Krooninen sairaus

tiivistelmä

Toistaiseksi pahanlaatuinen feokromosytoomien ja paragangliooma (PHEOs /PGLs) ei voida tehokkaasti parantaa ja siten uusia hoitostrategioita tarvitaan kiireellisesti. Lovastatiini on osoitettu tehokkaasti indusoida apoptoosia hiiren PHEO soluissa (MPC) ja aggressiivinen hiiri kasvainkudoksen peräisin olevat solut (MTT), joka oli liitetty vähentynyt fosforylaatio-mitogeeniaktivoidun (MAPK) reitti pelaajia. MAPK-reitin tärkeä rooli lukuisissa aggressiivisia kasvaimia ja on liittynyt alaryhmä PHEOs /PGLs, kuten

K-RAS-

,

jälkikä-

, ja

NF1

-mutated kasvaimia. Tavoitteena oli selvittää, MAPK signalointi voi myös olla rooli aggressiivinen, sukkinaattidehydrogenaasi (SDH) B mutaatio johdettu PHEOs /PGLs. Expression profilointi ja western blot-analyysi osoitti, että tiettyjä näkökohtia MAPK-signalointi ovat aktiivisia SDHB PHEOs /PGLs, mikä viittaa siihen, että esto statiinihoidon voisi olla hyödyllistä. Lisäksi pyrittiin arvioimaan, antiproliferatiivista vaikutusta lovastatiinin MPC ja MTT poikkesi kohdistama fluvastatiini, simvastatiini, atorvastatiini, pravastatiini, tai rosuvastatiinia. Simvastatiini ja fluvastatiini väheni soluproliferaation tehokkaimmin ja aggressiivisempi MTT solut näyttivät herkempiä tässä suhteessa. Esto MAPK1 ja 3 fosforylaatio hoidon jälkeen fluvastatiini, simvastatiini ja lovastatiini varmistettiin Western blot. Kohonneeseen Casp-3 ja PARP pilkkominen vahvisti apoptoosin induktioon hoidon jälkeen. Pitoisuutena riittävän alhainen vaikuttavan solujen lisääntymistä, spontaani migraatio MPC ja MTT inhiboitui merkittävästi 24 tunnin kuluessa hoidon. Lopuksi lipofiilisiä statiinit voivat aiheuttaa lupaava hoitovaihtoehto hoitoon aggressiivisen ihmisen paragangliooma indusoimalla apoptoosin ja estämällä kasvaimen leviäminen.

Citation: Fliedner SMJ, Engel T, Lendvai NK, Shankavaram U, Nolting S, Wesley R , et ai. (2014) Anti-Cancer Potential MAPK Pathway esto in paragangliooma-vaikutus eri Statiinit hiiren Feokromosytooma Cells. PLoS ONE 9 (5): e97712. doi: 10,1371 /journal.pone.0097712

Editor: Benjamin Edward Rich, Dana-Farber Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 10 tammikuu 2014; Hyväksytty: 22 huhtikuu 2014; Julkaistu: 20 toukokuu 2014

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Rahoitus: Rahoitusta tarjosi Intramural Tutkimusohjelmat ja Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development ja National Human Genome Research Institute , National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA ja ensimmäinen Sisätautien, University Medical Center Schleswig-Holstein, Lübeck, Saksa. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Viime aikoina, lovastatiini on ehdotettu lupaavia terapeuttisia mahdollisuus hoitaa RET, NF1, ja TMEM127 mutaatio johdettu katekolamiini tuottavat lisämunuaisen ja lisämunuaisen kromaffiinisolujen kasvainten (feokromosytoomien (PHEOs) ja paragangliooma (PGLs), vastaavasti ) [1]. Kuitenkin riski etäpesäkkeitä näissä kasvaimissa on suhteellisen alhainen ja kasvaimen resektion on siten lähes aina parantava. Sen sijaan riski pahanlaatuisia PHEOs /PGLs on erityisen suuri, kun kyseessä on sukkinaattidehydrogenaasi B (SDHB) geenimutaatioita [2], [3], ja uusia hoitostrategioita tarvitaan kipeästi tämän edellytyksen.

Tuore New England Journal of Medicine artiklan raportoitu laski syöpään liittyvää kuolleisuutta potilailla, joille määrättiin statiinit ennen diagnoosia [4]. Tästä samaa mieltä, lukuisia

in vitro

ja

in vivo

tutkimukset osoittivat, syöpälääkkeen vaikutuksia lovastatiinin ja muiden statiinien yksin tai osana yhdistetyn hoito-aggressiivinen kasvain (tarkistetaan [ ,,,0],5] – [7]). Suurempina pitoisuuksina kuin tarvitaan kolesterolitasojen alentamiseksi, statiinien on osoitettu estävän mevalonaatin polku vakavasti tarpeeksi estää synteesiä isoprenoidien, jotka toimivat tarpeen kalvoankkureita moitteettoman toiminnan tiettyjen proteiinien [8]. Anti-syöpä vaikutuksia statiinien on pääosin estoon liittyvän Ras-prenylaatio (ts farnesyloitumista tai geranylgeranylation), jossa muun vaikutuksia, häiritsee aktivointi loppupään toimijoiden MAPK-reitin [9], [10]. Yli-aktivointi mevalonaatin reitin, mukaan lukien MAPK-signalointi on osoitettu olevan riittävä solujen transformaatio [11]. Liiallinen MAPK signalointi tukee apoptoosin esto, proliferaation, ja muuttoliike ja on keskeinen ominaisuus monien syöpätyyppien (yhteenveto [12], [13]). Mikäli PHEOs /PGLs, kohonnut MAPK-reitin aktiivisuus on ilmeinen

H-RAS

,

K-RAS

,

TMEM127

,

RET

,

NF1

, ja mahdollisesti

MAX

mutaatio liittyviä kasvaimia [14] – [22].

Tietääksemme tällä hetkellä ole näyttöä lisääntynyt MAPK signalointia SDHB johdettuja PGLs on esitetty. Soluissa potilaista, joilla Cowden kaltainen oireyhtymä ja SDHB tai D geenivarianttien kuitenkin kohonneeseen MAPK 1 ja 3 fosforylaation on havaittu [23]. Kun läsnä on aktiivinen MAPK-reitin, statiinit voivat tarjota lupaavaa hoitoa tai co-hoitovaihtoehto hetkellä kohtalokas pahanlaatuisten PGLs.

laajuus syövän vaikutukset on osoitettu vaihdella riippuen mallista ja tyypistä statiinin käytettyjen [24] – [30]. Siten arvioimme joka seitsemästä tällä hetkellä saatavilla statiinit voivat olla tehokkain PHEO /PGL hoitoon.

Materiaalit ja menetelmät

Fluvastatiini, pravastatiini, lovastatiini ja simvastatiini olivat kaikki saatu Cayman Chemicals (Ann Arbor, MI); atorvastatiini ja rosuvastatiini saatiin Enzo Life Sciences, Inc. (Farmingdale, NY).

Soluviljely

Hiiri kasvainkudoksen johdettuja (MTT) soluja on viime aikoina kehitetty meidän lab [31 ]. Kaikki eläinkokeet välttämättömiä kehittämisen ja karakterisointi MTT solujen tehtiin periaatteiden mukaisesti ja menettelyt hahmoteltu National Institute of Health Guide for Care ja eläinten käyttöä, ja hyväksynyt

Eunice Kennedy Shriver

National Institute of Child Health and Human Development Animal Care ja Käytä komitea (Protocol numero ASP # 06-028). MTT solut ovat omaisuutta NIH. Hiiren pheochromocytoma soluja (MPC 4 /30PRR) oli antelias lahja tri Tischler, TUFTS, Boston. Soluja ylläpidettiin DMEM: ssä (Gibco, Life Technologies, Grand Island, NY), johon oli lisätty 10% lämpöinaktivoitua hevosen seerumia (Hyclone Logan, UT), 5% naudan sikiön seerumia (Gibco), HEPES (Gibco), ja penisilliiniä ( 10000 yksikköä /ml) /streptomysiiniä (100000 ug /ml) (Gibco), kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2 37 ° C: ssa. Väliaine vaihdettiin joka toinen päivä ja solut jatkettiin kun 80-90% konfluenssiin saavutettiin. Kaikki statiinien verrattiin sopivan pitoisuuden ajoneuvon (DMSO). Kun statiinien yhdistettiin arvioida mahdollisia additiivisia vaikutuksia, 25 uM 2 eri statiinien verrattiin 50 uM kunkin yksittäisen statiineja.

Proliferaatiomääritykset

Solut ympättiin kollageenilla päällystetty 96- kuoppalevyille (BD Biosciences, San Jose, CA), 10000 solua per kuoppa, ja annettiin kiinnittyä 24 tunnin ajan. Sitten elatusaine vaihdettiin pitoisuuksia 6,25, 12,5, 25, ja 50 uM eri statiinien, liuotettiin täydennettyä elatusainetta. Sen jälkeen 0, 24, 48, ja 72 h hoidon proliferaatiota arvioitiin kanssa Cell Proliferation Kit II (XTT) (Roche sovellettu tiede, Indianapolis, IN) mukaan tuote manuaalinen. Neljän tunnin inkuboinnin jälkeen levyt mitattiin 490 nm: ssä 650 nm viitaten aallonpituus mikrolevylukijalla (Victor

3 1420 -monileimalukijaa, Perkin Elmer, Waltham, MA). Kaikki kokeet suoritettiin neljänä rinnakkaisena ja toistettiin ainakin kahdesti.

Spontaanit solujen vaeltamiseen määrityksissä

Solut ympättiin 60000 solua kuoppaa kohti spontaaniin muuttoliike arviointia käytettäessä xCELLigence DP laite (Roche Diagnostics, Mannheim , Saksa), kuten aiemmin on raportoitu [32]. Spontaani muuttoliike kirjattiin 24 tuntia, kun läsnä oli 5 uM fluvastatiinin, lovastatiinin ja simvastatiinin yksin tai yhdessä 100 uM trans, farnesolin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA).

MAPK-reitin geenien rikastuminen SDHB PGLs

Expression saatu tietoja aiemmin esitettyihin microarray tietoja 45 näytettä pseudohypoxic PHEOs /PGLs, mukaan lukien 18 SDHB, 8 SDHD pään ja kaulan (HN), 6 SDHD vatsan ja rintakehän (AT), ja 13 VHL näytteitä verrattuna normaaliin lisämunuaisytimessä [33]. Kuten on raportoitu, ennustaminen analyysi microarray tunnistettiin 6937-geenien ominaista yhden eri alaryhmien pseudohypoxic PHEOs /PGLs. Nämä suhteutettu luettelo 254 MAPK-reitin geenit (Kioto Encyclopedia of Genes and Genome Pathway). Hallitseva yli-ilmentyminen SDHB näytteissä verrattuna normaaliin ydin vahvistettiin ANOVA ja välein perustuivat Studentized alue tilastotieto, Tukeyn ”Rehellinen merkittävä ero” menetelmä.

Ethics lausunto

Tissue kokoelma oli hyväksymä Institutional Review board of

Eunice Kennedy Shriver

National Institutes of Child Health and Human Development. Kirjallinen suostumus saatiin kunkin potilaan.

Human kasvainkudoksen

PHEO /PGL Kudos pakastettiin välittömästi upon resektio. Potilaan ja kasvaimen tiedot jokaisesta näytteestä on esitetty taulukossa 1. Jäädytetyt homogenisoitiin jäällä Tissue Protein Extraction Reagent (Thermo Fisher Scientific Inc., Lafayette, CO, USA) 0,1% fosfataasinestäjällä (Cell Signaling Technology Inc., Danvers , MA, USA) ja yksi proteaasinestäjä Complete Mini tabletti per 10 ml liuosta (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA). Homogenaatteja sentrifugoitiin 10000 x g: ssä 5 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Supernatantti käytettiin proteiini-uutetta.

Cell korjuun

Solut ympättiin kollageenilla päällystetyillä levyillä [34] on 600000 solua /ml, ja annettiin kiinnittyä vähintään 18 h ennen kuin materiaalin muutettiin 25 uM statiinin liuosten tai DMSO-kontrollin. Käsittelyratkaisuja uusittiin 24 tunnin kuluttua. 48 tunnin kuluttua hoidon, solut kerättiin kumikaavinta ja pestiin 3 kertaa jääkylmällä PBS: llä sentrifugoimalla 500 x g. Solut kerättiin 1500 x g, liuotetaan 0,1% cholamidopropyldimethylammoniopropanesulfate, joka sisältää yhden proteaasinestäjä Complete Mini tabletti 7 ml liuosta (Roche Applied Science) ja 0,5% fosfataasinestäjällä Cocktail 2 (Sigma-Aldrich). Näytteet sonikoitiin 2 minuuttia jään päällä ja sen jälkeen sentrifugoitiin 10000 x g 10 min, 4 ° C: ssa. Supernatantti käytettiin proteiinin otteen.

Western blot

arvioida proteiinin pitoisuuksien Quant-iT Protein Assay Kit (Invitrogen, Life Technologies Corporation) käytettiin. Equal proteiinin määrät kasvainuutteiden vuonna PAGE-geeli MAP näytepuskuria (Thermo Fisher Scientific) tai solu otteiden Lämmlin puskurissa ladattiin 4-20% Criterion TGX esivalettuja geelejä (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) tai käsin valettu 12 % geelit, jotka on erotettu natrium-dodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja siirrettiin PVDF-kalvoille (Immobilon-P, EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA). Membraanit blokattiin 5% rasvatonta kuivamaitoa fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella (pH 7,4), jossa ,01-+0,05% Tween 20 (Sigma-Aldrich Co.) 1 tunnin ajan. Vasta-aineet liuotettiin 5% naudan seerumin albumiinia ja 5% rasvatonta maitoa Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa (pH 7,6), jossa +0,01-0,05% Tween 20. Kalvoja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla yli yön 4 ° C: ssa tai 1 tunnin ajan huonelämpötila. Ensisijainen vasta-aineet olivat kanin anti-lohkaista-kaspaasi-3, kanin anti-p44 /p42 MAPK, kanin anti-fosfo-p44 /p42 MAPK, kanin anti-PARP, kanin anti-GAPDH (Cell Signaling, Technology Inc.), hiiren anti -β-aktiini (Sigma-Aldrich). Toissijaiset vasta-aineet olivat HRP-konjugoidulla aasin anti-kani (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, USA), vuohen anti-kani, ja vuohen anti-hiiri (molemmat DAKO North America, Inc., Carpinteria, CA). Kalvoja inkuboitiin Super Signal West Pico kemiluminesenssisubstraatilla (Thermo Fisher Scientific) ja altistettiin High Performance kemiluminesenssin kalvo (GE Healthcare) tai inkuboitiin Amersham ECL Prime Western blotting Detection Reagent (GE Healthcare) ja visualisoida ChemiDoc järjestelmässä (Bio-Rad Laboratories). Kalvot riisuttu kanssa palautus PLUS Western Blot kuoriminen Buffer (Thermo Fisher Scientific) ennen uudelleen esto ja inkubointi toisen sekundaarisen vasta-aineen.

Tilastollinen

kaksivaiheista lähestymistapaa käytettiin arvioimaan antiproliferatiivista teho kunkin lääkkeen pienentää solujen elinkykyä. Ensimmäisessä vaiheessa kukin 6 lääkkeiden verrattiin erikseen ajoneuvon kunkin tason hoidon kesto, annoksen, ja solutyypin. Tiedot Näissä analyyseissä käytetään olivat (ja rinnakkaiset) suhteet lääkkeen hyvin arvot jaettuna keskiarvo liittyy joukko DMSO kontrolliarvoihin. Nämä suhteet, 2.-4 itsenäisestä kokeesta, analysoitiin käyttämällä kaksisuuntainen kiinteiden vaikutusten ANOVA. Saatu p-arvot Bonferronin korjattu kertomalla ne 24, useita kokoonpanoja ajan, annos ja solutyypin tietyn lääkkeen. Seuraava, lääkkeet, jotka yleisesti merkittävästi vähentynyt proliferaatio valittiin ja tehokkain kestot ja annokset kullekin lääkkeelle kunkin solun tyyppi arvioitiin: alustavalla ANOVA, jota seurasi sijoitusta perusteella post-ANOVA tarkoittaa, jota seurasi Student-Newman- Keuls (SNK) post hoc kokeisiin mikä tarkoittaa erosivat merkittävästi. Yleinen suorituskyky 3 tehokkaimpiin lääkkeitä verrattiin käyttäen 4-tie ANOVA (tekijät: lääke, kesto, annoksen, ja solutyyppi); jälleen SNK post hoc testit tehtiin sen määrittämiseksi, mitkä lääkkeet olivat kokonaisuudessaan merkittävästi erilaisia.

vaikutus yhdistettynä statiinien verrattuna kunkin yksittäisen statiinin arvioitiin vastaavalla tavalla. Data esitetään keskiarvo ja keskivirhe (perustuu ANOVA ja delta-menetelmä) ainakin kahden itsenäisen kokeen. Tilastolliset laskelmat tehtiin Stata (Release 12, StataCorp., College Station, Texas, USA).

Tulokset

Evidence for MAPK-signalointi SDHB PHEOs /PGLs

kuten aiemmin osoitettiin, lovastatiini kohdistama voimakas antiproliferatiivinen vaikutus MPC ja MTT soluja, joka liittyy pienentynyt fosfo-MAPK 1 ja 3 (pMAPK1 /3) tasoa [1]. Sen arvioimiseksi, statiinihoidon voi olla hyötyä metastasoituneen PGLs, me arvioi pMAPK1 /3 oli läsnä aggressiivinen SDHB johdettu PGLs ja muita perinnöllisiä PHEOs /PGLs (Fig. 1A). Potilaan ja kasvaimen tiedot kunkin näytteen on esitetty taulukossa 1. Yksi ihmisen PHEOs /PGLs pMAPK1 /3-tasot olivat erittäin vaihtelevia. Vaikka keskimääräinen pMAPK1 /3 tasot olivat verrattain alhaiset SDHB kasvaimissa suhteessa muihin tutkituista näytteistä, fosforylaatio oli ilmeistä 4 kuudesta SDHB näytteitä. Mitään eroa ensisijaisen SDHB PGLs ja SDHB-etäpesäkkeitä oli ilmeinen.

. VVestern pMAPK1 /3, yhteensä MAPK1 /3, ja GAPDH ihmisen PHEOs /PGLs. Potilaan ja kasvaimen tiedot kunkin näytteen on esitetty taulukossa 1. Lyhenteet: B) SDHB, D) SDHD, N) NF1, M) normaalin lisämunuaisen ydin. B. Heatmap osoittaa ilmaus 21 MAPK-reitin geenit pseudohypoxic PHEOs /PGLs. Expression näistä 21 geeneistä oli merkittävästi koholla SDHB verrattuna normaaliin ydin (p 0,002). Kukin näyte annetaan numero. Vastaava näyte tunnisteen alkuperäisen artikkelin [33] esitetään taulukossa S1. Potilaan tiedot ja linkki talletetaan tiedot esitetään alkuperäinen artikkeli.

Lisäksi arvioimme mRNA ilmaisun profiilia MAPK-reitin geenien pseudohypoxic PHEOs /PGLs. Kartoitus 254 MAPK-reitin geenit 6937 aiemmin tunnistettu geenejä kohteisiin [33] paljasti ottelun 85 geenejä. Hierarkkinen ryhmittely näistä 85 geenien paljasti kaksi geeniklustereista, joista yksi sisälsi 21 geenejä, jotka näyttivät enemmän ilmentyy suuresti SDHB ja SDHD-AT PHEOs /PGLs verrattuna normaaliin lisämunuaisytimessä ja SDHD-HN ja VHL PHEOs /PGLs (Fig. 1B). Lähemmin nämä 21 geenit paljasti kokonaistuotanto kasvoi ilmaisun SDHB näytteissä verrattuna normaaliin lisämunuaisytimessä (p 0,002) (Kuva. 1 B) ja ANOVA yksittäisten geenien kanssa post-hoc arviointi vahvisti merkittävästi suurempi ilmaus MAPK12, CACNB3 , CACNG7, MAP4K2, MAP3K9, ja MAPK6 in SDHB PHEOs /PGLs normaalia lisämunuaisytimessä (p≤0.02). Siten tietyt näkökohdat MAPK signaloinnin näyttävät aktivoitava aggressiivisin SDHB johdettuja PHEOs /PGLs, joten kohdistaminen tämä reitti voi olla lupaava uusi hoitomuoto.

vertailu

in vitro

tehokkuudet eri statiinien

Sen tehokkuuden määrittämiseksi eri statiinien on PHEOs /PGLs käytimme kaksi hiiri mallia; MTT ja MPC solulinjoissa. Merkkejä sukkinaattidehydrogenaasi toimintahäiriön tai alayksikköä mutaatio odotetaan MPC tai MTT soluja, mutta tällä hetkellä ei ole parempi in vitro malli on olemassa tutkimaan vaikutusta uusien terapeuttisten vaihtoehtojen PHEOs /PGLs. Suhteellinen solujen elävyys, laskivat hoidon kesto ja keskittyminen eri statiinien MPC ja MTT. Kesto kolmen päivän hoidon korkein pitoisuus 50 uM oli tehokkain kaikkien statiinien (Fig. 2) ja osoittivat huomattavasti suurempi vaikutus verrattuna samaan annokseen ja statiinin toisena hoitopäivänä (SNK p≤0.029 kaikille statiinit paitsi pravastatiini, joka oli tehoton).

Prosenttia merkittäviä tuloksia kaikkien statiinien kaikille hoitoa annosten eri kohtelu kestot MPC (A) ja MTT (B). Prosenttiosuus merkittäviä tuloksia korotettiin MTT verrattuna MPC jälkeen 48 ja 72 tuntia, mikä viittaa siihen, että MTT ovat herkempiä statiinihoidon.

esiintyminen merkittävästi vähentynyt suhteessa elinkelpoisuuden verrattuna ajoneuvon lisääntyi annoksen kasvaessa ja hoidon kesto, ja nämä vaikutukset olivat selvempiä MTT kuin MPC, mikä osoittaa korkeampaa alttiutta aggressiivisempi solutyypin hoitoon statiinien (Fig. 2).

anti-proliferatiivista vaikutusta kuuden statiinien erosivat merkitsevästi (p 0,0001). Lovastatiini, simvastatiini ja fluvastatiini osoittivat korkeimmat leviämisen estäminen (Fig. 3). Suora vertailu niiden antiproliferatiivinen efficacies paljasti suurempi teho simvastatiinin ja fluvastatiinin verrattuna lovastatiinin (p = 0,033; simvastatiini vs. lovastatiini SNK p = 0,043, fluvastatiini vs. lovastatiini SNK p = 0,031).

MPC ( A-F) ja MTT (G-K) käsiteltiin ▪ 6,25 uM, ▴ 12,50 uM, ▾ 25,00 uM, ja ⧫ 50,00 uM atorvastatiini, fluvastatiini, lovastatiini, pravastatiini, rosuvastatiini, ja simvastatiinin 24, 48, ja 72 tuntia.

lisäksi toteamaan, mitä statiini on tehokkain estossa soluproliferaatiota MPC ja MTT, tutkimme, yhdistämällä kaksi erilaista statiinien saattaa lisätä hoidon tehoa. Mielenkiintoista on, että neljä tehokkain yhdistelmiä kaikki mukana simvastatiini: simvastatiini /lovastatiini, simvastatiini /fluvastatiini, simvastatiini /atorvastatiini ja simvastatiini /rosuvastatiini. Kuitenkaan mikään näistä yhdistelmistä laski suhteessa elinkelpoisuuden tehokkaammin kuin kolme tehokkain statiinit, fluvastatiini, simvastatiini ja lovastatiini yksinään (Fig. 4).

suhteellinen elinkelpoisuutta MPC (A) ja MTT (B) ilmoitettu annokset ja kesto tehokkaimpia yhdistetyt hoidot, mukaan lukien simvastatiinin suhteessa simvastatiinia yksin.

Western blot osoitti, että kolme tehokkain statiinien kaikki inhiboivat MAPK fosforylaatiota 48 h hoito 25 uM (kuvio . 5A). Lisäksi fluvastatiini, simvastatiini ja lovastatiini lisääntynyt pilkkominen tuote tasoja Casp-3 ja PARP, mikä osoittaa lisääntynyttä apoptoosia (kuvio. 5B).

. Western blot, joka osoittaa alentuneesta pMAPK1 /3 käsitellyissä vs. hoitamaton MPC ja MTT suhteessa yhteensä MAPK1 /3 ja GAPDH. B. Western blot osoittaa alentuneesta ehjä PARP (ylin nauhat) ja kohonneet pilkkoa PARP (alempi nauhat) käsitellyissä vs. hoitamaton MPC ja MTT. Mukaisesti, lohkaista Casp-3 kohosi käsitellyissä soluissa, mikä osoittaa apoptoosin. Soluja käsiteltiin 25 uM osoitettua statiinin 48 tuntia.

Leviämisen ei MPC eikä MTT vaikutti 6,25 uM tahansa testattu statiinin jälkeen 24 tai 48 tuntia. Kuitenkin spontaani solujen migraatio MPC ja MTT oli vakavasti inhiboitui käsittelemällä 5 uM fluvastatiini, simvastatiini ja lovastatiini (Fig. 6). Muuttavien kapasiteetti osittain pelastettiin lisäämällä 100 uM trans, farnesolin.

MPC (A) ja MTT (B) maljattiin ajoneuvo (Ctr), 5 uM fluvastatiini (Fluva), 5 uM simvastatiini (Simva ), 5 uM lovastatiini (Lova) kanssa tai ilman 100gM trans, farnesolin (FOH) ja spontaani muuttoliike kirjattiin 24.

keskustelu

Toistaiseksi ei parantavaa hoitoa on perustettu metastasoineeseen PHEOs /PGLs. Kuitenkin useita uusia terapeuttisia strategioita on hiljattain testattu malliorganismien [35] – [38], kuten lovastatiini [1]. Aiemmin statiinit on raportoitu laskevan lisääntymistä, eloonjääntiä, solusyklin etenemistä, ja muuttoliike muihin soluihin kuten aggressiivinen syöpä malleja, muun muassa MAPK-reitin estäminen [10], [25] – [27], [29], [30 ], [39] – [41]. Kuitenkin tällä hetkellä todisteita, että statiinia hoito on voimakas kaikkein aggressiivinen PHEOs /PGLs eli ne, joilla SDHB mutaatioita [42], puuttuu.

tulokset osoittavat, että MAPK1 /3 fosforylaatio on läsnä joissakin SDHB-PGLs, mukaan lukien etäpesäkkeet. Yhteisymmärryksessä aikaisemmassa tutkimuksessa oli kohonnut MAPK1 /3 fosforylaation kuolemattomissa lymphoblastoids sairastavien potilaiden Cowden kaltainen oireyhtymä ja ituradan SDHB tai SDHD geenivarianttien tai mutaatioita [23]. Lisäksi useat MAPK-reitin geenit näytti olevan enemmän ilmentyy suuresti SDHB-PGLs kuin normaalissa lisämunuaisen ydin. Tarkka toiminto ja mahdolliset osallistumista tunnistettujen geenien SDHB-mutaatio välittämä kasvaimen kehittymisen vielä arvioitava.

Yhteenvetona ainakin potilasalaryhmässä aggressiivisten PGLs jotka osoittavat MAPK1 /3 fosforylaation voivat hyötyä statiinihoidon. Tuloksemme osoittavat, että tälle potilasryhmälle ei voida rajoittaa klusterin 2 PGL potilasta. Määrittäminen MAPK1 /3 fosforylaatio on tapauskohtaisesti metastaattisessa PGLs voivat olla hyödyllisiä arviointiin mahdollisen hyödyn statiinihoidon.

Kun aiemmin julkaistu microarray perustuva tutkimus, jossa verrattiin PHEOs /PGLs eri geneettiset taustat, SDHx johdettu kasvainten laski, MAPK-reitin geenien ilmentymisen suhteen RET, NF1, TMEM127, ja satunnaisia ​​PHEOs /PGLs [21]. Ristiriita Tämän tuloksen ja meidän data saattaa johtua siitä, että suhteessa RET, NF1, TMEM127, ja tietyt satunnaista PHEOs /PGLs, ylös-säätely MAPK signaloinnin geenit voivat olla marginaalista SDHB PHEOs /PGLs, ja täten ei havaittavissa puuttuessa normaalin valvonnan kudosta. Meidän microarray tiedot paljastivat vastakkaisen ilmaisun malleja SDHB ja SDHD-HN PGLs suhteen MAPK signalointi geenejä; Näin ryhmittämällä nämä näytteet voivat peittää yli-ilmentyminen MAPK liittyvien geenien SDHB PHEOs /PGLs verrattuna muihin PHEOs /PGLs. Tässä esittelemme useita MAPK signalointi geenien säädelty suhteessa normaaliin lisämunuaisen ydin. Täten voimme päätellä, että statiinihoidon yksinään tai yhdessä muiden terapeuttisten hoito voi olla hyötyä tietyissä SDHB johdettuja PHEOs /PGLs.

Tällä hetkellä seitsemän eri statiinien, että markkinoilla – lisäksi niiden kolesterolia alentavat ominaisuudet – on osoitettu häiritsevän useita syövän asiaan reittejä [43], [44]. Niiden farmakologiset vaikutukset ja vaikutukset geenin ilmentymisen on osoitettu eroavan [43], [45], [46], ja näin ollen, riippuen hoidettavien solujen, tehokkain lääke on määritettävä. Tässä osoitamme, että tapauksessa MPC ja MTT, lipofiiliset statiinit fluvastatiini, simvastatiini ja lovastatiini huomattavasti pienempi soluproliferaatiota, simvastatiinin ja fluvastatiinin osoittaa hieman vahvempi vaikutuksia. Pravastatiini on osoitettu olevan tehoton useissa syövän malleissa [47], [48], mikä voi johtua sen hydrofiiliset ominaisuudet ja ei ole riittäviä kuljettajat kasvainsoluihin. Muissa tutkimuksissa verrattiin vaikutuksia useiden statiinien, simvastatiini tai fluvastatiinia esiintynyt tehokkaampaa kuin lovastatiinia [24], [30]. Lisätutkimuksia, voidaan harkita sitä, että farmakokineettisten ominaisuuksien fluvastatiinin on raportoitu olevan edullista kuin simvastatiinin ja lovastatiinin [45].

Mielenkiintoista on, että aggressiivinen MTT solut näyttivät olevan herkkä statiinihoidon, mikä osoittaa, että aggressiivinen solut voivat olla vastaanottavainen antiproliferatiivisia vaikutuksia statiinien. Ero mekanismi tekee MTT alttiimpia vielä selvittämättä.

Suurin statiini pitoisuus raportoitu ihmisen veressä oraalisen annon jälkeen (12,3 uM) [49] oli välillä meidän kolmanneksi korkein pitoisuus (12,5 uM) , joka laski merkittävästi soluproliferaatiota MPC ja MTT 48 tai 72 tuntia hoidon fluvastatiinin, lovastatiinin ja simvastatiinin. Holstein et al. raportoitu, että jopa 415 mg /m

2 suun kautta kuuden tunnin välein neljän päivän aikana olivat hyvin siedettyjä potilailla, joilla on vaikea pahanlaatuinen kasvain [49]. Kuitenkin veri statiinia tasot eivät nousseet lineaarisesti, joten suun kautta ei voi olla paras vaihtoehto saavuttaa korkea kudospitoisuudet. Optimaalinen antotekniikoita saavuttaa kohdennettuja pitoisuudet on määritettävä. Vähäisiä vaikutuksia statiinien normaaleihin soluihin verrattuna syöpäsoluihin, on raportoitu [24], [50].

ei-toksisia pitoisuuksia, voidaan saavuttaa antamalla suun kautta, statiinit on raportoitu olevan toisen syövän vastaisen vaikutuksen estyminen solumigraation ja invaasiota [9], [47], [51]. Tästä syystä testasimme seurauksena tehokas statiinien, lovastatiini, simvastatiini, ja fluvastatiinin spontaaniin soluliikkuvuus MPC ja MTT 5 uM. Meidän proliferaatiomäärityksillä osoitti ei vähentynyt leviämisen 6,5 uM 24 tunnin kuluessa hoidon. Lovastatiini, fluvastatiini, ja simvastatiini tehokkaasti esti migraation MPC ja MTT 24 tunnin kuluessa. Siirtyminen-esto näytti olevan ainakin osittain riippuvainen farnesyylitrans- ehtyminen, koska läsnäolo trans, farnesolin osittain pelastettiin vaeltavia kapasiteettia. Kuitenkin jopa suhteellisen suuri konsentraatio 100 uM trans, trans farnesolin ei täysin kääntää anti-vaeltavien vaikutus kolmen statiineja. Siten farnesyloitumista-riippumattomia vaikutuksia statiinien MPC ja MTT ei voida sulkea pois. Aikaisemmassa tutkimuksessa, geranyyligeranyylipyrofosfaatti on osoitettu olevan tehokkaampia kääntämään vaikutus statiinien kuin farnesyylipyrofosfaat- [24]. Lisäksi, ei-mevalonaatin reitti riippuu statiinin vaikutukset syöpäsoluihin, on myös kuvattu [43].

Koska suun kautta statiinien ei tuota pitoisuuksilla kuin käytetään tässä, jotta saavutettaisiin parhaat antiproliferatiivisia vaikutuksia vitro yhdessä muiden lääkeaineiden näyttää olevan lupaava strategia. Multikinaasi inhibiittorit sunitinibille ja sorafenibille vaikuttavat myös MAPK-reitin ja niiden on osoitettu olevan tehokkaita asteittain metastaattisen PGLs [52], [53]. Sunitinibihoito osoitti edullisia vaikutuksia 8 ulos 17 potilailla, joilla on etenevä metastaattinen PGLs. Mielenkiintoista, 6 reagoivien suorittaa SDHB-mutaatioita. Koska useimmat antineoplastisten lääkkeiden sivuvaikutukset multikinaasi estäjät voivat olla vakavia ja yhdeksän 17 hoidetuista potilaista sunitinibilla joutui keskeyttämään hoidon tai pienentää annosta lopulta.

Synergistinen vaikutus fluvastatiinin ja sorafenibin on esitetty melanoomasolujen in vitro [54]. Tämä pätee potentiaali pienenee multikinaasi inhibiittorikonsentraatioi-, jotka voivat lievittää vakavuutta haittavaikutuksia, kun anti-kasvain suorituskyky säilyy. Kuitenkin lisätutkimuksia pyrkii luomaan onko yhdistelmä multikinaasi estäjien statiinien voi olla lisäaineen vaikutuksia aggressiivinen PGLs. Kuten aikaisemmin ilmoitettiin, yhdistetty inhibitio PI3K /AKT ja mTORC1 /2 signalointi on ehdotettu lupaava terapeuttinen hoito tietyille PGLs [1].

Lopuksi, statiinit voi olla hyötyä yksin tai yhdistelmänä muiden terapeuttisten hoito potilailla, joilla on aggressiivinen PHEOs /PGLs jotka osoittavat MAPK-reitin aktiivisuutta.

tukeminen Information

Taulukko S1.

Näyte numerot kuviossa 1A vastaavien Chip Tunnisteet ja näyte tunnisteita Shankavaram Fliedner et ai. 2013 neoplasia 15: 435-447. Potilaan tiedot ja linkki talletetaan microarray tiedot esitetään alkuperäinen artikkeli.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0097712.s001

(XLSX) B

Kiitokset

Haluamme kiittää tohtori Tischler ja Dr. Martiniova tarjota MPC ja MTT-soluissa, vastaavasti. Olemme kiitollisia myös Dr. Perwitz, Ms Maushagen, ja Ms Resch tarjota asiantuntija-apua ja vasta-aineita. Lisäksi haluaisimme ilmaista kiitollisuutemme professori Aherrahrou ja tohtori Perwitz, joka ystävällisesti jakamaan laitteet.