Krooninen sairaus

tiivistelmä

Syöpäsolut osoittavat huomattavaa muutoksia solujen aineenvaihduntaan, erityisesti niiden ravinteiden alustaan ​​parempana. Olemme kehittäneet useita kokeellisia menetelmiä, jotka nopeasti analysoida metabolinen substraatti vuon syöpäsoluissa: Glykolyysivaiheen ja hapettumista suuren polttoaineen substraattien glukoosi, glutamiini, ja rasvahappoja. Käyttämällä XF Solunulkoisilla Flux analysaattori, näitä menetelmiä toimenpide, reaaliajassa, hapenkulutuksen (OCR) ja solunulkoisen happamoitumista rate (ECAR) elävien solujen mikrolevyn koska ne reagoivat alustoihin ja aineenvaihdunnan häiriön aineita. In proof-of-periaatteen kokeita, analysoitiin alustan vuon ja mitokondrioiden bioenergetiikan kahden ihmisen glioblastoomasolulinjoissa, SF188s ja SF188f, jotka olivat peräisin samasta emosolulinjassa mutta lisääntyvät hitailla ja nopeasti hinnat, vastaavasti. Nämä analyysit johtanut kolmeen mielenkiintoisia havaintoja: 1) molemmat solulinjat hengitettäväksi tehokkaasti merkittäviä endogeenisen substraatin hengitystä; 2) SF188f solut tehtiin merkittävä muutos glykolyyttisistä oksidatiivisen aineenvaihdunnan, yhdessä korkea glutamiini hapettumisen suhteen SF188s soluihin; ja 3) mitokondrio protoni vuotaa sidoksissa hengityksen SF188f solujen kasvoivat merkittävästi verrattuna SF188s soluihin. On uskottavaa, että protoni vuotaa SF188f solut voivat olla rooli mahdollistaa jatkuvan glutamiinia polttoaineenaan anaplerotic TCA cycle flux osittain irrottamalla TCA syklin oksidatiivisen fosforylaation. Yhdessä nämä nopea, herkkä ja suuren läpimenon alustaan ​​flux analyysimenetelmien käyttöön erittäin arvokasta lähestymistapoja kehittää parempaa ymmärtämistä geneettisten ja epigeneettiset reittejä, jotka säätelevät solujen aineenvaihduntaan, ja kehittää hoitoja, jotka kohdistuvat syöpää aineenvaihduntaa.

Citation: Pike Winer LS, Wu M (2014) Rapid analyysi glykolyyttisiä ja oksidatiivinen Alustan Flux syöpäsolujen Microplate. PLoS ONE 9 (10): e109916. doi: 10,1371 /journal.pone.0109916

Editor: Robert W. Sobol, University of Pittsburgh, Yhdysvallat

vastaanotettu: 25 elokuu 2013; Hyväksytty: 1. syyskuuta 2014; Julkaistu: 31 lokakuu 2014

Copyright: © 2014 Pike Winer, Wu. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ toteutettiin ja rahoittama Seahorse Bioscience. LSPW on työntekijä ja MW oli työntekijä aikaan työn yhtiössä. Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Lisa S. Pike Winer on työntekijä Seahorse Bioscience, North Billerica, MA, USA. Min Wu oli työntekijä Seahorse Bioscience aikaan tämän työn, North Billerica, MA, USA. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

Syöpäsolut merkittävästi ohjelmoida niiden aineenvaihdunta ajaa kasvaimen kasvua ja selviytymistä. Otto Warburg ensin, että aerobisissa olosuhteissa, kasvaimia oli korkeat Glykolyysivaiheen verrattuna ympäröivään kudokseen, ilmiö tunnetaan nimellä Warburg vaikutus, tai aerobinen Glykolyysivaiheen [1]. Hän olettaisi, että lisääntynyt Glykolyysivaiheen ja heikentynyt mitokondrioita hengitys on tärkein syy syövän [2]. Viime aikoina suuri määrä todisteita osoittaa, että syöpäsolut metabolisesti uudelleenohjelmointi, mikä johtaa laajaan käyttöön ja riippuvuutta glukoosia tai glutamiinin niiden kasvua ja selviytymistä [3] – [9]. Tämä metabolinen uudelleenohjelmointi on osoitettu olevan tulosta onkogeenin aktivaation ja /tai menetystä tuumorisuppressorin toimintoja, sekä vasteena ympäristön ärsykkeille, jotka kaikki säädellä ravinteiden substraatin otto ja metabolia [10] – [14]. Riippuen yhdistelmien vaikutusta ja tietyn solun yhteydessä syöpäsolut voivat ilmetä erilaisia ​​aineenvaihdunnan fenotyyppien [15], mikä voi vaikuttaa joko hoidon valinta tai hoitovaste.

Koska useat geneettisesti ja metabolisesti monipuolinen syöpäsoluja, nopea, informatiivinen, suhteellisen helppo suorittaa ja korkeamman suoritustehon alustan flux analysointi voi helpottaa ymmärtämään paremmin geneettisiä ja epigeneettiset polkuja, jotka säätelevät syövän solujen aineenvaihduntaa, onko olemassa rajallinen määrä metabolisen fenotyyppien keskuudessa kaikentyyppisiä syöpäsoluja, riippumatta kudosalkuperän, ja löytää aineita, jotka kohdistuvat tiettyihin metaboliatiet syövän hoitoon.

solut tuottavat ATP kautta kaksi suurta energiaa tuottavien reittejä: Glykolyysivaiheen ja oksidatiivisen fosforylaation. Glykolyyttisellä polku muuntaa glukoosia pyruvaattia. Yksi kohtalo pyruvaatin on vähennystä laktaatin sytosoliin hapettomassa riippumaton biokemiallinen reaktio johtaa ATP tuotannon ja netto protoni tuotantoa. Protonit pumpataan ulos solusta eri mekanismeja, säilyttää solunsisäisen pH: n [16] ja ulosvirtausta protonit ekstrasellulaariseen tilaan tai ympäröivän väliaineen soluihin aiheuttaa ekstrasellulaarisen happamoitumista [17] – [21]. Suuret ravinnesubstraatit glukoosia, glutamiinia, ja rasvahapot voidaan täysin hapettaa osaksi CO

2 ja H

2O kautta trikarboksyylihapposyklin (TCA-sykli), joka vaatii elektroninsiirtoketju (ETC) mitokondrioissa käyttäen happi terminaali elektronin vastaanottajan, ja joka on liitetty ATP-tuotantoa oksidatiivinen fosforylaatio. CO

2 tuotettu voidaan muuntaa bikarbonaatti- ja proton katalysoidaan karboliöljyistä anhydrase [16], toinen lähde protonien aiheuttaa väliaineen happamoitumista. Monissa ei-transformoituja erilaistuneita soluja, kuten neuroneja, oksidatiivinen fosforylaatio tuottaa suurimman solun ATP. Sen sijaan, syöpäsolut ovat hyvin riippuvaisia ​​Glykolyysivaiheen lisäksi oksidatiivisen fosforylaation niiden ATP tuotantoon [22]. Sekä ruokkii ATP-tuottamista, glukoosin ja glutamiinin ovat keskeisiä hiilen lähteitä, jotka tarjoavat anabolisia esiasteita, joista jotkin (esim, sitraatti ja oksaloasetaatti) on tuotettu katkaistu TCA-syklin biosynteesiä lipidien, nukleiinihappojen ja aminohappoja.

Koska elävät solut eivät säilytä ATP, ne tuottavat sitä jatkuvasti ja kysyntään, ja siksi jatkuvasti kuluttavat happea ja polttoainetta alustoille. Siten kysyntä ATP soluissa (ts ADP saatavuus) säätelee hapenkulutusta. Elektronit (energia) varastoidaan ravinnesubstraatit uutetaan kautta mitokondrioiden TCA sykli reaktiot ja suorittaa vähentämällä elektroni harjoittajien NADH ja FADH

2 olevan ETC Koska elektronit virtaavat alas ETC vapautuva energia käytetään pumppaamaan protoneja matriisista tulee intramembrane tilaan, joka muodostaa sähkökemiallisen protonigradienttia poikki mitokondrion sisemmän kalvon. Lopussa ETC, elektronit siirtyvät molekulaarista happea, mikä vähentää sen veden kautta päätelaitteen sytokromi-c-oksidaasi. Protonien palaa mitokondrion matriisin kautta ATP-syntaasi monimutkainen, energia varastoidaan protonigradienttia sitten ajaa fosforylaation ADP ATP kytkimen hengitystä (elektronien kuljetusta) ja ATP-tuottamista. Oksidatiivinen fosforylaatio, on kuitenkin epätäydellisesti kytketty hengitystä. Protonit voivat myös palata matriisin kautta protonin kanavia kuten irtoamisen proteiineja (UCP), jotka sijaitsevat sisäkalvon ohittaen ATP nopaliinisyntaasin ja vaimentamaan energiaa kaltevuus tuottamatta ATP prosessi tunnetaan protoni vuotaa. Osittain vähensi happiradikaalien (ROS), kuten Superoksidianionin voidaan valmistaa eri paikoissa ETC olosuhteista riippuen [23]; Protonin vuoto on pidetty tärkeänä solumekanismin suojella soluja hapettumista alentamalla ROS tuottama ETC [24].

Koska yhteys hapenkulutusta ja solunulkoisen happamaksi ravinteiden alustaan ​​aineenvaihduntaa, lisääntynyt hapenkulutus on mitta substraatin hapetusta, kun substraatti lisättiin soluihin. Samoin kasvu määrä solunulkoisen happamoitumisen kun glukoosi Lisäksi on mitta glykolyyttisten muutostilassa.

Various perinteisiä kokeellisia menetelmiä, jotka analysoivat alustan aineenvaihduntaan ovat vaikuttaneet nykyiseen ymmärrystä solun aineenvaihduntaan. Näitä ovat mitataan kertymistä radioleimattujen lopputuotteiden kuten H

2O ja CO

2 metaboloituu substraateista kuten

3 H merkitty glukoosia ja

14C-merkittyä rasvahappoja. Muut aiemmin käytetyt (ja uudempiin) menetelmät määrittää aineenvaihduntatuotteiden vakaa isotooppi merkkiaineita yhdistettynä massaspektrometrialla ja NMR-analyysi, jotka molemmat on saatu yksityiskohtaisia ​​tietoja alustalle aineenvaihduntaan. Nämä tekniikat voivat kuitenkin silti olla joko työvoimavaltaista ja hankalia, ja /tai suhteellisen saavuttamattomissa monelle laboratoriolle.

Tämä tutkimus oli kaksi päätavoitetta. Ensimmäinen oli soveltaa edellä mainittujen periaatteiden perustaa joukon nopeita ja helposti menetelmiä analysoida glykolyyttisiä flux ja oksidatiivisen alustan vuon syöpäsoluja. Tämä saavutettiin mittaamalla solujen hapenkulutuksen ja solunulkoisen happamoitumisen käyttäen XF Solunulkoisilla Flux analysaattori [22]. Toinen oli suorittamaan proof-of-periaatteen kokeita läpi soveltaa näitä alustan flux menetelmät sekä analysoimalla mitokondrioiden bioenergetiikan ihmisen glioblastoomasoluissa SF188s ja SF188f kuulustella niiden aineenvaihdunnan verkoissa.

Materiaalit ja menetelmät

Reagenssit

karbonyylidi-syanidia 4- (trifluorimetoksi) fenyy- (FCCP), myxothiazol, antimysiini A, rotenoni, 2-deoksiglukoosi, oksamaattia, aminooxyacetate, glukoosia, natriumpyruvaattia ja natriumpalmitaatti saatiin Sigma (St. Louis , MO, USA). L-glutamiini saatiin Invitrogen (Carlsbad, CA). Oligomysiini saatiin EMD (San Diego, CA, USA). Naudan seerumin albumiini, jae V (rasvahappo ultra-vapaa) saatiin Roche Diagnostics (Indianapolis, IN, USA). Kaikki yhdisteet ja keskisuurten mukaisesti valmistettiin valmistajan ohjeiden ellei toisin mainita.

Solulinjat ja soluviljelmä

Ihmisen glioblastooma SF188-solut hankittiin University of California at San Francisco Brain Kudospankki . Nämä solut alun perin pidettiin, suosittelema alullepanijan, käytettäessä MEM, joka sisälsi 5,5 mM glukoosia ja 2 mM L-glutamiinia. Ne on sovitettu vaihe-viisasta DMEM-alustassa, joka sisälsi 25 mM glukoosia ja 6 mM L-glutamiinia mallina järjestelmä tutkimuksen glutamiinin aineenvaihdunnan raportoitu [6]. Kontrollina, vanhempien solut myös sovitettu rinnakkain DMEM-alustassa, joka sisälsi 5,5 mM glukoosia ja 2 mM L-glutamiinia. Entinen hankki paljon nopeampaa kasvua 4 viikon kulttuuri keskipitkällä ja nimettiin SF188f (nopea). Jälkimmäinen on kuitenkin säilytettävä samanlainen kasvuvauhti kuin vanhempien soluja ylläpidetään MEM, ja nimettiin SF188s (hidas). Säilyttää erilliset kasvun fenotyyppi, SF188s ja SF188f soluja aina viljeltiin DMEM: ssä, joka sisälsi 5,5 mM glukoosia ja 2 mM L-glutamiinia ja 25 mM glukoosia ja 6 mM L-glutamiinia, vastaavasti 37 ° C: ssa Forma-inkubaattorissa, jossa oli 10% CO:

2 ja 100% kosteudessa -80% konfluenssiin 175 cm

2 T-pulloissa (Corning). Ihmisen eturauhassyöpä PC-3 ja kohdunkaulan syöpä HeLa-solut hankittiin American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA), ja pidettiin RMPI1640. Kaikki soluviljelyalustassa täydennetty 10% naudan sikiön albumiinia (FBS, Hyclone, Logan, UT, USA).

XF määritysalustaan ​​

emäsväliaineessa käytettiin määrityksissä on kuvattu tässä tutkimuksessa suoraan tai täydennetty alustoissa ja kofaktoreita määritelty kunkin tietyn määritykset (katso alla) ja kutakin koetta varten. Emäs määritys alusta valmistettiin seuraavasti. Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine (DMEM) jauhe (Sigma, luettelonumero D5030) oli lähtöaineena. Se ei sisällä glukoosia, L-glutamiinia, natriumpyruvaattia, natriumbikarbonaattia tai fenolipunaista, ja sillä on alhainen fosfaatin (katso materiaalit S1 File S1for yksityiskohtia valmisteilla). Lisäksi modifioitua Krebs-Henseleit- bikarbonaattipuskuria (KHB), joka sisältää ei bikarbonaattia ja alemman fosfaattia voidaan käyttää myös (Materiaalit S2 File S1) vaihtoehtona määritys väline rasvahappojen hapettumista. Käyttö aminohappo-puskurissa, toisin kuin emäsväliaineessa muita määrityksiä on mahdollista, mutta voi aiheuttaa erilaisia ​​kokeellisia tuloksia, jotka voivat edellyttää erilaisia ​​tietoja tulkintoja. Kaikki määritykset tässä kuvattua suoritettiin ainoastaan ​​pohjan alustassa osoitetun täydentämistä, lukuun ottamatta rasvahappojen hapettumista, joka suoritettiin sekä emäsväliaineessa ja KHB, jolloin saatiin samanlaisia ​​tuloksia.

valmistaminen palmitaatti-BSA-konjugaatti

natriumpalmitaatti liuotettiin lämmittämällä se 68 ° C: ssa 150 mM natriumkloridiliuosta. Sen jälkeen BSA: han liuoksessa moolisuhteessa 06:01. Täydellinen protokolla on kuvattu materiaali S3 File S1.

mittaus hapenkulutuksen ja solunulkoisen happamoitumisen hinnat

OCR ja ECAR mittaukset suoritettiin käyttäen XF24 tai XF96 Solunulkoisilla Flux analysaattori (Seahorse Bioscience , North Billerica, MA) kuvatulla [22]. Lyhyesti, solut maljattiin XF24 (V7) tai XF96 (V3) polystyreeni soluviljelylevyille (Seahorse Bioscience, North Billerica). SF188s solut ympättiin 30000 /kuoppa (XF24 levy) tai 20000 /kaivo (XF96 levy) ja SF188f solujen 20000 /kuoppa (XF24 levy) tai 15000 /kaivo (XF96 levy), tässä järjestyksessä. PC-3 ja HeLa-solut maljattiin 25000 ja 30000 solua per kuoppa, vastaavasti, XF24 soluviljelylevyille. Soluja inkuboitiin 24-28 tunnin ajan kostutetussa 37 ° C: ssa inkubaattorissa, jossa 10% CO

2 (DMEM-alustassa), tai 5% CO

2 (RMPI1640 ja MEM), vastaavasti. Koska kaksi solulinjaa lisääntyvät eri nopeuksilla aikana 24-28 tunnin inkubointijakson jälkeen SF188s ja SF188f soluja käsiteltiin trypsiinillä ja laskettiin sitten määrittää solujen määrä kussakin kuopassa jälkeen määrityksessä. Nämä solumäärät käytettiin normalisoimaan joko OCR tai ECAR. Niiden elinkykyisyyksiä, määritettynä sen jälkeen, kun määritykset olivat lähes mahdoton riippumatta läsnäolo tai puuttuminen eksogeenisen substraattien tai metabolisen inhibiittorit määrityksessä väliaineessa. Ennen suorittaa määrityksen, kasvualustaa kuoppiin XF solujen levy vaihdettiin sopivan määrityksen väliaine saavuttaa vähintään 1:1000 laimennus kasvualustaa. 600 ui (XF24) tai 150 ui (XF96) määrityksen väliainetta lisättiin soluihin varten XF määrityksessä. Vaikka anturi patruunat kalibroitiin, solu maljoja inkuboitiin 37 ° C /ei-CO

2 inkubaattorissa 60 minuuttia ennen alkua määrityksen. Kaikki kokeet suoritettiin 37 ° C: ssa. Kukin mittaus sykli koostui sekoittamalla 3 minuuttia ja tiedonkeruu ajan 3 minuutissa (13 datapistettä) varten XF24, ja 2 min ja 4 min varten XF96. OCR ja ECAR datapisteitä viittaavat keskikurssiin mittauksen aikana jaksoissa. Kaikki yhdisteet valmistettiin sopivina pitoisuuksina halutun määrityksessä väliaineessa ja pH säädettiin arvoon 7,4. Tilavuus 75 ui varten XF24 (25 ui varten XF96) yhdistettä lisättiin kuhunkin ruiskutusporttiin. Tyypillisessä kokeessa, 3 perustason mittaukset tehtiin ennen lisätty mitään yhdistettä, ja 3 vaste mittaukset tehtiin lisäämisen jälkeen kunkin yhdisteen. OCR ja ECAR ilmoitettiin absoluuttinen hinnat (pmol /min OCR ja MPH /min ECAR) tai normalisoidaan solujen määrää tai ilmaistuna prosentteina perustason hapenkulutus. Tässä tutkimuksessa lähtötason OCR tai ECAR (tekninen termi) viittaa lähtö- hinnat ennen lisäämällä ainetta, jota voidaan käyttää vertailuja näiden hinnat lisäyksen jälkeen. Sen sijaan, pohjapinta OCR tai ECAR (biologinen termi) viittaa OCR tai ECAR, joka esiintyy soluissa, levossa, jotta voidaan säilyttää perus solujen toimintaa. Ellei toisin mainita, kolmas mittaus lähtöarvo tai lisäyksen jälkeen kunkin alustan tai yhdistettä käytetään tuottamaan absoluuttista OCR tai ECAR arvoja. Kuten hyvin, prosentteina perustason OCR arvoista laskettiin OCR kolmannessa mittauksen jälkeen agentti injektion jaettuna OCR välittömästi ennen injektiota. Kukin tieto määritettiin minimaalisesti kolmena kappaleena.

XF Alustan Flux määritysolosuhteissa

glykolyyttisiä vuon ja glykolyyttiset kapasiteettia.

määritysravintoliuokseen koostuu emäsväliaineessa täydennetty 2 mM L -glutamine. Glutamiini on tarpeen, jotta saavutettaisiin suurimmat Glykolyysivaiheen korko joillekin, mutta ei kaikissa solulinjoissa. Samaan väliaineeseen määrittämiseen käytettiin glykolyyttisten kapasiteettia. Glukoosin pitoisuus, lisättiin aloittaa glykolyysin ja mitata glykolyyttiset kapasiteetti oli 10 mM, suurempi kuin saturaatiopiste molemmissa olosuhteissa.

glukoosi hapettumista.

määrityksen väliaine oli emäs alustaa ilman mitään eksogeenisiä polttoaineen alustan täydentämistä. Glukoosin pitoisuus, lisättiin aloittaa glukoosin hapettumisen oli 10 mM, joka määritettiin alustavissa kokeissa olevan yli kylläisyyttä.

glutamiinia hapettumista.

määrityksen väliaine oli emäs väliaine ilman eksogeenisiä polttoainetta substraatti. Pitoisuus glutamiini lisättiin soluihin aloittaa glutamiinia hapetus 4 mM, joka oli myös ennalta määritetty olemaan yläpuolella kylläisyyttä.

rasvahappojen hapettumista.

määrityksen väliaine oli emäsväliaineessa (tai KHB), jota oli täydennetty 5,5 mM glukoosia ja 50 uM karnitiinin (tarvitaan kuljettamaan pitkäketjuista rasvahappoa mitokondrioita). Rasvahapot testattu sisältävät pitkäketjuista rasvahappoa palmitaatti, keskipitkän ketjun rasvahappojen oktanoaatti, ja lyhytketjuisten rasvahappojen butyraattia. Ne titrattiin pitoisuuksia stimuloimaan maksimaalisen OCR vastausta. Työ pitoisuus palmitaatti konjugoituna BSA oli 150 uM, ja oktanoaatti 1 mM, mikä oli myös edellä kylläisyyttä.

On tärkeää, että edellä mainitut määritysolosuhteissa ehdottomasti noudatetaan. Mikä tahansa vaihtelu määritysalustaan ​​koostumus voi johtaa erilaisiin tulkintoihin ja oivalluksia matkapuhelinverkon metabolisen verkkoon. Kyllästää substraattikonsentraatioita ja optimaalinen yhdisteen pitoisuudet määritettiin suorittamalla titrauskokeita kuvatulla Materiaalit S4 ja S5 File S1. Vaikutus määritysolosuhteissa tulkinnasta koetulosten kuvataan muualla.

Solulaskennat

SF188s ja SF188f solut irrotettiin trypsiini-EDTA ja korjattu välittömästi seurausta XF määritystä. Solujen lukumäärä kussakin kuopassa määritettiin käyttäen ViCell automatisoitu trypaanisinisen laskuri (Beckman-Coulter, Fullerton, CA), ja sitä käytettiin normalisoimaan OCR ja ECAR kuten kuvassa legendoja.

Tilastollinen analyysi

tiedot esitettiin keskiarvo ± keskihajonta, joissa on vähintään kolme toistoa käytetään kunkin datapisteen. Ellei toisin mainita, pariksi Opiskelijan

t

koe suoritettiin kunkin koeryhmän arvioimaan tilastollisen merkittävyyden vastaan ​​verrokkeihin nähden.

Tulokset

Glykolyysi ja glykolyyttiset kapasiteetti

Olemme aiemmin osoittaneet, että glykolyysi osuus -80% kaikista ECAR useissa syöpäsolujen määritettiin kahdella tavalla: a) poistamalla glukoosin määrityksen keski- ja b) lisätään glykolyyttisiä reitin inhibiittorit, kuten heksokinaasi n estäjä 2- DG ja laktaattidehydrogenaasin (LDH) estäjä oksamaattia [22]. Loput 20% ECAR voidaan katsoa johtuvan muiden metabolisia prosesseja, kuten TCA syklin CO

2 kehitystä. Mittaamiseksi Glykolyysivaiheen käyttäen ECAR tarkemmin ja helpommin, otimme seuraavaa lähestymistapaa. Glukoosi lisättiin soluihin, joita inkuboitiin glukoosi-väliaineessa, jota oli täydennetty glutamiinilla (katso materiaalit ja menetelmät). ECAR lisäys lisäyksen jälkeen glukoosin vahvistetaan Glykolyysivaiheen korko. Myöhempi lisäämällä glykolyysin estäjä poistaa glukoosin aiheuttaman ECAR lisäys. Jokainen happamoituminen johtuu muista metabolisia prosesseja, kuten TCA sykli CO

2 vapautuminen (mistä tahansa alustalle, mutta glukoosi) havaitaan ECAR ennen glukoosiksi lisäksi. OCR glukoosille, seurataan samanaikaisesti ECAR, toimii indikaattorina onko glukoosin myös hajoaa kautta mitokondrion hengitystä (kuvio 1A).

. Kaaviokuva glykolyyttisen reitin. NADH tuotettu sytosoliin kuten glukoosi muunnetaan pyruvaattia ja regeneroidaan LDH sytosoliin. B. Kinetic ECAR vaste SF188s solujen glukoosi (10 mM) ja 2-PO (100 mM) tai oksamaattia (100 mM), vastaavasti. SF188s solut maljattiin 30.000 solua /kuoppa XF24 V7 soluviljelmälevyihin 24-28 tuntia ennen määrityksiä. Määritys väliaine oli substraatti-vapaa emäs väliaineessa (kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät), jota oli täydennetty 2 mM glutamiinilla. ECAR arvo ei normalisoitu. Edustava koe joukosta vähintään kolme on esitetty tässä. Kukin tietopiste edustaa keskiarvoa ± SD, n = 4. C. ECAR vaste HeLa-solujen glukoosin (10 mM), 2-DG (100 mM) ja antimysiini (1 uM). Aseta: OCR vaste samassa kokeet osoittavat Crabtree vaikutusta ja että glukoosia ei kasvanut OCR. HeLa-solut maljattiin 30000 /kuoppa XF24 soluviljelylevyissä 24-28 tuntia ennen määrityksiä. ECAR tai OCR-arvot eivät olleet normalisoitu. Määritys väliaine oli substraatti-vapaa emäs väliaineessa (kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät), jota oli täydennetty 2 mM glutamiinilla. Edustava koe joukosta vähintään kolme on esitetty tässä. Kukin tietopiste edustaa keskiarvo ± SD, n = 5.

Suoritimme kokeen käyttämällä SF188s ja HeLa-solut. Kuten kuviossa 1B on esitetty, glukoosin lisäksi SF188s solut laukaistaan ​​välittömästi ECAR kasvua, 38 ± 4 mph /min (ECAR mittaus 6 alle mittaus 3), joka on sittemmin poistettiin lisäämällä glykolyysin inhibiittorit, joko 2-DG tai -oksamaattia. Tämä koe osoitti, että eksogeenisesti lisätyt glukoosi jakaantuivat laktaattia (koska LDH inhibitio -oksamaattia vähentää ECAR samalla tavalla 2-DG), mikä aiheuttaa ECAR kasvua ja siten validointi meidän koesuunnittelun. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin HeLa-soluissa (kuvio. 1 C), jotka olivat yhdenmukaisia ​​aiempien tutkimuksen [22], sekä useissa viimeaikaisissa käy ilmi, että ECAR vaste yhtäläisyyksiä että laktaatin tuotanto [25] – [27]. Ennen lisäämällä glukoosia soluihin sekä lisäyksen jälkeen 2-PO tai oksamaattia, meillä on jälleen havaittu pieni ECAR, 6 ± 1 mph /min ja 10 ± 2 mph /min (at mittaus 3), vastaavasti SF188s ja HeLa-soluja (kuvio 1 B ja C). Kutsumme tätä pientä mutta mitattavissa ECAR ei-glykolyyttisiä happamoitumista. OCR vastaus osoitti, että injektion glukoosin ei ainoastaan ​​ole laukaista kasvua, mutta itse asiassa aiheutti lievää laskua OCR (kuvio 1 C), joka on samanlainen kuin Crabtree Effect, ensimmäinen havaittu kasvainsoluissa Crabtree vuonna 1920 [ ,,,0],28].

kaksi merkittävin protoni lähteistä, jotka voivat edistää muiden kuin glykolyyttisissä happamoituminen ovat TCA sykli ja jakautuminen solunsisäisen glykogeenin eli glykogenolyysiä [20]. Voit selvittää panos TCA cycle CO

2 evoluutio, käytimme monimutkainen III estäjä Antimysiini- pysäyttää elektroni virtausta ja siten TCA cycle vuon HeLa-soluissa. Glukoosi lisättiin ensin aloittaa glykolyysin, jota seurasi 2-DG poistamaan sen, jättäen jälkeensä ei-glykolyyttisten ECAR. Lopullinen lisäys antimysiinin esti TCA sykli aiheuttamasta CO

2. Vaikka jäännös jäi, 4 ± 1,4 mph /min, Antimysiini- eliminoidaan noin puolet ei-glykolyyttisissä ECAR (kuvio 1 C), mikä vahvistaa osuus TCA cycle CO

2-johdetun protoni ei-glykolyyttisiä happamoitumista. Testasimme onko antimysiini kestä- ECAR johtui glykogenolyysiä käyttämällä CP91149, estäjä glykogeenifosforylaasin (ensimmäinen entsyymi glykogeenin hajoaminen), mutta eivät havainneet mitään merkittävää vaikutusta CP91149 ei-glykolyyttisiä happamoitumisen (tuloksia ei ole esitetty) , mikä johtaa meidät päättelemään, että jäljellä ei-glykolyyttisissä ECAR jouduttiin osuus muilla metabolisia prosesseja, kuten dekarboksylaatioreaktioiden katalysoivat glukoosi-6-fosfaattidehydrogenaasin ja /tai pyruvaattidehydrogenaasia. Yhdessä nämä tulokset jälleen vahvistivat, että Glykolyysivaiheen osuus useimpien ECAR havaittiin syöpäsolujen ja totesi, että TCA-johdettu CO

2 on osallistuu pääasiassa ei-glykolyyttisten happamoitumista.

glykolyyttisissä flux määritetty

in vitro

ympäristön happipitoisuus heijastaa pohjapinta Glykolyysivaiheen nopeudella. Kun solut kokevat mitokondrion ATP tuotannon eston vuoksi oksidatiivisen fosforylaation, joko alhainen happipitoisuus jännitteitä tai oligomysiini, ne laajentaa niiden glykolyyttisiä vuon ja tehdä enemmän ATP glykolyyttisistä väyliä ylläpitää solujen ATP homeostaasin [22]. Kutsumme tätä kasvoi glykolyyttisissä vuon vastauksena puute mitokondrioiden ATP tuotannossa glykolyyttisiä kapasiteettia. Kokeellisesti määrittelemme glykolyyttisissä ominaisuudessa glukoosin aiheuttaman ECAR mitokondrioiden ATP estäjä oligomysiini.

määrittää sekä glykolyyttisiä vuon ja glykolyyttisen kapasiteetti saman solupopulaation yhdessä kokeessa, mittasimme ECAR kun peräkkäin suonensisäisten glukoosi, oligomysiini, ja 2-PO. Kuten kuviossa 2A on esitetty, lisäämällä glukoosin HeLa-solut, kuten odotettua, laukaisi glykolyyttisen vuon 19 ± 0,9 mph /min (EACR mitattaessa 6 alle, että mittaus 3) HeLa-soluissa. Lisäämällä myöhemmin oligomysiini aiheutti edelleen lisäystä ECAR 44 ± 3,8 mph /min (ECAR mitattaessa 9 alle, että mittaus 3), mikä osoittaa, kohonnut glukoosi vuon kohti laktaatti ja paljastaen glykolyyttisen kapasiteettia HeLa-soluissa. Lopullinen lisäys Glykolyysivaiheen inhibiittoripastojen 2-DG poisti koko Glykolyysivaiheen (kuvio 2A). Lasketut glykolyyttisiä vuon ja glykolyyttiset kapasiteettia glykolyysijärjestelmän kokeesta on esitetty kuviossa 2B.

. Kinetic ECAR vaste HeLa-solujen glukoosin (10 mM), oligomysiini (2 uM), ja 2-PO (100 mM). Aseta näkyy OCR vastetta glukoosille ja oligomysiini. HeLa-solut maljattiin 30000 /kuoppa XF24 V7 soluviljelmälevyihin 24-28 tuntia ennen määrityksiä. Määritys väliaine oli substraatti-vapaa emäs, jota oli täydennetty 2 mM glutamiinilla. ECAR tai OCR-arvot eivät olleet normalisoitu. Edustava koe ulos 5 Tässä näkyy. Kukin tietopiste edustaa keskiarvo ± SD, n = 4. B. Laskettu glykolyyttisissä flux, glykolyyttisiä kapasiteettia. Glykolyyttisten vuo on erotus Sähköautot mittauksen 6 ja mittaus 3. Samoin glykolyyttisiä kapasiteetti kuvaa eroa ECAR mittauksen 9, ja että mittauksen 3. * p 0,05.

kaksi kokeellista edellytysten on täytyttävä edellä kokeessa. Ensinnäkin oligomysiini pitoisuuden tulisi maksimaalisesti estää hengitystä. Tämä saavutettiin valitsemalla oligomysiini pitoisuus, joka johti maksimaalisen OCR eston titraus kokeessa. Esimerkiksi 0,5 uM oligomysiini havaittiin olevan riittävä maksimaalisen inhibition OCR HeLa-soluissa (tietoja ei ole esitetty). Toiseksi on tärkeää varmistaa, että tarjonta eksogeenisen glukoosi kyllästää, jolloin glykolyyttisen koneen olla rajoittava tekijä. Saturoituvaa glukoosin pitoisuus saavuttaa maksimaalisen ECAR vaste määritettiin glukoosipitoisuus titraus kokeessa, jossa oli kasvavia määriä glukoosia lisättiin soluihin, minkä jälkeen lisättiin valvonta- tai oligomysiini pitoisuutena maksimaalisesti estää hengitystä. HeLa-soluissa, esimerkiksi, olemme huomanneet, että ECAR kasvanut jatkuvasti, kunnes glukoosipitoisuus saavutti 5 mM, minkä jälkeen ei ollut enää ECAR lisäys (kuvio S1). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin kymmenkunta transformoitu ja ei-transformoitujen solulinjojen (tietoja ei esitetty). Valitsimme suuremmat kyllästää konsentraatio 10 mM kuin vakio pitoisuus määrittää sekä glykolyyttisiä vuon ja glykolyyttiset kapasiteettia.

glukoosi hapetus

glukoosi johdettuja pyruvaatti antaa myös mitokondriot, jossa se muunnetaan asetyyli CoA pyruvaattidehydrogenaasin ja siirtyy TCA syklin kautta sitraattisyntaasin (tai oksaaliasetaatti kautta pyruvaattikarboksylaasi [29]. asetyyli ryhmä on mahdollisesti hapetetaan CO

2 ja H

2O (kuvio 3A) . happea vievä prosessi glukoosin hapettumisen ensin pyruvaatin ja sitten CO

2 ja H

2O kutsutaan tässä glukoosin hapettumisen.

. Kaaviokuva biokemiallinen reitti glukoosin hapettumisen . NADH tuotettu sytosoliin kuten glukoosi muunnetaan pyruvaatti tuodaan mitokondriot kautta malaatti-aspartaatti sukkula regeneroituja kautta ETC ylläpitää jatkuvaa glukoosin hapettumisen. B. kineettinen OCR vasteen PC-3-solujen glukoosille (10 mM ); C. OCR vastetta glukoosille (10 mM), oligomysiini (1 uM) ja FCCP (0,3 uM). PC-3-solut maljattiin 25000 /kuoppa XF24 V7 viljelylevyillä. Määritys väliaine oli substraatti-vapaa emäs väliaineessa. OCR-arvot eivät ole palautuneet ennalleen. Edustava koe kolmesta esitetään tässä. Kukin tietopiste edustaa keskiarvo ± SD, n = 4.

Kokeellisesti käytimme glukoosin aiheuttaman OCR mittaamaan glukoosin hapettumisen. Jotta voidaan vahvistaa glukoosin hapettumisen määrityksen, valitsimme PC-3-soluja, jotka aktiivisesti hapettavat glukoosia. Määrittämään glukoosin hapettumista, 10 mM glukoosia, lisättiin soluihin määrityksessä väliaineessa, joka ei sisällä glukoosia tai glutamiinin (katso Materiaalit ja menetelmät). Kuten kuviossa 3B on esitetty, lisäys glukoosin PC-3-solujen aiheuttama välitöntä lisäämistä OCR, 45 ± 11 pmol /min (OCR mitattaessa 6 alle, että mittaus 3), mikä osoittaa glukoosin virtaus osaksi TCA aikana, ja lopulta , ETC täydellistä hapettumista. Tämä kokeellinen suunnittelu edellyttäen kvantitatiivinen mittaus glukoosin hapettumisen tässä koeolosuhteissa. Eräässä muunnelmassa suunnittelu, PC-3-solut altistettiin glukoosille, oligomysiini, ja FCCP peräkkäin, 3 mittaukset ennen kunkin yhdisteen lisäksi, ja jokaisen yhdisteen lisäksi. FCCP erotetaan toisistaan ​​ammatillisiin hengitys päässä oksidatiivinen fosforylaatio, joka mahdollistaa hapetus tahansa hapettuvan substraatin läsnä määritysravintoliuokseen tapahtua. Kuten kuviossa 3C on esitetty, FCCP stimuloi piikki OCR seuraavissa glukoosin lisäksi, mutta ei kontrolli, joka edelleen varmistaa, että biokemiallisia reittejä glukoosin hapetus olivat aktiivisia PC-3-soluja. OCR vastaus FCCP vahvistaa ja tarjoaa puolikvantitatiivinen arviointi solujen kykyä hapettaa glukoosia. Tämän kokeen suunnittelusta, soluja esi-inkuboitiin alustan-vapaan emäksen väliaineessa 60 min ennen määritystä, niin on olemassa mahdollisuus, että ne on voitu korostaa, ja muuttaa vaste glukoosille lisäksi.