloidaan 8-CPT-2Me-cAMP

Eturauhassyöpä soluja (3 x 10

3 solua /kuoppa 48-kuoppalevyille) kasvatettiin RPMI-S) käytettäessä kosteutetussa CO

2 (5%) inkubaattorissa 37 ° C: ssa. 90% konfluenssiin, väliaine aspiroitiin ja tilavuus RPMI-S lisättiin, minkä jälkeen lisättiin yhdisteitä, kuten edellä on kuvattu. [

3H] tymidiiniä (2 uCi /ml) lisättiin sitten ja soluja inkuboitiin yli yön. Reaktiot lopetettiin imemällä väliaine ja yksisolukerrokset pestiin kahdesti jääkylmällä 5% TCA: lla, jota seuraa kolme pesua jääkylmällä PBS: llä. Solut hajotettiin tilavuuteen 1 N NaOH: a (40 ° C /2 h), proteiinipitoisuus arvioitiin ja lysaatit laskettiin nestetuikelaskurilla [47], [48].

mittaus COX -2 tai mTOR-estäjän vaikutuksia 8-CPT-2Me-cAMP indusoidun ilmentymisen lisääntyminen p-CPLA

2, ja COX-2

Eturauhassyöpä soluja (3 x 10

6 solua /6 kuoppalevyille) inkuboitiin yli yön RPMI-S-elatusaineessa pestiin kahdesti kylmällä HHBSS ja tilavuus RPMI-S-elatusaineeseen lisättiin kuhunkin kuoppaan. Soluja vastaavassa kuoppia käsiteltiin kuten edellä on kuvattu. Reaktiot pysäytettiin imemällä väliaine ja tilavuus lyysipuskuria lisättiin jäissä 20 min. Solulysaatit raaputettiin Eppendorf-putkiin ja sentrifugoitiin 5 minuutin ajan 800 x g: llä 4 ° C: ssa ja proteiini sisältö lysaatit määritettiin. Sitten näytteet tutkittiin edellä kuvatulla tavalla.

Measurement of COX-2 ja mTOR-estäjän vaikutuksia 8-CPT-2Me-cAMP-indusoidun ilmentymisen lisääntyminen p-S6-kinaasi

T389 on Raptor immunosaostumissa eturauhasen syöpäsolujen

fosforylaatio S6-kinaasi on T389 pidetään mittana mTORC1 aktivoinnin. Eturauhassyöpäsolut (3 x 10

6 solua /kuoppa 6-kuoppaisilla levyillä) inkuboitiin yli yön RPMI-S-elatusaineessa pestiin kahdesti kylmällä HHBSS ja tilavuus RPMI-S-elatusaineeseen lisättiin kuhunkin kuoppaan. Solut vastaavat kuoppia käsiteltiin kuten edellä on kuvattu. Reaktiot pysäytettiin imemällä väliaine ja lisäämällä tilavuus CHAPS lyysipuskuria, joka sisälsi 40 mM HEPES (pH 7,5), 120 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM natriumpyrofosfaatti, 10 mM β-glyserofosfaatti, 0,5 mM natriumortovanadaatti, 0,3 % CHAPS ja Roche proteaasiestäjäseostabletit (1 tabletti /10 ml). Solut lyysattiin jäillä 20 minuutin ajan. Solulysaatit raaputettiin uuteen Eppendorf-putkiin ja sentrifugoitiin 5 minuutin ajan 800 x g: llä 4 ° C: ssa ja sen jälkeen proteiini sisältö lysaatit määritettiin. Yhtä suuret määrät lysaatin proteiinia (200-250 ug) immunosaostettiin Raptor vasta-aineita (01:50) Santa Cruz Cat no. sc 81537), minkä jälkeen lisättiin 40 ui proteiini A-agaroosi. Seoksia inkuboitiin yön yli kierto 4 ° C: ssa. Raptor immunosaostumat otettiin talteen sentrifugoimalla (2000 rpm /5 min /4 ° C) ja pestään kahdesti kylmällä CHAPS lyysipuskuria. Tilavuus 4 x näytepuskuria lisättiin näytteisiin, joita sitten keitettiin 5 minuuttia, sentrifugoitiin, elektroforeesi (10% akryyliamidi geeli), siirrettiin Hybond-P-membraanille. Kalvot immunoblotattiin vasta-aineita p-S6-kinaasi

T389. Proteiinivyöhykkeet havaittiin ECF ja mitattujen Storm

860 Phosphorimager [47], [48].

mittaus mTORC2 aktivaation fosforylaatio Akt

S473 in Rictor immunosaostumissa syöpäsolujen stimuloidaan 8-CPT-2Me-cAMP

fosforylaatio Akt at S473 by Rictor pidetään mittana mTORC2 toimintaa. Eturauhassyöpäsolut (3 x 10

6 solua /kuoppa 6-kuoppaisilla levyillä) inkuboitiin yli yön RPMI-S-elatusaineessa pestiin kahdesti kylmällä HHBSS, ja tilavuus RPMI-S-elatusaineeseen lisättiin kuhunkin kuoppaan. Olemme tutkineet vaikutus COX-2-estäjät ja mTOR-estäjä Torin1 fosforylaatiota Akt

S473 in Rictor immunopresipi 1-LN soluja olosuhteissa edellä kuvatulla tavalla. Reaktiot lopetettiin imemällä väliaine ja lisäämällä tilavuus CHAPS lyysipuskuria (puskuri B). Solut lyysattiin jäillä 15 minuutin ajan. Yhtä suuret määrät lysaatin proteiinia (200-250 ug) immunosaostettiin anti-Rictor vasta-aineita (01:50, Santa Cruz, CA, ca # 81538) lisäämällä 40 ui proteiini-A-agaroosin liete. Sisältöä inkuboitiin rotaatiossa yön yli 4 ° C: ssa. Rictor immunosaostumat pestiin (1) hajotuspuskuria B, jota oli täydennetty 0,5 M NaCl; (2) lyysipuskuria B; ja (3) Tris • HCI: ää (pH 7,4), johon oli lisätty 1 mM DTT: tä, 1 mM PMSF: ää, ja 1 mM bentsamidiinin sentrifugoimalla 2500 rpm 5 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Jotta Rictor immunosaostaa määrä 4 x näytepuskuria lisättiin, ja näytteitä keitettiin 5 min. Sentrifugoinnin jälkeen supernatantti elektroforeesi polyakryyliamidi- 10% geelit, proteiini siirrettiin PVDF-kalvolle ja immunoblotattu vasta-aineita p-AKT

S473. Proteiinivyöhykkeet näkyviksi ja kvantitoitiin ECF ja Phosphorimaging. Vastaavat membraanit varten Akt kuin latauskontrollina [47], [48].

vaikutukset Epac1 geenien COX-2: n ilmentymisen syöpäsoluissa stimuloidaan 8-CPT-2Me-cAMP

roolin määrittämiseksi Epac1 aktivoinnissa mTORC2 eturauhassyövän soluissa, joita käsiteltiin 8-CPT-2Me-cAMP: n ilmentyminen Epac1 on vaiennettu RNAi [47], [48]. Kemiallinen synteesi dsRNA, joka on homologinen kohteena Epac1 peptidisekvenssi s204VAHLSN209 mRNA-sekvenssin 5′-TGT GGC CCA CCT CTC CAA CTC -3 ’(Swiss Prot Epac1 ensisijainen hakunumero 0953958) suoritettiin Ambion (Austin, TX). dsRNA valmistettiin hehkutus mielessä 5’- UGG CCC ACC UCU CCA ACU CU-3 ’ja antisense 5’GAG UUG GAG AGG UGG GCA ACA -3’ ja hehkutettu dsRNA säikeet puhdistettiin toimesta Ambion kit. Hiljentäminen Epac1 geenin ilmentymisen ennen stimulaatiota 8-CPT-2Me-cAMP suoritettiin transfektoimalla syöpäsolujen 100 nM (48 h) ja Epac1 dsRNA, kuten aiemmin on kuvattu [47], [48]. Ohjaus solut transfektoitiin ekvimolaarisen pitoisuus salattu RNA (Ambion Kataloginumero 4610), kuten edellä. Suuruus Epac1 hiljentäminen transfektoiduissa soluissa, mitattuna Epac1 mRNA ja Epac1 proteiinin tasot vaihtelivat 60-65% [47], [48]. Solut 6-kuoppaisilla levyillä käsiteltiin seuraavasti: (1) lipofektamiinin + puskuri; (2) lipofektamiinin + 8-CPT-2Me-cAMP (100 uM /30 min); (3) Epac1 dsRNA (100 nM /48 h) + 8-CPT-2Me-cAMP (100 uM /30 min); tai (4) salattu dsRNA (100 nM /48 h) + 8-CPT-2Me-cAMP (100 uM /30 min), ja inkuboitiin kuten edellä on kuvattu. Reaktiot lopetettiin imemällä väliaine, tilavuus CHAPS lyysipuskuria B lisättiin, sitten solut hajotettiin jäillä 15 minuutin ajan, siirrettiin Eppendorf-putkiin, sentrifugoitiin (1000 rpm /5 min /4 ° C), ja supernatantit siirrettiin uusiin putkiin ja proteiinipitoisuus määritettiin. Näytteet käsiteltiin kuten edellä on kuvattu.

mittaus vaikutusten hiljentäminen Raptor tai Rictor RNAi hiljentäminen ilmenemistä p-cPLA2: n ja COX-2: n eturauhassyövän soluissa, joita käsiteltiin 8-CPT-2Me-cAMP

transfektio eturauhasen syöpäsolujen kanssa Raptor dsRNA tai Rictor dsRNA suoritettiin, kuten alla on kuvattu. Edelleen selville osallistumista mTORC1 8-CPT-2Me-cAMP aiheuttama ylössäätely S6-kinaasi, me tukkinut ilmentymisen Raptor geenin RNAi, joka häiritsee kokoonpano mTORC1 monimutkainen ja tukahduttaa fosforylaatiota sen loppupään kohde S6-kinaasi . Hehkutettu RNAi on Raptor ostettiin Sigma ja koostuu sense vissa (5′-3 ’) UCU GCA AAG AUU UGU UGA gdt (ID # SAS1-16Hs01-00048387-AS). Solut transfektoitiin 100 nM hehkutettu Raptor dsRNA ja valvonta-solut transfektoitiin lipofektamiinia kuten aiemmin on kuvattu [47], [48]. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia transfektion jälkeen, ohjaus soluja stimuloitiin joko puskurilla, tai 8-CPT-2Me-cAMP (100 uM /30 min /37 ° C). Solut negatiiviseen kontrolli transfektoitiin salattu dsRNA (100 nM /48 h, Ambion) ja stimuloitiin sitten joko puskurin tai 8-CPT-2Me-cAMP. Reaktiot lopetettiin imemällä väliaine ja solut hajotettiin tilavuuteen puskuria B kuten edellä on kuvattu. On yhtä suuret määrät lysaatin proteiinia, jonka tilavuus oli 4 x näytepuskuria lisättiin näytteitä keitettiin 5 min, sentrifugoitiin ja elektroforeesi 10% polyakryyliamidigeelillä. Proteiinit siirrettiin PVDF-membraaneille ja vastaavien immunoblotattu anti-COX-2, ja p-cPLA2-vasta-aineita. Proteiinivyöhykkeet visualisoitiin ja kvantifioidaan ECF ja phosphorimaging kuten edellä on kuvattu. Näytteet käsiteltiin ja tutkittiin edellä kuvatulla tavalla.

Sen varmistamiseksi, että 8-CPT-2Me-cAMP-indusoidun aktivaation mTORC2 on mukana ylösajon cPLA2: n ja COX-2 me vaiennetaan Rictor geeniekspression RNAi, jossa häiritsee kokoonpano mTORC2 kompleksit ja siten tukahduttaa mTORC2 aktivointia. SiRNA koetin ostettiin Ambion (Sirna ID S226002) sense-sekvenssin (5′-GGG UUA GUU UAC AAU CAG C -3 ’) ja antisense (5’GCU GAU UGU AAA CUA ACC -3’). Solut transfektoitiin 100 nM hehkutettu Rictor dsRNA ja valvonta-solut transfektoitiin lipofektamiinia kuten aiemmin on kuvattu [47], [48]. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia transfektion jälkeen, ohjaus soluja stimuloitiin joko puskurin tai 8-CPT-2Me-cAMP (100 uM /30 min /37 ° C). Soluja negatiivisia kontrolleja transfektoitiin salattu dsRNA (100 nM /48 h, Ambion) ja stimuloitiin sitten joko puskurin tai 8-CPT-2Me-cAMP kuten edellä. Reaktiot lopetettiin imemällä väliaine. Solut hajotettiin jäällä 20 min CHAPS lyysipuskuria. Lysaatit siirrettiin Eppendorf-putkiin, sentrifugoitiin 800 rpm: llä 5 minuutin ajan 4 ° C: ssa ja proteiinipitoisuus supernatanteista määritettiin. On yhtä suuret määrät lysaatin proteiinia, jonka tilavuus oli 4 x näytepuskuria lisättiin, ja näytteitä keitettiin 5 min, sentrifugoitiin, ja elektroforeesi 10% polyacrylalmide geeliä. Proteiinit siirrettiin PVDF-membraaneille ja vastaavat kalvot immunoblotattu anti-p-cPLA2: n tai COX-2-vasta-aineita. Proteiinivyöhykkeet näkyviksi ja kvantitoitiin ECF ja Phosphorimaging.

Tulokset

lisääntymisen merkkejä tulehduksellisten markkerien p-cPLA2, COX-2, PGE

2, EP, ja EP4 eturauhassyövässä soluja stimuloitiin 8-CPT-2Me-cAMP

ensin arvioitiin proinflammatoristen ympäristössä kolmessa androgeeni-riippumaton ihmisen eturauhassyövän riviä, nimittäin 1-LN, DU-145, ja PC-3, jonka määrällisesti p-cPLA2

Ser505, COX-2, EP2, EP4, ja PGE

2 näissä soluissa stimuloitiin joko puskurin tai 8-CPT-2Me-cAMP (kuvio 1). Eturauhassyövän hoitoon solujen 8-CPT-2Me-cAMP aiheutti 2-2,5-kertainen ekspression p-cPLA2

Ser505 kontrolleihin verrattuna (kuvio 1). Todennäköinen mekanismi, jolla Epac1 voi aktivoida cPLA2 on kohottamalla solunsisäisen kalsiumin ja aktivoimalla MAPK. Epac1 sääntely Ca

2 + vapautumista Endoplasmakalvosto on aikaisemmin raportoitu [52]. Epac1 lisää solunsisäistä Ca

2+ by PLCγ välittämä hydrolyysi PIP2 tuottavien IP3 joka nostaa solunsisäisiä Ca

2+ [53]. Kaikki kolme eturauhassyövän riviä stimuloitiin puskurilla osoitti vähäistä tai hyvin alhainen COX-2-mRNA: ta ja proteiinia, verrattuna 8-CPT-2Me-cAMP-stimuloidut solut, jotka osoittivat 2-3-kertainen COX-2: n mRNA ja proteiini ( Kuvio 1A ja B).