Krooninen sairaus

tiivistelmä

Helicobacter pylori

(

H

.

pylori

) on spiraalin muotoinen gram-negatiivinen bakteeri, joka aiheuttaa yleisin krooninen infektio ihmisen mahalaukussa. Noin 1% -3% tartunnan saaneista yksilöt kehittävät mahasyövän. Kuitenkin mekanismit, joilla

H

.

pylori

indusoi mahasyövän ei täysin ymmärretä. Käytettävissä olevat tiedot osoittavat vahvan yhteyden virulenssitekijä

H

.

pylori

, Sytotoksiini liittyvä geeni A (CagA), ja mahasyöpä. Edelleen karakterisoimiseksi

H

.

pylori

virulenssi, loimme kolme solulinjat tarttuu mahalaukun syövän solulinjoissa SGC-7901 ja AGS kanssa

Caga

+

H

.

pylori

ja transfektoimalla SGC-7901, jossa on vektori, jossa täyspitkän

CagA

geenin. Olemme havainneet, 135 eri ilmennettyjen proteiinien kolmen solulinjojen avulla Proteome tekniikkaa, ja 10 ero proteiinien yhteiset kolme solulinjat valittiin ja tunnistettiin LC-MS /MS sekä varmistettiin western blot: p-aktiini, L-laktaatti (LDH), dihydroli- dehydrogenaasi (DLD), pre-mRNA-jalostus kerroin 19 homologi (PRPF19), ATP syntaasi kalmoduliinia (CAM), p64 CLCP, Ran-specific GTPaasia aktivoiva proteiini (RanGAP), P43 ja kalretikuliini. Havaitseminen näiden proteiinien ilmentymisen ja geenejä, jotka koodaavat näitä proteiineja ihmisen mahasyövän kudoksissa reaaliaikainen PCR (RT-qPCR) ja Western blot osoitti, että ilmentyminen

β-ACTIN

,

LDH

,

DLD

,

PRPF19

ja

CaM

geenejä säädellään ylöspäin ja

RanGAP

oli alassäädetty mahasyövän kudoksissa ja /tai metastaattinen imusolmukkeiden verrattuna peri-syöpäkudokset. Korkea geenien ilmentyminen havaittiin

H

.

pylori

infektion mahasyövässä kudoksissa. Lisäksi

LDH

,

DLD

ja

CaM

geeniä demetyloitunut klo promoottori -2325, -1885 ja -276 sivustoja, vastaavasti, ja

RanGAP

geeni erittäin metyloitu promoottorin -570 ja -170 sivustoja

H

.

pylori

infektoiduista ja

Caga

-overexpressing soluja. Nämä tulokset tarjoavat uusia oivalluksia molekyylitasolla synnyssä ja hoidon tavoitteet mahasyövän kanssa

H

.

pylori

infektio.

Citation: Zhou J, Wang W, Xie Y, Zhao Y, Chen X, Xu W, et al. (2016) Proteomiikka-Based tunnistaminen ja analysointi liittyvien proteiinien

helikobakteeri

mahasyövän. PLoS ONE 11 (1): e0146521. doi: 10,1371 /journal.pone.0146521

Editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japani

vastaanotettu: 15 syyskuu 2015; Hyväksytty: 19 joulukuu 2015; Julkaistu: 8. tammikuuta 2016

Copyright: © 2016 Zhou et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoitus: tuettiin National Natural Science Foundation of China (81260303, 31560326), Guizhoun maakunnassa Foundation (QianJiaoHe [2014] 06) ja Key Project of Science and Technology of Guizhoun Province (QianKeHe SY [2011] 3067, QianKeHe J [2012] 2039). Alkuperäisessä versiossa työtä tukivat National Natural Science Foundation of China (81260303, 31560326) ja Key Project of Science and Technology of Guizhoun maakunnassa (QianKeHe SY (2011) 3067).

Kilpailevat edut: Tällä kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Helicobacter pylori

(

H

.

pylori

) aiheuttaa eniten yhteinen krooninen mahalaukun infektio ihmisellä maailmanlaajuisesti. Noin puolet maailman väestöstä on infektoitunut

H

.

pylori

, ja suurin osa asuttivat yksilöt kehittävät oireettomia gastriitti. Niistä tartunnan yksilöitä, noin 10% -20% ihmisistä kehittää mahahaava sairauksien ja 1% -3% kehittää mahasyöpä [1,2]. Vuonna 1994

H

.

pylori

luokiteltiin tyypin I karsinogeeniksi mahasyövän Maailman terveysjärjestön International Agency for Research Cancer.

Mahalaukun syöpä on yksi yleisimpiä syöpiä, ja yli 70% uusista tapauksista ja kuolemista tapahtuu kehitysmaissa [3]. Vaikka maailmanlaajuinen esiintyvyys on ollut laskussa jo useita vuosikymmeniä, mahasyöpä edelleen yleistä useimmissa kehitysmaissa, mukaan lukien Japani, Korea ja Kiina [4-6]. Vuonna 2012 Kiinan Syöpärekisterissä vuosikertomus osoitti, että mahasyövän sairastuvuus ja kuolleisuus ovat toinen ja kolmas kaikkien pahanlaatuisia kasvaimia, vastaavasti.

Suurin osa

H

.

pylori

kannoilla

CAG

patogeenisyyssaarekkeen (

CAG

PAI), joka sisältää 27-31 geenejä, jotka koodaavat bakteerin tyypin 4 eritystä järjestelmä (T4SS) [7] . Sytotoksiini liittyvä geeni geeni (

CagA

), joka sijaitsee 3′-päässä

cag

PAI, koodaa ainoa tunnettu bakteeri onkoproteiini, CagA, joka kulkeutua isäntäsoluihin by T4SS jälkeen bakteerien kiinnittymistä vatsaan. Kun sisällä isäntäsoluissa, CagA on tyrosiinifosforyloituu jäsenet Abl: n ja Src-kinaasi-perheille ja on vuorovaikutuksessa useiden solunsisäisten efektoreiden, mikä aktivointi loppupään signalointimolekyylien [8]. Kliinisissä tutkimuksissa,

Caga

positiivisten kantojen on johdonmukaisesti liittyy vakavampia mahalaukun tulehdus ja haavaumat, ja pieni osa yksilöt kehittävät mahasyövän [9]. Kuitenkin mekanismit yhdistys CagA syöpä ei ole selvitetty.

Proteomiikka on noussut lupaavaksi teknologinen alusta järkevän tunnistamiseksi biomarkkereiden ja uusia terapeuttisia tavoitteita sairauksien ja määrittämistä taustalla olevien mekanismien syövän synty [10]. Kuitenkin useimmat tärkeät proteiinit havaitaan proteomiikka in vitro ei ole vahvistettu in vivo kliinisissä näytteissä.

DNA: n metylaation ja demetylaatio on tärkeä rooli kehittymisessä ja etenemisessä syöpien estämällä sitoutumista transkriptiotekijöiden DNA ja on tapahtuu lähes yksinomaan geenin promoottori-CpG-saarekkeiden [11-13]. Niistä elimet, vatsa osoittaa korkein taajuus epänormaali CpG-saarekkeen metylaation, mahdollisesti

H

.

pylori

-välitteisen [14-16]. Vaikka tutkimuksia DNA: n metylaatio lisääntyvät, geenin metylaatio valtioiden aiheuttamien

H

.

pylori

eivät ole vielä selvillä.

Tässä työssä pyrittiin tunnistamaan erityiset proteiinit liittyvät

H

.

pylori

infektio käyttämällä vertaileva proteomiikka ja luonnehtia geenien ilmentymisen ja CpG-saarekkeen metylaation näiden proteiinien mahasyövässä kudosten ja solujen.

Materiaalit ja menetelmät

Ihmiskudokset

Ihmisen kudokset saatiin kirurgian yksilöitä 30 mahasyöpäpotilaista ja sovitettu viereisten syöpä kudoksiin ja metastaattinen imusolmukkeiden Guiyang Medical Hospital, Guiyang Kiina, tammi 2009 kesäkuussa 2010. diagnoosit oli vahvistettu kahdella patologia. Niistä potilaista, 23 oli miehiä ja 7 oli naisia. Potilaat olivat ikä 38-77 vuotta. Kaksikymmentäkaksi potilaalla oli suoliston-tyyppinen adenokarsinooma, ja 8 oli hajanainen-tyyppinen adenokarsinooma. Tutkimuksen protokolla hyväksyi eettinen komitea Guiyang Medical Hospital, ja kaikki aiheet tarjotaan kirjallinen lupa.

Soluviljely

Ihmisen mahan masolulinjassa AGS (ATCC CRL-1739TM) ja SGC-7901-solut ostettiin suoraan American Type Culture Collection (ATCC) ja Cell Bank of Type Culture Collection of Kiinan Academy of Sciences (Shanghai, Kiina), vastaavasti, ja kuljetettiin alle 3 kuukautta laboratoriossamme vastaanottamisen jälkeen. Soluja viljeltiin Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-väliaineessa, jota oli täydennetty 10% lämmöllä inaktivoitua naudan sikiön seerumia, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä (Gibco, Grand Island, NY, USA) 37 ° C: ssa kosteutetussa inkubaattorissa 5% CO

2.

H

.

pylori

kulttuuri

H

.

pylori

kannan NCTC11637 (ATCC 43504, lahja kiinalainen Center

Helicobacter pylori

rasitusta Management ja säilyttäminen, Peking, Kiina), joka on

Caga

positiivinen, oli kasvatetaan selektiivisessä alustassa on Columbia agar levyn joka sisältää 10% naudan sikiön seerumia ja

H

.

pylori

Selective Supplement (Oxoid Ltd, Englanti) 37 ° C: ssa mikroaerobisen olosuhteissa.

Solun infektion

H

.

pylori

AGS ja SGC-7901-soluja (5 x 10

5) ympättiin 6-kuoppalevyillä 24 tuntia ja tartunnan

H

.

pylori

6 h ja 12 h, jonka infektiomultiplisiteettiarvoilla (mois) 1: 100, 1: 500 ja 1: 1000, vastaavasti. Solut infektoitiin 12 tunnin ajan MOI 1: 1000

H

.

pylori

keitetään 15 min verrokkeina.

rakentaminen ekspressiovektorin pcDNA3.1 /

Caga

DNA uutettiin

H

.

pylori

ja täyspitkä

CagA

sekvenssi syntetisoitiin PCR: llä ja kloonattiin pMD18-T plasmidien rakentamiseksi pMD18-T /

CagA

.

Caga

geeni tunnistettiin sekvensoimalla (GQ161098). pMD18-T /

CagA

pilkottiin restriktioentsyymeillä

Pst

I ja

Bam

HI, ja

CagA

ligoitiin pcDNA3.1 /Zeo (-) (Invitrogen, USA) rakentamiseksi eukarioottiekspressiovektoriin pcDNA3.1 /

CagA

. Sekvenssit alukkeiden annetaan taulukossa 1.

Cell transfektion pcDNA3.1 /

CagA

SGC-7901-soluja inkuboitiin 12 tuntia 6-kuoppaisille levyille saada 80% konfluentteja soluja. Sitten solut transfektoitiin mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. 48 tunnin kuluttua solut jaettiin 1:10 uusiin 6-kuoppaisille levyille ja inkuboitiin vielä 24 tuntia ja sitten pidettiin selektiivinen zeocin sisältävien (250 ug /ml) standardi väline 2 viikkoa kunnes klooni muodostumista. Solut transfektoitu tyhjällä pcDNA3.1 /Zeo (-) käytettiin kontrolleina.

Proteiinin uutto ja western blot

Proteiini uutteet valmistettiin suspendoimalla teissolupelletit on RIPA-puskurissa tai homogenisoimalla 200 mg kudoksiin RIPA puskuriin. Yhteensä 30-50 ug proteiinia uute altistettiin SDS-PAGE-geelielektroforeesilla, siirrettiin polyvinylideenidifluoridi (PVDF) kalvolle (Millipore, Bedford, MA, USA) ja blotattiin yön yli hiiren monoklonaalisten anti-CagA-vasta-ainetta (1: 800, sc-28368), hiiren monoklonaalinen anti-fosfotyrosiinivasta-ainetta (PY99, 1: 300, sc-7020), kaniinin polyklonaalista anti-beeta-aktiini-vasta-aine (1: 500, ab189073), kanin polyklonaalinen anti-LDH-vasta-ainetta (1: 350 , ab125683), hiiren monoklonaalinen anti-DLD (1: 800, sc-376890), kanin polyklonaalinen anti-PRPF19 (1: 400, ab27692), hiiren monoklonaalinen anti-ATP-syntaasi-vasta-ainetta (1: 300, ab54880), kaniinin polyklonaalista anti -calmodulin anbody (1: 250, ab208911), kanin polyklonaalinen anti-RanGAP-vasta-ainetta (1: 200, ab92360), kanin polyklonaalinen anti-p64CLCP-vasta-ainetta (1: 300, ab28722), kanin polyklonaalinen anti-kalretikuliinin-vasta-ainetta (1: 350, AB4) ja hiiren monoklonaalinen anti-glyseraldehydi-3-fosfaatti -dehydrogenase vasta-aineella (GAPDH, 1: 8000) Santa Cruz (CA, USA), Abcam (Cambridge, UK) ja CangChen (Shanghai, Kiina), vastaavasti, 5% BSA: ta Tris-puskuroitu suolaliuos ja 0,01% Tween-20. Peroksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineilla (1: 5000, SC-2371, Santa Cruz, CA, USA) käytettiin ja kehitettiin kemiluminesenssi reagenssin ECL Plus käyttämällä Hyperfilm (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK). Kvantifiointi western blotit suoritettiin käyttäen Määrä Yksi ohjelmistoa. Kukin koe suoritettiin 3 kertaa, ja edustava tulos esitetään.

Proteiinin uutto ja kaksiulotteinen geelielektroforeesi

Solunapit liuotettiin soluhajotuspuskurin yön yli 4 ° C: ssa, ja proteiini saostettiin kolmella tilavuudella jääkylmää asetonia, inkuboimalla 4 ° C: ssa 2 tuntia. Sitten näytteitä sentrifugoitiin 20000 rpm 30 minuutin ajan, ja pelletit suspendoitiin uudelleen solujen hajotuspuskuriin ja säilytettiin 4 ° C: ssa yön yli.

yhteensä 800 ug proteiinia säädettiin tilavuuteen 250 ui jossa nesteytys ratkaisu, ja isoelektrinen fokusointi (IEF) suoritettiin käyttämällä Ettan IPGphor II isoelektrinen fokusointi (Amersham Biosciences) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Protokolla IEF on 300 V for1 h, 500 V 2,5 tuntia, 1000 V 2 tuntia; 8000 V 8 tuntia, 60 KVH (yhteensä).

Suoritettuaan IEF, IPG liuskat (Amersham Biosciences) tasapainotettiin tasapainotuspuskurilla 15 min ja laitettiin 12% SDS-PAGE-geelillä kaksi- ulotteinen elektroforeesi 30 mA /geeli. Tuloksena SDS-PAGE-geeli fiksoitiin 20% TCA: ssa 30 minuuttia ja sitten värjättiin kolloidisella Coomassie G-250 [5].

Proteiini läiskät geelillä skannattiin ja analysoitiin automaattisesti. Ilmentyvät eri proteiinitäplien varmistettiin Imaging Master 2D 5,0 analyyttinen ohjelmisto (Amersham Biosciences). Studentin t-testi suoritettiin kvantitatiivista analyysia 2D geelejä. Differential ilmaisema erityinen proteiini määriteltiin ≥2-kertainen muutos spot optisen tiheyden välillä Hyväksytty setit kaksoiskappaleet. Ero täplät sitten leikattiin irti SDS-PAGE-geelien edelleen tunnistamiseen LC-MS /MS: llä.

RNA ja kvantitatiivinen RT-PCR-

Kokonais-RNA uutettiin 50 mg: sta kudosta ja käsiteltiin DNaasi I (RNaasittomalla). Geenit monistettiin SYBR Green (Applied Biosystems, Australia). Hypoksantiini-guaniinifosforibosyylitransferaasi- (

HPRT

) käytettiin normalisoinnin ohjaus, ja suhteelliset mRNA-tasot laskettiin vertaileva C

t jossa käytetään vaihe-one-ohjelman (Applied Biosystems, Australia) [8]. Kukin näyte analysoitiin kolmena rinnakkaisena, ja tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. Käytetyt alukkeet on lueteltu taulukossa 1.

DNA: n uutto ja metylointianalyysi CpG-saarekkeiden

DNA eristettiin soluista ja modifioitu natriumbisulfiitin käyttämällä EZ DNA Metylointi-Gold Kit

™ (Zymo Research, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Promoottori-CpG-saarekkeiden ennustettiin käyttämällä metyyli Primer Express-ohjelmisto ja monistettiin bisulfiitti-modifioitu DNA PCR: llä käyttäen seuraavia menettelyjä: denaturointi 96 ° C: ssa 10 min, jota seurasi 40 sykliä denaturointi 94 ° C: ssa 40 sekuntia, pariutuminen 60 ° C: ssa 40 sekunnin ajan, ja venymä 72 ° C: ssa 40 sekunnin ajan, ja lopullinen pidennys 72 ° C: ssa 10 min. Monistetut PCR-tuotteet kloonattiin pMD19-T vektoreita ja sekvensoitiin. Lisäksi DNA eristettiin kasvainkudoksista käytettiin havaitsemaan

H

.

pylori

16S

rRNA

geeni ja

Caga

geeni. Alukesekvenssit on lueteltu taulukossa 2.

Tilastollinen analyysi

Tulokset ilmoitetaan keskiarvoina ± SD. Tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen SPSS 15.0 ohjelmistoa. Yksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA) ja Studentin t-testiä käytettiin analysointiin.

P

0,05 (kaksipuolinen) katsottiin merkitseväksi.

Tulokset

käyttöönotto CagA mahalaukun syöpäsoluihin

Koska CagA on

H

.

pylori

on kriittinen virulenssin tekijä kehittymistä ja etenemistä mahasyövän, CagA havaittiin mahasyövässä solulinjoissa RT-PCR ja western blot infektion jälkeen SGC-7901 ja AGS solujen

H

.

pylori

ja transfektointi SGC-7901-solujen

Caga

-vector. CagA proteiini alkoi ilmestyä suhteessa solujen bakteerien 1: 500 viljellyissä soluissa 6 h, ja pitoisuus oli korkein suhteessa 1: 1000 6 h (kuvio 1A ja 1 B). Kuitenkin, fosforyloitu CagA soluissa havaittiin suhteessa 1: 500 viljelyn jälkeen 12 h, ja korkein pitoisuus soluissa havaittiin suhteessa 1: 1000 6 h viljelyn. CagA mRNA ja proteiini havaittiin myös vakaasti

Caga

-overexpressing SGC-7901-soluissa (kuvio 1 C ja 1 D). Nämä tiedot viittaavat siihen, että CagA otettiin onnistuneesti käyttöön kolmeen solulinjoihin ja fosforyloitu.

(A ja B) Western blot-analyysi CagA ja fosforyloidun CagA in

H

.

pylori

infektoiduista SGC-7901 (A) ja AGS (B) soluista. Solut infektoitiin ilmoitettu suhde solujen

H

.

pylori

varten ilmoitettuina ajankohtina otettiin talteen ja hajotettiin, ja proteiinit erotettiin SDS-PAGE: lla. Solut infektoitiin

H

.

pylori

keitettiin 15 minuutin ajan MOI 1: 1000, käytettiin kontrollina. (C ja D) havaitseminen CagA mRNA ja proteiini

Caga

-overexpressing SGC-7901-solujen RT-PCR (C) ja western blot (D). GAPDH toimi latauskontrollina. Tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen.

Hp

,

H

.

pylori

; P-CagA fosforyloitu CagA; GAPDH, glyseraldehydi-3-fosfaatti- dehydrogenaasi.

tunnistaminen ero proteiinien mahasyövässä soluissa

Kun solut infektoitiin

H

.

pylori

6 h MOI 1: 1000 tai transfektoitu

Caga

-vector, Proteomisten tekniikkaa käytetään luomaan kuusi kaksiulotteinen elektroforeesi (2-DE) kartat kolmesta solulinjoista ja niiden valvonta (kuvio 2), ja 135 ero täplät havaittiin, joista 73 oli säädelty ja 62 alassäädetty. Kymmenen ero huomasi yhteinen kaikille kolmelle solulinjat tunnistettiin LC MS /MS ja varmistettiin western blot, mukaan lukien 6 säädelty proteiinit: p-aktiini, LDH, DLD, PRPF19, ATP syntaasia ja kalmoduliini (CAM), ja 4 alassäädetty proteiineja, kuten RanGAP, p64 CLCP, P43 ja kalretikuliini (taulukko 3 ja kuvio 3A).

SGC-7901 ja AGS infektoimia soluja

H

.

pylori

6 h MOI 1: 1000 (solu

H

.

pylori

) ja SGC-7901 transfektoitujen solujen pcDNA3.1 /

CAGA

48 tuntia, kerättiin ja lyysattiin ja proteiinikonsentraatiot määritettiin käyttämällä Bradford kolorimetrisesti. Yhteensä 800 ug proteiinia ladattiin kaksiulotteisen elektroforeesin. Solut infektoitiin keitettyjen

H

.

pylori

tai transfektoitu tyhjällä vektorilla toimi ohjauslaitteet tartunnan tai transfektoituja soluja, tässä järjestyksessä. (A) SGC-7901-soluissa tartunnan

H

.

pylori

. (B) AGS infektoiduissa soluissa

H

.

pylori

. (C) SGC-7901-solut, jotka oli transfektoitu

CagA

-vector. (D) Suurennettu kuva 10 ero paikkoja. B4, B11, C6, C7, C8 ja C9 paikkoja oli säädelty, kun taas D12, D16, E2 ja E11 täplät alassäädetty. Nämä paikat on merkitty taulukossa 3.

(A) Western blot analyysi osoitti proteiinien kontrollisoluissa (1),

H

.

pylori

infektoiduista SGC-7901-solujen (2) ja

Caga

-overexpressed SGC-7901-soluissa (3). GAPDH toimi latauskontrollina. Tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen. (B) Kvantitatiivinen RT-PCR analyysi osoitti geenien 30 mahasyövässä kudoksiin. Arvot esitetään keskiarvona Ct kertainen verrattuna peri-syöpäkudoksiin, jossa peri-syöpäkudoksiin asetettiin 1 (C) Western blot analyysi osoitti proteiinien 30 mahasyövän kudoksiin. 200 mg kudokset homogenisoitiin ja kokonais-proteiinit kerättiin. Yhteensä 50 ug proteiinia uutteet altistettiin SDS-PAGE-geelielektroforeesilla. GAPDH toimi latauskontrollina. (D) havaitseminen

H

.

pylori

16S

rRNA

geeni ja

Caga

geenin mahasyövässä kudoksissa PCR (ylempi). M edustaa DNA-molekyylipainomarkkeri. Kaista 1 on positiivinen kontrolli. Kaista 2 on negatiivinen kontrolli. Kaistat 3, 4 ja 6 ovat positiivisia näytteitä. Kaistat 5 ovat negatiivisia näytteitä. Kvantitatiivinen RT-PCR analyysi osoitti geenien mahasyövän kudoksissa ja ilman

H

.

pylori

infektio (Ala). Arvot esitetään keskiarvona Ct kertainen verrattuna ryhmään ilman

H

.

pylori

infektio, joka oli asetettu 1. Kuvassa on esitetty keskiarvo 30 näytteen. Data esitetään keskiarvoina ± SD. Virhe palkit kuvaavat standardipoikkeamat. LDH, L-laktaattidehydrogenaasi. DLD, dihydroli- dehydrogenaasi. PRPF19, pre-mRNA: n prosessointi tekijä 19 homologi. RanGAP, Ran-specific GTPaasia aktivoiva proteiini. Cam, kalmoduliinilla. p64 CLCP, ydin- kloridi ionikanavan proteiinia. *,

P

0,05 verrattuna peri-syöpäkudokseen (B ja C) ja kudoksiin ilman

H

.

pylori

infektio (D).

H

.

pylori

infektio edistää ilmentymistä ero proteiinien mahasyövässä kudoksissa

Koska

H

.

pylori

selektiivisesti colonizes ihmisen mahalaukussa aktivoida joukko patologisia prosesseja, geenin ilmentyminen 10 ero proteiinien 30 ihmisen mahasyövän näytteet arvioitiin kvantitatiivisella RT-PCR. Niistä 10 geenit, ilmaus

β-ACTIN

,

LDH

,

DLD

,

PRP19

ja

CaM

vuonna syöpien ja /tai metastaattinen imusolmukkeet olivat säädelty verrattuna peri-syöpäkudokset, kun taas ilmaus

RanGAP

oli alassäädetty. Samalla periaatteella 6 proteiinit myös epätavallisen ilmaistaan ​​samassa kudoksissa (kuvio 3B ja 3C). Ei merkittäviä eroja ilmentyminen muiden geenien havaittiin.

H

.

pylori

kolonisaatio mahasyövässä kudoksissa mitattiin havaitsemalla 16S

rRNA

geeni ja

Caga

geenin

H

.

pylori

PCR.

H

.

pylori

oli läsnä 20 30 näytettä (positiivinen korko 67%), ja kaikki

H

.

pylori

kannat ovat

Caga

positiivinen. MRNA tasot

β-ACTIN

,

LDH

,

DLD

,

PRP19 ja Cam

olivat korkeammat

H

.

pylori

positiivisten kudosten kuin negatiivisista näytteistä (kuvio 3D).

H

.

pylori

indusoi poikkeava DNA: n metylaation mahasyövän soluissa

kolme solulinjoissa, PCR-tuotteiden CpG-saarekkeiden edellä geenien onnistuneesti hankittu seuraavasti bisulfiittikäsittelyn ja sekvensoitiin. Näissä geenit,

LDH

,

DLD

ja

CaM

geeniä demetyloitunut klo promoottori -2325, -1885 ja -276 sivustoja, vastaavasti, ja

RanGAP

geeni erittäin metyloitu promoottorin -570 ja -170 sivustoja (Kuva 4).

(A) elektroforeettinen analyysi promoottorin CpG saarilla merkitty geenien bisulfiittimodifikaatio-PCR. (B) metylaatiokohtia CpG saarten ilmoitettuina geenin promoottorit.

LDH

, L-laktaattidehydrogenaasi.

DLD

, dihydroli- dehydrogenaasi.

RanGAP

, Ran-specific GTPaasia aktivoiva proteiini.

CaM

kalmoduliinia. M, molekyylipainomarkkeri. 1, käsittelemättömät SGC-7901-solut; 2,

H

.

pylori

infektoiduista SGC-7901-soluissa; 3,

Caga

-overexpressing SGC-7901-soluissa. Nuolet osoittavat epänormaalia metylaatiokohtia.

Keskustelu

Kumulatiivinen todisteet osoittavat, että

H

.

pylori

infektio on tärkeä tekijä

H

.

pylori

-associated mahalaukun sairauksien ja että CagA on edistää tekijä mahasyövän [17,18]. Meillä on rakennettu kolme kokeellista solulinjoissa, mukaan lukien kaksi mahasyövän solulinjat infektoitiin

H

.

pylori

(

Caga

+) ja mahasyövän solulinja yli-ilmentävät

Caga

, ja todennut, että CagA alkoi ilmestyä soluissa 6 h kuluttua tartunnasta ja jopa 12 tuntia. Myöhemmin fosforyloitu CagA alkoi ilmestyä, sopusoinnussa injektio ja myöhemmin fosforylaation CagA mahalaukun epiteelisoluihin jonka T4SS on

H

.

pylori

infektion jälkeen ihmisen mahalaukun limakalvo. Fosforyloituu CagA aktivoi alavirran signalointireittejä ja sillä on patologinen rooli. Havaitsimme myös CagA soluissa stabiilisti transfektoitu

Caga

-vector. Nämä tiedot vahvistavat onnistunut rakentaminen kolmen koe-solulinjat.

proteomiikka on käytetty tutkimaan suhde

H

.

pylori

infektio ja mahalaukun sairauksia, ja monet ilmentyvät eri proteiineja on tunnistettu [19-22]. Kuitenkin yhdistys näiden proteiinien kanssa CagA ja niiden ilmentyminen ihmisen mahasyövän kudoksiin jää epäselväksi. Saimme yhteensä 135 ero paikkoja kolmen solulinjoista, joista 73 oli säädelty ja 62 alassäädetty. Kymmenen ero paikkoja olivat yhteisiä kaikille kolmelle solulinjoihin, mukaan lukien 6 säädelty proteiinit (β-aktiini, LDH, DLD, PRP19, ATP syntaasia, ja CAM) ja 4 alassäädetty proteiineja (p64 CLCP, RanGAP, P43 ja kalretikuliini) ja 10 proteiinien ilmentyminen varmistettiin western blot näissä solulinjoissa. Nämä proteiinit osallistuvat energia-aineenvaihduntaan, luuranko uudelleenjärjestely, pre-mRNA: n prosessointi, signaalin siirtoon, ja muut proteiinit tiiviisti kehittymistä ja etenemistä monen ihmisen syövistä [23,24]. Olemme kvantitatiivisesti ilmentymistä geeneillä, jotka koodaavat näitä 10-proteiineja ihmisen mahasyövän kudoksissa, mikä paljasti, että

β-ACTIN

,

LDH

,

DLD

,

PRP19

ja

CaM

olivat johdonmukaisesti ilmennetään runsaasti ja

RanGAP

oli huonosti ilmaistu sekä syövän kudoksissa ja /tai metastaattinen imusolmukkeiden verrattuna peri-syöpäkudokseen. Poikkeavaan näiden proteiinien ilmentymisen varmennettiin myös Western blot mahasyövän ja metastaattinen imusolmukkeet. Seuraavaksi huomasimme, että

Caga

+

H

.

pylori

asuttaneet 20 30 mahasyövän kudosten ja edistää tai esti näiden geenien ilmentymistä in vivo.

LDH ja DLD läheisesti korreloivat energia-aineenvaihduntaa. Disorder energia-aineenvaihdunnan pidetään tärkeä tekijä kehittymistä ja etenemistä syövän. Toisin kuin normaalit solut, syöpäsolujen näytteille lisääntynyt riippuvuus glykolyyttisellä polkuun riittävästi happea, kutsutaan aerobinen Glykolyysivaiheen. Suuri määrä palorypälehapon, lopullinen tuote reitin, muunnetaan maitohappo LDH, edistämällä glykolyyttisen reitin ja energia-aineenvaihdunnan epätasapaino [25]. Maitohappo voi myös vähentää pH: ta solun mikroympäristön, mikä lisää neovaskulaarinen vastauksena angiogeneesitekijät edistää kasvainsolujen etäpesäkkeiden [26,27]. Vastaa meidän tuloksia,

LDH

oli hyvin ilmaistu syövän kudoksissa 61,8%: lla mahasyöpä; Potilailla, joilla LDH yliekspressio oli lyhyempi eloonjääminen verrattuna potilaisiin, joilla on alhainen ilme [28]. Kim

et al

. [29] havaittiin, että

DLD

ilmaisun kasvaa syövän etenemiseen, mikä antaa enemmän energiaa kasvainsolujen kasvua. Siksi korkea ilmentyminen LDH ja DLD on ratkaiseva tekijä kehittymistä ja etenemistä mahasyövän, ja

H

.

pylori

infektio edistää ilmentymistä näiden kahden geenien mahasyövässä kudoksissa.

Beta-aktiini, keskeinen osa solun tukirangan, ylläpitää rakenne, liike ja jakautuminen solujen normaaliolosuhteissa.

β-ACTIN

on poikkeuksellisen ilmaistaan ​​monia sairauksia [30]. PRPF19 proteiinin uskotaan toimivan pre-mRNA: n silmukoinnin. Ubikinaa- of PRPF19 voi johtaa DNA-vaurioita, ja epänormaali DNA korjaus on tärkeä syy tumorigeneesin [31]. Kalmoduliinin on kalsiumia sitova proteiini, joka säätelee monia signalointireittejä ja siten osallistuu solujen lisääntymisen, mitoosin ja geenin transkription. Kalmoduliinin edistää solujen lisääntymistä Maksakarsinoomien yhdistettynä PI3K ja siirtyminen G1 S-vaiheeseen yhdessä sykliini E [32]. Estäjä kalmoduliini pysäyttää solut G1 vaiheessa estää solunjakautumisen [33]. Yhdenmukaisesti näiden tulosten totesimme, että

H

.

pylori

voivat osallistua syövän kehittämiseen mahalaukun kudosten indusoimalla korkea ilmentymistä näiden kolmen proteiinin.

Lisäksi havaitsimme alas-säätely

RanGAP

geenin syöpä kudoksiin

H

.

pylori

infektio. RanGAP on GTPaasia aktivoiva proteiini. Hydrolyysin jälkeen GTP hen vuoteen GTPaasina, aktiivinen RanGTP poistuu käytöstä RanGDP, mikä saarto soluviestitykseen estävän syövän etenemistä [34]. Samoin vähentynyt RanGAP indusoimaa ubikitinaation edistää syövän kehitystä [35].

DNA: n metylaatio voi aiheuttaa epänormaalia geenin ilmentymistä.

H

.

pylori

infektio lisää metylaatiotasoilla joidenkin geenien ja tulokset karsinogeneesissä mahalaukun limakalvon [36,37]. DNA: n metylaatio yleensä näkyy CpG-saarekkeiden geenien promoottorit. Havaitsimme metylaatiostatuksen CpG saarten näiden geenien laskennalliseen solulinjoissa ja todennut, että

LDH

,

DLD

ja

CaM

geeniä demetyloitunut klo promoottori -2325, -1885 ja -276 sivustoja, vastaavasti, ja

RanGAP

geeni erittäin metyloitu promoottorin -570 ja -170 sivustoja, sopusoinnussa korkea ilmaus

LDH

,

DLD

ja

CaM

geenien ja alhaisen ilmentymisen

RanGAP

geenin mahasyövän kudoksiin

Caga

+

H

.

pylori

infektio.

Yhteenvetona nämä tulokset viittaavat siihen, että

H

.

pylori

infektio kautta CagA translokaatio voivat aiheuttaa poikkeavaan metylaatio näiden geenien johtaa huonosti geeniekspression mahasyövässä kudosten ja solujen. Tuloksemme antaa uutta ymmärrystä molekyyli patogeneesin mahasyövän kanssa

H

.

pylori

infektio. Jatkotutkimuksissa tutkii vaikutuksia nämä muuttuneet metylaation kuvioita patogeneesissä mahasyövän kliinisissä näytteissä.

Kiitokset

Kiitämme Kiinan keskus

Helicobacter pylori

rasitusta Management ja säilyttäminen tarjota

H

.

pylori

NCTC11637 ja tohtori Yang Wenxiu ja Wu Jiahong tekniseen tukeen.