Krooninen sairaus

tiivistelmä

Asetyylisalisyylihappo (aspiriini) on erittäin tehokas hoitoon paksusuolen syöpäpotilaiden postdiagnosis; kuitenkin toimintamekanismit aspiriinin paksusuolen syöpä ei ole määritelty. Aspiriini ja sen päämetaboliitti natriumsalisylaatin aiheuttaman apoptoosin ja väheni paksusuolen syövän solujen kasvua ja natriumsuolan aspiriini inhiboi myös kasvaimen kasvua käytettäessä atyymisissä nude hiiren ksenograftimallissa. Paksusuolensyöpä solukasvuneston mukana oli downregulation SP1, SP3 ja SP4 proteiineja ja vähentynyt ilmentyminen Sp-säänneltyjen geenituotteet myös BCL-2, surviviini, VEGF, VEGFR1, sykliini D1, c-MET ja p65 (NFKB). Lisäksi olemme myös osoitti RNA interferenssin että P-kateniinin, tärkeä tavoite aspiriinin joissakin tutkimuksissa on Sp-säännelty geeni. Aspiriini aiheuttama ydinaseiden kaspaasiriippuvaisen lohkaisu SP1, SP3 ja SP4 proteiineja ja tämä vaste liittyi sitomisen sinkki-ionien lähtien lisäämällä sinkkisulfaattia esti aspiriinin välittämää apoptoosia ja tukahduttamisesta Sp proteiineja. Tulokset osoittavat tärkeä taustalla olevan mekanismin toiminnan aspiriinia syöpälääke ja, joka perustuu nopeaan metaboliaan aspiriinia salisylaatti ihmisillä ja korkean salisylaatti /aspiriini suhde seerumissa, on todennäköistä, että syövän vastaisen aktiivisuuden aspiriinin johtuu myös että salisylaatti metaboliitiksi.

Citation: Pathi S, Jutooru I Chadalapaka G, Nair V, Lee SO, Safe S (2012) Aspirin Estää Colon Cancer Cell ja kasvaimen kasvu ja Downregulates spesifisyys Protein (Sp) transkriptiotekijät . PLoS ONE 7 (10): e48208. doi: 10,1371 /journal.pone.0048208

Editor: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 9. elokuuta, 2012 Hyväksytty: 24 syyskuu 2012; Julkaistu: 26 lokakuu 2012

Copyright: © 2012 Pathi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Institutes of Health (R01 CA136571) ja Texas AgriLife Research. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Asetyylisalisyylihappo tai aspiriini on ei-steroidinen anti-inflammatorinen lääke (NSAID) käytetään laajasti kivun, kuumeen ja muiden tulehdustilojen [1] ja rooli aspiriini ja muut NSAID syöpä on ollut laajalti tutkittu [2], [3]. Aspiriini käyttö liittyy pienentynyt riski peräsuolen syöpä, rintasyöpä, ruokatorven, keuhko-, vatsa ja munasarjasyövän, ja aspiriini on sekä chemopreventive ja kemoterapeuttista ainetta rinta- ja paksusuolen syöpä [4] – [8]. Tuoreessa raportissa on chemopreventive vaikutuksia aspiriinia osoitti, että esiintyvyys paksusuolen syövän Skotlannissa pieneni merkitsevästi väestössä pienimmällä päiväannos aspiriinia (75 mg) ja vähentyneen ilmaantuvuuden havaittiin, vaikka vain 5 v aspiriinin käyttö [7]. Toisessa tutkimuksessa kemoterapeuttisen vaikutukset aspiriinin paksusuolensyöpä potilailla, riskisuhde 0,53 (kuolleisuuden) havaittiin potilailla, jotka eivät käytä huumeita ennen diagnoosia ja tämä arvo laski 0,39 potilasalaryhmässä yli-ilmentävät oksygenaasi 2 (COX-2) [5].

Useat tutkimukset paksusuolen syöpäsoluissa ja paksusuolen kasvainten mallit ovat osoittaneet, että aspiriini inhiboi kasvun ja indusoi apoptoosia näissä järjestelmissä; kuitenkin, erityiset vaikutukset aspiriinin ovat hieman vaihteleva näissä raporteissa. Esimerkiksi aspiriini downregulates bcl-2: n ilmentymisen [9], inhiboi verisuonen endoteelin kasvutekijää, osoittaa antiangiogeeninen aktiivisuus [10], [11], ja estää WNT /β-kateniinin reitin [12]. Dunlop ja työtoverit ovat myös osoittaneet, että aspiriini aiheuttama downregulation IκBα paksusuolen syöpäsoluissa tulokset tiiviimpään ydinvoiman kertyminen NFKB kompleksin (p65 /p50) ja tämä on yhdistetty pro-apoptoottisen väylän koolonkarsinoomasoluissa [13] – [15].

Etyyli-2 – [(2,3-bis (nitro-oksi) propyyli) disulfanyyli] bentsoaattia (GT-094) on synteettinen nitro-ei-steroidiset anti-inflammatorinen lääke (NO-NSAID) ja kuten aspiriini, GT-094 estää myös paksusuolisyöpäsolulinjassa ja kasvaimen kasvua [16], [17]. Mekaaniset tutkimukset osoittavat, että syövän vastaista aktiivisuutta GT-094 johtuu osittain ROS riippuva downregulation spesifisyys proteiinia (Sp) transkriptiotekijöiden SP1, SP3, SP4 ja Sp-geenien, jotka sisältävät BCL-2, surviviini, hepatosyyttikasvuteki- kasvutekijän reseptoria (c-MET), VEGF: n ja sen reseptorin VEGFR1 [17]. Muut lääkkeet kuten NSAID, kuten tolfenaamihappo ja COX-2-estäjät estävät myös syöpäsolujen kasvua ja säätelevät vaimentaen Sp transkriptiotekijöiden [18] – [26], ja tässä tutkimuksessa olemme tutkineet vaikutuksia aspiriinia Sp proteiinien ja muiden SP- säännelty geenejä, mukaan lukien β-kateniinin. Tuloksemme osoittavat, että aspiriini ja salisylaatti downregulate SP1, SP3, SP4 ja useat Sp säädelty geeni tuotteiden koolonkarsinoomasoluissa ja tunnistaa tärkeä väylä syövän vastaisen aktiivisuuden aspiriinin, joka on yhdenmukainen RNA-interferenssi (RNAi) tutkimukset, joissa pudotus SP1, sp3 ja SP4 syöpäsoluissa myös estää kasvua ja aiheuttaa apoptoosin [24] – [26]. Knockdovvn Sp proteiinien osoitettiin myös, että β-kateniinin on Sp-säännelty geenin koolonkarsinoomasoluissa. Tämän tutkimuksen tulokset, yhdistettynä aikaisempien raporttien mekanismeista aspiriini estoa paksusuolen syöpäsolujen kasvua, helpottaa myös kehittymistä hoitojen aspiriinin ja NSAID analogit yhdessä muiden hoitoon käytetyt aineet paksusuolensyöpä. Raportoitiin korkea seerumin salisylaatti /aspiriini suhteet havaittu ihmisillä tehdyissä tutkimuksissa käyttäen aspiriinia [27] viittaavat siihen, että salisylaattia voi olla tärkeä tekijä syövän vastaista aspiriinin aktiivisuuden paksusuolensyöpä potilailla.

koemenettelytavat

solulinjoja, reagenssien ja vasta-aineiden

RKO, SW480, HT-29 ja ihmisen HCT-116 koolonkarsinooma solulinjat saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA). RKO ja SW480-solut ylläpidettiin Dulbeccon modifioidussa /Hamin F-12 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), jossa fenolipunaista täydennetty 0,22%: isella natriumbikarbonaatilla, 5% naudan sikiön seerumia ja 10 ml /l 100X antibiootti /antimykoottia liuosta (Sigma). HT-29 ja HCT-116-soluja ylläpidettiin McCoyn 5A-alustassa (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), jossa fenolipunaista täydennetty 0,22%: isella natriumbikarbonaatilla, 10% naudan sikiön seerumia ja 10 ml /l 100X antibiooteille anti-sieni-liuosta (Sigma). Soluja kasvatettiin 150 cm

2 kulttuuri levyjä ilma /CO

2 (95:5) atmosfäärissä 37 ° C: ssa ja siirrostetaan noin joka 3-5 päivää. Kaikki vasta-aineet hankittiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), paitsi lohkaistiin poly (ADP) riboosi-polymeraasi (PARP) ja c-Met (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), SP1 surviviiniperäiset ja VEGF-R2 (Millipore, Temecula, CA), VEGFR1 ja p65 (Abcam Inc. Cambridge, MA), ja β-aktiini-vasta-aineita (Sigma-Aldrich). β-kateniinin ostettiin Epitomics, Inc., Burlingame, CA. NSAID asetyylisalisyylihapon ja natriumsalisylaatti ostettiin Sigma-Aldrich. N, N, N ’, N’-tetrakis (2-pyridyyli metyyli) etyleenidiamiinia (TPEN), glutationia (98%) (GSH), ja laktakystiini ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Ditio- treitoli (DTT) (98%) saatiin Boehringer Mannheim Corp, (Indianapolis, IN). Caspase-inhibiittorit 2, 8 ja 9 ja pancaspase estäjä (Z-VAD-fmk) ostetaan Calbiochemiltä (San Diego, CA). Leptomycin B oli estäjä tumasta ostettujen Enzo Life Sciences International, Inc. (Plymouth Meeting, PA). Lipofectamine ja Lipofectamine 2000 ostettiin Invitrogen. Lusiferaasi reagenssi oli Promega (Madison, WI). p-galaktosidaasin reagenssi saatiin Tropix (Bedford, MA). NFKB promoottorikonstruktiin hankittiin Stratagene (Cedar Creek, TX). VEGF ja surviviinista promoottorikonstrukteja toimittivat Drs. Gerhard Siemeister ja Gunter Finkenzeller (Institute of Molecular Medicine, tuumoribiologiassa Center, Freiburg, Saksa) ja tohtori M. Zhou (Emory University, Atlanta, GA), tässä järjestyksessä. SP1 SP3 promoottori konstruktit ystävällisesti Drs. Carlos Cuidad ja Veronique Noe (University of Barcelona, ​​Barcelona, ​​Espanja).

soluproliferaatiomäärityksissä

RKO, SW480, HT-29 ja HCT-116 koolonsyöpäsolulinjaa levytettiin (3 x 10

4 kuoppaa kohden) käyttäen DMEM: Ham F-12-väliaineessa, joka sisälsi 2,5% puuhiilellä puhdistettua naudan sikiön seerumia (FBS) 12-kuoppaisille levyille ja annettiin kiinnittyä 24 tunnin ajan. Sitten soluja käsiteltiin joko vehikkelillä tai konsentraatiot aspiriini ja natriumsalisylaatti. 24, 48 ja 72 tuntia hoidon jälkeen solut laskettiin käyttäen Coulter Z1 hiukkanen laskuri. Kukin koe suoritettiin kolmena kappaleena ja tulokset ilmoitetaan keskiarvoina ± SE kussakin määrityksessä.

anneksiini V värjäystä

Apoptosis, nekroottinen ja terveen solun havaitseminen pakki ostettiin Biotium, Inc (Hayward , CA). RKO, SW480, HT-29 ja HCT-116-paksunsuolen syöpäsolujen (7,5 x 10

4) ympättiin Lab-Tek kaksi chambered kansi lasilevyille ja annettiin kiinnittyä yön yli. Käsittelyn jälkeen aspiriinia (10 mM) 24 tunnin ajan, solut pestiin kylmällä fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) kahdesti ja inkuboitiin FITC anneksiini V, etidiumhomodimeeri III ja Hoechst 33342 on anneksiini V: n sitoutumisen puskurissa 20 min mukaan valmistajan ohjeita protokollan. Sitten solut pestiin kahdesti anneksiini V: n sitoutumisen puskuria ja havaita flouroscence digitaalisen fluoresenssimikroskoopilla.

siRNA häiriöitä määrityksissä

siRNA: t ja Sp1, Sp3, SP4 ja Lamin hankittiin Sigma- Aldrich. SiRNA komplekseja käytettiin tässä tutkimuksessa osoitetaan seuraavasti:

Lamin: SASI_Hs02_00367643

SP1: SASI_Hs02_00363664

SP3 5′-GCG GCA GGU GGA GCC UUC ACU TT

SP4 5′-GCA GUG ACA CAU UAG UGA GCT T

RKO ja SW480 koolonsyöpäsolulinjaa ympättiin (6 x 10

4 per ml) 6-kuoppalevyille DMEM: Hamin F-12-väliaineessa, jota oli täydennetty 2,5% hiilellä erotettua FBS: ää ilman antibioottia ja jätettiin kiinnittyä 1 d. Knockdovvn SP1 SP3, SP4 yksittäin tai yhdistelmänä kaikista 3 proteiinien suorittaa käyttämällä asianmukaisia ​​siRNA yhdessä iLamin kontrollina suoritettiin käyttäen LipofectAMINE 2000 transfektioreagenssia kohti valmistajan ohjeiden.

Transfektio ja lusiferaasianalyysissä

RKO ja SW480 paksusuolen syövän soluja (1 x 10

5 per kuoppa) maljattiin 12-kuoppaisille levyille DMEM /Hamin F-12-väliaineessa, jota oli täydennetty 2,5% hiilellä erotettua FBS: ää. 24 tunnin kuluttua eri määriä DNA: ta [eli 0,4 ug PGL3-Luc, 0,04 ug β-galaktosidaasi, ja 0,4 ug pNFκB-Luc (4) -Luc] transfektoitiin käyttämällä LipofectAMINE 2000 mukaista reagenssia valmistajan protokollaa. Kun 5 h transfektion transfektioseos korvattiin täydellistä elatusainetta, joka sisälsi joko vehikkeliä (DMSO) tai ilmoitettu yhdisteen DMSO.

RNA-interferenssi tutkimuksia, RKO ja SW480 paksusuolen syövän soluja kotransfektoitiin siRNA varten SP1 SP3, SP4 tai Lamin yhdessä eri määriä DNA pGL3- Luc tai 0,4 ug pNFκB-Luc. Sen jälkeen, kun 22 tunnin, jälkeen solut hajotettiin 100 pl: lla 1X toimittaja lyysipuskuria, ja solu-uutteet (30 ml) käytettiin lusiferaasi ja β-galaktosidaasi määrityksissä. Lumicount luminometria käytettiin kvantifioimaan lusiferaasi ja β-galaktosidaasi toimintaa, ja lusiferaasiaktiivisuudet normalisoitiin P-galaktosidaasin aktiivisuuden.

Western blotit

RKO, SW480, HT-29 ja HCT- 116 paksusuolen syövän soluja ympättiin DMEM: Ham F-12-väliaineessa, joka sisälsi 2,5% hiilellä erotettua FBS: ää, ja 24 tunnin kuluttua soluja käsiteltiin joko vehikkelillä (DMSO) tai ilmoitettu yhdisteitä. Solut kerättiin käyttäen high-puskuria (50 mM HEPES, 0,5 mol /l NaCl: a, 1,5 mM MgCl

2, 1 mM EGTA: ta, 10% glyserolia ja 1% Triton-X-100) ja 10 ml /l Protease Inhibitor Cocktail (Sigma-Aldrich). Sentrifugoinnin jälkeen lysaatit 15000

g

15 min 4 ° C: ssa, supernatantit otettiin talteen ja proteiini kvantifioitiin Bradfordin proteiinimäärityksellä. Proteiini lysaatit (15-60 ug) inkuboitiin 5-10 minuutin ajan 100 ° C: ssa yhdessä 5X latauspuskuria ja sitten erotettiin elektroforeesilla 7,5-12% natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeeleillä 120 V 3-4 tuntia. Proteiinit siirrettiin polyvinylideenidifluoridi kalvoja märkä elektroblottaus puskurissa, joka sisälsi 25 mM Tris, 192 mM glysiiniä, 20% metanolia, 1,5 tunnin ajan 180 mA. Membraanit blokattiin 45 min 5% TBST-Blotto (10 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, pH 8,0, 0,05% Triton X-100, ja 5% rasvatonta kuivamaitoa), ja inkuboitiin tuoreessa, 5% TBST-Blotto kanssa 1:500 primaarista vasta-ainetta yön yli varovasti ravistellen 4 ° C: ssa. Pesun jälkeen kahdesti TBST 10 minuuttia, kalvo inkuboitiin sekundaarisella vasta-aineella (1:5000) 5% TBST-Blotto 3-4 tunnin kevyesti ravistellen. Membraani pestiin kaksi kertaa TBST: llä 10 min ajan, inkuboitiin 2 ml: n kemiluminesenssin alustan (Millipore, Temecula, CA) 1 minuutin ajan, ja valotettiin Kodak kuvan asemalle 4000 mm Pro (Carestream Health, Rochester, NY).

Vieraslajisiirteen tutkimukset kateenkorvattomissa hiirissä

Nainen kateenkorvattomia nude-hiiret hankittiin Harlan Laboratories (Indianapolis, iN). Hiiret majoitettiin ja ylläpidettiin spesifisissä patogeenivapaissa olosuhteissa hyväksytyissä tiloissa American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care ja voimassa olevien määräysten ja standardien Yhdysvaltain Department of Agriculture, United States Department of Health and Human Services. Tutkimus toteutettiin tiukasti mukaisesti suosituksia Opas hoito ja käyttö Laboratory Animals of National Institutes of Health. Protokolla hyväksyttiin Texas A M University Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC) (AUP # 2012-131). Kaikki Leikkaus suoritettiin natrium- pentobarbitaalianestesiassa, ja yritettiin minimoida kärsimyksen. Aiheuttavan kasvaimia, RKO solut kerättiin subkonfluenteista viljelmät lyhyt altistuminen 0,25% trypsiiniä ja 0,02% etyleenidiamiinitetraetikkahappoa. Trypsinisaatiolla pysäytettiin, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia, ja solut pestiin kerran seerumittomalla alustalla ja suspendoitiin seerumivapaassa väliaineessa. Vain suspensiot, joka koostuu yksittäisten solujen 90%: n elinkelpoisuutta käytettiin injektioita. Ksenografti perustettiin ihonalaisella solujen (3 x 10

6) kylkiin Yksittäisten hiirien. Kasvainten annettiin kasvaa 6 d, kunnes ne olivat palpoitavissa. Sitten hiiret satunnaistettiin kahteen ryhmään 6 hiirtä ryhmää kohti ja annostellaan suun kautta letkulla maissiöljyä 200 mg /kg /päivä (neutraloitu ekvimolaarisella pitoisuus NaOH) ja aspiriinia päivittäin 14 d. Hiiret punnittiin, ja kasvaimen koko mitattiin joka toinen päivä mittaharpilla, jotta laskentaan kasvainten: V = LW

2/2, jossa L ja W olivat pituus ja leveys, vastaavasti. Sen jälkeen 14 d, eläimet lopetettiin; lopullinen runko ja kasvainten painot määritettiin ja piirrettiin. Lopussa kokeen, suuret sisäelimissä ja kasvaimet kerättiin ja analysoitiin Sp proteiinin ilmentymisen ja apoptoosin induktion avulla western blotteja ja TUNEL värjäys vastaavasti.

Tilastollinen

Tilastollinen merkitys erojen määritettiin analysoimalla varianssi ja Studentin t-testi, ja tasot todennäköisyys havaittu. Kaikki tilastolliset testit olivat kaksipuolisia. IC

50-arvot laskettiin käyttäen epälineaarista regressioanalyysiä ja ilmaistaan ​​uM, 95%: n luottamusväli.

Tulokset

Aspiriini estää kasvun ja indusoi apoptoosia koolonkarsinoomasoluissa

tässä tutkimuksessa eri pitoisuuksilla (2,5-10 mM) aspiriinin esti kasvun SW480, RKO, HT29 ja HCT116-solut yli 3 päivän ajan (kuviot. 1A ja 1B), ja IC

50-arvot aspiriini aiheuttama kasvun esto oli alueella 2,5-5 mM kaikki 4 solulinjoissa. Suuren annoksen (10 mM) aspiriini käytettiin määrittämään proapoptoottiset vaikutuksia tämän yhdisteen käsittelyn jälkeen vain 24 tuntia ja tulokset osoittavat, että aspiriinin lisääntynyt anneksiini V värjäytyminen kaikki 4 koolonsyöpäsolulinjaa (Fig. 1 C). Proapoptoottiset vaikutukset aspiriinia (5 ja 10 mM) tutkittiin tarkemmin vuonna koolonkarsinoomasoluissa määrittämällä muutokset ilmaisun selviytymisen proteiinien Bcl-2 ja surviviinin ja induktio kaspaasiriippuvaisen PARP pilkkominen. Aspiriini indusoi pitoisuudesta ja ajasta riippuva downregulation surviviini ja bcl-2 ja indusoitiin PARP pilkkominen, merkki apoptoosin (kuviot. 1D ja 1E).

esto SW480 ja RKO (A) ja HT29 ja HCT116 (B) solujen lisääntymisen. Soluja käsiteltiin DMSO: ssa tai 2,5-10 mM aspiriinia 3 päivää, ja solujen määrä määritettiin kuten on kuvattu Kokeelliset menettelytavat. Induktio anneksiini V värjäytymistä (C) ja apoptoottisten vasteita RKO ja SW480 (D) ja HT29 ja HCT116 (E) soluja. Anneksiini V: värjäytyminen määritettiin, kuten on kuvattu Kokeelliset menettelytavat. Ilmentymisen apoptoottisten proteiinien PARP pilkkominen määritettiin Western blot -analyysillä kokosolulysaateista kuvatun Kokeelliset menettelytavat. Tulokset (A) ja (B) ovat keskiarvoja ± SE 3 kaksoiskappaleanalyysiä määrittämistä varten kussakin testiryhmässä ja merkitsevä (p 0,05) esto on merkitty (*).

aspiriini ja salisylaattia downregulates SP1 , SP3, SP4 ja Sp geenien

Aiemmat tutkimukset RNA-interferenssi (RNAi) osoittavat, että sekä surviviini ja bcl-2 säätelee SP1, SP3 ja SP4 syöpäsoluissa [17], [22], [24] – [26]. Siksi RKO, SW480, HT29 ja HCT116-soluja käsiteltiin 5 ja 10 mM aspiriinia 24 tai 48 tuntia ja western blot-analyysi osoitti, että oli pitoisuudesta ja ajasta riippuva väheneminen SP1, SP3 ja SP4 proteiinit kaikki 4 solussa linjat (kuviot. 2A ja 2B). Lisäksi hoito RKO, SW480, HT-29 ja HCT116 koolonkarsinoomasoluissa 5 tai 10 mM aspiriinia 24 tai 48 tunnin ajan vähensi myös ilmentyminen useiden geenituotteiden säätelee Sp1, Sp3 ja SP4 [24] – [29], ja näiden VEGF: ää, VEGFR1, sykliini D1 ja c-MET proteiineja (kuviot. 2C ja 2D), ja vaikutukset aspiriinin niiden ilmentyminen sekä pitoisuudesta ja ajasta riippuvia.

alassäätely Sp proteiinien RKO ja SW480 (A) ja HT29 ja HCT116 (B) ja Sp-säänneltyjä geenituotteiden RKO ja SW480 (C) ja HT29 ja HCT116 (D) soluja. Soluja käsiteltiin 5 tai 10 mM aspiriinia 24 tai 48 tunnin ajan, ja kokosolulysaateista analysoitiin western blot -analyysillä, kuten on kuvattu Kokeelliset menettelytavat. Tulokset ovat tyypillisiä päällekkäisiä kokeita. (E) Aspirin pienenee reportterigeeniaktiivisuutta. Solut transfektoitiin pSp1For4, pSp3For5, pVEGF ja pSurvivin ja käsiteltiin DMSO: ssa tai aspiriinia (5 tai 10 mM). Lusiferaasiaktiivisuus määritettiin, kuten on kuvattu Kokeelliset menettelytavat. Tulokset ilmoitetaan keskiarvoina ± SE (3 toistoa) ja merkitseviä (p 0,05) inhibition on osoitettu (*).

Tutkimme myös vaikutuksia 5 ja 10 mM aspiriinia lusiferaasiaktiivisuuden RKO ja SW480-solut transfektoitu, jotka sisälsivät runsaasti GC promoottori insertit SP1 (pSp1For4, -751 -20), SP3 (pSp3For5, -417 -38), VEGF (pVEGF, -2018-50), ja surviviiniperäistä ( pSurvivin, -269-49) geenejä (Fig. 2E). Lukuun ottamatta VEGF-konstruktin, 5 ja 10 mM aspiriini vähentynyt merkittävästi lusiferaasin aktiivisuus ja nämä tulokset korreloivat vähentynyttä ilmentymistä vastaava Sp1, Sp3, VEGF: n ja surviviinin proteiinien RKO ja SW480-soluissa. Kasvu lusiferaasiaktiivisuuden RKO soluissa, joita käsiteltiin 5 mM aspiriinin ja transfektoitiin pVEGF voi johtua siitä, että suhteellisen hidas downregulation tämän proteiinin, joka havaittiin vain 48 tunnin kuluttua on 10 mM konsentraatio, mikä viittaa siihen, että muut aspiriini aiheuttama reittejä voi myös voidaan aktivoimalla VEGF.

aspiriini metaboloituu nopeasti salisylaatti [27] ja vaikutukset salisylaatti paksusuolen syöpäsolujen kasvua, Sp proteiinit ja Sp-geenien tutkittiin myös (Fig. 3). Salisylaatti (natriumsuola) (2,5-10 mM) esti myös kasvua kaikkien 4 solulinjoissa (kuviot. 3A ja 3B), ja kasvua inhiboiva vaikutukset olivat samanlaisia ​​kuin aspiriini (kuviot. 2A ja 2B). Kasvun estyminen mukana ajasta riippuva downregulation SP1, SP3, SP4 ja Sp-säänneltyjä geenituotteiden (BCL-2, sykliini D1 surviviiniperäiset ja VEGF) in RKO ja SW480 (Fig. 3C) ja HCT116 ja HT29 (Fig. 3D-solut). Tämä vastekaaviot natriumsalisylaattia oli verrattavissa niihin, aspiriini (kuviot. 1 ja 2), ja samankaltaisia ​​vaikutuksia havaittiin myös metyylisalisylaatti (tuloksia ei ole esitetty), joka on myös metaboloituu nopeasti salisylaatti.

Inhibition of RKO ja SW480 (A) ja HCT116 ja HT29 (B) solujen kasvua. Soluja käsiteltiin 2,5-10 mM natriumsalisylaatti jopa 3 päivää, ja solujen määrä määritettiin kuten on kuvattu Kokeelliset menettelytavat. Proteiini downregulation in RKO ja SW480 (C) ja HCT116 ja HT29 (D) soluja. Soluja käsiteltiin 5 tai 10 mM salisylaattia 24 tai 48 tunnin ajan, ja kokosolulysaateista analysoitiin western blotit, kuten on kuvattu Kokeelliset menettelytavat.

Aspirin-indusoidun suppression NFKB ja β-kateniinin johtuu, osittain Sp-downregulation

aikaisemmin on raportoitu, että aspiriinin tehostettu ydinaseiden NFKB kertymistä [13] – [15] ja tämä tarkemmin tutkimuksen RKO ja SW480-solut käsiteltiin 5 ja 10 mM aspiriinia 48 tuntia. Tasot sytosolin p65 ja p50-tasot laskivat, kun taas ydinvoiman p65 ja p50 pitoisuudet olivat suhteellisen muuttumattomana hoidon jälkeen aspiriinia (kuviot. 4A ja 4B) ja nämä tulokset erosivat aikaisempien tutkimusten [13] – [15]. Lisäksi yleiseen tasoon tumaproteiinien olivat 10% sytosolin proteiineista ja tämä varmistettiin western blot analyysi kokosolulysaateista soluista käsiteltiin 5 tai 10 mM aspiriinia joka osoitti, että sekä p65 ja p50-proteiinit laski sekä solulinjoissa 48 tunnin kuluttua hoidon aspiriinin (kuviot. 4A ja 4B). Aspiriini myös vähentynyt lusiferaasiaktiivisuuden SW480 ja RKO-solujen, jotka on transfektoitu pNFκB-luc-konstrukti (Fig. 4C), ja nämä tulokset olivat yhdenmukaisia ​​havaitun downregulation sekä p65 ja p50-proteiineja (kuviot. 4A ja 4B). Aiemmat tutkimukset raportoitu, että aspiriinin laski β-kateniinin ilmentymistä koolonkarsinoomasoluissa [12], ja tuloksemme vahvistivat, että 5-10 mM aspiriini vähentää myös β-kateniinin ilmentymistä RKO ja SW480 paksusuolen syövän soluja (Fig. 4D).

Vähentynyt p65 /p50 in RKO (A) ja SW480 (B) soluista. Soluja käsiteltiin 48 tunnin ajan 5 tai 10 mM, ja kokosolu, ydin- ja sytosolin uutteet analysoitiin western blot analyysiä, kuten on kuvattu Kokeelliset menettelytavat. Tasot p65 ja p50-proteiineja (suhteessa p-aktiini) in kokosolulysaateille kvantitoitiin 3 rinnakkaisnäytettä kokeita ja ne vähenivät merkittävästi aspiriinia. (C) Aspirin pienenee NFKB-Luc. Konstrukti transfektoitiin RKO ja SW480-soluja käsiteltiin DMSO: ssa tai aspiriinia, ja lusiferaasiaktiivisuus määritettiin, kuten on kuvattu Kokeelliset menettelytavat. Tulokset ovat keskiarvoja ± SE (3 toistoa) ja merkitseviä (p 0,05) inhibition on osoitettu (*). (D) alassäätely β-kateniinin. Soluja käsiteltiin 5 tai 10 mM aspiriinia 48 tuntia, ja koko solulysaatit analysoitiin western blotit, kuten on kuvattu Kokeelliset menettelytavat.

Koska NFKB (p65) ja β-kateniinin promoottorit sisältävät GC-rikas Sp sitoutumiskohtia [28], [29], käytimme RNAi määrittämään roolia SP1, SP3 ja SP4 sääntelyssä p65, p50 ja β-kateniinin koolonkarsinoomasoluissa. RKO ja SW480-solut transfektoitiin pieni estävä RNA: iden kohdistaminen SP1 (ISP1), SP3 (iSp3), ja SP4 (ISP4) yksinään ja yhdistelmänä (ISP1 /3/4). Kuvio 5A osoittaa, että jokainen yksittäinen oligonukleotidi väheni ilmaus sille asetettuun (SP1, SP3 ja SP4) ja ISP1 /3/4 pudotti kaikki kolme proteiinia. ISP1 myös vähentynyt ilmentyminen SP4 (mutta ei SP3) ja tämä on sopusoinnussa aikaisempien tutkimusten osoittavat rajat sääntelyn vuorovaikutusta keskuudessa Sp transkriptiotekijät johtuen niiden GC-rikas promoottorit [22], [25]. Kuvio 5B havainnollistaa solun kontekstisidonnaisia ​​eroja vaikutuksia Isp1, iSp3 ja ISP4 on p65 ilmentymistä RKO ja SW480-solut, joissa SP1, SP3 ja SP4 knockdown aiheutti pieniä muutoksia p65 in RKO soluissa ja SP1 ja vähäisemmässä määrin SP4 knockdown väheni p65 in SW480-soluissa. ISP1 /3/4 (yhdistetty oligonukleotidit) väheni p65 ilmentymistä molemmissa solulinjoissa, kun taas vähäinen vaikutus havaittiin p50. Näin ollen, aspiriini aiheuttama downregulation of p50 (kuviot. 4A ja 4B) oli Sp-riippumaton. Kuvio 5C osoittaa, että ISP1 /3/4 vähensi myös lusiferaasiaktiivisuuden RKO (90%) ja SW480 (40%) transfektoitujen solujen NFKB-luc-konstrukti, ja erilaiset vaikutukset Sp Knockdown näissä soluissa viittaavat hallitsevampi rooli Sp-riippuvainen sääntelyn NFKB in RKO kuin SW480-soluissa. Sp taintumisen (yhdistetty) laski myös β-kateniinin proteiinin RKO ja SW480-soluissa ja tuloksia knockdown yksittäisten Sp proteiinien viittaavat siihen, että SP1 ja SP4 ovat hallitseva transkriptiotekijät tarvitaan ilmentämällä β-kateniinin RKO soluissa, kun taas knockdovvn SP1 , SP3 ja SP4 vähentää β-kateniinin proteiinin tasot SW480-soluissa (kuvio. 5D). Mielenkiintoista, RNAi tutkimukset osoittavat, että PARP pilkkominen (apoptoosin) indusoidaan pääasiassa jälkeen knockdovvn SP3 sekä RKO ja SW480-soluissa (kuvio. 5E).

knockdovvn SP1, SP3, SP4 ja SP1 /3/4 (A) ja p65 /p50 (B) koolonkarsinoomasoluissa. Solut transfektoitiin eri oligonukleotideja, ja kokosolulysaateista analysoitiin western blot -analyysillä, kuten esitetty Kokeelliset menettelytavat. (C) knockdovvn SP1 /3/4 (yhdistetty) estää NFKB-luc. Solut transfektoitiin iLamin (kontrolli) ja ISP1 /3/4 (yhdistetty oligonukleotidit) ja NFKB-luc, ja lusiferaasiaktiivisuus määritettiin, kuten on kuvattu Kokeelliset menettelytavat. Tulokset ilmoitetaan keskiarvoina ± SE (3 toistoa), ja merkittävästi (p 0,05) vähentynyt aktiivisuus on merkitty (*). Sp Knockdown vähentää β-kateniinin (D) ja indusoi PARP pilkkominen (E). Solut transfektoitiin eri oligonukleotideja, ja kokosolulysaateista analysoitiin western blotit, kuten on kuvattu Kokeelliset menettelytavat.

Mechanism aspiriinin indusoiman downregulation Sp1, Sp3 ja SP4

useita reittejä on kuvattu parannettu Sp hajoamista syöpäsolulinjoissa ja näihin kuuluvat aktivaatio proteasomien, kaspaasien ja ROS [17] – [20], [22] – [26] ja myös polku, johon liittyy tumasta SP1 seuraa proteolyyttiselle hajoamiselle sytosolissa [30]. Western blot-analyysi ydin- ja sytosolin fraktiot RKO ja SW480-soluissa osoittaa, että SP1, SP3 ja SP4 ovat tumassa ja hoidon aspiriinin vähentynyt SP1, SP3 ja SP4 proteiinin tasot tumassa ilman ilmeistä translokaation sytosoliin (Fig. 6A). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin, kun yhteiskäsittely aspiriinin ja tumasta estäjän leptomycin B (yhdistetty), mikä osoittaa, että tumasta SP1, SP3 tai SP4 ei vaadittu aspiriini aiheuttama downregulation SP1, SP3 ja SP4. Muita tekijöitä, kuten nitro-NSAID GT-094 ja betuliinihappoa laski Sp proteiinien RKO ja SW480-solujen kautta ROS-riippuvainen induktio Sp transkription repressori ZBTB10 ja tämä vaste oli vaimennettu antioksidantteja, kuten GSH tai DTT [17], [31 ]; kuitenkin tulokset kuviossa 6B osoittavat, että nämä antioksidantit eivät estä aspiriini aiheuttama downregulation Sp proteiineja. Tulokset alustavista tutkimuksista osoittavat, että aspiriinin aiheuttama downregulation Sp proteiinien ei myöskään estänyt proteasomiestäjät (tuloksia ei ole esitetty), mutta vaikutti yhteiskäsittely kanssa pancaspase inhibiittorin Z-VAD-fmk. Kuviot 6C ja 6D osoittavat, että aspiriinin aiheuttama Sp downregulation in RKO ja SW480-solujen estyi jälkeen yhteiskäsittely kanssa pancaspase estäjän (Z-VAD-fmk), kaspaasi-2 (Z-VDVAD-fmk) ja kaspaasi-8 (Z- IETD-fmk: n) estäjiä, mutta vain osittain tukossa kaspaasi 9 (Z-LEHD fmk) estäjä.

(A) vaikutukset leptomycin B. Soluja käsiteltiin 10 mM aspiriinin läsnä ollessa tai poissa ollessa leptomycin B 48 tunnin ajan, ja kokosolulysaateista analysoitiin western blot -analyysillä, kuten on kuvattu Kokeelliset menettelytavat. Vaikutukset antioksidantit (B) ja kaspaasi-inhibiittorit (C, D) on aspiriini aiheuttama Sp proteiinin downregulation. Soluja käsiteltiin DMSO: aspiriini yksinään tai yhdessä antioksidantteja tai kaspaasi-inhibiittorit, ja sen jälkeen 48 tunnin ajan, koko solulysaatit analysoitiin western blotit, kuten on kuvattu Kokeelliset menettelytavat.

Favier ja työtoverit [ ,,,0],32], [33] aiemmin raportoitu HeLa-soluissa, jotka sinkki chelation jonka läpäisevä metalli ionikelaattorina TPEN aktivoitu useita caspases (3-, 8- ja 9-) ja väheni ilmaus SP1, SP3 ja SP4 proteiineja, jotka sisältävät sinkki-ioneja niiden katalyyttinen sivustoja. Hoito RKO ja SW480-solujen kanssa 25 tai 50 uM TPEN 18 tunnin indusoidun PARP lohkominen ja aktivointi (pilkkominen) kaspaasien 8, 9, 3, ja 7 (Fig. 7A). Kriittinen rooli sinkin ehtyminen välittämisessä tätä vastetta ja downregulation Sp proteiinien varmistettiin käsittelemällä koolonkarsinoomasoluissa kanssa TPEN yksinään tai yhdessä 50 uM ZnSO

4 (Fig. 7B). TPEN vähentynyt ilmentyminen SP1, SP3 ja SP4 sekä lisäämällä ZnSO

4 täysin päinvastainen TPEN riippuva downregulation SP1, SP3 ja SP4 proteiineja. Kuten TPEN, aspiriini myös indusoi PARP lohkominen ja aktivointi (pilkkominen) kaspaasien 8, 9, 3 ja 7 (kuvio. 7C). Aspiriini aiheuttama PARP pilkkominen myös inhiboi sinkkisulfaattia (Fig. 7D); Lisäksi hoito RKO ja SW480-solujen aspiriinia yksinään tai yhdessä 50 uM ZnSO

4 osoittavat, että ZnSO

4 vähensi myös aspiriini välittämää downregulation SP1, SP3 ja SP4 (Fig. 7E), mikä vahvistaa, että aspiriini, kuten TPEN, indusoi kaspaasiriippuvaisen lohkaisu Sp proteiineja, jotka on määrä sinkki-ionin ehtyminen.

(A) TPEN indusoi aktivointi (pilkkominen) kaspaasien. Soluja käsiteltiin 25 tai 50 uM TPEN 18 tuntia, ja koko solulysaatit analysoitiin western blotit, kuten on kuvattu Kokeelliset menettelytavat. (B) TPEN pienenee Sp proteiinin ilmentymisen ja sinkkisulfaatti estää vaikutuksia TPEN on Sp downregulation. Soluja käsiteltiin 50 uM ZnSO

4 18 tunnin ajan, ja kokosolulysaateille analysoitiin Western blot. (C) Aspirin aktivoi kaspaaseiksi. Soluja käsiteltiin aspiriinia 48 tuntia, ja kokosolulysaateista analysoitiin western blotit, jotka on mainittu Kokeelliset menettelytavat. (D) Aspirin aiheuttama PARP pilkkominen on estänyt ZnSO

4. Soluja käsiteltiin 48 tuntia aspiriinia yksinään tai yhdessä ZnSO

4 ja PARP pilkkominen analysoitiin western blotit kokosolulysaateista. (E) vaikutukset ZnSO

4 aspiriinin aiheuttama downregulation Sp proteiineja.