Krooninen sairaus

tiivistelmä

SSX on transkriptiotekijä, jossa vaikeasti onkogeeninen toimintoja ilmaistu erilaisissa ihmisen kasvainten epiteelin ja mesenkymaaliset alkuperää. Se on herättänyt huomattavaa kiinnostusta tavoitteeksi syöpäterapialle koska se saa aikaan humoraalivasteiden ja näyttöjen rajoitettu ilmaisun syöpään, spermatogonioiden ja mesenkymaaliset kantasolut. Täällä, tutkimme onkogeenisiä ominaisuuksia SSX käyttämällä RNA-interferenssiä knock-alas endogeenisen ilmentymisen SSX melanooman ja luusarkoomasolulinjoissa. Ehtyminen SSX ilmaisun johti pienentyneeseen leviämisen kanssa solujen kerääntymistä G1 vaiheessa solusyklin. Huomasimme, että kasvua edistävät ja selviytymistä ominaisuudet SSX välittyvät osittain joskin modulaatio MAPK /Erk ja Wnt signalointireitteihin, koska SSX hiljentäminen esti Erk-välitteistä signalointia ja transkription cMYC ja Akt-1. Huomasimme myös, että SSX muodostaa ohimenevä kompleksin β-kateniinin at G1-vaiheesta S-vaiheeseen tuloksena muuttuneen ilmentymisen β-kateniinin kohdegeenien, kuten E-kadheriinin, etana-2 ja vimentiinista, mukana epiteelin mesenkyymisoluyhteisviljelmissä siirtymiä. Tärkeää vaiennettaisi SSX ilmaisun

in vivo

merkittävästi heikentynyt kasvu melanooman tuumoriksenograftien. Kasvainbiopsioissa alkaen SSX vaiennetaan kasvaimista näytetä pienentää sykliini A: värjäys, osoittaa alhainen leviämisen ja pääasiassa cycloplasmic β-kateniinin verrattuna SSX ilmentävien kasvainten. Esillä oleva tutkimus osoittaa, aiemmin tuntematon funktio SSX, että onkogeeni ja kasvaimen tavoite kehittää uusia syöpälääkkeitä.

Citation: D’Arcy P, Maruwge W, Wolahan B, Ma L, Brodin B (2014) onkogeeninen tehtävät Cancer-Kivesten antigeeni SSX proliferaatioon, Survival, ja signalointireitteihin syöpäsolujen. PLoS ONE 9 (4): e95136. doi: 10,1371 /journal.pone.0095136

Editor: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 17 syyskuu 2013; Hyväksytty: 24 maaliskuu 2014; Julkaistu: 30 huhtikuu 2014

Copyright: © 2014 D’Arcy et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia Ruotsin Children Cancer Foundation, Lillian Sagens och Curt Ericssons Forskningsstiftelsellä, ja Tukholman Syöpäsäätiön Bertha Brodin. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

SSX

tunnistettiin alun perin osana

SS18 /SSX

-fuusiogeenin nivelkalvonestees- sarkooma [1] ja koska melanoomaan liittyvä kasvain antigeeni HOM-Mel40 [2] . Se koostuu perheen yhdeksän, erittäin homologisia geenejä järjestettiin klustereita X-kromosomissa tuotteita luokiteltu syöpää kivesantigeenien perustuu niiden rajoitetulla ilmaisun kasvaimissa ja kiveksissä. Normaaleissa soluissa, SSX ilmentyminen on havaittu spermatogonioista [3], [4], mesenkymaaliset kantasolut [5]. Ilmaus SSX perheenjäsenten kasvaimia on tutkittu laajasti, ja on osoitettu, että SSX1, SSX2, SSX4 ja SSX5 ilmaistaan ​​itsenäisesti tai samanaikaisesti usein näyttää laajalti hajallaan tai paikallinen ekspressiokuvioita kasvaimissa epiteelin, hematopoieettisten, hermo ja mesenkymaaliset alkuperä [3], [6] – [8].

proteiini on runsaasti varattuja aminohappoja [9], ja sisältää kaksi ns repressorin verkkotunnusten tukahduttaa transkriptio

in vitro

; Kruppel liittyvä laatikko lokalisoitu N-päässä, ja vahvempi repressori verkkotunnuksen (RD) on C-päässä [10], [11]. Soluissa, SSX on rakeinen ekspressiomalli ja lokalisoituu tumaan ja sytoplasmaan [5], [12]. Suora vuorovaikutus SSX DNA ei ole osoitettu, on siis oletetaan, että SSX tukahduttamiseksi transkriptio muodostamalla komplekseja DNA sitovia proteiineja. Tämän tueksi mallin sekä SSX ja SS18 /SSX fuusio geenituotteen on osoitettu olevan vuorovaikutuksessa jäsenten Polycomb repressorin monimutkainen BMI-1 ja Ring 1 [13], ja ydinhistonien [14] viittaa siihen, että SSX voi ohjata ilmentymistä säätelevien geenien solujen erilaistumista. Muut proteiinit, jotka ovat vuorovaikutuksessa SSX ovat Ras-like GTPaasia sitova proteiini RAB3IP, ydin- proteiinin SSX2IP [15], ja LIM homeobox proteiinin LHX4 [16].

Koska sen löydön syövän-kives-antigeeni, Immunoterapeuttisina kohdentaminen SSX on herättänyt suurta kiinnostusta kuin syöpälääkkeen strategian ansiosta immunogeenisyyttä [2], [3], rajoitettu kasvain ilme, ja korrelaatio SSX ilmaisun ja taudin etenemiseen [8], [17], [18] . T-solujen sytotoksisia vasteita on luotu

in vitro

vastaan ​​SSX epitooppeja [19] – [21] kuitenkin validointi SSX terapeuttisena kohteena

in vivo

ei ole raportoitu. Tässä tutkimuksessa olemme arvioineet roolin SSX välittämisessä solujen kasvua ja selviytymistä syöpäsolujen vuonna

vitro

ja

in vivo

, ja tunnistaa kasvu signalointireitteihin SSX ilme.

tulokset

SSX2 ilmentyy ensisijaisesti etäispesäkemelanoomassa vauriot ja solulinjat, mutta ei normaaleissa soluissa

Tutkimme ilmaisua SSX1 on SSX5 12 metastaattinen melanooma vaurioita, 9 varhain kuljetettiin melanoomasolulinjoja, normaalin ihmisen epiteelin melanosyyttien (NHEM) ja ihmisen diploidi fibroblasteja (HDF) käyttämällä sekvensointia validoitu RT-PCR-menetelmää on aiemmin kuvattu [5]. Vastaavia muita julkaistut tutkimukset huomasimme, että useat SSX transkriptit samanaikaisesti ilmentyy kaikissa ihosyövän ja melanoomasolulinjoja tutkinut. Mielenkiintoista SSX2 havaittiin lähes kaikissa melanooman kudoksissa ja solulinjoissa (95%) verrattuna SSX4 (57%), SSX1 (38%), SSX5 (33%) ja SSX3 (19%) ilmentymistä. Mikään SSX jäsenten havaittiin normaalin ihmisen epiteelin melanosyyttien (NHEM) tai normaalin ihmisen diploidi fibroblasteja (HDF) (kuvio 1). Sekvenssi käytettyjen alukkeiden havaitsemiseksi SSX-1 SSX-9 ja ilmentymistä SSX luusarkoomista solulinjoissa, mukaan lukien linjan tässä tutkimuksessa käytetyt SAOS-2, on esitetty kuviossa S1.

SSX: n ilmentyminen oli analysoidaan sisäkkäisen RT-PCR-menetelmällä aikaisemmin on kuvattu käyttäen alukkeita tunnustaa SSX1 että SSX 9 cDNA. Tuore koepaloja saatiin etäpesäkeleesioita melanoomapotilaiden. DFW melanooman solulinjaa, joka ekspressoi korkeita tasoja SSX1 on SSX5 käytettiin RNAi tutkimuksiin. NHEM: normaalin ihmisen epiteelin melanosyyttejä, HDF: ihmisen diploidien fibroblastit.

Ehdolliset hiljentäminen SSX Estää kasvainsoluproliferaation mukaan estämällä kasvainsolujen S-vaiheen

Saadaksesi käsityksen funktio SSX kasvainsoluissa, me vaiennetaan SSX on melanoomasolulinja DFW, joka ilmentää SSX1 on SSX5 (kuvio 1) käyttäen plasmideja sekä vakaan ja doksisykliini ehtolausekkeen shRNA molekyylien kohdistaminen SSX1-9 transkriptit (kuvio 2A ja kuvio S2), kuten on kuvattu aineisto ja menetelmät.

A) graafinen esitys shRNA sekvenssi (komplementaarinen SSX1 jotta SSX9) liitettiin shRNA vektoreihin vakaa ja doksisykliini säännelty shRNA ilmaisu (ks materiaali ja menetelmät). B) Western blot, joka osoittaa SSX ekspression kontrolli-shRNA ja SSX-shRNA transfektoitujen solujen 24 tunnin kuluttua doksisykliinin lisäksi elatusaineeseen. C) Cell pesäke kvantifiointiin ohjaus ja SSX-shRNA transfektoitujen DFW kasvatettujen solujen läsnä doksisykliinin ja 8 päivää. D) Solulisääntyminen käyrät määritetty laskemalla elävien solujen määrä valvonta- ja SSX hiljaisuus kulttuureissa käyttäen trypaanisinistä värjäystä. E) S-vaiheen solusyklin etenemisen määräytyy BrdU vuonna fluoresenssi soluerottelijaa (FACS). F) Suhteellinen solujen G1, S ja G2 vaiheisiin solusyklin hallinnassa ja SSX shRNA pudotti DFW soluissa yli 96 tunnin ajan.

Ehdollinen vaiennettu SSX indusoitiin lisäämällä doksisykliini keskipitkällä ja johti merkittävään laskua SSX proteiinia 24 tunnin kuluttua (kuvio 2B). Solujen elinkelpoisuus laskee käyttäen trypaanisiniekskluusiolla soluja osoitti, että läsnä eläviä, mutta ei-jakautuviin soluihin, kun läsnä on doksisykliini osoittaa, että SSX ilmaisu on tarpeen solujen kasvun (kuvio 2D). Tutkia pätevyyden Tämän havainnon myös suoritettu siRNA knockdovvn SSX ilmaisun kaksi luusarkoomasolulinjoissa, U2-OS ja Saos-2, käyttäen RNAi-molekyylien kohdistaminen SSX1-9 tai spesifinen SSX1 ja SSX2. Samoin kuin aikaisemmat tulokset SSX ehtyminen johti pienentyneeseen leviämisen vertailuryhmän siRNA osoittaa, että fenotyyppi havaittu on bona fide vaikutus SSX Knockdown ja johdu off-tavoite vaikutukset (kuva S2). Vuonna klonogeenisten määrityksissä hiljentämisen SSX in DFW kasvainsolujen johti heikentynyt pesäkkeiden muodostumisen havaita nelinkertaisen määrän väheneminen pesäkkeiden soluissa kasvatettu doksisykliinin osalta 14 päivää verrattuna kontrolleihin (kuvio 2C). Solusyklin analyysi DFW solujen lisäyksen jälkeen doksisykliinin osoitti, että solut eivät anna S-vaiheen solusyklin (kuvio 2D). Prosenttiosuus soluja S-vaiheessa laski 50% (0 ja 24 tuntia), 5% (72 ja 96 tuntia), yhdessä samanaikaisesti kertyminen solujen G1 vaiheeseen, joka ilmaisee vian solusyklin etenemisen ( Kuvio 2F). Vahvistamaan tämän vaikutuksen SSX ilmaisun S-vaiheeseen pääsyn, me synkronoitu villityypin (SSX +) ja SSX tippuu alas DFW soluja G1 /S-vaiheessa tupla tymidiini lohko ja päästää normaaliin FBS sisältävässä väliaineessa. Ohjaus (SSX +) DFW solut nopeasti edennyt G1 S-vaiheen 4-10 h vapautumisen jälkeen tymidiiniä lohko. Sen sijaan SSX-pudotus soluja ei voinut kulkea G1 /S-vaiheeseen rajan, jossa solujen pysyessä pidätettiin G1 vaiheessa (kuvio 3A). Tämän mukaisesti havaintojen tasot sykliini E, säätö- osa sykliini E-CDK2 monimutkainen ja tärkeä säätelijä G1 ja S-vaiheen etenemisen, väheni rinnakkain alaspäin säätely SSX. (Kuva. 3B).

Ohjaus (SSX +) ja vaiennettu (SSX-) DFW melanooma solut synkronoidaan G1 /S-vaiheessa tupla tymidiini saarto ja vapautuu tavanomaisessa väliaineessa kuvatulla aineisto ja menetelmät. A) Entry solujen S vaiheeseen (S) analysoitiin määrällisesti DNA sisältöä käyttämällä propidiumjodidi (PI) sisällyttäminen ja fluoresoiva soluerottelijaa FACS. B) Western blot, joka osoittaa aikariippuvainen ilmaus SSX ja sykliini E ohjaus ja SSX vaiennettu (+ Dox) DFW soluja. Solut synkronoitava G1 /S (0 h), vapautuu normaali alustalla, joka sisälsi FBS ja kerättiin osoitetuissa aikapisteissä.

SSX välittää kasvainsolujen kasvua läpi MAPK /Erk signalointireitin

havainto, että SSX ylläpitää solujen lisääntymistä ja tarvitaan pääsyn kasvainsolujen S-vaiheen sai meidät tutkimaan, jos tämä vaikutus liittyi signa- jotka stimuloivat solujen lisääntymistä ja selviytymistä. Aloitimme vertaamalla potentiaalia SSX ilmentävien ja knockdown solujen aktivoimiseksi (fosfory-) solunsisäinen sanansaattajat Erk ja Akt-1, seuraava kasvutekijä stimulaatiota.

Menetys SSX-ilmentyminen liittyy pienentynyt fosforylaation solunulkoisen signaalin -regulated kinaasi (Erk) 1 ja 2, mutta ei Akt-1 seuraavat stimulaation FBS. Pieneneminen proteiinin tasot Akt-1 on kuitenkin havaittu SSX vaiennetaan soluissa (kuvio 4). Tuloksemme viittaavat siihen, että vaikutukset SSX kasvainsolujen proliferaatioon on liitetty ainakin osittain moduloimalla MAPK /Erk signalointireitin.

Western blot, joka osoittaa ekspression Erk1-2 ja Akt-1 ja niiden aktivoitu (fosforyloituu) lomakkeet Pakt (Ser 473) ja Perk (Thr202 /Tyr204) valvonta shRNA ja SSX-shRNA DFW soluissa. Solut nälkiinnytettiin seerumivapaassa 36 tunnin (0 h), ja solun signaloinnin aktivoitiin lisäämällä seerumi median. Näytteitä kerättiin 10 ja 30 minuutin (10 ’ja 30’) sekä 6 ja 24 tuntia (6 h, 24 h) seuraava seerumi stimulaatiota. SSX ilmentyminen määritettiin immunosaostuksella (fl188 vasta-aine) ja western blot (N18-vasta-aine) myöhemmän recognozing bändit noin 22 ja 14 kDa.

SSX Vuorovaikutus on β-kateniinin sääteli EMT Associated β kateniinia Genes

3 ’alueella SSX-1, 2 ja 4 geenit fuusioidaan lähes koko SS18-geenin nivelkalvon sarkoomia. Mielenkiintoista SS18 /SSX2 fuusioproteiini muodostaa kompleksin β-kateniinin tuloksena aktivaation T-solun tekijän TCF /lymfosyyttien tehostajana tekijä (Lef) reportteri-konstrukti, kun ektooppisesti ilmaistaan ​​nisäkässoluissa [22]. Siksi selvitettävä, jos tämä vuorovaikutus säilyy varten täyspitkän SSX proteiineja.

Koska SSX ilme vaihtelee solusyklin etenemisen, me synkronoitu DFW ja Saos-2-solut (aika 0) klo G1 /S-vaiheessa rajan ja vapautuu solun syklin 6 ja 24 tuntia ja suoritettiin immunosaostus solulysaateille kanssa SSX vasta-aineilla ja immunoblottaus β kateniinin vasta-aineita (kuvio 5a). β-kateniinin oli kerasaostuvat SSX sekä Saos-2 ja DFW solujen etene G1 /S (aika 0) sekä soluista, jotka päästettiin solusyklin 6 ja 24 tuntia. Varmistaakseen spesifisyys, yhtäläinen proteiini määrät Saos-2 solu-uutteet immunosaostettiin merkitystä immunoglobuliinien hiiren (M) ja kanin (R) kontrolleina (kuvio 5A).

A) DFW ja Saos-2 solulinjoista synkronoitu in G1 /S kaksinkertaisella tymidiinillä saarron kuten materiaali- ja menetelmät (0 tuntia), ja vapautuu normaali alustalla, joka sisälsi FBS 6 ja 24 tuntia. SSX immunosaostettiin proteiini uutteet kerätään ilmoitettu ajankohtina käyttäen kanin anti SSX-vasta-ainetta (FL188, havaitaan SSX1-9). Vastaavan määrän proteiinia G1 /S esti Saos-2-solut immunosaostettiin irrelevantin anti-hiiri (m) tai ant-kanin (r) vasta-aine. Proteiinikompleksi suoritettiin elektroforeesi pelkistävissä olosuhteissa ja siirrettiin eetteriin vuohen anti SSX (N18) tai hiiren anti β-kateniinin aineita. Yhteensä syöttö tasot β-kateniinin on esitetty ylemmässä geelin kuva. B) aktiivisuus TCF /Lef lusiferaasin reportteri SSX vaimentuu ja hallita DFW ja Saos-2-soluissa 48 tuntia transfektion jälkeen siRNA-molekyylejä (n = 5). Aktiivisuus TCF /Lef reportteri SSX vaiennetaan solujen suhteessa, että kontrollisolujen (= 1). C) Gene transkriptio liittyy SSX ilme sekä Saos-2 ja DFW solujen riippua PCR paneelit, jotka sisältävät 84 liittyviä geenejä epiteelin ja mesenkymaalitransitioon (n = 5) ja vahvistettu Q-RT-PCR in SSX vaiennetaan ja hallita DFW ja Saos -2 soluja kuten kuvataan aineisto ja menetelmät. SSX pudotettiin vuonna Saous-2 tai DFW soluihin käyttämällä siRNA-molekyylejä tai shRNA vektoreita kuten on osoitettu. Solut kerättiin ja RNA eristettiin 6 meidän jälkeen siRNA transfektion tai 6 tuntia lisäämisen jälkeen doksisykliini alustaan ​​(ehdollisesti shRNA). Menetys SSX ilmaisun jälkeen, RNAi varmistettiin western blot ennen jokaista Q-RT-PCR-array, kuten kuviossa on esitetty. Kertamuutosta [2∧ (delta Delta Ct)] on normalisoitu geenien ilmentyminen [2∧ (delta Ct)] in SSX vaiennetaan soluissa jaettuna normalisoitu geenien ilmentyminen kontrolliryhmässä (SSX +) soluja. Arvot alle osoittaa kielteistä tai down-regulation.

Päinvastainen koe suoritettiin myös joka solu otteita DFW saostettiin β-kateniinin vasta-aineilla ja blotattiin anti-SSX vasta-aineita. Immunosaostus β-kateniinin johti rasaostamalla SSX. Irtisanomisaika on, että saanto SSX jälkeen saatu β-kateniinin vasta oli pienempi kuin käänteisessä immunosaostus, mikä voi johtua lisääntynyt kilpailu β-kateniinin sitovien muiden proteiinien (kuva S3).

kanoninen Wnt-reitin, β-kateniinin sitoutuu TCF /Lef transkription aktivoimiseksi liittyvien geenien soluproliferaatiota, selviytyminen, liikkuvuuteen ja erilaistumiseen [23]. Tämän perusteella selvitettiin, jos vuorovaikutus β-kateniinin kanssa SSX vaikutukset transkription TCF /β-kateniinin kohdegeenien. Ensin määritetään aktiivisuuden TCF /Lef-lusiferaasireportteri in SSX-tippuu alas ja ohjaus (SSX +) soluja. DFW ja Saos-2-solut transfektoitiin tetraplicates kanssa TCF /Lef- tulikärpäsen lusiferaasi toimittaja ja joko siRNA on SSX tai valvontaa molekyylejä. Aktiivisuus toimittaja arvioitiin 48 tuntia transfektion jälkeen. Mielenkiintoista havaitsimme lasku reportteri aktiivisuuden siRNA-SSX käsiteltyjen solujen viiden itsenäisen kokeen (kuvio 5B). Me tutkimme seuraavaksi SSX /β-kateniinin vuorovaikutus liittyi muutoksia transkriptio endogeenisen β-kateniinin /TCF kohdegeenien. Tätä varten vertasimme transkription profiileja ohjaus ja SSX pudotus käyttäen RT-PCR-paneelit 84 transkriptien liittyy epiteelisolujen ja Mesenchyma (EMT) siirtymät Saos-2-soluissa. Valitsimme liittyvien geenien EMT perustuu rooliin β-kateniinin edistämisessä EMT ja edellisessä raportti osoittaa, että SSX ilmentyminen liittyy invasiivisia kapasiteetti kasvainsolujen ja ilmentyminen mesenkymaalisten geenien [5]. Saadut tulokset 5 itsenäisen muodostelman varmistettiin RT-PCR: llä DFW solulinjassa. 84 analysoidaan geenejä huomasimme, että menetys SSX ilmaisun Saos-2 ja DFW nähtiin lisääntynyt transkriptio Akt-1, E-kadheriinin (CDH1), GSK3p, Etana 2 (SNAI2), c-myc (cMYC), ja vimentiinista (VIM) (kuvio 5C). Lukuun ottamatta Akt-1, kaikki nämä geenit kuljettaa DNA: ta sitovan sekvenssit TCF /Lef, ja niitä pidetään β-kateniinin tavoitteet. Havaitsimme myös lisääntynyt kollageenin 3A transkription seuraavat säätelyä alaspäin SSX Saos-2 (taulukko S1).

siRNA kohdentaminen SSX heikentää -tuumoriksenografti Growth

on osoittanut, että SSX tarvitaan kasvaimen solu kasvaa

in vitro

, tutkimme kasvun ohjaus ja SSX vaiennettu hiirissä. Olemme injektoidaan subkutaanisesti SCID-hiirissä joko kontrolli-shRNA (SSXm) tai SSX-shRNA (SSXi) transfektoitu stabiilisti DFW-soluja (kuvio 5A-B), tai DFW solut, joissa shRNA ekspressio ehdollisesti säännelty doksisykliinillä (kuvio 5C-D ). Vuonna ehdollinen järjestelmässä, SSX knockdown aiheutettiin implantoitu ihon alle hidas vapautuminen doksisykliini pellettejä kuvatun materiaalin ja menetelmät. Kontrolliin verrattuna (SSX +) tuumoriksenografteja, SSX knockdown kasvaimia osoitti heikentynyt kasvu havaittuna alentunut kasvaimen kasvukäyrät ja vähentämällä kasvaimen tilavuus päätepisteessä määrityksen (kuva 6 A-D). Mikroskooppisen, SSX syöpäkasvain näkyy laaja kuolion, jopa 80% ja oli rajattuja rajoja (kuvio 6E, HTX) paikallisten lisääntyvien sykliini positiivisia soluja. Sitä vastoin kontrolli kasvaimia osoitti radial solujen kasvua runsas proliferatiivinen (sykliini Myönteinen) alueet sekä ydin- β-kateniinin (kuvio 6E). Mielenkiintoista SSX Knockdown kasvaimia osoitti pääasiassa sytoplasmisen lokalisoinnin β-kateniinin verrattuna ohjaus kasvaimia, mahdollisesti osoittaen rooli SSX solu lokalisaatio β-kateniinin (kuvio 6E). Olemme vahvistaneet SSX Knockdown kasvaimissa Western blot tuoreen kasvainbiopsioissa. (Kuva 6F).

A) DFW melanoomasoluja stabiilisti transfektoitu SSX-shRNA (SSXi) tai kontrollina shRNA (SSXm) vektori, laajennettu ja ksenosiirrettyjä SCID-hiirissä. A) Kasvaimen tilavuus määritettiin ilmoitettuina aikoina. B) Kasvaimen tilavuus päätepisteessä kokeen (21 päivää). C) kasvukäyrät ksenograftien peräisin ehdollisesti SSX-shRNA vaiennetaan DFW soluja (SSX-) ja ohjaus shRNA (SSX +) soluja. Doksisykliini annettiin kaikkien hiirten ihon alle insertoimalla hitaan vapautumisen pellettien mantain tasainen pitoisuus doksisykliiniä (10 uM) ja 21 päivää. D) Kasvaimen tilavuus päätepisteessä kokeen. E) immunohistokemia kasvainten visualisoida valomikroskoopilla käyttämällä 10x tavoite, lisää 63x suurennus: Hematoksyliini (HTX), leviämisen merkki (ki-67) ja β-kateniinin (β-kissa).

Nämä tulokset osoittavat, että alas-säätely SSX ilmaisun heikentää kasvaimen kasvua

in vivo

ja tuloksia muuttuneessa β-kateniinin lokalisointi.

keskustelu

SSX proteiineja koodaavat geenien, jotka ovat vain ilmaistu useissa syövän alatyyppejä ilmentymistä normaaleissa kudoksissa rajoitettu sukusolujen, trophoblasts ja sikiön mesenkymaaliset kantasolut. Koska tämä rajoitettua ilmaus, SSX antigeenit ovat houkuttelevia kohteita kasvaimen immunoterapiaa [21]. Kuitenkin toiminta SSX proteiinien siittiöiden tai tumorgenesis on huonosti määritelty. SSX ilmaistaan ​​selvä alaryhmien spermatogonioiden ja sikiön mesenkymaaliset kantasolut viittaa rooli SSX solun erilaistuminen [4], [5]. Kasvaimissa, SSX lisää invasiivisia potentiaalin ja tukahduttaa E-kadheriinin ilmentymisen, kuten on esitetty melanooma [5] ja rintasyövän soluja, vastaavasti [24]. Tuloksemme osoittavat, että ekspressio SSX on välttämätöntä merkintä tuumorisolujen S-vaiheen solusyklin ja siten, kasvainsoluja, jotka ilmentävät SSX ylläpitää solujen lisääntymistä ja pysyvyyttä. Nämä toiminnot voivat liittyä kyky SSX moduloida MAPK /Erk, Akt ja β-kateniinin signalointireitteihin. Yhdenmukainen roolin SSX soluproliferaatioon, knockdovvn SSX estetty Perk aktivoinnin keskeinen osa leviämisen kaskadin aloittaman solunulkoinen kasvutekijä kinaasien. Lisäksi SSX pudotus johti myös vähentää ilmentymistä Akt, solun signalointi-kinaasin on keskeinen rooli useilla solun toimintoja, kuten solun kasvussa, aineenvaihduntaa ja selviytymistä [25]. Tämän tueksi Viimeaikaiset raportit ovat osoittaneet, että SSX on välttämätön melanooma solujen lisääntymisen [26] ja hyökkäys kapasiteetti rintasyövän solujen [24].

Huomasimme, että SSX suoraan vuorovaikutuksessa β-kateniinin G1 pidätetty soluja ja että tämä vuorovaikutus vaikuttaa transkriptioon β-kateniinin /TCF kohdegeenien koska vaiennettaisi SSX-ilmentyminen liittyy alentunut aktiivisuus TCF /Lef reportterikonstruktio ja vähentynyt transkriptio β-kateniinin /TCF kohdegeenien, kuten E -cadherin, GSK3b, etana-2, vimentiinistä ja c-Myc.

β-kateniinin on voimakas transkriptiotekijä, jossa on suuri luettelo kohdegeenien osallistuvien solujen lisääntymisen, stemcellness ja epiteelin ja mesenkymaaliset siirtymiä (EMT ). Aikaisemmassa raportissa ehdotettu rooli SSX EMT perustuu havaintomme, että melanooma solulinjassa ja sikiön mesenkymaaliset kantasolut, ilmentyminen SSX liittyi mesenkymaalisten fenotyyppiä kuten lisääntynyt solujen invaasiota kapasiteetti väheni E-kadheriinin ja lisääntynyt matriisi proteinaasi 2 (MMP2) lauseke [5]. Olemme nyt osoittaa, että SSX vuorovaikutuksessa β-kateniinin ja perustuvat transkriptio profiilitietoja ehdottaa, että tämä vuorovaikutus voi aiheuttaa tai ylläpitää mesenkymaaliset fenotyyppi. Aktiivisuus SSX /β-kateniinin kompleksin endogeenisen kohdesivustot voi kuitenkin olla riippuvainen solulinjaan, aika ja signalointia mikroympäristö.

SSX on nykyinen tavoite kehittämiseen solupohjaisen immunovaccines . HLA A2 rajoitettu sytotoksinen T-solujen (CD8 +), jotka tunnistavat SSX peptidejä on eristetty imusolmukkeista peräisin SSX2 seropositiivisista melanoomapotilaan [19] ja on myös generoidaan immunotargeting eturauhassyöpäsolujen

in vitro

[ ,,,0],21]. Lisäksi on raportoitu, että hoito autonominen dendriittisolujen pohjustetaan SSX peptidien johti kasvaimen remission on nivelkalvon sarkooman potilas [27]. Tässä raportissa, osoitamme, että transkription hiljentäminen SSX estää niiden kasvun melanooman ksenograftien joka tukee paremmin merkitystä SSX kuten terapeuttisena kohteena.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics Statement

Kaikki eläin työ on hyväksynyt Ruotsin keskeinen aluksella eläinkokeissa (Centrala Försöksdjur nämnden, CFN), Tukholma North. Eettinen hyväksyntänumeroista N399 /07, N340 /10 B. B. Eläinten ole suoritettu tutkimuksia niiden eettisten ohjeiden. Kokoelma kliinisistä näytteistä tutkimusta tehtiin potilaan concent ja hyväksytty Karolinska, forskningsetikkommitté Nord nro 03-019. Kaikki tiedot analysoitiin anonyymisti ja periaatteiden mukaisesti ilmaistu Helsingin julistuksen.

Solulinjat

DFW on HLA-A2 melanoomasolulinjalla saatu metastaattisen melanooman kasvain. Linjalla syntyy Karoliinisen instituutin [28], ja ystävällisesti R. Kiessling. SAOS-2 (sarkooma osteogeeninen) on solulinja, joka on johdettu ensisijainen osteosarkooma [29], ja U2OS on luusarkoomasolulinjassa, molemmat solulinjat saatiin M. Fritsche, Universität Freiburg, Saksa. Kaikki solulinjat havaita korkea od SSX1 on SSX5, määritettiin käyttämällä RT-PCR: llä (kuvio 1 ja kuvio S1). Soluja kasvatettiin yksikerroksisina viljelminä, in RPMI (Sigma), jota oli täydennetty 10% tetrasykliini-FBS: ää (Clontech), 100 ug /ml streptomysiiniä, 100 U /ml penisilliiniä ja 2 mM L-glutamiini, jossa kostutetussa atmosfäärissä, ja 5% CO

2 37 ° C: ssa.

SSX-RNA-interferenssi

sopiva RNA-interferenssi (RNAi) oligonukleotidi on suunnattu kaikille SSX isoformit SSX (1, ​​2, 3, 4, 4B, 5 , 7, 8, ja 9) ja SS18 /SSX1, SS18 /SSX2 ja SS18 /SSX4 fuusio selostukset ilmaistuna nivelkalvon sarkoomia tunnistettiin rinnastamalla mRNA eksoni 5, eksonin 6 ja 3’UTR-alue SSX1 on SSX5 käyttäen perustettu RNAi kriteerit. Insertit on suunniteltu sisältämään 19 ep: n SSX mRNA-sekvenssin välissä on 9 nukleotidin ei-komplementaarisia spacer, ja sen jälkeen käänteinen komplementaarinen 19 emäsparin mRNA-sekvenssin (kuvio 2A). Sillä shRNA vektorisäätö, salattu sekvenssi, joka sisältää 3 yhteensopimattoman tehtävissä myös kloonata vektoreihin. shRNA oligonukleotidit kloonattiin pSuper (vakaan) ja pSuperior (doksisykliini indusoituva) vektoreita (Oligoengine) ja seulottiin PCR: llä ja DNA-sekvensoinnilla.

SSX hiljentäminen solulinjoissa käytimme sekä shRNA vektoreita ja siRNA-molekyylit . Tutkia spesifisyyden RNAi-SSX järjestelmä ja valvoa off-tavoite vaikutukset vaikutus siRNA-SSX Tässä tutkimuksessa käytetyt verrattiin kaupallisesti saatavilla shRNA vektoreita suunnattu SSX1 ja SSX2 3 independet solulinjoissa (DFW, U2OS ja SAOS- 2. Tämä on esitetty täydentävä kuviossa 2.

lyhytaikaisissa transfektioissa DFW transfektoitiin pSuper SSX shRNA (SSXi) tai valvontaa RNA-vektorin (SSXm) yhdessä tyhjän vektori, jossa neomysiiniresistenssigeeni kasetti. Soluja valitaan transfektion jälkeen G418 sisältävillä alustoilla, ja laajennettu irtotavarana ennen määrityksiä. Jos sukupolven indusoituvan siRNA-solujen, DFW solut transfektoitiin tetrasykliini repressorin ilmentävällä vektorilla pcDNA6 /TR (Invitrogen) ja pSuperior vektoriin käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden ja valitaan 8 ug /ml blastisidiinia ja 1 ug /ml puromysiiniä. Cell kloonit valittiin perustuen niiden tehokkuutta äänenvaimennusjärjestelmissä SSX ilmentymisen lisäyksen jälkeen doksisykliinin pitoisuutena 10 ug /ml arvioitiin western blot.

geenin transkriptio tutkimuksissa villityypin DFW tai Saos-2 transfektoitiin siRNA-SSX tai ohjata siRNA-molekyylejä (Ambion). Tehokas vaiennettu SSX vahvistettiin transfektoidut kloonit 8 ja 24 tuntia ennen RNA: n eristämistä ja Q-RT-PCR paneelit.

Yksinkertaisuuden SSX vaiennetaan soluja kutsutaan SSX- ja ohjaus solujen SSX +.

Cell Cycle Synkronointi ja analyysi

Solut synkronoidaan G1 /S-vaiheessa kaksinkertaisella tymidiinin lohko.

Lyhyesti; Solut maljattiin 50% konfluenssiin ja käsiteltiin 2 mM tymidiiniä 12 tuntia, tripzinized, maljattiin uudelleen ja vapautuu normaalia väline 8 tuntia, ja pysäytettiin jälleen elatusaineessa, joka sisälsi 2 mM tymidiiniä 12 tunnin ajan. Ehdollisen hiljentäminen SSX on synkronoitava DFW soluissa, doksisykliini (10 ug /ml) lisättiin soluihin 2 tuntia ennen vapauttamista solujen normaalin keskitason ja solujen Sitten näytteitä kerättiin ilmoitettuina ajankohtina ja analysoitiin propidiumjodidia värjäystä tai 5′ bromi-2′-deoksi-uridiini (BrdU) (Roche Diagnostics), värjäystä ja FACS-analyysiä. Solujen prosenttiosuus kussakin vaiheessa solusyklin laskettiin käyttäen ModFit ohjelmistoa.

Vasta-aineet, immunoblottaus ja immunosaostus

SSX immunosaostus, viljellyt solut lyysattiin RIPA-lyysipuskuria (50 mM Tris HCl: lla, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,25% Na-deoksikolaattia, 1% NP-40), jota oli täydennetty proteaasi-inhibiittorit (Roche). Näytteet sonikoitiin sitten ja sentrifugoitiin 10 minuuttia (14000 x g). 100 ug proteiinia saatu supernatantti suspendoitiin uudelleen yhteensä 1 ml PBS: llä, joka sisälsi proteaasi-inhibiittoreita ja immunosaostettiin yli yön 4 ° C: ssa 3 ug anti SSX 1-9-vasta-aineen fl188 (Santa Cruz Technologies), joka on kytketty proteiini-G-Dynabeadseja (Invitrogen). Immunosaostumat pestiin kerran lyysipuskurilla, ja kahdesti PBS: lla suspendoitiin uudelleen latauspuskuria (Invitrogen), kuumennettiin 70 ° C: ssa 5 minuuttia ja ratkaistaan ​​4-12% polyakryyliamidigeeleillä ja Western-blottauksella.

havaitsemiseksi proteiinien western blot, solut hajotettiin

in situ

kanssa lysis /latauspuskuria; sonikoitiin ja kuumennettiin 70 ° C: ssa ja ratkaistava 4-12% polyakryyliamidigeelilelektroforeesilla western blottauksella.

Seuraavia vasta-aineita käytettiin: FL188 (kasvatettu kaniinin) havaitsemista varten SSX 1-9, ja N18 ( kasvatettu vuohi) havaitsemista varten SSX1-4, 6 ja 8, (Santa Cruz Biotekniikka), ja talon tuotettu polyklonaalinen vasta vastaan ​​SSX peptidisekvenssiä (SSX PAB); vasta-aineita sykliini-E (HE-12, Santa Cruz); p-kateniinin (BD Biosciences Pharmingen), Erk, Perk, Akt, Pakt (Cell Signalling). Sillä kemiluminesens- havaitsemiseksi käytettiin piparjuuriperoksidaasi-kytketty konjugaatteja ja parannettua kemiluminesenssin substraatin tunnistus (ECL ja Super Signal West Femto, Pierce).

solunelinkykyisyysmääritys

Solujen elinkelpoisuus arvioitiin laskemalla elossa ja kuolleet solut käyttävät trypaanisinivärin syrjäytymisen solumäärien kolmena kappaleena. Lyhyesti 50000 ympättiin 12-kuoppalevyille ja käsiteltiin 10 ug /ml doksisykliiniä. Solut trypsinoitiin ja värjättiin trypaanisinisellä at ilmoitettuina ajankohtina. Jokainen ehto ajettiin kolmena kappaleena ja kaikki kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa.

Solujen lisääntyminen määritettiin reaaliajassa käyttämällä xCELLigence solu analysaattori (Asea Biosciences), joka mittaa sähköisen impedanssin tarttuvien solujen ja ilmaistaan mielivaltaisina yksikköinä (solu index). Cell-indeksi riippuu solujen kiinnittyminen, morfologia ja leviämisen.

pesäkemuodostusta

1 x 10

3 DFW SSXi solua maljattiin 3 cm soluviljelmälevyihin (kolmena kappaleena).