Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kuvaamme käyttöä ”SuperSelective” alukkeita, jotka mahdollistavat havaitsemiseksi ja kvantitoimiseksi somaattisten mutaatioiden jonka läsnäolo liittyy syövän diagnosointiin, ennuste, ja hoito, reaaliaikaisesti PCR-määrityksissä, jotka voivat analysoida harvinaiset DNA-fragmentit läsnä verinäytteistä (neste koepaloja). Suunnittelu Näiden deoksiribonukleotidiyksikköjä alukkeiden sisältää sekä suhteellisen pitkä ”5 ’ankkuri sekvenssi”, joka hybridisoituu voimakkaasti kohdistaa DNA-fragmentteja, ja hyvin lyhyt, fyysisesti ja toiminnallisesti erillisiä, ”3” jalka sekvenssi ”, joka on täydellisesti komplementaarinen mutantti kohdesekvenssiin , mutta epäsuhta villityypin sekvenssin. Niin vähän kuin kymmenen mutantin fragmentit voidaan luotettavasti havaita läsnä 1000000 villityyppifragmenttien, jopa silloin, kun ero mutantin ja villityypin on vain yhden nukleotidin polymorfismin. Multiplex PCR-määrityksissä käyttäen joukko SuperSelective alukkeiden, ja vastaava joukko eriväristä molekyyliosoitinkoettimien koettimia, voidaan käyttää tilanteissa, joissa eri mutaatiot, vaikkakin esiintyy eri soluissa, jotka sijaitsevat samassa kodonissa. Näitä ei-symmetrinen reaaliaikainen multiplex PCR-määrityksissä olla rajoitettu pitoisuuksia kunkin SuperSelective aluketta, mikä mahdollistaa samanaikaisen määrittämisen kunkin mutaation runsaasti vertaamalla sen raja-arvon kynnysarvo on viittaus geenin läsnä näytteessä.

Citation: Vargas DY, Kramer FR, Tyagi S, Marras SAE (2016) Multiplex Real-Time PCR Analyysit että Mittaa runsaus Erittäin Harvinainen Mutaatiot liittyy syövän. PLoS ONE 11 (5): e0156546. doi: 10,1371 /journal.pone.0156546

Toimittaja: Javier S. Castresana, Navarran yliopisto, Espanja

vastaanotettu: 23 maaliskuu 2016; Hyväksytty: 16 toukokuu 2016; Julkaistu: May 31, 2016

Copyright: © 2016 Vargas et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoitus: Tämä tutkimus, avoin pääsy maksu valkoisen kirjan ilmestymisen ja palkat kaikkien laatijoiden käsikirjoituksen tuettiin laboratorion (Public Health Research Institute, Rutgers University) osuus tuloista saatujen ei-yksinomaisen lisensointi molekyylimajakoissa teknologian PHRI Properties, Inc., joka on ei-kaupallinen yhtiö omistaa kokonaan Rutgers University. Kumpikaan PHRI Properties, Inc., eikä sen noin 75 molekyylimajakat lisenssinhaltijoiden ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: FRK , ST, ja SAEM saada rojalteja ei-yksinomaisen lisensointi molekyylimajakoissa teknologian PHRI Properties, Inc. asianomaisten lisensoitu yhdysvaltalaista patenttia ovat: ”havaittavasti leimattu Dual Lihakkuus Oligonukleotidikoetinten, Analyysit ja Kits” 5925517; ja ”nukleiinihappo- detektiokoettimia ottaa Non-FRET fluoresenssisammutuksen ja sarjat sekä Analyysit mukaan lukien Probes” 6150097. Ei ole muita patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Se on ollut pitkään hakeutuvat tavoite pystyä havaitsemaan hyvin alkuvaiheessa erittäin harvinaisia ​​mutaatioita, joiden läsnäolo kliinisessä näytteessä on käyttökelpoinen syövän diagnosoimiseksi, ennusteen määrittämiseksi, ja esitetään, mitä tehokasta hoitoa [1]. Havaitseminen ja määrällinen arvio tärkeistä somaattisista mutaatioista on useita käyttötarkoituksia, mukaan lukien: (i) havaitseminen syövän hoidettavissa vaiheessa potilailla, jotka perivät geenejä, jotka tekevät syöpä todennäköisempää; (Ii) mutaatiot hyvänlaatuisen syöpäsolut, jotka osoittavat, että ne voivat nyt etäispesäkkeitä; (Iii) mittaus runsaasti syöpäsolujen hoidon aikana; ja (iv) päätetään siitä lääkeresistenttiä syöpäsoluja on ilmennyt hoidon aikana, jotta hoito voidaan säätää. Lisäksi tavoitteena on kehittää menetelmiä, jotka mahdollistavat multiplex määritykset, jotka voivat samanaikaisesti mitata runsaus eri harvinaisia ​​mutaatioita. Jos tällaisia ​​määrityksiä oli tullut saataville, syöpä voitaisiin mahdollisesti muunnettu usein kuolemaan johtava tauti on krooninen sairaus, joka voidaan hoitaa usein testaus yhdistettynä yksilöllisiä terapeuttisia säätöjä.

vauhdittaa näitä ponnisteluja on oivallus, että syöpäsolut, missä kehon ne sijaitsevat, jakaa usein, apoptoosiin ja nekroosia, ja sen seurauksena, genomisen DNA: n fragmentteja, jotka syöpäsolut ovat läsnä kunkin potilaan veriplasmassa [2]. Tämän ymmärtäminen on avannut mahdollisuuden, että läsnäolo harvinainen mutaatiot, jotka viittaavat syövän diagnoosi, ennuste, ja hoito voidaan havaita ja kvantitoida hyvin varhaisessa vaiheessa, suorittamalla ”nestemäinen koepaloja”, käyttäen DNA eristettiin plasmasta [3-5] . Haasteena määritys suunnittelijoiden on löytää keino selektiivisesti havaita ja kvantitoimalla näitä harvinaisia ​​mutantti sekvenssifragmentista plasman DNA, läsnäolosta huolimatta runsas villityypin sekvenssifragmentista peräisin normaaleista soluista koko kehon, ja huolimatta siitä, että eri asiaa mutaatiot kuitenkin peräisin eri soluissa, esiintyy usein samalla tai vierekkäisillä kodoneja. Menestys ”seuraavan sukupolven” sekvensointi havaitsemiseen harvinainen mutantin sekvenssin fragmentteja plasman DNA [6-8], vaikka monimutkainen ja kallis, on havainnollistettu arvo tämän lähestymistavan.

Molecular diagnostisia määrityksiä perustuvat eksponentiaalinen amplifikaatio nukleiinihapon kohdesekvenssien, kuten polymeraasiketjureaktioissa, ovat edullisia ja riittävän herkkiä tuottaa signaaleja niin vähän kuin yhden templaattimolekyyliin. Haasteena on suunnitella näistä määrityksistä on erittäin selektiivinen, niin että ne mahdollistavat eksponentiaalisen monistamisen mutantti-DNA-fragmentteja, ja samalla vaimentaa sukupolven amplikonien kaukaa runsaammin villityypin DNA-fragmentit, vaikka ainoa ero mutanttisekvenssi ja villityypin sekvenssi on yhden nukleotidin polymorfismi.

Lupaava lähestymistapoja käyttää monistuksen alukkeita, jotka on suunniteltu erittäin selektiivinen. Esimerkiksi nukleotidisekvenssit monistuksen tulenkestävän mutaation järjestelmän (ARMS) alukkeet [9] ovat täysin komplementaarisia Mutanttikohdesekvenssit, mutta niissä on ”kyselevän nukleotidi” niiden 3′-päässä, joka ei ole komplementaarinen vastaavaan nukleotidin villityypin kohdesekvenssejä. Saatu ristiriitaiset villityypin hybridit ovat paljon vähemmän todennäköisesti mahdollistaa synteesin amplikonien, koska DNA-polymeraaseja vaativat 3′-terminaalisen emäsparin aloittaa synteesin. Tässä selektiivinen mekanismi on entsymaattinen. Toisaalta, dual pohjustus oligonukleotidi (DPO) alukkeet [10], MYT alukkeita [11], hiusneula alukkeita [12, 13], ja PASS alukkeita [14], käyttää eri mekanismilla. Ne myös hallussaan esikäsittely-sekvenssi, joka on täysin komplementaarinen mutantin kohde, mutta niissä on sisäinen Kyselevät nukleotidin, joka ei täsmää vastaavan villityypin sekvenssin. Pituus niiden pohjustus sekvenssi on valittu niin, että alla hehkutus olosuhteissa täydellisesti täydentävä mutantti hybridit todennäköisesti muodostuu, ja ovat siten todennäköisesti johtaa sukupolven amplikonien, kun taas ristiriitaiset villityypin hybridit ovat paljon vähemmän todennäköisesti muodostuu, ja ovat siis paljon vähemmän todennäköisesti johtaa sukupolven amplikonien. Vaihtoehtoisia lähestymistapoja, joissa PCR-kiristys [15], tai käyttämällä hiusneula oligonukleotidin salpaajien [16], käyttää seosta, joka sisältää sekä tavanomaista DNA-alukkeita, jotka sitoutuvat mutanttisekvensseistä, ja ”anti-alukkeita”, jotka on suunniteltu sitoutumaan valikoivasti villi tyyppinen sekvenssit, estäen aloittamisesta villityypin amplikoni synteesi. Kuitenkin kaikki nämä lähestymistavat, vaikka yleensä sovellettavissa havaitsemiseksi mutanttisekvensseistä, joko ole riittävän herkkä havaitsemaan äärimmäisen harvinaisia ​​mutantteja [12-15], joka ei ole yhteensopiva reaaliaikaisia ​​PCR läsnäolon takia luonnotonta nukleotidien niiden järjestyksessä [10], tai ei ole osoitettu, jotta määrällisiä määrityksiä multiplex reaaliajassa PCR-määrityksissä, kun eri kohde mutaatioita esiintyy samassa kodonissa [9, 11, 16].

Tässä raportissa kuvataan kokeita, jotka tutkia suunnittelu ja toiminta ”SuperSelective” PCR-alukkeita, jotka mahdollistavat kvantitoimiseksi harvinaisten mutantti tavoitteita. Merkittävää on, kun nämä alukkeet aloittavat synteesin mutanttien DNA-fragmentit, tuloksena amplikonista eksponentiaalisesti monistetaan korkea hyötysuhde myöhemmissä lämpökäsittelyä, ja reaaliaikaista tietoa on tavanomainen keino arvioida runsaudesta mutantti malleja alkuperäisessä näytteessä. Lisäksi tämä raportti kuvaa erityisesti malleja varten SuperSelective alukkeiden, ja muutoksia PCR-muodossa, jotka mahdollistavat multiplex reaaliaikaisen PCR-määrityksissä voidaan suorittaa mittaavissa runsaasti eri Mutanttikohdesekvenssit suhteessa runsaasti viittaus villin tyyppi järjestyksessä kunkin näytteen.

Materiaalit ja menetelmät

pohja- ja molekyylimajakoissa

SuperSelective alukesekvensseissä tutkittiin tuella Mfold web-palvelimen [17] ja OligoAnalyzer tietokoneohjelma (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA) varmistaa, että määritysolosuhteissa ne tuskin muodostaa sisäisiä hiusneularakenteiden, ja tuskin muodostuu itsestään dimeerejä tai heterodimeerejä tavanomaisen alukkeilla taaksepäin. Alukkeet hankittiin Integrated DNA Technologies; ja eri värisiä molekyylimajakka- koettimia havaitsemiseksi amplikonien hankittiin Biosearch Technologies (Petaluma, CA).

DNA-templaattien

Plasmidit, jotka sisältävät

EGFR

sekvenssejä (joko L858 mutanttisekvenssi tai villityypin sekvenssi) valmistettiin lisäämällä 115 emäsparin geenin fragmentti pGEM

®-11Zf (+) -vektoriin (Promega, Madison, WI). Sekvenssit Näiden plasmidien varmistettiin sekvenssianalyysillä. Ihmisen genomista DNA koodaava

EGFR

L858R-mutaation eristettiin solulinjasta H1975 (CRL-5908, American Type Culture Collection, Manassas, VA) ja ihmisen genomisen DNA: n, joka sisältää vastaavan villityypin sekvenssi hankittiin Coriell Cell arkistot (Camden, NJ). Mutantti ja villityypin

EGFR

plasmidit, ja ihmisen genomisen DNA: t, pilkottiin inkuboimalla restriktioendonukleaasilla MseI (New England Biolabs, Ipswich, MA). 20-ul hajotusseokset sisälsi 4 ug DNA: ta, 10 yksikköä MseI, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl

2, 100 ug /ml naudan seerumin albumiinia, ja 10 mM Tris-HCl (pH 7,9). Nämä reaktiot inkuboitiin 120 min ajan 37 ° C: ssa, minkä jälkeen inkuboitiin 20 min 65 ° C: ssa inaktivoimiseksi endonukleaasi.

Plasmidit, jotka sisältävät

BRAF

sekvenssejä (joko V600E mutantin sekvenssin, V600R mutanttisekvenssi tai villityypin sekvenssi) hankittiin Integrated DNA Technologies, ja valmistettiin lisäämällä 200 emäsparin geenin fragmentti pIDTSmart Amp vektoreihin.

BRAF

plasmidit digestoitiin inkuboimalla restriktioendonukleaasilla Sca I (New England Biolabs). 20-ul hajotusseokset sisälsi 4 ug DNA: ta, 10 yksikköä Sca I, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl

2, 1 mM ditiotreitolia, ja 50 mM Tris-HCl (pH 7,9). Nämä reaktiot inkuboitiin 120 min ajan 37 ° C: ssa, minkä jälkeen inkuboitiin 20 min 80 ° C: inaktivoimiseksi endonukleaasi.

PCR-määrityksissä

Monoplex reaaliaikaisen polymeraasiketjureaktion suoritettiin 30-mikrolitratilavuuksia, joka sisälsi 50 mM KCI, 3 mM MgCI

2, 10 mM Tris-HCI (pH 8,0), 250 uM dATP: tä, 250 uM dCTP, 250 uM dGTP, 250 uM dTTP, 1,5 yksikköä AmpliTaq-Gold DNA: -polymeraasia (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA), 120 nM kutakin aluketta, ja 1x SYBR

® Green (ThermoFisher Scientific) seuranta-amplikonin runsaasti aikana ketjun pidentymisen vaiheessa kunkin lämpökäsittelyn.

Duplex real -aika polymeraasiketjureaktio reaktiot suoritettiin 30 ul: n tilavuudella, joka sisältää 50 mM KCI, 2,5 mM MgCl

2, 10 mM Tris-HCI (pH 8,0), 250 uM dATP: tä, 250 uM dCTP, 250 uM dGTP, 250 uM dTTP , 1,5 yksikköä Platinum Taq DNA-polymeraasia (ThermoFisher Scientific), joko 500 nM (symmetrinen PCR) tai 60 nM (ei-symmetrinen PCR) kunkin

BRAF

SuperSelective pohjamaali, 1000 nM perinteisen

BRAF

yhteinen reverse-aluke, ja 300 nM kutakin molekyylimajakan seurantaan runsaasti kunkin amplikonin aikana hehkutus vaiheessa kunkin lämpökäsittelyn.

Triplex reaaliaikaisen polymeraasiketjureaktion sisälsi samat reagenssit kuin duplex reaktiot, paitsi että ne sisälsivät 60 nM kutakin

BRAF

SuperSelective pohjamaali, 60 nM

EGFR

SuperSelective pohjamaali, 1000 nM perinteisen

BRAF

yhteistä kääntöpuolta pohjamaali, ja 500 nM tavanomaisen

EGFR

käänteisaluke-. Hyödynsimme

EGFR

villityypin plasmidit ohjearvon geenikohteen näissä mallissa triplex määrityksissä, koska ne olivat saatavilla laboratoriossamme.

Kaikki monistukset suoritettiin 200 ul valkoinen polypropeeni PCR putket (USA Scientific, Ocala, FL) käytettäessä IQ5 spectrofluorometric -lämpösyklilaitteella (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Reaktio seoksia inkuboitiin 10 minuutin ajan 95 ° C: ssa aktivoida AmpliTaq Gold DNA-polymeraasia (monoplex reaktiot) tai inkuboitiin 2 minuutin ajan 95 ° C: ssa aktivoida Platinum Taq DNA-polymeraasia (multiplex reaktioita), jota seurasi 55 tai 60 sykliä 95 ° C: denaturaatio 20 s, 60 ° C annealing 20 s, ja 72 ° C: ssa ketjun pidentymistä 20 s.

tulokset

SuperSelective alukkeet ovat oligodeoksiribonukleotidit, jonka tehtävänä on PCR-määritys on jaettu kahteen osaan [10, 14, 18]. Toiminnon tehokkaasti sitoutumaan geeni on valittu suhteellisen pitkä 5′-sekvenssi-segmentti (jota kutsumme ”ankkuri”), ja toiminta selektiivisesti sitoutumaan lähellä alasekvenssi kyseisen geenin, joka sisältää mutaation kiinnostuksen ja sitten aloittamalla synteesi amplikoni, joka annetaan erillinen, lyhyt 3 ’sekvenssin segmentti (jota kutsumme ”jalka”). Kun jalka sisältää ”kyselevän nukleotidi”, joka on komplementaarinen vastaava nukleotidi mutantti kohdesekvenssin, mutta epäsuhta vastaava nukleotidi villityypin kohdesekvenssiin. Vuonna SuperSelective alukkeet, ankkuri erotetaan jalka ylimääräisellä, suhteellisen pitkä, deoksiribonukleotidi sekvenssin segmentti (jota kutsumme ”silta”). Silta on valittu siten, että sen varmistamiseksi, että se ei muodosta sekundaarirakenteita ja ei ole komplementaarinen ”välissä sekvenssi” malliin molekyyli, joka yhdistää ankkurin kohdesekvenssin että jalka kohdesekvenssiin. Näin ollen, kun aluke hybridisoidaan templaattimolekyyliin, silta sekvenssin aluketta ja välissä sekvenssin mallin muodostavat yksijuosteinen ”kupla”, joka toiminnallisesti erottaa tehokkaasti muodostumista ankkurin hybridi muodostumista jalka hybridi . Saatu alukkeet ovat bifunktionaalisia: alle hehkutus olosuhteissa pitkän 5 ”ankkuri-sekvenssin, mahdollistaa alukkeen sitoa tehokkaasti ja selektiivisesti genomisen alueen kiinnostavia esillä olevan kohde-DNA-fragmentit, kun taas lyhyt 3 ’jalka-sekvenssin (jolla kyselevän nukleotidin ), koska se on kytkettynä ankkuriin sekvenssin silta sekvenssin, kykenee muodostamaan heikko (täysin komplementaarinen) hybridi mutantti kohdesekvenssin; mutta koska sen lyhyt pituus, että jalka ei todennäköisesti muodostaa huomattavasti heikompi (paritonta) hybridi vastaavan villityypin sekvenssin.

Kuvio 1A esittää esimerkkiä SuperSelective aluketta sitoutuneena mutantin kohdesekvenssiin. Tämä erityisesti aluke suunniteltiin valikoivasti DNA-fragmenttien monistamiseksi, jotka sisältävät

BRAF

V600E yhden nukleotidin polymorfismi, joiden läsnäolo soluissa altistaa potilaita perinnöllinen polypoottinen peräsuolen syöpä [19, 20]. Kutsumme tätä aluketta ”

BRAF

V600E 24-14 /14-5: 1: 1″, joka osoittaa, että ankkuri-sekvenssi on 24 nukleotidia pitkä, silta sekvenssi on 14 nukleotidin pituinen (koko peräisin välissä sekvenssin malli, joka on myös 14 nukleotidiä pitkä), ja jalka-sekvenssi on 7 nukleotidin pituinen, ja kyselevän nukleotidin sijaitsee toiseksi viimeisessä asemassa alukkeen 3′-päähän.

(A) SuperSelective aluke

BRAF

V600E 24-14 /14-5: 1: 1 sisältää pitkän 5′-ankkuri-sekvenssi, joka sitoutuu voimakkaasti templaattijuosteet, lyhyen 3′-jalka-sekvenssi, joka sisältää kyselevän nukleotidisekvenssin, joka on täysin komplementaarinen vastaava nukleotidi on mutantti templaatti (mutta ei täsmää vastaavan nukleotidin villityypin templaatti), ja silta-sekvenssi, joka yhdistää ankkurin sekvenssin jalka-sekvenssin, ja että valitaan ei ole komplementaarisia vastaavalle välissä sekvenssin templaattijuostetta, jolloin muodostuu yksijuosteisen kupla, joka erottaa toiminta ankkuri funktio jalka. (B) Reaaliaikainen PCR Testeissä, joissa käytetään SuperSelective pohjamaali

BRAF

V600E 24-14 /14-5: 1: 1. Kuusi reaktiot aloitettiin 10

6

BRAF

villityypin malleja plus eri määriä mutantti malleja (10

1, 10

2, 10

3, 10

4 10

5, ja 10

6) esitetään sinisellä; reaktio aloitetaan vain 10

6 villityypin malleja on piirretty katko- oranssi linja; ja kontrollina reaktiota, joka ei sisällä templaatti-DNA on piirretty punaisella. (C) Kynnyssykli mitattava kunkin reaktiossa, joka sisälsi mutantti-malleja on funktiona logaritmin määrä mutantti-malleja alunperin läsnä kussakin reaktiossa. Katkoviivoja oranssi viiva osoittaa kynnyssykli reaktion, joka sisältää ainoastaan ​​villityypin malleja.

Reaaliaikainen PCR-määrityksissä, jotka sisältävät SuperSelective alukkeita

Reaaliaikainen PCR määritykset tehtiin, joiden ainoa ero tavanomaisesta reaaliaikainen PCR-määritys oli korvaaminen tavanomainen eteenpäin-alukkeen kanssa

BRAF

V600E SuperSelective alukkeesta on esitetty kuviossa 1A. Nämä monoplex määrityksissä sisälsi tavanomaisen reverse-aluke, joka oli läsnä samassa pitoisuudessa kuin SuperSelective alukkeena. Kahdeksan 30-ul PCR-määrityksissä valmistettiin. Seitsemän reaktiot sisälsivät DNA-osia 10

6 plasmideja, joilla on

BRAF

villityyppisen sekvenssin ja DNA-osia joko 10

6, 10

5, 10

4, 10

3, 10

2, 10

1 tai 0 plasmidit, jolla on yhden emäksen monimuotoisuus

BRAF

V600E mutanttisekvenssi. Kahdeksannen reaktio, joka ei sisältänyt DNA-fragmentteja, toimi kontrollina. Kaikki reaktiot sisälsivät interkalatoivista DNA väriaine, SYBR

® Green, jonka fluoresenssin intensiteetti aikana ketjun pidentymisen vaiheen kunkin termisen syklin kuvaa niiden amplikonien syntetisoitiin.

Kuvio 1B esittää tämän kokeen tulokset . Kontrollireaktio, jotka eivät sisältäneet templaatti-DNA ei tuota mitään vääriä amplikoneja, kuten aluke-dimeerit, vaikka pidempi pituus SuperSelective alukkeita. Reaktio sisältävä 1,000,000 villityypin malleja eikä mutantti malleja tukahdutettiin siinä määrin, että se ei tuottanut huomattavan määrän amplikonien kunnes noin 50 monistamiskierroksen oli suoritettu. Vielä kuusi reaktiot aloitettiin 1000000 villityypin malleja ja eri määriä mutantti-malleja kesti merkittävästi vähemmän monistus- sykliä tuottaa huomattavan määrän amplikonien. Kun kynnys (Ct) ja kukin näistä kuudesta reaktioiden logaritmisesti määrän mutantti malleja kussakin reaktiossa, tulos oli suora viiva (kuvio 1C). Tämä käänteinen lineaarinen suhde logaritmi määrä mutantti tavoitteita alun perin läsnä näytteessä, ja Ct-arvon havaittiin, että näyte on tunnusomaista kvantitatiivisia eksponentiaalinen amplifiointimäärityksissä [21, 22]. Merkittävää on, että Ct arvon sisältävän näytteen 10 mutantti malleja läsnä 1.000.000 villityypin malleja oli helposti erotettavissa Ct arvosta tuottama näyte, joka sisältää vain 1.000.000 villityypin malleja (kuvassa kuin pisteviiva oranssi viiva) .

näissä määrityksissä, valikoiva vaihe tapahtuu, kun SuperSelective aluke sitoutuu DNA (-) juosteen malli, joka on läsnä alkuperäisessä näytteessä analysoidaan. Kun jalka sekvenssin SuperSelective aluketta käynnistää synteesin amplikonin koko sekvenssi SuperSelective aluketta (mukaan lukien ”keinotekoinen” silta-sekvenssi) on sisällytetty, että (+) amplikonin. Myöhempien lämpökäsittelyjen, tuloksena amplikonit monistetaan tehokkaasti normaalilla tavalla, jossa koko SuperSelective alukkeen sekvenssi, joka toimii pitkän tavanomaisia ​​alukkeen, joka on komplementaarinen (-) amplikoneja, jotka sisältävät komplementin alukkeen silta sekvenssin paikassa n välissä sekvenssi, joka oli läsnä alkuperäisessä mallin (kuvio 2).

valikoiva vaihe tapahtuu vain, kun SuperSelective pohjamaali hybridisoituu DNA (-) template fragmentti näytteessä läsnä. Johtuen pienestä koosta jalka sekvenssin, todennäköisyys aloittamisesta (+) amplikoni on huomattavasti suurempi, jos kohdesekvenssi on jalka on (-) malli fragmentti on täysin komplementaarinen mutantin sekvenssin, kuin jos kohdesekvenssin jalka on (-) template fragmentti on ristiriitaiset villityypin sekvenssin. Jos (+) amplikonin synteesin tapahtuu, sitten syntynyt (+) amplikonin toimii templaattina tavanomaisen reverse-aluke, ja tehokkaasti kopioidaan seuraavalla lämpökäsittelyn, tuottaa (-) amplikonin, jossa komplementti ainutlaatuinen silta sekvenssi, joka oli läsnä SuperSelective aluke on korvattu välissä sekvenssi, joka oli läsnä alkuperäisessä (-) malli fragmentti. Tämän seurauksena myöhemmissä lämpökäsittelyä, koko SuperSelective Alukesekvenssi on komplementaarinen (-) amplikonin säikeet, ja eksponentiaalinen monistaminen tapahtuu tehokkaasti, ja sitä voi seurata reaaliaikaisesti.

Optimointi suunnittelu SuperSelective alukkeiden

kolme osaa SuperSelective pohjamaali niillä on erilaiset tehtävät. 5 ”ankkuri-sekvenssi on suunniteltu siten, että se on riittävän pitkä ja riittävän vahvoja niin, että hehkutus lämpötila PCR-määritys se sitoutuu kohdesekvenssiin, riippumatta siitä, onko vai ei kohdesekvenssin on mutantin tai villin tyypin. Lyhyen 3 ’jalka-sekvenssi, toisaalta, on suunniteltu pystyä sitoutumaan täysin komplementaarinen mutantti- kohdesekvenssin hehkutus lämpötila PCR-määritys, mutta ei sitoudu paritonta villityypin sekvenssin samoissa olosuhteissa . Rooli kupla, joka muodostuu sillan sekvenssin aluketta ja välissä sekvenssi mallin, on kaksitahoinen: (i) erottamalla ankkuri sekvenssi jalka sekvenssin läsnäolo yksijuosteisen kupla aiheuttaa muodostuminen heikosta jalka hybridi tapahtuu riippumatta muodostumista vahva ankkuri hybridi; ja (ii) kytkettynä että jalka sekvenssin alukkeen mahdollisten kohdesekvenssiin malliin, todennäköisyys, että lyhyt jalka-sekvenssin (6, 7, tai 8 nukleotidiä) todella muodostuu hybridi on merkittävästi lisääntynyt. Vapaasti kelluva sekvenssin koko jalka ei juuri koskaan muodostaa hybridi kanssa kohdesekvenssiin PCR hehkutus olosuhteissa. Jotta voidaan paremmin ymmärtää roolin eri järjestyksessä segmenttejä SuperSelective alukkeiden, ja jotta ymmärtää, miten parhaiten suunnitella näitä alukkeita siten, että ne ovat hyvin selektiivinen tahansa kohdesekvenssiin suoritimme joukon mallin määrityksiä että tutkittava optimaalinen suunnittelu jalka järjestyksessä, ja optimaalinen suunnittelu kupla.

villityypin sekvenssin, jossa

BRAF

V600E mutaatio tapahtuu AT rikas (3′-TAAAGTG-5 ’), millä varmistetaan, että heikko paritonta hybridi, että se muodostaa kanssa jalka on

BRAF

V600E 24-14 /14-5: 1: 1 SuperSelective pohjamaali on hyvin epätodennäköistä muodostaa alle hehkutus ehtojen PCR-määritys [23], joka johtaa merkittävän suppression villityypin amplikoni synteesiä (kuvio 1). Kun kuitenkin suorittaa samanlaisia ​​määrityksiä, joiden SuperSelective pohjamaali suunniteltu havaitsemaan yhden emäksen monimuotoisuus

EGFR

L858R mutanttisekvenssi, jonka läsnäolo ei-pienisoluinen keuhkosyöpä ennustaa vastustuskykyä tyrosiinikinaasiestäjiksi [ ,,,0],24, 25], huomasimme, että sen läsnäolo GC rikas villityypin sekvenssi (3′-ACCCGAC-5 ’) aiheutti vähemmän tukahduttaminen villityypin amplikoni synteesi. Siksi suoritettiin sarja kokeilee erilaisia ​​

EGFR

L858R SuperSelective pohjamaali mallit (kuvio 3) optimoida syrjintään mutantin sekvenssin ja sen lähes identtinen villityypin sekvenssin.

Silta sekvenssi kussakin SuperSelective aluketta näkyy sinisenä, ja kyselevän nukleotidin kussakin jalka järjestyksessä näkyy punaisena.

EGFR

L858R alukkeiden järjestetään ryhmiin, jotka heijastavat niiden käyttöä vertailukokeita.

BRAF

V600E kohdesekvenssi on 69 emäsparia pitkä;

EGFR

L858R kohdesekvenssejä on välillä 79 ja 87 emäsparia pitkiä, riippuen SuperSelective aluke, jota käytetään; ja

EGFR

T790M kohdesekvenssi on 68 emäsparia pitkä.

vaikutus vaihtelee pituuden jalka sekvenssin

tutkitaan vaikutus lyhentämisessä että SuperSelective pohja- jalka järjestyksessä voittaa suurempi todennäköisyys, että jalka muodostaa hybridi GC rikas sekvenssi läsnä

EGFR

villityypin tavoite. Suoritimme kolme sarjaa määrityksiä, jokainen hyödyntäen SuperSelective pohjamaali, jonka jalka sekvenssi oli 6, 7 tai 8 nukleotidia. Kaikissa muissa suhteissa, suunnittelu alukkeet oli sama: (i) kyselevän nukleotidi sijaitsee toiseksi viimeisessä asennossa 3 ’jokaisen jalka; (Ii) ankkuri sekvenssi oli 24 nukleotidin pituinen; ja (iii) silta sekvenssin ja välissä sekvenssi olivat kukin 14 nukleotidin pituisia. Sekvenssit näiden kolmen alukkeita (

EGFR

L858R 24-14 /14-6: 1: 1;

EGFR

L858R 24-14 /14-5: 1: 1, ja

EGFR

L858R 24-14 /14-4: 1: 1) on esitetty kuviossa 3. Kukin PCR-määritykset aloitettiin eri määriä mutantti mallin (10

6, 10

5, 10

4, 10

3, 10

2, ja 10

1: sta), kun läsnä on 10

6 kopiota villityypin mallia. Saatu raja-arvot funktiona logaritmin määrä mutantti-malleja alunperin läsnä (kuvio 4A).

lineaarisuus suhde kynnyksen aikana ja logaritmin alkuperäinen määrä mutantti-malleja läsnä jotka sisälsivät 10

6 villityypin malleja ja eri määriä mutantti mallin määritettiin PCR-määrityksissä aloitetaan eri SuperSelective pohjamaalilla malleja. (A) PCR-reaktiot aloitettiin

EGFR

L858R SuperSelective alukkeita jolla jalka sekvenssit eripituisia. (B) PCR-reaktiot aloitettiin

EGFR

L858R SuperSelective alukkeita, jotka muodostavat symmetrisen kuplia eri ympärysmitta.

Ct-arvot saatiin alukkeen, jolla on lyhin jalka pituus (kuusi nukleotidia, 4: 1: 1) kaikki kuuluvat suoralla, joka osoittaa, että vaikka

EGFR

kohdesekvenssi on GC rikas, niin vähän kuin 10 mutantti malleja voitaisiin kvantitoida puuttumatta 1000000 villityypin malleja, jotka olivat läsnä. Primers jolla pidempi jalka pituudet (seitsemän nukleotidin 5: 1: 1, tai kahdeksan nukleotidin, 6: 1: 1), mutta johti poikkeama lineaarisuudesta kun mutantti tavoitteet ovat harvinainen, puutteellisten tukahduttaminen amplikonin synteesin runsas villityypin malleja. Nämä tulokset osoittavat, että lyhyempi jalka pituudet, vaikka alentamalla tasapaino runsaasti jalka hybridien, jolloin enää viiveitä kynnyssykli saavutetaan, johtavat parannettu selektiivisyys. Vuodesta termodynaaminen näkökulmasta, parannettu selektiivisyys lyhyempi jalka pituudet johtuu suurempi suhde tasapainon runsaasti täydellisesti komplementaarinen mutantin jalka hybridit verrattuna tasapainon runsaasti sopimattomasta villityypin jalka hybridit.

vaikutus vaihtelevien sijainti kyselevän nukleotidin

Tutkimme myös vaihtelun vaikutusta sijainti kyselevän nukleotidi jalka sekvenssin alukkeen mahdollisuutta erottamaan mutantti malleja villityypin malleja. Suoritimme sarjan PCR-määrityksissä jossa kuusi eri SuperSelective alukkeita käytettiin, kukin jolla kyselevän nukleotidin eri asema 7 nukleotidin mittainen jalka järjestyksessä. Pituudet ankkurin sekvenssin, silta-sekvenssi, ja välissä sekvenssi pidettiin 24, 14, ja 14 nukleotidia, vastaavasti. Sekvenssit näistä kuudesta

EGFR

L858R alukkeet on esitetty kuviossa 3. Kaksi reaktiot suoritettiin kutakin aluketta, yksi aloitettiin 1.000.000 kopiota mutantin templaatin, ja yksi aloitettiin 1.000.000 kopiota villityypin templaatti. Kynnys sykliä, jotka havaittiin on lueteltu taulukossa 1. Tulokset osoittavat, että ikkuna syrjintää (ACt) välinen raja sykli mutantti ja kynnys sykli villityypin on suurin silloin, kun sijainti kyselevän nukleotidi on lähimpänä 3′-pään alukkeen. Koska on olemassa vain pieni ero ACt alukkeen, jonka kyselevä nukleotidi sijaitsee 3 ’päähän jalka (ACt = 18,8), ja aluketta, jonka kyselevä nukleotidi sijaitsee toiseksi viimeisessä asemassa 3’ päähän jalka (ACt = 18,2), voimme päätellä, että sijoittaminen kyselevän nukleotidin joko asennossa toimii hyvin. Koska kysely-nukleotidin toiseksi viimeisessä asemassa 3 ’päähän jalka ei muodosta emäsparin vastaavan nukleotidi villityypin sekvenssin, mukaisesti PCR-hehkutus olosuhteissa, 3’-terminaalinen nukleotidi jalka on hyvin epätodennäköistä muodostaa emäsparin sitä vastaavan komplementaarisen nukleotidin villityypin sekvenssin.

vaikutus vaihtelee kehän kupla

Tutkimme myös vaihtelun vaikutusta kehän yksijuosteinen kupla, joka toiminnallisesti erottaa ankkuri hybridi päässä jalka hybridi (katso kuva 1).