Krooninen sairaus

tiivistelmä

MikroRNA (miRNA) on raportoitu olevan keskeinen rooli syövän eteneminen ja metastaasit. Aikaisemmat tutkimus osoitti, että miR-375 usein vaimentua mahasyövän tukahduttaa solujen lisääntymistä kohdistamalla Janus-kinaasi 2 (JAK2). Täällä lisäksi havaittu, että ilmentymistaso miR-375 on merkittävästi vähentynyt metastaattisessa mahasyövän kudoksiin verrattuna ei-etäpesäke valvontaa. Kohdunulkoinen ilmentyminen miR-375 estää migraation ja invaasion mahasyövän solujen osittain kohdistamalla JAK2. Lisäksi miR-375 ilmentymistä säätelee negatiivisesti etäpesäke liittyvät transkriptiotekijän Snail, joka sitoutuu suoraan oletetun promoottori miR-375. Lisäksi yli-ilmentyminen Snail voi osittain kääntää esto mahasyövän solumigraation aiheuttama miR-375. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että miR-375 voidaan säätelee negatiivisesti Snail ja osallistuvat mahasyövässä solumigraatioon ja invaasiota mahdollisesti kohdistamalla JAK2.

Citation: Xu Y, Jin J, Liu Y, Huang Z, Deng Y, You T, et al. (2014) Snail säätelemät MiR-375 Estää Migration ja invaasiota Mahalaukun syöpäsolujen Targeting JAK2. PLoS ONE 9 (7): e99516. doi: 10,1371 /journal.pone.0099516

Editor: Ming Tan, University of South Alabama, Yhdysvallat

vastaanotettu: 07 helmikuu 2014; Hyväksytty: 15 toukokuu 2014; Julkaistu: 23 heinäkuu 2014

Copyright: © 2014 Xu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Natural Tiedesäätiö of China (31301149, 31071221, 31190063, 31125017 ja 31100975), Ministry of Science and Technology of China (2013CB945603, 2012CB945004 ja (2011CBA01001), opetusministeriö Kiinan (20110101110103 ja (20130101120001), Natural Scientific Foundation of Zhejiang Province, Kiina (LQ13H160013, LQ14H160003, Z2100247 ja Y2100106), 111 Project (B13026), The Fundamental Research rahastoja Keski yliopistot (2014QNA7015) ja Zhejiangin maakunnan Program viljely korkean tason Innovative Health kykyjä. rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

etäpesäke on kauhein näkökohtia syövän ja on tutkittu jo yli 100 vuoden ajan [1], [2]. Mahasyövän, korkea kuolleisuus lähinnä määritteet taudinmääritys, koska ei ole erityisiä oireita varhaisessa vaiheessa. Ja etäpesäkkeiden vastaa mahasyövän liittyvää kuolleisuutta [3], [4]. Muuttoliike ja hyökkäys syöpäsolujen ovat välttämättömiä vaiheita syöpä metastasoitunut kulkue joka koostuu sarjasta toisiinsa toimenpiteet, mukaan lukien proliferaatio, irrallisuus, liikkeeseen, liikenne, pidätys elinten noudattamista verisuonen seinämän, ekstravasaatio, perustaminen mikroympäristön, ja proliferaatioon kaukainen elimiin. Mahasyövän, solujen tunkeutuminen ympäröivään kudokseen on ratkaiseva varhaisessa vaiheessa [3], [5]. Kuitenkin mekanismit mahalaukun syövän solujen muuttoliike, invaasio ja metastaasi, ei ole täysin ymmärretty.

Viime vuosina erilaisia ​​molekyylejä, esimerkiksi kasvutekijöiden, sytokiinien, soluväliaineen-remodeling molekyylejä, ja joitakin transkriptiotekijöitä kuten Snail, Twist ja ZEB1 [6], [7], [8], [9], [10], [11], on paljastunut ajaa etenemistä syöpäsolujen muuttoliikkeen, invaasio ja metastaasi. Viime aikoina on käynyt ilmi, että sen lisäksi, että poikkeavuuksia proteiinia koodaavan geenien muutoksia ei-koodaava geenit voivat myös edistää syöpäsolujen muuttoliike, invaasio ja metastaasi, kuten miRNA, jotka ovat luokan pieni yksijuosteista ei-koodaavat RNA-molekyylejä, jotka säätelevät geeniekspressiota on paljon potentiaalia ja ovat sekaantuneet säätelyyn syöpäsolujen muuttoliikkeen, invaasio ja etäpesäkkeiden aktivaattoreina tai vaimentimet [12], [13], [14], [15], [16] . Tähän mennessä useita miRNA on tutkittu olevan osallisena mahalaukun syövän etäpesäkkeiden etenemisen, esimerkiksi miR-218, miR-9, miR-7, ja miR-146a [6], [17], [18], [19]. Olemme tutkineet yhdistyksen välillä tietty säädeltyyn miRNA ja erityisiä etäpesäke vaihe mahasyöpä, joka antaa oivalluksia mahdollisia mekanismeja mahalaukun syövän solujen muuttoliike, invaasio ja metastaasi.

Meidän Edellisessä tutkimuksessa miR-375 oli merkittävästi vaimentua mahasyövän ja estivät mahalaukun syöpäsolujen lisääntymistä kohdistamalla JAK2 [20]. Mielenkiintoista on, että esillä olevassa tutkimuksessa olemme edelleen havainneet, että ilmentymisen taso miR-375 oli vieläkin pienempi mahasyövän näytteitä etäpesäkkeen-positiivisilla potilailla compaired kanssa metastaasia-free potilailla. Niinpä ehdotetaan, että miR-375 saattaa olla syy rooli mahasyövässä etäpesäkkeitä. Tutkimustemme paljastui, että ektooppinen ilmentyminen miR-375 esti migraation ja invaasion mahalaukun syöpäsolujen myös osittain kohdistamalla JAK2. Olemme edelleen kehotuksen selvittää, miten miR-375 ilmentymistä säädellään mahasyövässä. Tulokset osoittivat, että miR-375 oli tavoite etäpesäkkeiden liittyvän transkriptiotekijän Snail ja sen ilmentyminen korreloi käänteisesti Snail mahasyövän. Yliekspressio Snail voi osittain kääntää esto mahasyövän solumigraation aiheuttama miR-375. Täten havaintomme osoittavat, että miR-375 estää mahalaukun syövän solujen maahanmuuton ja invaasion kautta Snail /miR-375 /JAK2 sääntelyn kautta.

Materiaalit ja menetelmät

Clinical näytteitä (Ethics Statement) ja solujen linjat

Kliininen mahasyövässä yksilöitä ja niiden parin yhteensopivat hyvänlaatuisen mahalaukun näytettä 39 potilaalla, joille mahalaukun syöpä resektio oli toimittanut Sir Run Run Shaw sairaala (Hangzhou, Kiina). Kaikki näytteet kerättiin kirjallinen suostumus potilaan kuten aiemmin on kuvattu [20]. Molemmat mahakasvaimen kudosten ja viereisten nontumorous mahalaukun kudosnäytteiden leikkauksen jälkeen olivat ja jaetaan kahteen osaan. Yksi jäädytettiin nestetypessä välittömästi jatkokäyttöä varten, toinen osa säilytettiin formaliiniin patologian analysointia. Potilaat osallistuvat tutkimuksessamme erotettiin etäpesäke-vapaa ja etäpesäkkeiden-positiivisten ryhmät (9/30). Mahasyövän solulinjoja (AGS ja MGC-803) ja yhden ei-pahanlaatuisia mahalaukun epiteeli- solulinjan (GES-1) on kuvattu aiemmin [20].

RNA

Kokonais-RNA mahalaukun näytteiden ja solulinjojen uutettiin käyttäen Mirvana miRNA Isolation Kit (Ambion, TX, USA) sen jälkeen, kun valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Quantitative reaaliaikainen PCR-analyysi

ilmentyminen miR-375 on määritettiin käyttäen Taqman MicroRNA määritykset (Applied Biosystems, CA, USA) spesifisiä alukkeita (P /N: 4373151, Applied Biosystems). Käänteistranskriptioreaktio suoritettiin alkaen 10 ng kokonais-RNA: sta käyttäen liu’utetaan alukkeita. Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR (qRT-PCR) suoritettiin käyttäen standardia Taqman MicroRNA Analyysit pöytäkirja ABI7500 Real-Time PCR Detection System. ΔΔCt menetelmä suhteellisen kvantisointia määrittämiseen käytettiin miRNA ilme. Ct on murto syklin, jossa fluoresenssi kunkin näytteen kulkee kiinteän kynnyksen. ACt laskettiin vähentämällä Ct of snRNA U6 (RNU6B, P /N: 4373381, Applied Biosystems) päässä Ct n miRNA kiinnostava. ΔΔCt laskettiin vähentämällä ACt on vertailunäytteen (pariksi ei-pahanlaatuista kudosta kirurgisissa näytteissä, normaaleista kudoksista ja GES-1 solun mahasyövän solulinjoja) päässä ACt kunkin näytteen. Kertainen muutos määritettiin 2

-ΔΔCt.

Muuttoliike ja invaasiomääritys

Solut transfektoitiin 20 nM valmiiksi miR-375 tai negatiivinen kontrolli käyttämällä transfektio Agent (Ambion, TX, USA) seuraavasti valmistajan ohjeiden mukaisesti 24-kuoppalevyillä. 24 h transfektion jälkeen, TranswellTM migraatiokokeessa ja Matrigel invaasiomääritys tehtiin erikseen käyttäen 24-kuoppaista TranswellTM insertit 8 um huokoskoko (Corning Costar Corp.). Sillä TranswellTM migraatiokokeessa, 2 x 10

4 AGS tai 3 x 10

4 MGC-803 solut suspensoitiin 100 ul vastaava viljelyalustaa ilman naudan sikiön seerumia (FBS) ladattiin yläosaan kammioon siirtokuoppaan insertin ulkopuolisten päällystettyihin kalvo. Sillä Matrigel invaasiomääritys, 5 x 10

4 AGS tai MGC-803-solut maljattiin 100 ui seerumia ylemmän Matrigel-päällystetty kammion sijaan. Molemmissa määrityksissä, alaosaan oli sisältävä 600 ui väliainetta, jossa 20% FBS. Sitten solut annetaan siirtynyt tai tunkeutuneet 12 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Solut, jotka vaelsivat tai tunkeutunut osaksi alaosaan kiinnitettiin, värjättiin 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli (DAPI, 1:1000), visualisoitiin faasikontrastimikroskooppia ja valokuvattiin. Kokonaismäärä siirtynyt tai tunkeutuu soluihin laskettiin IPP (Image-Pro Plus 6.0) -ohjelmistoa. Kaikki kokeet itsenäisesti toistettiin vähintään kolme kertaa.

Scratch-haavan paranemista määrityksessä

Solut transfektoitiin kuten edellä on kuvattu, ja annettiin kasvaa konfluenssiin. Soluja viljeltiin sitten vastaavaan väliaineessa ilman FBS: ää 12 tunnin ajan ja sitten raaputettiin pipetin kärjen. Haavan alueet on leimattu ja valokuvattiin 0 h, 12 h, 24 h ja 36 h vastaavasti. Nopeus solujen muuttoliikkeen arvioitiin sekä valokuvaamalla ja määrällisesti siirtynyt matkan solujen siirtynyt haavan reunasta kohti keskustaa IPP 6.0 järjestelmään. Kaikki kokeet toistettiin kolme kertaa.

konstruktit

tuottamiseksi pGL3-375pro plasmidi-DNA-sekvenssi, joka sisältää pri-miR-375 (ensisijainen miR-375) promoottori monistettiin RT-PCR: llä käyttäen alukkeilla 5′-ATCG CTCGAG ACA GAC CCT GCT AAG CGA CTC-3 ’ja 5′-ATCG AAGCTT ACG CCT TGG AGC TTG TCC-3′ ja sitten kloonattiin pGL3-basic vektorin (Promega). Plasmidin, joka ilmentää Snail soluissa, avoimen lukukehyksen (ORF) sekvenssin Snail kloonattiin nisäkkään ekspressiovektoriin pEGFP-C1 (Clontech, CA, USA) käyttäen alukkeita 5’-ATCG AA GCT TCG ATG CCG CGC TCT TTC CTC G-3 ’ja 5′-ATCG GGA TCC TCA GCG GGG ACA TCC TGA GCA-3’. Ektooppisten ilmentyminen FLAG-merkittyä JAK2, ihmisen JAK2 jossa koodaava alue kloonattiin pCMV-Tag 2C vektori. Plasmidin, joka ilmentää miR-375 nisäkässoluissa, pariksi oligonukleotidit perustuvat ensisijaisesti sekvenssi on-miR-375 ja sen viereisten alueiden kloonattiin nisäkkään ekspressiovektoriin pEGFP-C1 (Clontech, CA, USA). Kaikki konstruktit varmistettiin sekvensoimalla.

lusiferaasianalyysissä

Neljäkymmentätuhatta Solut siirrostettiin 24-kuoppaisille levyille 24 tuntia ennen transfektiota. Solut transfektoitiin joko pGL3-375pro tai pGL3-Basic-vektoriin. PRL-TK vektorin (Promega, WI, USA), joka sisältää

Renilla

lusiferaasin myös kotransfektoitiin referenssinä ohjaus. Firefly ja

Renilla

lusiferaasiaktiivisuudet mitattiin käyttämällä Dual-Luciferase Reporter Assay (Promega) 24 h transfektion jälkeen. Firefly lusiferaasiaktiivisuudeksi normalisoida Renilla lusiferaasiaktiivisuutta.

Tilastolliset analyysit

Data esitetään keskiarvoina ± keskivirhe (SE) kolmen erillisen kokeen. Väliset suhteet ilmaus miR-375 ja ilmaus Snail mRNA selvittävät

Pearsonin

korrelaatiokerrointa, joka oli kuvattu aiemmin [20]. Opiskelijan

t

-testin ja

X

2 testi suoritettiin määrittämiseksi tilastollista merkittävyyttä.

P

0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

MiR-375 on dramaattisesti vaimentua mahasyövän soluissa ja kudoksissa etäpesäke-positiivisten potilaiden

selvittää, onko miR-375 liittyy mahasyöpä etäpesäkkeitä, me ensimmäinen havaittu ilmentymistason miR-375 ensisijainen mahasyövässä kudoksia etäpesäke-positiivisia ja etäpesäkkeiden vapaa potilailla. Kun verrataan näytteitä etäpesäkkeen-free-potilailla, ekspression taso miR-375 oli noin kaksinkertaiseksi väheneminen kudoksissa metastaasin-positiivisilla potilailla (

P

0,05) (kuvio 1A). Consonance tähän tulokseen, ilmentymistason miR-375 mahalaukun solulinjoissa negatiivisesti liittyy kyvyt solujen maahanmuuton ja hyökkäystä. Metastaattista ominaisuudet mahalaukun epiteelin solulinjojen (GES-1, MGC-803, AGS) karakterisoitiin. Kuten kuviossa 1C ja 1D, muuttoliike ja hyökkäys kyvyt AGS solulinjan olivat suurempia kuin MGC-803 ja GES-1 solulinjoissa (

P

0,01). Kääntäen, miR-375 ilmentymisen AGS-soluissa oli pienempi kuin MGC-803 ja GES-1-solut (

P

0,01) (kuvio 1 B). Sanalla sanoen, miR-375 on vaimentua mahasyövän kudoksissa etäpesäke-positiivisten potilaiden ja mahalaukun syövän solujen enemmän muuttoliikkeen ja invaasion kykyjä. Tämä korrelaatio osoittaa, että miR-375 saattaa olla syy rooli mahasyövässä etäpesäkkeitä.

ilmentyminen miR-375 tutkittiin qRT-PCR. (A) Suhteellinen kertainen muutokset (Tuumorikudos /Normaali kudos, T /N) mahasyöpä näytteitä etäpesäke-ilmaiseksi tai positiivisten potilaiden ja niiden vieressä ei-pahanlaatuinen kudosten. Ilmaisu taso miR-375 oli noin kaksinkertaiseksi väheneminen kudoksissa 30 etäpesäke-positiivisia potilaita kuin 9 etäpesäke-vapaa potilailla,

* P

0,05. (B) Ilmaisu taso miR-375 kolmella ihmisen mahalaukun epiteeli- solulinjoissa erilaisilla maahanmuutto- ja invaasion kykyjä. Ilmentymisen taso miR-375 AGS-soluissa oli alhaisempi kuin MGC-803 ja GES-1-soluissa.

** P

0,01. (C, D) Siirtyminen ja hyökkäys kyvyt kolmen mahalaukun epiteelisolujen linjoja mitattiin Transvvell- kammioita. Kuvat edustavat kentät siirretty (C) tai invasiivinen (D) solujen kalvolla. Pylväsdiagrammit edustavat keskimääräinen lukumäärä solujen alapinnalle kalvon ± SE. **

P

0,01 verrattuna ei-pahanlaatuisia mahalaukun epiteelisolujen linja GES-1.

yli-ilmentyminen miR-375 estää mahalaukun syöpäsoluja maahanmuutto- ja invaasio

tutkia roolia miR-375 mahasyövän etäpesäkkeitä, tutkimme vaikutus miR-375 yliekspressio maahanmuutto- ja hyökkäys AGS ja MGC-803 mahasyövän solujen alhainen endougenous ilmaus miR-375. Solut transfektoitiin joko miR-375 esiaste (miR-375) tai prekursori-negatiivinen kontrolli oligonukleotidit (negatiivinen) tai ei kumpikaan edellä (Mock). Transwell migraatiokokeessa osoitti, että yli-ilmentyminen miR-375 suuresti esti migraation AGS (kuvio 2A, 2B), ja MGC-803-soluja (kuvio S1A, S1B). Vuonna sopusoinnussa Näiden tulosten naarmuuntumista haavan paranemista määritys paljasti myös, että nopeudet AGS (kuvio 2C, 2D) ja MGC-803-solut (kuvio S1C, S1D) muuttoliikkeen kohti haava-alueen merkittävästi vähentää, kun yli-ilmentymisen miR-375 . Me käytettiin edelleen Matrigel invaasiomääritys ja totesi, että yli-ilmentyminen miR-375 johti yli kaksinkertaisesti vähentäminen invasiivisia ominaisuuksia AGS (kuvio 3A, 3B) ja MGC-803-solut (kuvio 3C, 3D). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että yli-ilmentyminen miR-375 on riittävä inhiboimaan sekä migraation ja invaasion kyvyt mahalaukun syöpäsoluja.

AGS transfektoitujen solujen miR-375 esiaste (miR-375), negatiivinen kontrolli (Negative ) tai kumpikaan edellä (Mock) alistettiin TranswellTM migraatiokokeessa (A) ja scratch-haavan analyysi (C). (A) edustaja aloilla siirtynyt solujen alapuolella kalvo, joka kiinnitettiin ja värjättiin DAPI. (B) kokonaismäärä siirtynyt solujen alapinnalle kalvon laskettiin IPP 6,0 ohjelmisto. (C) Solut muutto haavoittunut alue oli valokuvattu mikroskoopilla 0 h, 12 h, 24 h ja 36 h haavan tekemisen. Katkoviivat osoittavat alueet puuttuvat solut. (D) nopeus muuttoliikkeen tutkittiin mittaamalla etäisyyden solujen siirtynyt haavan reunasta kohti keskustaa 36 h jälkeen naarmuuntumista. Tiedot esitetään keskiarvona ± SE vähintään kolmen itsenäisen kokeen. Bars, 50 pm. **

P

0,01.

AGS ja MGC-803 transfektoitu ennalta miR-375 (miR-375), negatiivinen kontrolli (Negative) tai kumpikaan edellä (Mock) sovellettiin Matrigeliä hyökkäystä analyysiin. (A, C) edustaja kentät solujen alaosaan 12 tunnin kuluttua hyökkäyksen näytettiin. Mittaviivat 50 pm. (B, D) kokonaismäärä invasiivisia solujen alapinnalle kalvon laskettiin IPP 6,0. Data näytetään keskimääräisenä ± SE kolmesta itsenäisestä kokeesta. **

P

0,01.

MiR-375-säännelty JAK2 on osallisena säätelyssä mahasyövän solujen maahanmuuton ja invaasion

Meidän edellinen tutkimus on tunnistettu JAK2 alavirran kohteena miR-375 [20]. Täällä olemme kiinnostuneita opiskelusta onko JAK2 on mukana säätelyyn mahasyövän solujen muuttoliikettä ja invaasiota. Meillä työskentelee vektori-RNAi tekniikkaa heikentävistä endogeenisen JAK2 ja totesi, että maahanmuutto ja hyökkäys toiminta AGS (kuva 4) ja MGC-803-solut (kuva S2) olivat molemmat estyy suuresti. Samalla tutkittiin myös JAK2 voisi torjua esto vaikutus mahalaukun syöpäsolujen maahanmuutto- ja invaasion aiheuttama miR-375. Solut kotransfektoitiin miR-375 esiasteen ja joko JAK2 yliekspressio vektorin (miR-375 + JAK2) tai ohjaamaan tyhjän vektorin (miR-375 + Vec). Yliekspressio JAK2 selvästi edistänyt solujen maahanmuuton ja invaasion kuvan 4 ja S2. Siten vastaa meidän hypoteesia, miR-375 saattaa estää migraation ja invaasion mahasyövän solujen osittain kohdistamalla JAK2. Olemme lisäksi todenneet, että JAK2 yliekspressio ei vaikuta ilmentymistason miR-375 kuvan S3. Emme kuitenkaan voi sulkea pois sitä mahdollisuutta, että dysregulaatio miR-375 häiritsee muita tavoitteita tarvitaan mahasyövän solujen muuttoliikettä ja invaasiota.

transfektoitu ilmaistuilla vektoreita tai oligonukleotidit niille on TranswellTM muuttoliike (A) tai Matrigel invaasiomääritys (C). Pelastus kokeilut miR-375 yliekspressio suoritettiin ektooppinen ilmentyminen JAK2 ilman 3′-UTR in miR-375-käsitellyt solut. (A, C) edustaja kentät solujen alaosaan 12 tunnin kuluttua siirtämisestä tai invaasion näytettiin. Mittaviivat 50 pm. (B, D) kokonaismäärä siirtynyt tai invasiivisia soluja yhdeksästä satunnaisesti valitusta aloilla laskettiin IPP 6,0. *

P

0,05, **

P

0,01.

Snail downregulates miR-375 ilmaisu

Edellä esitetyt tulokset osoittavat, että miR-375 voidaan kohdistaa tiettyihin transkriptiotekijät, jotka liittyvät syövän eteneminen ja metastaasit prosessi. Luonnollisesti, keskitymme miten miR-375 ilmentymistä säädellään. Ensin selvisi conversed DNA-alue ylävirtaan pri-miR-375-geeni, joka oli ilmoitettu sisältävän PRI-miR-375-geenin promoottori [21]. Sitten suoritetaan Consite ohjelman (https://asp.ii.uib.no:8090/cgi-bin/CONSITE/consite), ja todettiin, että oli kuusi sitoutumiskohtia transkriptiotekijän Snail on DNA-alue (kuvio 5A). DNA-alue kloonattiin pGL3-basic vektorin (Promega) (pGL3-375pro) mittaamiseksi promoottorin aktiivisuutta. Johdonmukaisesti tietojen kanssa Walker ryhmä [21], tuloksemme osoittivat, että tämä DNA-alueen sisältää pri-miR-375-geenin promoottorin ja kykenee ohjaamaan lusiferaasin ilmentymistä (kuvio 5B). Lusiferaasiaktiivisuus tehokkaasti tukahduttaa, kun pGL3-375pro vektori kotransfektoidaan Snail ekspressiovektorilla (Snail), mutta ei silloin, kun ko-transfektoitiin tyhjällä kontrollivektorilla (Mock) (kuvio 5C). Lisäksi Snail yli-ilmentyminen voisi vähentää ilmentymistaso miR-375 46% (kuvio 5D). Sen määrittämiseksi kliinistä merkitystä näiden tulosten saavuttamiseksi edelleen korreloi ilmentymistason miR-375 kanssa Snail mRNA-tasolla samalla mahasyövän potilaille. Kuten kuviossa 5E, selvä käänteinen korrelaatio löytyi ilmentymistason miR-375 ja Snail-mRNA: n (

P

0,05, r = -0,6). Näin ollen nämä havainnot osoittavat, että Snail on potentiaalinen ylävirtaan säätelijänä miR-375 ilme.

(A) bioinformatiikan analyysi käyttäen Consite ohjelma paljasti mahdollisia sitoutumiskohtia ja totesi, että oli kuusi sitoutumiskohtiin transkriptiotekijä Snail in DNA-alueen, joka sisälsi pri-miR-375-geenin promoottori. (B): n oletettu promoottorialue miR-375-geeni ligoitiin ylävirtaan tulikärpäsen lusiferaasi reportterigeenin promoottorin vähemmän pGL3-perusvektoriin (pGL3-375pro), jolloin tuloksena on 20-kertainen lusiferaasiaktiivisuus. (C) Lusiferaasiaktiivisuutta of pGL3-375pro soluissa transduktio Snail vektori. Lusiferaasiaktiivisuus tehokkaasti tukahduttaa, kun pGL3-375pro vektori kotransfektoitiin Snail ekspressiovektoriin. (D) Ilmaisu taso miR-375 soluissa transduktio Snail yli-ilmentämään vektorin. Snail yli-ilmentyminen voisi vähentää ilmentymistaso miR-375 46%. (E) käänteinen korrelaatio miR-375 ilmaisun ja Snail mRNA tasolla ensisijainen mahasyövässä kudoksiin. Tilastollisesti merkitsevä korrelaatio miR-375 ja Snail havaittiin

Pearsonin

menetelmää korrelaatiokerroin -0.6. **

P

0,01.

Snail on mukana säätelyyn mahasyövän solujen muuttoliikettä kohdistamalla miR-375

Selventämään lisäksi korrelaatio miR-375 ja Snail, tutkimme onko Snail on mukana säätelyyn mahasyövän solujen muuttoliikettä kohdistamalla miR-375. Meillä työskentelee vektori-tekniikka upregulate Snail ekspressiotason ja totesi, että maahanmuutto aktiivisuus AGS soluja (kuvio 6) edistettiin suuresti. Samalla tutkittiin myös Snail voisi torjua esto vaikutus mahalaukun syöpäsolujen muuttoliikkeen aiheuttama miR-375. Solut kotransfektoitiin miR-375 yli-ilmentymisen vektoriin ja Snail yliekspressio vektori (Snail + miR-375). Yliekspressio Snail selvästi edistänyt solujen muuttoliikettä ja saattavat osittain torjua esto vaikutus mahalaukun syöpäsolujen muuttoliikkeen aiheuttama miR-375, kuten on esitetty kuvassa 6. Näin ollen vastaa meidän hypoteesin, Snail voi estää migraation mahasyövän solujen osittain kohdentamalla miR-375.

transfektoitu osoitetuilla vektoreilla niille on Transwell migraatiokokeessa. (A) edustaja kentät solujen alaosaan 12 tuntia post maahanmuutto näytettiin. Mittaviivat 50 pm. (B) määrä keskimäärin siirtynyt solujen yhdeksästä satunnaisesti valitusta aloilla laskettiin IPP 6,0. **

P

0,01.

Keskustelu

miRNA on raportoitu säännellä kasvain maahanmuuttoa, invaasio ja etäpesäkkeiden myös mahasyövän [6], [22 ]. MiR-375 oli aiemmin osoitettu olevan tärkeä rooli mahalaukun syöpäsoluissa lisääntymistä [20], [23]. Kuitenkin sääntelymekanismeja jäävät epäselviksi. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme edelleen tutkitaan toiminto ja mahdolliset mekanismit miR-375 siirtymien ja invaasion mahalaukun syöpäsoluja. Olemme havainneet, että yli-ilmentyminen miR-375 esti solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion mahasyövän solujen osittain kohdistamalla JAK2. Se on ollut yli kymmenen vuotta JAK2 kloonattiin ensin [24]. JAK2 ilmaistaan ​​lähes jokaisessa kudoksessa ja liittyy monia pathologic edetessä. Vaikka on selvää, että JAK2 toimii onkogeenin sekä myeloproliferatiivista häiriöt ja joitakin kiinteitä kasvaimia [25], [26], [27], ei suoraan osallistu JAK2 syövän muuttoliike, invaasio tai etäpesäke on raportoitu. Jännittävän, Tutkimuksemme osoitti ensimmäisenä, että kaatamalla JAK2 RNAi esti muuttoliike ja hyökkäys toiminta mahalaukun syöpäsolujen samanlainen kuin yli-ilmentyminen miR-375. Lisäksi yli-ilmentyminen JAK2 voisi edistää siirtymistä ja invaasion mahalaukun syöpäsoluja. Niinpä oletetaan, että JAK2 voisi torjua estävää vaikutusta soluihin muuttoliikettä ja invaasiota aiheuttamat miR-375. Koska kriittinen rooli miR-375 ja JAK2 päällikön sääntelyviranomaisten mahalaukun syöpäsolujen proliferaatiota, migraatiota, ja invaasio, molemmat on terapeuttista potentiaalia mahalaukun syövän hoidossa. Siksi on vielä tutkittava, onko muihin kohteisiin osallistuu miR-375 välittämä mahalaukun etäpesäkkeitä.

Erityisen kiinnostava, olemme edelleen tutkittu, miten miR-375 mukana mahasyövän. Vaikka on olemassa selvää, että DNA: n metylaation ja histonien deasetylaatiolla ovat mahdollisia mekanismeja vaimennussäätely miR-375 mahasyövän [23]. Mekanismit miR-375 säätelyhäiriötä mahasyövän etäpesäkkeiden tunnetaan edelleen huonosti. On mahdollisuus, että transkription tukos miR-375-geenin ilmentyminen tässä prosessissa. Täällä näytämme, että etäpesäke liittyvä transkriptiotekijä Snail on potentiaalinen ylävirtaan säätelijänä miR-375 ilme. Snail on DNA: ta sitova sinkkisormiproteiini proteiinia ja on raportoitu transkription repressori [28]. Acumulating todisteet osoittavat, että Snail sitoutuu E-laatikot promoottori E-kadheriinin ja tukahduttaa sen transkription säätelemiseksi kasvaimen invaasio kehitys [29]. Lisäksi yli-ilmentyminen Snailin syöpien todettiin liittyvän imusolmuke etäpesäke, kasvaimen uusiutumisen ja ennuste [30], [31], [32], [33], [34], [35]. Vuonna sopusoinnussa muiden raporttien, meidän tutkimuksessa todettiin, että Snail mRNA yli-ilmentyy mahasyövässä kudoksissa verrattuna niiden vieressä hyvänlaatuisen kudoksissa. Koska promoottorin aktiivisuutta miR-375 voitaisiin tukahduttaa Snail ja yliekspressio Snail voi vähentää miR-375 ekspressiotaso merkittävästi, olemme edelleen löytäneet selvä käänteinen korrelaatio ilmentymistason miR-375 ja taso Snail mRNA mahasyövän näytteet. Snail on myös todettu olevan osallisena säätelyssä mahasyövän solujen muuttoliikettä kohdistamalla miR-375.

Yhteenvetona olemme tunnistaneet, että miR-375 oli poikkeuksellisesti ilmaistu mahasyövän kudoksiin etäpesäke-positiivisten potilaiden tai mahalaukun syöpäsolujen enemmän muuttoliikkeen ja invaasion toimintaa verrattuna kudoksiin etäpesäke-vapaa potilailla tai ei-invasiivisia mahalaukun epiteelisolujen linja GES-1 vastaavasti. Yli-ilmentymisen miR-375 vähensi mahasyövän solujen muuttoliikettä ja invaasiota toimia ainakin osittain kohdistamalla JAK2. Lisäksi Snail voi olla ylävirtaan säätelijä miR-375, joka säätelee negatiivisesti ilmentymistä miR-375 ja oli mukana säätelyssä mahasyövän solujen muuttoliikettä kohdistamalla miR-375. Yhdessä tuloksemme antaa undescribed reitin, jossa transkriptiotekijä Snail säätelee ilmentymistä miR-375, joka estää sen välittömänä kohteena JAK2, mikä estää migraation ja invaasion mahalaukun syöpäsoluja. Tuloksemme osoittavat, että palauttaminen miR-375 tai estämiseksi Snail tai JAK2 voivat olla käyttökelpoisia terapeuttisia strategioita mahasyövän hoitoon. Se varmasti tulee olemaan erittäin mielenkiintoista tutkia tarkemmin mahdollista tehokkuutta näiden molekyylien kohdistaminen miR-375, JAK2 tai Snail hoidossa mahasyövän. Toinen mielenkiintoinen aihe tulevaa tutkimusta on tunnistaa muita mahdollisia tavoitteita miR-375, ja tarkemmin sanottuna mahdollista osallistumista JAK2 mahasyövän etäpesäkkeitä.

tukeminen Information

Kuva S1.

Kohdunulkoinen ilmentyminen miR-375 estää migraation MGC-803 soluja. MGC-803-solut, jotka on transfektoitu miR-375 esiaste (miR-375), negatiivinen kontrolli (negatiivinen) tai ei kumpikaan edellä (Mock) alistettiin Transwell migraatiokokeessa (A) ja alusta-haavan analyysi (C). (A) edustaja aloilla invasiivisia solujen alapuolella kalvo, joka kiinnitettiin ja värjättiin DAPI. (B) kokonaismäärä siirtynyt solujen alapinnalle kalvon laskettiin IPP 6,0 ohjelmisto. (C) Solut muutto haavoittunut alue oli valokuvattu mikroskoopilla 0 h, 12 h, 24 h ja 36 h haavan tekemisen. Katkoviivat osoittavat alueet puuttuvat solut. (D) nopeus muuttoliikkeen tutkittiin mittaamalla etäisyyden solujen siirtynyt haavan reunasta kohti keskustaa 36 h jälkeen naarmuuntumista. Tiedot esitetään keskiarvona ± SE vähintään kolmen itsenäisen kokeen. Bars, 50 pm. *

P

0,05, **

P

0,01.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0099516.s001

(TIF) B Kuva S2 .

yliekspressio JAK2 kumoaa miR-375 aiheuttama esto MGC-803 solut muuttoliikettä ja invaasiota. Solut, jotka on transfektoitu esitetty vektoreita tai oligonukleotidit altistettiin kanssa Transwell muuttoliike (A) tai Matrigel invaasiomääritys (C). Pelastus kokeilut miR-375 yliekspressio suoritettiin ektooppinen ilmentyminen JAK2 ilman 3′-UTR in miR-375-käsitellyt solut. (A, C) edustaja kentät solujen alaosaan 12 tunnin kuluttua siirtämisestä tai invaasion näytettiin. Mittaviivat 50 pm. (B, D) kokonaismäärä siirtynyt tai invasiivisia soluja yhdeksästä satunnaisesti valitusta aloilla laskettiin IPP 6,0. *

P

0,05, **

P

0,01.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0099516.s002

(TIF) B Kuva S3 .

JAK2 ei ole vaikutusta miR-375 ilmentymistä. AGS ja MGC-803-solut transfektoitiin JAK2 yliekspressio vektoriin tai kontrollivektorilla ja alistettiin RT-PCR-analyysi ilmentymistason miR-375. RNA: n taso U6 käytettiin kontrollina.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0099516.s003

(TIF)