Krooninen sairaus

tiivistelmä

histonideasetylaasi estäjät (HDACi) edustavat lupaavaa luokkaa epigenetic aineiden kanssa syövän vastaisia ​​ominaisuuksia. Täällä me raportoimme että (S) -2, uusi hydroksamaatti-pohjainen HDACi, osoitettu aikaisemmin tehoavan akuutti myelooinen leukemia soluja, oli myös voimakas apoptoosin indusoija /erilaistumista ihmisen eturauhasen LNCaP ja PC3 syöpäsoluja. LNCaP-soluja (S) -2 kykeni laukaisemaan H3 /H4 histoni asetylaatio, H2AX fosforylaatio markkerina DNA-vaurioita ja tuottavat G

0 /G

1 solusyklin pysähtymiseen. Johdonmukaisesti, (S) -2 johti lisääntynyt ilmentyminen sekä proteiinin ja mRNA p21 tasot LNCaP, mutta toisin SAHA, ei normaalissa ei-tuumorigeenisiä eturauhasen PNT1A soluja. Mekanistinen tutkimukset osoittivat, että (S) -2-indusoitua apoptoosia in LNCaP kehitetty katkaisun pro-kaspaasi 9 ja 3 ja poly (ADP-riboosi) polymeraasin toi- mukana annoksesta riippuvainen mitokondrion kalvon potentiaalia. Todellakin, lisäksi yleiseurooppalaisen kaspaasiestäjä Z-VAD-fmk vähentää huomattavasti huumeiden välittämän apoptoosin, kun antioksidantti

N

asetyyli-kysteiini oli lähes tehoton. Tärkeää on, ennakkotiedot kanssa nude-hiirissä ksenosiirrettyjä kanssa LNCaP osoittivat, että (S) -2 kysytään lasku kasvaimen tilavuuden ja kasvu H2AX fosforylaation sisällä syöpäsoluja. Lisäksi erittäin metastaattinen eturauhassyöpä PC3-solut olivat myös herkkiä (S) -2, että: i) aiheuttama kasvun pysähtymisen ja maltillinen apoptoosin; ii) ohjataan solujen kohti erilaistumista ja neutraalien lipidien kertymistä; iii) vähensi solujen invasiivisuus potentiaalia vähentämällä määrä MMP-9 toimintaa ja jopa säätelevä TIMP-1 ilmentymisen; ja iv) esti solun liikkuvuus ja muuttoliike kautta Matrigel. Kaiken (S) -2 on osoittautunut voimakas HDACi kykenee indusoimaan kasvun pysähtymisen, solukuolemaan ja /tai erilaistumista LNCaP ja PC3 eturauhassyövän solut ja, koska sen alhainen toksisuus ja tehokkuus

in vivo

, voi olla kliinistä merkitystä tukemaan tavanomaisia ​​eturauhassyövän hoidossa.

Citation: Laurenzana A, Balliu M, Cellai C, Romanelli MN, Pacietti F (2013) tehokkuus histonideasetylaasi- estäjä (S) -2 vastaan ​​LNCaP ja PC3 ihmisen syöpäsolujen. PLoS ONE 8 (3): e58267. doi: 10,1371 /journal.pone.0058267

Editor: Chunhong Yan, Albany Medical College, Yhdysvallat

vastaanotettu: 16 huhtikuu 2012; Hyväksytty: 05 helmikuu 2013; Julkaistu: 04 maaliskuu 2013

Copyright: © 2013 Laurenzana et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta MIUR (OPM, korkeakoulut ja tutkimus PRIN 2006 FP, # 200606139), University of Florence, Italia (aiempi 60% vuosien 2009 ja 2010 FP ja MNR), Ente Cassa di Risparmio di Firenze 2007- 9 (Firenze, Italia, # 2007,1019 FP) ja Associazione Italiana contro le Leucemie, Linfomi e Mieloma (AIL) Sezione di Firenze FP. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Epigeneettiset korjaantuvat chromatin uudelleenjärjestelyjä kykenee moduloimaan geenin ilmentymisen solun sisällä muuttamatta DNA-sekvenssin. Asetylointi on laajimmin tutkittu translaation jälkeisen modifikaation histoni-proteiinien [1], koska tasapainoista toimintaa kahden perheen entsyymien, eli histoni ase- tyylitransferaaseja (HAT) ja histonideasetylaaseja (HDAC: t), jotka katalysoivat asetylaatio /deasetyloinnin histonien, vastaavasti ja siten muuttamalla kromatiinin konformaation ja DNA saatavuutta transkription tekijöitä, [2], [3], [4]. Lisäksi hattuja ja HDAC edistää muuntavan geenin ilmentymisen suora vuorovaikutus nonhistone keskeisten säätelyproteiineihin [5] kuin p53, GATA1, GATA2, retinoiinihapporeseptoriin, NF-kB ja cytoskeletal proteiinien, kuten α-tubuliinin [6], [7], [8]. Ei ole yllättävää, että poikkeava toiminta näiden entsyymien voi tukahduttaa transkriptio erityisiä onkopsykologista synnyssä ja lyijy, lopulta, kasvaimen muodostuminen [9], [10]. Ja todellakin, histoni hypoacetylation, koska yli-ilmentyminen HDAC: ien, on tunnustettu rooli kasvainten synnyssä eri syövistä vatsa [11], paksusuolen [12], [13], rintojen [14] ja eturauhasen [15], [ ,,,0],16], [17].

erityisesti osalta eturauhassyöpä, tämä on useimmin diagnosoitu ei-kutaaninen maligniteetti ja kolmanneksi yleisin syy syöpään liittyvien kuolemien miesten länsimaissa. Vaikka useita hoitovaihtoehtoja ovat käytettävissä varhaisvaiheen eturauhassyöpä, potilaiden uusiutunut alkutuotannosta hoidon leikkaus ja /tai sädehoito, tai esitettävä etäpesäkkeitä, androgeenisesti puute on edelleen tukipilari hoidon. Huolimatta androgeeniablaatio, lähes kaikki kasvaimet lopulta edetä kastraatio vastustuskykyisten tautien [18], [19], [20], jotka on hoidettu tavanomaisilla sytotoksisille tai epigeneettisellä aineet, kuten HDAC estäjät (HDACi). Jälkimmäinen ovat nousseet uuden luokan voimakas syöpälääkkeiden kykenevät indusoimaan kasvainsolujen kasvua pidätys, erilaistumiseen ja /tai apoptoosin [16], [17]

in vitro

ja toimii säteilyherkistimien syöpäsoluissa by alas -regulating DNA korjausaktiivisuus [21], [22], [23]. Jotkut näistä HDACi osoittivat kuitenkin useita rajoituksia

in vivo

johtuen niiden myrkyllisyydestä, pieni liukoisuus, ja lyhyet puoliintumisajat [24], [25]. Siksi kehittää uusia HDACi syövän vastaisten ominaisuuksien ja alhaisen myrkyllisten profiilit on keskeinen tavoite translaatiotutkimuksen.

Olemme aiemmin raportoitu uusia voimakkaita hydroksamaatin perustuvien HDACi ominaista 1,4-bentsodiatsepiini rengas ( BDZ) käytetty korkki ja linkitetty kautta kolmoissidos liitäntäyksikön, lineaariseen alkyyli- ketju kuljettaa hydrok- toiminnon kuin Zn

++ – kelatoivat ryhmä [26]. Näistä hybridit, erityisesti yksi, MC133 (S) -2 [vastedes (S)

–

2] osoitti olevan erittäin tehokas proapoptoottinen ainetta kohti eri viljellyt ja ensisijainen akuutti myelooinen leukemia (AML) solut

in vitro

ja

ex vivo

, ja oli käytännössä turvallista hiirille

in vivo

enintään 150 mg /kg /viikko [27].

esillä olevassa tutkimuksessa olemme tutkineet antitumor potentiaalin (S) -2 kaksi laajimmin tutkittu ihmisen epiteelisolujen eturauhassyövän solulinjoissa, eli androgen-herkkien LNCaP, ja androgeenin-herkkä ja erittäin metastaattinen PC3, käyttäen ihmisen tuumorigeeninen PNT1A eturauhasen epiteelisolujen kontrollina. (S) -2 estivät eturauhassyöpä solujen lisääntymistä, indusoi suuremman apoptoottisen vasteen verrattuna SAHA (tai Vorinostat, yksi parhaista esiintyivät HDACi hyväksynyt FDA hoitoon ihon T-solulymfooma) [28], [29] vuonna LNCaP-solut ja vähemmässä määrin myös erittäin metastaattista PC3 soluja, joiden muuttoliike ja invasiivisuus ominaisuudet rajusti, että huumausaineiden. Sen sijaan normaalin epiteelin eturauhasen PNT1A solut olivat lähes huume tunteeton. Tärkeää on, (S) -2 aiheuttama apoptoosin LNCaP kehitetty eri kaspaasiriippuvaisen mekanismi.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja Hoidot

Nonmetastatic LNCaP ja metastasoituneen PC3 eturauhassyövän solut, ja ihmisen ei aiheuttanut kasvaimia eturauhasen epiteelisolujen PNT1A solut olivat ystävällinen lahja P. Chiarugi (Dept. Biochemical Sciences, University of Florence), jotka on saatu solulinjat Euroopan Collection of Cell Cultures [30]. Ihmisen eturauhasen soluja viljeltiin RPMI 1640, johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS). Soluja pidettiin 37 ° C °: ssa 5% CO

2 kosteutetussa ilmakehässä. (S) -2 ja SAHA (tai Vorinostat; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) [28], [29] liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO, Sigma-Aldrich) 0,1 M pitoisuus ja tallennettu pimeässä huoneenlämpötilassa (RT). Työskentely lääkeliuokset saatiin asianmukaisesti laimennettu kantaliuosta ja viljelyalustan. DMSO työskenteli ajoneuvon lopulliseen annokseen ≤0.1% (v /v) viljelmässä sekä (S) -2 ja SAHA. Kaspaasien esto kokeita Z-VAD-fmk (R Sigma-Aldrich) lisättiin viljelmässä 2 h ennen (S) -2 lisäksi.

Cell Cycle Analysis

eturauhasen soluja käsiteltiin 24 tuntia ilman /2,5 uM lääkettä, sitten uudelleensuspendoitiin propidiumjodidista /RNaasi-liuosta (BD PharMingen, San Diego, CA) ja inkuboitiin RT pimeässä 15-30 min. Prosenttiosuudet solujen suhteessa G

0 /G

1, G

2 /M, ja S-vaiheessa määritettiin tuella Becton Dickinson FACSCalibur System.

Western blotting

Kerätyt solut suspendoidaan uudelleen 20 mM RIPA-puskuria (pH 7,4), joka sisältää cocktail proteinaasi-inhibiittorit (Calbiochem, Merck, Darmstadt, Saksa) ja käsiteltiin sonikoimalla (Microson XL-2000, Minisonix, Farmingdale, NY, USA) . Proteiinit määritettiin BCA Protein Assay (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA), analysoitiin SDS-PAGE: lla ja Western blotting raportoitu muualla [31]. Kalvot koetettiin ensisijainen vasta-aineita: asetyyli-H3, asetyyli-H4, ja H4 (Upstate Biotechnology, Millipore, Bilerica, MA, USA); PARP, γ-H2AX, H2AX, H3 ja kaspaasi 9 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA); α-tubuliinin ja asetyloitu α-tubuliinin (Sigma-Aldrich), kaspaasi 3 ja p21 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Sopivia peroksidaasikonjugoidun IgG valmisteet (Sigma-Aldrich), on käytetty sekundäärisiä vasta-aineita; ECL meneteltiin kehittämiseen.

kvantitointi mitokondrion kalvon Mahdolliset

Määritä muutoksia lääkkeen aiheuttama transmembraaninen mitokondrion kalvon potentiaali (Δψm), solut on värjätty JC-1 (Invitrogen , Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), kationinen väriaine, jolla on potentiaalia riippuvaiset kertymistä mitokondrioissa osoitetaan fluoresenssiemission siirtyminen vihreän (525 ± 10 nm) punaiseen (610 ± 10 nm). LNCaP-soluja (0,5 x 10

6) käsiteltiin ilman /2,5 ja 5 uM (S) -2 72 tunnin ajan ja sitten suspendoitiin uudelleen RPMI 1640, joka sisälsi 15 ug /ml JC-1 väriaine 30 minuutin ajan RT: pimeä; sen jälkeen solut pestiin ja fluoresenssi mitattiin virtaussytometrialla. Mitokondriot Depolarisaatio on nimenomaan merkitty vähenemistä punaisesta vihreäksi fluoresenssi-intensiteetin suhteen [32].

kaspaasi 3 Aktivointi Pitoisuus

Eturauhassyöpä soluja (10

5 solu /ml) olivat inkuboitiin 2,5 uM (S) -2 48 tuntia ja sitten altistettiin karboksifluoreseiini FLICA Apoptosis Detection Kit kaspaasi-määritys (Caspase 3 FLICA, Immunochemistry Technology, Bloomington, MN, USA). Solut värjättiin FAM-DEVD-FMK FLICA reagenssi liuotettuna PBS: ssä 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa, ja pestiin kahdesti PBS: llä, ennen kuin suorittamista sy- tofluorimetrisillä määrityksen.

geelitsymografiaa

Analyysi gelatinaasi (MMP-9) aktiivisuuden suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [33]. Lyhyesti, PC3-solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille ja käsiteltiin lisäämällä määrää (S) -2 seerumivapaassa media 24 tuntia. Alikvootit elatusainetta (CM) sekoitettiin 4 x (v /v) näytepuskuria (0,25 mol /l Tris-HCl, pH 6,8, 0,4% SDS, 40% glyserolia ja bromifenolisinistä), sitten ladattiin 10% SDS geeli, joka sisälsi 1 mg /ml gelatiinia (Sigma-Aldrich) ja ajaa ei-pelkistävissä olosuhteissa vakiojännitteellä 125 V elektroforeesin jälkeen geeli inkuboitiin renaturoimalla puskurissa (2,5% Triton X-100) huoneenlämpötilassa 30 min , pestiin kahdesti tislatulla vedellä (10 min kerta), ja inkuboitiin sitten kehittää puskurilla (50 mmol /l Tris pH 8,0, 5 mmol /l CaCI

2, 0,2 mol /l NaCl: a ja 0,02% Brij-35 ) lämpötilassa 37 ° C: ssa yön yli, värjättiin 0,5% Coomassie Blue liuosta 2 tuntia ja väri poistettiin liuoksella [5% etikkahappoa, 10% metanolia (v /v) tislatussa vedessä], kunnes siteet Gelatinolyyttinen aktiivisuus visualisoitiin ja mitataan sitten densitometrinen analyysi Image J ohjelmisto.

haavanparantumis- Pitoisuus

PC3-soluja viljeltiin 6 cm levyille konfluenssiin asti ja sen jälkeen yksikerroksista oli naarmuuntunut sitä pienellä steriilin pipetin kärki tuottaa kapean haavan alustaan. Keskipitkällä ja roskat imettiin pois ja korvattiin tuoreella kasvualustalla, läsnäollessa erilaisia ​​pitoisuuksia (S) -2. Kuvat otettiin ennen ja 24 tuntia sen jälkeen haavoittaen tuella Nikon E 4500 photocamera (Nikon) Nikon TMS-F faasikontrastimikroskoopissa (Nikon Instruments, Firenze, Italia).

invasiivisuus Pitoisuus

näitä kokeita varten käytettiin Boyden kammioita, joissa ylempi ja alempi kuopat erotettiin porus polykarbonaattisuodattimille päällystetty matrigeeliä (50 ug /suodatin) (Becton Dickinson, BD, New Jersey, USA). Viljelmät esikäsitelty /ilman (S) -2 (2,5-5 pM) 24 tuntia ja sitten alikvootit PC3-solujen (20 x 10

3) siirrettiin ylempään osastoon kammion. Solujen invasiivisia valmiudet arvioitiin 6 h ja ilmaistuna absoluuttisen määrän ± SD solujen läsnä suodattimet; viisi erilaista mikroskooppikentäs- kullekin tilalle on tutkittu.

Oil Red O värjäyksen neutraaleja lipidejä

Neutraalit lipidit havaittiin (i) histokemiallisesti [34] annetun yksisoluiset kerrokset, jotka nopeasti kiinnitettiin? -? 0 ° C metanolia, värjättiin Oil Red O (ORO) (Sigma-Aldrich), ja (ii) spektrofotometrisesti (Cary 50 Scan, Varian, Victoria, Australia) 510 nm rekisteröimällä absorbanssi soluun sitoutuneen ORO poiston jälkeen isopropanolilla [35], [36]. ORO kertymistä ilmaistiin suhteellinen absorbanssi yksikköä /mg solun proteiinia.

Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR-analyysi

QRT-PCR suoritettiin käänteinen litteroitiin cDNA käsittelemättömien ja käsiteltyjen solujen käyttäen Applied Biosystems 7500HT System standardimenetelmien mukaisesti. Kertainen p21, MMP-9 ja TIMP-1 induktion laskettiin muutoksia p21 tai MMP-9: n tai TIMP-1 Ct-arvot käsitellään

versus

käsittelemättömät solut ja normalisoitiin 18S rRNA Ct Amplification oli suoritettiin oletus PCR-asetus: 40 sykliä 95 ° C 15 s ja 60 ° C: ssa 60 sekunnin ajan käyttämällä SYBR Green perustuva tunnistus (SYBR Green Master mix; Applied Biosystems) ja seuraavia alukkeita: p21, eteenpäin 5 ’ -CTGCCCAAGCTCTACCTTCC-3 ’? ja reverse 5′-CAGGTCCA CATGGTCTTCCT-3′; MMP-9 eteenpäin 5’-GCTACCACCTCGAA CTTTGAC-3 ’ja reverse 5′-TGCCGGATGCCATTCAC-3′; ja TIMP-1, eteenpäin 5’-CCAACAG TGTAGGTCTTGGTGAAG-3 ’ja reverse 5′-CTGTGGCTCCCTGGAACA-3’; ja 18S rRNA, eteenpäin 5’CGGCTACCACATCCAAGGAA-3 ’? ja reverse 5′- GCTGGAATTACCGCGGCT-3’.

Alustava

in vivo

Kokeiluja Hiiren ksenograftimallia

protokolla ja tulokset tästä alustavan lähestymistapaa

in vivo

koe on raportoitu varatuista tukeminen Information (kuva S1).

tilastollinen analyysi

Opiskelijan

t

-testiä tai yksisuuntainen varianssianalyysi arviointiin käytettiin tilastollisen merkitsevyyden tuloksia. Ero arvojen joukosta pidettiin merkitsevä

P

≤ 0,05.

Tulokset

(S) -2 Kysyy LNCaP-solujen G

0 /G

1 solukierron pysähtymisen ja muutokset Morfologia

LNCaP, viljelty ilman /lisääntyvän (S) -2 pitoisuuksina (1, 2,5 ja 5 uM) enintään 72 tuntia, tehtiin annoksesta ja ajasta riippuvaa kasvun pysähtymisen saavuttaa 50% eston kahden päivän inkubaation 1-2,5 uM (S) -2; kun taas käsitellyissä viljelmissä 5 uM määrä elinkelpoisten solujen väheni huomattavasti alittavat selvästi alkaen pinnoitus tiheys (kuvio 1A). Vaikutus (S) -2 LNCaP solusyklin etenemisen mitattuna virtaussytometrialla osoitti, että 24 tunnin altistuminen 2,5 uM huumeiden lisääntynyt merkittävästi solujen prosenttiosuutta G

0 /G

1 (59 93%) ja väheni solupopulaation S-vaiheessa (29-2%) (kuvio 1 B, ylhäällä). Vuonna addittion, kun hoito, tyypillinen morfologia LNCaP-solujen muuttunut karan muotoinen, melko suurennettu fenotyyppi, jolloin saatiin yksisolukerroksiin, jotka oli ominaista osittain solun menetystä ja vähentää yhteyksiä jäljellä soluja (kuvio 1 B, keskellä). Johdonmukaisesti, solusyklin estäjä p21-proteiini – raportoitu olevan ajan moduloidaan HDACi [37] – vahvistunut ajasta riippuva tavalla vastauksena 2,5 uM (S) -2; proteiini havaittiin alkaen 6 h hoidon, lisääntynyt sen jälkeen, kun 15 tuntia ja saavutti 24 h (kuvio 1 B, alhaalla).

(A) – soluja (10

5) ympättiin 6- kuoppalevyille ja annettiin kiinnittyä yön yli. Seuraavana päivänä (S) -2 lisättiin ilmoitettuina pitoisuuksina (0-5 uM) ja elinkelpoisten solujen (trypaani blu-negatiivinen) laskettiin avulla on Bürker kammion seuraavien kolmen päivän aikana. (B, top) – (S) -2 indusoi G

0 /G

1 solusyklin pysähtymiseen ja lisääntynyt p21 ilme. LNCaP-soluja (2 x 10

5), käsiteltiin 2,5 uM lääkeaineen 24 tunnin ajan, sitten irrotettiin ja alikvootit solususpensioita inkuboitiin propidiumjodidilla (PI) liuosta 30 minuutin ajan ja sen jälkeen analysoitiin virtaussytometrialla (DNA määrä, X-akseli, yhteensä tapahtumaa, Y-akseli). Solujen prosenttiosuus eri vaiheissa solusyklin laskettiin ModFit ohjelman ja esitetään kussakin paneelissa. (B, keskellä) – Faasikontrasti- kuvaa kumppani kulttuurien osoitti, että (S) -2 aiheuttama morfologisia muutoksia ja vähentyneen merkittävästi solutiheyden. (B, alhaalla) – Soluja käsiteltiin 2,5 pM lääkeainetta ilmoitettuina ajankohtina, ja p21-proteiinin tasoja tarkkailtiin immunoblottaamalla; GAPDH tutkittiin myös tasapuolisen lastaus näytteiden kunkin kaistan. (C) – LNCaP solujen kasvun pysähtymisen olekaan täysin riippuvainen jatkuvasta lääkkeen läsnä ollessa. Solut on ympätty 6-kuoppaisille levyille (10

5 solusta /kuoppa) ja annettiin kiinnittyä yön yli. Seuraavana päivänä viljelmät lisättiin ilman /kanssa 2,5-5 uM (S) -2 3d ja sitten korvattiin lääkkeetön väliaineessa ylimääräisiä 3d ja verrattuna kulttuureissa, joissa lääke oli tasaisesti yllä jopa 6d kun elävät solut laskettiin. Kukin pylväs esittää keskimääräistä saatu rinnakkaisesta kuopasta ± SD.

Lisäksi kasvun pysähtymisen LNCaP alttiina (S) -2 olekaan täysin riippuvainen jatkuvasta lääkkeen läsnä ollessa. Tämä olettamus on johdettu seurannan solujen määrä käsitellyissä viljelmissä ilman /2,5 tai 5 uM (S) -2 3d ja sitten korvattiin lääkkeetön väliaineessa ylimääräisiä 3d, kun taas kumppani kulttuureissa lääkeaine tasaisesti yllä 6d. Solut pysyivät käytännöllisesti katsoen pidätettiin vaikka lääkeaine-väliaineessa korvaaminen, jolloin saatiin arvoja, jotka olivat samanlaisia ​​kuin viljelmät jatkuvasti alttiina lääkkeen (kuvio 1C).

(S) -2-indusoitu apoptoosi LNCaP-soluissa Riippuu aktivointi kaspaasi Cascade ja mitokondrioiden Integrity

Yksi varhainen HDACi aiheuttama tapahtumia DNA-tasolla oli muodostumista kaksinkertainen säikeen katkoksia (DSB) ja fosforylaatio H2AX jolloin saadaan γ-H2AX joka auttaa DNA-vaurioiden korjaamiseen [38]. Vaste LNCaP-soluja (S) -2 määritettynä immunovärjäyksellä osoitti, että 2,5 uM lääke lisäsi merkittävästi γ-H2AX signaalista 6 h, ja nämä tasot olivat melko yllä jopa 24 h jälkeen, kuvio samanlainen kuin huumeisiin aiheuttama asetyyli-H4 (kuvio 2A, ylhäällä). Lisäksi, apoptoosin alkaminen, kuten merkitty lohkaisemalla kaspaasisubstraatin poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP), havaittiin 15 h hoidon ja kasvoi tasaisesti jopa 48 h (kuvio 2A, alhaalla), kun noin 80% LNCaP-solut osoittivat: (i) lääkeaine-välitteisen kaspaasi 3 (kuvio 2B) ja (ii) annos-riippuvainen muutos JC-1 punainen /vihreä fluoresenssin suhde tarkoittamaan asteittaista hajoamista mitokondrion transmembraanisen potentiaalin (ΔΨm ) (kuvio 2C).

(A) – Soluja inkuboitiin lääkkeen kanssa (2,5, 5 uM) varten ilmoitettuina ajankohtina. Koko-solu-uutteita analysoitiin Western immunoblot havaitsemiseksi: fosfo-H2AX, että se laukaisee seuraavat DNA-vaurioita; PARP ja sen katkaistun fragmentti tarkoitetaan apoptoottisia activaction; ja asetyyli-H4, koska esto HDAC. GAPDH ja α-tubuliinin käytettiin lastaus valvontaa. (B) – Käsittelemätön tai lääkeaineen-käsitellyt solut (2,5 uM: ssa 48 h) inkuboitiin aikana viimeisten 60 min FAM-DEVD-FMK carboxyfluoresceine, sitten huuhdottiin kahdesti PBS: llä ja niiden vihreä fluoresenssi mitattiin virtaussytometrialla. Taajuus histogrammi tapahtumien lukumäärä (Y-akseli)

vs.

fluoreseiini-intensiteetti (x-akseli) oli kaksi huippua: kaspaasi-negatiiviset solut (leimaamattomia soluja) olivat vasemmalla puolella P2 alueella; kun taas kaspaasi-positiiviset solut, jotka leimattiin Flica tapahtunut P2 alueella. (C) – Käsittely (S) -2 johti annoksesta riippuvainen mitokondrion transmembraanisen potentiaalin (ΔΨ) hajoamista. Tämä vaikutus arvioitiin käyttämällä apuna JC-1 väriaine, joka aggregaatit normaalissa mitokondrioita ja lähettää punaista fluoresenssia, mutta se ei voi kerääntyä mitokondriot, jotka ovat menettäneet transmembraaninen potentiaali, ja siksi tuottaa diffuusi sytoplasmaattinen vihreä signaali kuolleita soluja. Mitokondrioiden depolarisaatio on merkitty lasku punainen /vihreä (R /G) fluoresenssin intensiteetin suhdetta [32]. Arvot on normalisoitu käyttämällä ohjaussignaalin (vain ajoneuvon) mielivaltainen arvo 100%. Kukin pylväs on keskiarvo kahdesta toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta, jotka suoritettiin kolmena kappaleena. (D) – LNCAP soluja käsiteltiin (S) -2 (2,5-5 pM) tai (S) -2 (5 uM) plus 15 mM N-asetyylikysteiini (NAC) sovellettu 2 h ennen lääkkeen lisäksi. Apoptoosin aktivaatiosta paljasti katkaisun PARP ja fosforylaation H2AX ja nämä tapahtumat sekä lääke-välitteisen α-tubuliinin asetylaatio ei vastakohtana NAC. GAPDH: ta käytettiin viite-proteiinia. (E) – Z-VAD-fmk esti lääkkeen aiheuttama lohkaisu PARP ja fosforylaation H2AX. LNCAP soluja käsiteltiin kuten edellä, mutta sen sijaan, NAC, viljelmiä esi-inkuboitu 30 uM Z-VAD-fmk 2 tuntia ennen hoidettavan 24 h lääkkeen. Solulysaatit analysoitiin pilkkomalla PARP, aktivointi kaspaasi 3 ja 9, H2AX fosforylaatio sekä asetylaatio H4 ja α-tubuliinin; α-tubuliinin käytettiin lastaus ohjaus.

Lisäksi, tutkia mekanismi (S) -2-indusoitua apoptoosia LNCAP-soluissa, vaikutukset antioksidantti N-asetyyli-kysteiini ( NAC) ja yleiseurooppalaisen kaspaasiestäjä Z-VAD-fmk tutkittiin erikseen. Eri tavalla raportoitu AML-solujen [27], kun läsnä oli 15 mM NAC viljelyväliaineessa ei ollut kykenevät vähentämään lääkkeen aiheuttamista lohkaisu PARP siten sulkea pois merkittävän roolin reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) huumeisiin välittämää apoptoosia (Kuva 2D). Sen sijaan, kokeita ilman /30 uM pan-kaspaasi-inhibiittori z-VAD-fmk paljasti, että tämä yhdiste pystyi estämään lääkeaineen-välitteisen kaspaasi 9 ja 3 sekä katkaisun PARP ja kasvaa γ-H2AX [ ,,,0],39], mikä viittaa siihen, että (S) -2-indusoitua apoptoosia in LNCaP kehitetty eri kaspaasiriippuvaisen mekanismi (kuvio 2E). On syytä huomata, että lääkkeen aiheuttama asetylaatio H4 ja α-tubuliinin ei haitannut Z-VAD-fmk.

(S) -2 tavoitteet LNCaP mutta ei normaalissa eturauhasessa PNT1A Cells

Mahdollinen translaation arvo (S) -2 arvioitiin vertaamalla toimintaprosesseille (S) -2 ja SAHA osalta apoptoosin induktion ja histoni asetylaatio LNCaP-soluissa ja normaalissa eturauhasessa epiteelin kuolemattomaksi PNT1A soluja. (S) -2 kehotetaan kasvoi selvästi tasojen pilkotun PARP fragmentti, γ-H2AX ja asetyyli-H3 LNCaP-solujen paljon suurempi teho kuin SAHA (kuvio 3A, vasemmalla). Lisäksi (S) -2 näytti olevan suhteellisen turvallinen normaaliin PNT1A soluja, jotka, sen sijaan, olivat herkkiä kohteena SAHA joka käy ilmi katkaisun PARP käsittelemällä 5 uM lääkkeen (kuvio 3A, oikealla), kun taas asetyyli-H3 tasot in PNT1A soluissa pysyi melko vakaana riippumatta joko induktorien.

(A) – LNCAP ja PNT1A soluja inkuboitiin 24 h kasvavia määriä joko (S) -2 ja SAHA. Solu-uutteita alistettiin Western immunoblottaus havaita fosfo-H2AX, PARP ja sen pilkotun fragmentin ja asetyyli-H3; a-tubuliinia käytettiin latauskontrollina. (B) – p21 mRNA tasoilla LNCAP ja PNT1A soluja inkuboitiin ilman /kanssa (S) -2 tai SAHA 24 tunnin mitattiin kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR. Normaali PNT1A solut olivat ilmeisesti vähemmän herkkiä (S) -2 verrattuna SAHA. Pylväät, keskimäärin kolme riippumatonta näytettä: baaria ± SD; merkittävää eroa (

P

≤0.05). (C) – PARP pilkkominen ja γ-H2AX tasoja indusoituu LNCaP ja PNT1A soluissa 24 h-hoitoa ilman /kanssa (S) -2 verrattiin samaan blot.

Lisäksi kasvu pidätys in (S) -2-käsiteltyjen LNCaP liittyi selvästi annosriippuvainen nousu (7-13 kertaa) in p21 mRNA jotka myös tehostaa SAHA vaikkakin vähemmän annosriippuvaisen etenemisen (kuvio 3B, vasemmalla) . On huomattava, että p21 ilmentymistä PNT1A soluissa ei vaikuttanut (S) -2, kun taas silmiinpistävän säädelty 5 uM SAHA (kuvio 3B, oikealla). Lisäksi saadut tulokset vertaamalla samalla blot vaikutuksia (S) -2 LNCaP ja PNT1A solut ovat selvästi osoittaneet, että LNCaP olivat varmasti enemmän herkkyys kuin normaalit PNT1A solujen suhteen PARP lohkominen ja γ-H2AX tasot (kuvio 3C) .

(S) -2 indusoi solusyklin pysähtymiseen, apoptoosin ja erilaistuminen PC3 Cells

vaikutus (S) -2 proliferaatioon erittäin metastaattinen eturauhassyöpä PC3-solujen on myös arvioidaan. Soluja viljeltiin kolmen päivän ajan /määrän lisääntyessä (S) -2 tehtiin annosriippuvainen lisäkasvun estäminen (kuvio 4A) sopusoinnussa merkittävän osuuden kasvu solujen pidätettiin G

0 /G

1 vaihe (46-75%) ja vähennys (40-15%) soluista S-vaiheessa (kuva 4B). Johdonmukaisesti, p21 oli merkitsevästi ajan säännellään 15 ja 24 h hoidon (kuvio 4C). Kiinnostaa, (S) -2-induced asetyyli-H3 tasot olivat jo parannettu 24 tunnin ja nousi edelleen 48 tuntia, juuri kun vaikutus SAHA alkoi vähentyä (kuvio 4D).

(A) – solut (10

5) ympättiin 6-kuoppaisille levyille ja annettiin kiinnittyä yön yli. Päivä sen jälkeen (S) -2 lisättiin ilmoitettuina pitoisuuksina ja solujen lukumäärä määritettiin pitkin seuraavat kolme päivää. (B) – Soluja inkuboitiin 24 h 2,5 uM (S) -2 määrittää% PI-värjäytyneiden solujen eri vaiheissa solusyklin määritettynä virtaussytometrialla. Kuvia joko käsittelemättömien ja käsiteltyjen viljelmien otettiin tuella faasikontrastimikroskopiaan. (C) – p21 mRNA tasot PC3 solujen viljelmistä hoitaa ilman /kanssa (S) -2 mitattiin kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR. (D) – Vertaileva Western blot-analyysi asetyyli-H3 tasot solussa otteita PC3 käsiteltiin joko (S) -2 tai SAHA; α-tubuliinin käytettiin latauskontrollina.

Kuitenkin PC3-solut, vaikka niiden herkkyys (S) -2-välitteisen sytostaasi, näytti olevan kestävämpi kuin LNCaP lääkkeen aiheuttamalle apoptoosin osoittaa se, että samankaltaista pilkkoa PARP, γ-H2AX ja asetyyli-α-tubuliinin kahdessa solulinjassa, voitiin saavuttaa ainoastaan ​​käsittelemällä PC3-solut kahdesti annostuksen käytetään LNCaP-soluja (kuvio 5A). Lisäksi fluoresenssimäärityksellä kaspaasi 3 aktivoinnin 2,5 uM (S) -2 osoitti, että noin 23% PC3 soluista tehtiin apoptoosin jälkeen 48 h-hoitoa (kuvio 5B)

eli

alle kolmasosa suhteellinen käsitellyille LNCaP. Lisäksi PC3-solut jäänyt lautasen inkuboinnin jälkeen 72 h kasvavia määriä lääkettä tuli suurempia suhteessa kontrolleihin ja kertynyt sytoplasmassa neutraali lipidi pisaroita, värjäystä positiivisesti Oil-Red O (ORO) seurauksena lääkeaineen indusoimaan adipogeenisen erilaistumisen (kuvio 5C), joka oli jo raportoitu esiintyvän näissä soluissa [40].

(A) – näytteitä PC3 ja LNCaP hoitaa ilman /kanssa (S) -2 (2,5 ja 5 uM) 24 tunnin ajan, analysoitiin Western blot ja immunologisesti varten: PARP ja sen katkaistun fragmentin, γ-H2AX ja asetyyli-α-tubuliinin, kun α-tubuliinin käytettiin loading ohjaus. (B) – solut joko käsittelemättömiä tai niitä käsiteltiin 2,5 uM (S) -2 48 tuntia inkuboitiin vain 1 h ennen korjattavan FAM-DEVD-FMK carboxyfluoresceine ja sitten huuhdeltiin kahdesti PBS: llä ja niiden vihreä fluoresenssi mitattiin virtauksen cytometry (katso kommentti piste B, kuva 2). (C) – mikroskooppinen arviointi vaikutusten (S) -2 kertyminen neutraali lipidi pisaroiksi PC3-solut, joita käsiteltiin kolme päivää. Kiinnityksen jälkeen solut värjättiin ORO ratkaisu; kvantifiointi ORO värjäys suoritettiin kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät.

(S) -2 Vähentää invasiivisuus, Migration and Liikkuvuus PC3 Cells

Matrix (MMP) vapautuu kasvainsoluja solunulkoiseen ympäristöön ovat ratkaisevia syövän edistänyt kudoshajoamista ja invaasio yhdessä metastaattinen prosessi [41], [42], [43]. MMP-9: n päässä väliaine PC3 viljelmistä jätettiin gelatiinitsymografialla, ja se osoitti annoksesta riippuvaa vähenemistä MMP-9 -aktiivisuuden (kuvio 6A), joka on mukana hieman, mutta ei merkittävästi, lasku MMP-9 ilmentymistä (kuvio 6B, vasen). Sen sijaan, ilmentyminen kudoksen estäjä metalloproteinaasi-1 (TIMP-1) – tiedetään panevan anti-metastaattinen vaikutuksia vastakkaisia ​​MMP-9 ja muut MMP: t [44], [45] – on silmiinpistävän parannettu 24 tunnin kuluttua hoidon (kuvio 6B, oikealla).

(A) – määräosat vakioitua elatusainetta PC3 viljelmiä inkuboitiin ilman /kanssa (S) -2 puuttuessa FCS toimitettiin gelatiinitsymografialla ja densitometrinen analyysi MMP -9 aktiivisuus (prosentteina kontrollista). (B) – MMP-9 ja TIMP-1-mRNA: n tasot PC3-soluja käsiteltiin ilman /kanssa (S) -2 24 h määritettiin kvantitatiivisella reaaliaikaisella PCR: llä. (C) – (S) -2 estivät PC3 soluliikkuvuus

in vitro

. Konfluentteja viljelmiä ”haavoittunut” avulla steriilin muovinen kärki ja ylläpitää ilman /kasvavia määriä lääkeainetta 24 tuntia. Faasikontrastimikroskopiaan käytettiin ottaa kuvia yksisolukerrosten. (D) – (S) -2 laski invasiivisuus PC3. Viljelmät esikäsitelty /ilman (S) -2 (2,5-5 pM) 24 tuntia ja sitten alikvootit PC3-solujen (20 x 10

3) siirrettiin ylempään osastoon kammion. Solut muuttivat kautta matrigeelin on suodattimet Boyden kammioiden laskettiin 6 h ja ilmaistuna absoluuttinen solujen määrä ± SD; viisi erilaista mikroskooppikentäs- (suurennus: x200) kunkin kunnossa tutkittujen ja merkittävä ero keskuudessa yksilöitä perustettiin

P

≤0.05.

Lisäksi tulokset ”haavan paranemista”