Krooninen sairaus

tiivistelmä

Viime vuosikymmenellä, optimoitu hoitoa ei-pienisoluinen keuhkosyöpä oli johtaa parempaan ennusteeseen, mutta yleinen selviytyminen on edelleen hyvin lyhyt. Edelleen ymmärtää molekyylitason taudin meidän täytyy tunnistaa biomarkkerit liittyvät selviytymisen. Tässä esittelemme kehitystä online-työkalu soveltuu reaaliaikaisen meta-analyysi julkaistiin keuhkosyöpään microarray aineistoja tunnistaa biomarkkerit liittyvät selviytymisen. Haimme caBIG, GEO ja TCGA arkistot tunnistamaan näytteitä julkaistuihin geenien ilmentyminen tietoja ja selviytymistä tietoa. Yhden ja usean Coxin regressioanalyysi, Kaplan-Meier selviytymisen tontilla riskisuhde ja logrank P-arvo lasketaan ja piirretään R. Täydellinen analyysi työkalu voidaan käyttää verkossa osoitteessa: www.kmplot.com/lung. Kaikki yhdessä 1715 näytteet kymmenestä itsenäisestä aineistot yhdistettiin järjestelmään. Osoituksena, käytimme väline vahvistaa 21 aiemmin julkaistu säilymiseen liittyy biomarkkereita. Näistä eloonjäänti parhaiten ennusti CDK1 (p 1E-16), CD24 (p 1E-16) ja CADM1 (p = 7E-12) in adenokarsinooman ja CCNE1 (p = 2.3E-09) ja VEGF ( p = 3.3e-10) kaikissa pienisoluista keuhkosyöpää. Muita geenejä merkittävästi korreloi selviytymisen sisältää RAD51, CDKN2A, OPN, EZH2, ANXA3, ADAM28 ja ERCC1. Yhteenvetona perustettu integroitu tietokanta ja online-työkalu, joka kykenee yksi- ja monimuuttuja-analyysin

in silico

validointi uusien biomarkkereiden ehdokasta ei-pienisoluinen keuhkosyöpä.

Citation: Győrffy B, Surowiak P, Budczies J, Lánczky A (2013) Online Survival Analysis Software Arvioidaan Prognostic arvo biomarkkerit käyttäminen Transcriptomic Data in Non-Small-Cell Lung Cancer. PLoS ONE 8 (12): e82241. doi: 10,1371 /journal.pone.0082241

Editor: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 27 heinäkuu 2013; Hyväksytty 22 lokakuuta 2013 Julkaistu: 18 joulukuu 2013

Copyright: © 2013 Győrffy et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat työ tukivat OTKA PD 83154 avustusta, jonka Veikkaa hanke (myönnä. 259303 EU Health.2010.2.4.1.-8 puhelu) ja jonka KTIA U_BONUS_12-1-2013-0003 avustusta. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Vaikka keuhkosyöpä hoitovaihtoehtoja ovat parantuneet merkittävästi viimeisen vuosikymmenen aikana johtaa parempaan potilaiden elinaikaa jokaisessa vaiheessa tauti, se on edelleen johtava syöpään liittyvistä kuolemantapauksista Yhdysvalloissa 160000 kuolemantapausta vuodessa [1 ]. Noin 85% kaikista tapauksista yleisin keuhkosyövän on ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), joka sisältää adenokarsinooma, levyepiteelisyöpä, suuri karsinooma, ja bronchioloalveolar karsinooma [2]. Samoin muille syövän yhteisöille voimme odottaa uusia molekyyli alatyyppejä syntyä tulevaisuudessa, koska se on nyt yleisesti hyväksytty, että valomikroskoopilla perustuu histologisen alaosasto käyttää vain yksi monista fenotyyppisen ilmenemismuotoja geenimuutoksia taustalla keuhkosyövän kehitystä [2].

geenien tunnistaminen, joiden muuttunut ilmentyminen liittyy selviytymisen eroja saattaisi liittää tieto paikantaa ne, jotka voitaisiin käyttää osoittimina kasvain n biologisen tilan. Pohjimmiltaan on olemassa kaksi mahdollista skenaariota tässä: tällaiset biomarkkereiden voi olla joko yksittäinen geeni tai allekirjoituksen, joka käsittää joukon geenejä. Vaikka lukuisia yksittäisiä geenejä, jotka liittyvät selviytymisen on julkaistu viimeisten kolmenkymmenen vuoden aikana, uusi microarray-pohjainen monigeenisiin molekyylien ennustemalleja käyttäen genomista allekirjoitusta ilmestyi vasta viimeisten kymmenen vuoden ajan [3], [4], [5], [6] [7], [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18], [ ,,,0],19]. Edellytyksenä varten toistettavuus tällaisesta genomisesta allekirjoitusten on saatavilla raakadatan, joka oli vain varmistettu julkaisuista viimeisten kuuden vuoden aikana [9], [10], [11], [12], [13], [ ,,,0],14], [15], [16], [17], [18]. Yllättävää kyllä, kahdessa tapauksessa ei allekirjoitusta kokonaisuutena, mutta geenien kukin erikseen tärkeää ennustetekijöitä markkereita on identifioitu [15], [19].

Ensimmäinen löytö ennustetyövälineenä merkki on seurattava useita validointi opinnot. Sitten tulokset ovat yleensä syntetisoitiin meta-analyysin mukaan lukien suuri määrä on edullisesti enemmän kuin tuhat potilasta. Täällä yhdistämällä asiaankuuluvat tietoja useista tutkimuksista, tilastollinen teho lisääntyy ja tarkempia arvioita voidaan saavuttaa. Useita edellinen meta-analyysit pyrkinyt tällaiseen meta-analyysi aiemmista tutkimuksista yksinäinen geenin ehdokkaita lukien VEGF [20], MMP-9 [21], sykliini E [22] surviviiniperäiset [23] ja CDK1 [24].

Täällä integroitu saatavilla genomi-tason transcriptomic aineistoja ja sitten käytetään tätä tietokantaa suorittaa meta-analyysi aiemmin ehdottanut selviytyminen liittyy biomarkkereiden-ehdokkaita. Olemme myös perustaa maailmanlaajuinen portaali kuten meta-analyysi mahdollistavat express validointi uusien ehdokkaiden ilman laajamittaista bioinformatiikan vaivaa automatisoidussa puitteissa.

Materiaalit ja menetelmät

Rakentaminen keuhkosyöpään microarray tietokanta

selvitimme Cancer Biomedical Informatics Grid (caBIG, https://cabig.cancer.gov/, mikrosiru näytteet julkaistu caArray hanke), Gene Expression Omnibus (GEO, http: //www. ncbi.nlm.nih.gov/geo/) ja The Cancer Genome Atlas (TCGA, https://cancergenome.nih.gov) tunnistaa keuhkosyöpä aineistoja käyttämällä avainsanoja ”keuhkojen”, ”syöpä”, ”pieni kennon” ”NSCLC”, ”survival”, ”GPL96”, ”GPL3921” ja ”GPL570” (ja vaihtoehtoiset nimet mikrosirun alustoilla). Haku rajattiin julkaisuja samanaikaisesti käytettävissä microarray geenien ilmentyminen tietojen ja julkaistut kliiniset ominaisuudet lukien selviytyminen. Voit testata satunnaisuus, pareittain rank testi suoritettiin kerätyn kliinisten tietojen kuten ikä, sukupuoli, tupakointi historia, histologia, vaihe, laatu, menestys kirurgian, sädehoidon ja sovelletaan kemoterapia kaikille potilaille WinStat 2013. pareittain rank-testi, näytteet ensin mukaan lajiteltuna aineistoja. Sitten kukin näyte ( ”X”) sarjassa verrattiin kaikki arvot, joita esiintyy myöhemmin luettelon kaikista näytteistä ( ”Y”) – olettaen satunnaisuutta, todennäköisyys X Y on 1/2. Korrelaatiot kliinisen muuttujien ja selviytymisen tutkittiin ja Kaplan-Meier -käyrät nämä piirrettiin käyttämällä WinStat 2013. Joukossa eri microarray alustoille, Affymetrix HG-U133A (GPL96), HG-U133 Plus 2.0 (GPL570) ja HG-U133A 2.0 ( GPL3921) olivat mukana, koska nämä ovat säännöllisesti käytetty ja koska nämä paneelit on 22277 koetinsarjojen yhteistä. Käyttö saman koetinsarjojen mahdollistaa mitata saman geenin samanlaisia ​​tarkkuus, suhteellinen laajuus ja dynaaminen alue.

Jotta mahdollinen harha johtuu array virheitä, olemme suorittaneet laatutarkastuksen kaikille taulukot. Tässä, taustalla (välillä 19 ja 218), raaka Q (0,5 ja 14), prosenttiosuus esillä puheluita (yli 30%), läsnäolo bioB- /C- /D piikkejä, GAPDH 3 ’ 5 ’suhde (jäljempänä 4,3) ja beeta-aktiini-3’ 5 ’suhde (alle 18) tarkastettiin. Kynnys arvot vastaavat 95%: n alueella paneelit kuten aiemmin on kuvattu [25]. Laadunvalvonta ei ollut mahdollista GSE4573 kuin tämä aineisto ainoastaan ​​MAS5 normalisoitu data oli saatavissa. Suodatusmenetel- lisättiin tietokantaan jättää mahdollisesti puolueellinen taulukot. Lisäksi vertasimme kaikki mikrosirun Tiedostojen sijoittui ilmaus kaikkien geenien paikalla microarray julkaistu uudelleen eri tutkimuksissa.

Set-up palvelimen online selviytymisen laskennassa

unprocessed.CEL tiedostot oli MAS5 normalisoitui R ympäristössä (https://www.r-project.org) käyttäen simpleaffy kirjasto (https://bioinformatics.picr.man.ac.uk/simpleaffy/). Olemme valinneet MAS5 normalisointia sillä se sijoittui paras normalisoinnin menetelmiä kun vastakohtana tulokset RT-PCR mitat edellisessä tutkimuksessa [26]. Lisäksi MAS5 voidaan soveltaa yhteen paneelit, jotka mahdollistavat saumattoman jatkamisesta tulevaisuudessa tietokantaan. Täydellinen tietokanta, vain yhteinen koettimet mitattuna kaikilla kolmella array alustoilla säilytettiin (n = 22277). Sitten toinen skaalaus normalisointi suoritettiin keskustaan ​​keskiarvo ilmaus kullekin array 1000 – tämä tekniikka voi merkittävästi vähentää erän vaikutuksia. Geenien ilmentyminen ja kliiniset tiedot integroitiin käyttäen PostgreSQL, avoimen lähdekoodin objekti-relaatiotietokannan järjestelmä (https://www.postgresql.org/).

arvioimiseksi ennusteen arvioinnissa geenin, kukin prosenttipiste (of lauseke) alemman ja yläkvartiilit laskettiin ja tehokkaimpiin kynnys käytettiin lopullisessa cutoff on univariate Coxin regressioanalyysiä. Histologia, grade, vaihe, sukupuoli ja tupakointi historia voidaan käytetään monimuuttujamenetelmin. Kuitenkin monimuuttujamenetelmin käyttää vähemmän potilaita kuin yhden muuttujan analyysiin, koska ei jokainen potilaille on kaikkien kliinisten tiedot. Kaplan-Meier selviytymisen juoni ja riskisuhde 95%: n luottamusväli ja logrank P-arvo laskettiin ja piirrettynä R käyttäen ”survplot” -toiminnon ”survival” Bioconductor paketti. R käsikirjoitus ohjelmisto käyttää suorittamaan Kaplan-Meier-analyysi ja määritellä parhaat sulku on saatavana R script S1.

Koko laskennallinen polku on saatavilla uudelleenkäyttöä-analyysin alustariippumaton verkossa saatavilla ohjelmisto käynnissä Debian Linux (https://www.debian.org) palvelimen powered by Apache (https://www.apache.org). Komentosarjoja palvelinpuolen kehitettiin PHP, jotka kumpikin ohjaavat käyttöliittymää, pyynnöt ja toimituksen tulokset. RODBC paketti tarjoaa middleware kerroksen välillä R ja PostgreSQL. Tämä alusta pääsee Internetin kautta https://www.kmplot.com/lung.

validointi aiemmin julkaistu selviytymisen liittyvät biomarkkerit

PubMed Haku suoritettiin tunnistamiseksi keuhkosyöpä selviytymisen siihen liittyvät biomarkkerit käyttäen kaikkia yhdistelmiä avainsanoja ”keuhkosyöpää”, ”NSCLC”, ”adenokarsinooma”, ”okasolusyöpä”, ”survival”, ”geenien ilmentyminen”, ”allekirjoitus” ja ”meta-analyysi”. Vain julkaistut tutkimukset Englanti olivat mukana. Kelpoisuusvaatimukset myös tutkinnan biomarkkereiden ainakin 50 potilasta – biomarkkereita kuvattu kokeellisissa malleissa jätettiin pois. Jokaisen geenin /allekirjoituksen tarkat olosuhteet, joissa se tunnistettiin on irrotettu, ja nämä on käytetty suodatus valittaessa potilaita selviytymiselle analyysiä.

havainnollistamiseksi suorituskykyä eri biologisten merkkiaineiden aineistot mukaan lukien eri määrä potilaita, olemme luoneet suppilo tontteja kuvaavat riskisuhde (ja luottamusvälit) vaaka-akselilla vs. otoskoko pystyakselilla kunkin aineisto. Lisäsimme myös mahdollisuus, että online-käyttöliittymän samanaikaisesti analysoivat kunkin yksittäisen aineistot. Lopuksi merkitys asetettiin p 0,01.

Tulokset

rakentaminen yhdistetyn keuhkosyöpään microarray tietokanta

Havaitsimme kaikki yhdessä 1715 potilasta, 1120 seitsemässä GEO aineistoja, 133 potilaita TCGA ja 462 potilasta caArray. Ei ollut näytteitä toistuvasti julkaistu. Yksi näyte (GSM370984) epäonnistui kaksi parametreja laadunvalvonnassa – tämä joukko suljettiin kaikkien analyyseihin. Lisäksi, 215 taulukot yhden parametrin oli poissa 95%: n alueella kaikista paneelit – nämä paneelit voidaan sulkea pois analyyseistä valitsemalla ”sulkea harha paneelit” online käyttöliittymän. Kokonaiselossaoloaika julkaistiin 1405 potilasta ja aikaa ensimmäiseen etenemiseen julkaistiin 764 potilasta. Olemme koonneet ikä, sukupuoli, tupakointi historia, histologia, vaihe, laatu, menestys kirurgian, sädehoidon ja sovelletaan kemoterapiaa kaikille potilaille – mikään näistä parametrien oli merkittävä pareittain rank testi osoittaa satunnaista jakautumista tietoja. Yhteenveto näistä kliinisistä ominaisuuksista jokaiselle aineisto käytetty on esitetty taulukossa 1. selviytyminen potilaiden ositettu alatyypin, sukupuolen, tupakoinnin historiaa ja vaihe on esitetty kuvassa 1.

Määritä -up online selviytymisen analyysiympäristön

Olemme käyttäneet Kaplan-Meier tontteja visualisoida assosiaatiota geeni tutkittavana ja selviytymistä. Ennen analyysin potilaiden suodatettiin käyttäen saatavilla kliinisiä parametrejä sisältävän vain sellaiset potilaat, joissa merkitystä geeni on arvioitava. Paitsi suodatusvaihtoehdot spesifinen kliinisten parametrien, toteutimme algoritmi, joka sisältää käyttö kaikkien persentiilit alemman ja yläkvartiili tunnistaa parhaiten menestyvien sulku.

Tietääksemme, läsnä kehitys on ensimmäinen järjestelmä, jonka avulla reaaliaikainen monimuuttuja selviytyminen analyysi geenien käytettävissä transcriptomic ikäluokat.

validointi aiemmin julkaistu NSCLC biomarkkerit

tunnistettu 21 aiemmin julkaistu selviytymisen liittyviä yksittäisiä geenejä ja 7 geeniekspression allekirjoituksia (lueteltu taulukossa S1 ). Kukin näistä biomarkkereiden ehdokkaiden tutkittiin kohortin jolla on samanlaiset kliiniset ominaisuudet kuin potilaat, jossa ne alun perin kuvattu. Geenejä mitattuna useat koetinsarjojen on mikrosirut, joilla korkealaatuisia käytettiin (korkea laatu: keskimääräinen ilme yli 500 tai maksimaalinen ilme yli 1000, heikkolaatuinen: keskimääräinen ilmaisun alle 100, väli: kaikki muista antureista). Tapauksessa oli useita laadukkaita antureista sitten parhaiten toimiviin käytettiin. Analyysin tulokset on esitetty taulukossa 2 ja kuviossa 2.

meta-analyysi näiden geenien ja allekirjoitukset vastaavat näytteen kohortissa tuotti CCNE1, cdc2 ja CADM1 paras suorittaa yksittäisten geenien (A-C) ja allekirjoitus Yamauchi et al. (D). Suppiloa juoni kuvaa riskisuhteita (luottamusvälein) vs. näytenumeron cdc2 ja VEGF näyttää luotettavampi arvio suurempien tietokannan kokoa (E-F).

Keskustelu

merkitys syövän biomarkkereiden on korostettu menestys HER2 geenin rintasyöpä. Korkea HER2 ilme oli ensimmäinen merkkiaine elinajan, mutta kohdennettujen anti-HER2-hoidon muutti kuva: tänään HER2-positiivisten potilaiden on parantunut ennuste verrattuna naisiin, joilla HER2 negatiivinen tauti [27].

Täällä käyttämällä integroitu tietokanta kymmenen aiemmin julkaistu transcriptomic aineistoja, me validoitu yhdessä selviytymisen joukon geenejä ei-pienisoluinen keuhkosyöpä. Yleensä vahvin yhdistykset havaittiin myös niiden tutkittu aiemmassa meta-analyysi (VEGF, CCNE1 ja CDK1). Kaikkien näiden geenien suurempi ekspressio liittyi lyhyempi selviytymisen. Yli 5000 potilasta, meta-analyysi VEGF [20] palveluksessa eniten potilaita – analyysimme vahvisti myös korrelaatio VEGF ilmaisun ja kokonaiselinaika NSCLC potilaiden sekä yhden ja usean analyysejä. Tärkeys VEGF johtuu saatavuus kohdennettuja tekijöille suoraan estämällä sen aktivoinnin. Mielenkiintoista, yksi geeneistä (CDK1) aiemman meta-analyysi itse asiassa hylkäsi korrelaatio geenin ja selviytymisen [24]. Sen sijaan, tuloksemme muodostavat suuren mittakaavan riippumaton validointi geenin. Yksittäisissä geenejä, vain muutama liittyi pidempi eloonjäämisen kun näytetään suurempia ilmaisun – näihin kuuluvat CADM1, ANXA3, ADAM28, XIAP ja XAF1. Tulevaisuuden terapeuttinen kohdistaminen näistä on mahdollista vain käyttämällä erilaista lähestymistapaa kuin useimpien geenien, joissa suurempi ekspressio itse asiassa johtaa lyhyempi selviytymistä.

Leikkauksen jälkeen, noin kaksi kolmasosaa uusiutumista varhaisen vaiheen tauti esiintyy kaukaisia ​​sivustoja . Siksi hävittämiseksi mikrometastaasien oltava etusijalla mahdollisimman varhain. Aiempi meta-analyysi kaikkien tehdyissä tutkimuksissa kemoterapiaa hyöty osoitti 5% parannus kokonaiselossaoloaikaa [28]. Tämä selviytymisen etu kemoterapiaa myös arvossa 9 vuoden seurannassa. Näistä syistä käyttö adjuvanttihoitoa on nykyinen standardi hoitoa potilaille, joilla on varhaisessa vaiheessa NSCLC. Meidän analysointijärjestelmä olemme integroineet kemoterapian käyttöön, jotta validointi geenien liittyy erityisesti selviytymisen kemoterapiaa saaneista potilaista.

Merkittävä etiologinen tekijä keuhkosyöpä on tupakointi joka kattaa lähes 85% kaikista tapauksissa. Keuhkosyöpä kehitys on samanlainen kuin muut syöpätyyppeihin ottamalla vaiheittain eteneminen pahanlaatuinen muutos ohjaa kollektiivinen vaikutus geneettisten muutosten aiheuttamien hengitettynä karsinogeenien [29]. Samaan aikaan, määrä ei koskaan ole tupakoi keuhkosyöpäpotilaita on myös kasvussa [30]. Kerääminen uusia oivalluksia oleva mekanismi ja etiologiset tekijät näillä potilailla on tarpeen ymmärtää paremmin sairauksien ja kehittää uusia hoitostrategioita [2]. Tietokannassamme meillä oli tupakoinnin historiaa 1042 potilasta (näistä 187 ei tupakoitsija) ja meta-analyysin avulla myös mahdollisuus rajoittaa joko tupakoitsija on nonsmoker kohortteja potilaista. Muita suodatus vaihtoehtoja ovat käyttämällä sukupuolen (tietoja on saatavilla 1564 potilasta) ja lavastus (697 potilasta). Yhdistelmät näistä vaihtoehdoista mahdollistaa validoida biomarkkereiden ehdokkaita Saharan ikäluokat, joiden koko ei ole saavutettu mitään edellisen yksittäisten tutkimusten.

Aiemmin sisällä johtajien haaste hankkeen keuhkoadenokarsinooma, käyttö yhdessä kliinisen ja geenien ilmentyminen tietoja suoriutui parhaiten ennustamaan ennusteen [17]. Monimuuttuja-analyysi online ohjelmiston avulla verrata kliinisen ja molekyylitason muuttujia. Valitettavasti kaikki kliiniset tiedot julkaistaan ​​jokaiselle potilaalle – tämä rajoittaa merkittävästi potentiaalia tahansa monimuuttujamenetelmin lukien sekä kliinisen ja geenien ilmentymisen muuttujia.

Meidän täytyy myös mainita joitakin ongelmia meta-analyysit, jotka voivat heikentää niiden pätevyyden – näihin kuuluvat harhat liittyvät potilaan valinta, kliiniseen heterogeenisuus, eri lopputulokseen toimenpiteitä, menetelmiin ja tilastollisia menetelmiä [31]. Yksi vaihtoehto testi harhat on piirtämistä otoskoko vaikutusta vastaan ​​koko koska tämä on yleensä vinoutunut ja epäsymmetrinen läsnä bias [32]. Pohjimmiltaan, ilman bias, suurin vaihtelu olisi havaittu eniten pieniä tutkimuksia ja ainakin suurissa tutkimuksissa. Tämä on käsite alkuperäisen suppilo juoni jota käytetään osoittamaan korrelaatio vaaran hinnat ja otoskoot kahden valitun geenejä. Lisäsimme analyysi vaihtoehto meidän työkalu ajaa laskennat jokaiseen aineisto erikseen mahdollistavat nopean rakentamisen tällaisten analyysien tahansa geeni.

Olemme lopuksi myös arvioinut aiemmin julkaistu geeniekspression allekirjoituksia ennustaa selviytymisen. Nykyään kliininen soveltaminen monigeenisiin allekirjoitusten on yhä kiistanalainen, koska monet niistä eivät outperform ennustus perinteisillä parametreja. Täällä seitsemästä allekirjoitusten kaksi kykenivät ennustamaan selviytymistä I vaiheessa [13], ja kaikkien NSCLC potilaat [14].

Yhteenvetona hyödyntämällä genominlaajuisten microarray aineistot julkaistaan ​​viiden viimeisen vuosina olemme onnistuneet yhdistämään laajassa tietokannassa sopivia

in silico

validointi biomarkkereiden ehdokkaista ei-pienisoluinen keuhkosyöpä.

tukeminen Information

Taulukko S1.

Luettelo geenien aiemmin julkaistu geenin sarjaa.

doi: 10,1371 /journal.pone.0082241.s001

(XLS)

R Script S1.

R script käytetään tuottamaan Kaplan-Meier tontit

doi: 10,1371 /journal.pone.0082241.s002

(R) B