Krooninen sairaus

tiivistelmä

musiinin MUC4 ja sen kalvo kumppani ErbB2 onkogeeninen reseptorin mahdollisia vuorovaikutuksessa olevaa kumppaneita ihmisen haiman kasvainten kehittymiseen. Kuitenkin miten ne toimivat on edelleen suurelta osin tuntemattomia. Tässä työssä, pyrimme tunnistamaan solun mekanismeja ja solunsisäiset signaalireitit valvonnassa sekä ErbB2 ja MUC4 ihmisen haiman adenocarcinomatous solulinjassa. Käyttämällä samanaikainen immunosaostus ja GST pull-down, osoitamme, että MUC4 ja ErbB2 vuorovaikutuksessa ihmisen haiman adenocarcinomatous solulinja CAPAN-2

kautta

EGF domeenien MUC4. Vakaa solun klooneja, joissa joko MUC4 tai ErbB2 tippuu alas (KD), jonka shRNA lähestymistapaa. Biologiset ominaisuudet nämä solut tutkittiin

in vitro

ja

in vivo

. Tuloksemme osoittavat, että ErbB2-KD solut ovat enemmän apoptoottisia ja vähemmän proliferatiivinen (vähentynyt sykliini D1 ja lisääntynyt p27kip1 ilmaus) samalla muuttoliikkeen ja invasiivisia ominaisuuksia ei ole muutettu. MUC4-KD kloonit olivat vähemmän proliferatiivinen alentuneeseen sykliini D1 ilmentyminen, G1 solusyklin pysähtymiseen ja muuttunut ErbB2 /ErbB3 ilme. Muuton ominaisuudet vähenivät taas invasiivisia ominaisuuksia lisättiin. Tärkeää on, että esto ErbB2 ja MUC4 ilmaisua ei heikennä sama signalointireiteissä (inhibitio MUC4 ilmentymisen vaikuttaa JNK-reitin kun taas ErbB2 muuttaneet MAPK-reitti). Lopuksi ErbB2-KD ja MUC4-KD solut osoittivat heikentynyttä kasvaimen kasvua

in vivo

. Tuloksemme osoittavat, että ErbB2 ja MUC4, jotka vuorovaikuttavat fyysisesti, aktivoida erilaisia ​​solunsisäisiä signalointireitteihin säännellä biologisia ominaisuuksia CAPAN-2 haiman syöpäsoluja.

Citation: Jonckheere N, Skrypek N, Merlin J, Dessein AF, Dumont P, Leteurtre E, et ai. (2012) limakalvon MUC4 ja sen kalvo Partner ErbB2 Regulate biologiset ominaisuudet Ihmisen CAPAN-2 haimasyöpäsoluissa

kautta

Eri Signalling Pathways. PLoS ONE 7 (2): e32232. doi: 10,1371 /journal.pone.0032232

Editor: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, Kiina

vastaanotettu: 12 elokuu 2011; Hyväksytty: 24 tammikuu 2012; Julkaistu: 29 helmikuu 2012

Copyright: © 2012 Jonckheeren et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Dr. Nicolas Jonckheere on vastaanottaja tutkijatohtorin Institut National du Cancer (Inca) ja Ligue Nationale contre le Cancer (LNCC). Nicolas Skrypek on vastaanottaja PhD pastoreiden Centre Hospitalier Régional Universitaire (CHRU) de Lille /alue Nord-Pas de Calais. Tohtori Frédéric Frénois on vastaanottaja tutkijatohtorin päässä Fondation pour la Recherche médicale (FRM). Johann Merlin on vastaanottaja PhD apurahan päässä Université de Lille 2 alue Nord-Pas de Calais. Tätä työtä tukee avustusta la Ligue Nationale contre le Cancer (Equipe Labellisée Ligue 2010 IVS). Isabelle Van Seuningen on vastaanottaja ”Contrat Hospitalier de Recherche Translationnelle” /CHRT 2010 AVIESAN. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haiman adenokarsinooma (PDAC) on neljäs johtava kuolinsyy syöpä maailmassa. Eloonjäämisen käyrä on erittäin lyhyt (6 kuukautta) ja eloonjäämisaste 5 vuoden on hyvin pieni (3%). Tämä dramaattinen tulos liittyy puute hoitomenetelmien ja varhaisdiagnostiikan markkereita, joka tekee haimasyöpä tappavin syöpä. Tuolloin diagnoosin, yli 80% PDAC ovat jo metastaattinen tai paikallisesti levinnyt ja vain noin 10 15% potilaista kelpuuteta poistettu kirurgisella. Haiman syövän synnyn seuraa metaplasiaa /dysplasia /syövän etenemisen kanssa PDAC kehittymässä ductal vaurio esiasteista kutsutaan haiman intraepiteliaalinen neoplasia (Panin-1A /1B /-2 /-3), jossa histologisia, cytologic ja geneettiset muutokset kerääntyä [1], [2 ]. Tunnistaakseen uusia molekyylikohteista, etenkin muuttunut ilme alussa Panin ja selvittämisessä molekyylitason mekanismit tauti, epäilemättä mahdollisuuden kehittää uusia terapeuttisia lähestymistapoja lopettaa /hidastaa syövän etenemiseen.

Tässä yhteydessä , membraaniin sitoutuneen musiinin MUC4, joka on ilmaistu jo vuonna PANIN-1A ottaa huomioon, että ei ole ilmaistu terveen haiman, ja sen kalvo kumppani onkogeeninen reseptorin ErbB2, joka on usein yli-ilmentynyt haimasyövän sekä PanINs, ovat lupaavia terapeuttisina kohteina [3], [4], [5], [6].

MUC4 geeni koodaa suuri apomucin (930 kDa), joka koostuu kahdesta alayksiköstä MUC4α ja MUC4β [7], [8] [9], [10]. MUC4α on solunulkoinen alayksikkö, jossa tyypillinen hyperglykosyloidun alueella. MUC4β on transmembraaninen alayksikön sisältää kolme EGF-kaltaiset domeenit (EGF3, EGF1 ja EGF2 sijaitsee päässä C-terminuksesta N-päässä), jotka ovat konservoituneita ihmisillä ja jyrsijöillä [4], [11]. Kokeelliset todisteet rotan homologeja Muc4 ja ErbB2 viittaa siihen, että EGF-kaltaisten domeenien osansa reseptori-ligandi-vuorovaikutusten ja ovat säädin liittyvä signalointi kasvuun, liikkuvuudessa tai erilaistumisen solun [4], [12]. Näiden tietojen Carraway ja yhteistyökumppanit ovat ehdottaneet Muc4 moduloijaksi leviämisen /erilaistuminen tasapaino [13], mutta tällä kertaa, kuten ehdotettu mekanismi ei ole validoitu ihmisen MUC4.

onkogeeni neu koodaa ErbB2 /HER2 tyypin I trans- kasvutekijän reseptorin, joka kuuluu kasvutekijän reseptorin (EGFR /erbb1) perhe käsittää ErbB3 ja ErbB4. ErbB2-proteiini koostuu solunulkoinen domeeni, transmembraanidomeeni ja solunsisäinen tyrosiinikinaasidomeeni. ErbB2 ei ole tunnettuja ligandia ja kuvataan co-reseptori, joka hetero-dimerisoituu muiden ErB reseptoreihin [14]. ErbB2 on yleisesti yli-ilmennetään syöpien, kuten PDAC, jossa ErbB2 usein monistetaan.

Tutkimukset ihmisen soluista on niukkaa ja ehdottaa toistaiseksi mahdollista roolia MUC4 että biologiset ominaisuudet haimasyöpäsoluissa [15], [ ,,,0],16]. Mitä ErbB2, vain yksi tuore tutkimus toisessa haimasyövän solumallin on osoittanut, että ErbB2 voi olla mukana ominaisuuksien haimasyöpäsoluissa [17]. Edellinen toimii paksusuolen ja keuhkojen solut osoittivat, että MUC4 ja ErbB2 voi toimia toimiva kokonaisuus ja välittää signaaleja solun [18], [19]. On kuitenkin vielä epäselvää MUC4 ja ErbB2 aktivoi samoja signalointireitille (t).

Tässä työssä olemme sitoutui tunnistamaan solunsisäisen signaloinnin reittejä valvonnassa joko ErbB2 tai MUC4 samassa solumallissa haimasyövän testata tätä hypoteesia. Osoitamme, että ihmisen MUC4 ja ErbB2 eivät fyysisesti vuorovaikutuksessa haiman syöpäsoluissa ja että estäminen ilmaisun kunkin kalvo kumppaneita ei heikennä samaa signalointireiteissä (esto MUC4 ilmaisun vaikuttaa JNK-reitin kun taas ErbB2 muuttaa MAPK-reitti). Erilaisia ​​vaikutuksia biologisiin ominaisuuksiin haimasyövän soluja, havaittiin, mikä viittaa siihen, itsenäistä toimintaa näiden kahden proteiinien rooli haiman kasvainten kasvua ErbB2, kun taas MUC4 näyttää olevan osallisena sekä kasvaimen kasvua ja levittämistä.

Materiaalit ja menetelmät

perustaminen ErbB2 ja MUC4 KD solulinjoissa

CAPAN-2 haimasyöpä solulinja (ATCC HTB-80) viljeltiin kuten aiemmin on kuvattu [20]. ErbB2-KD-solut saatiin seuraavat stabiili transfektointi CAPAN-2-solujen pGeneClip ™ puromysiinin koodaavalla ErbB2 ShRNA (SA biotieteiden ™). Stabiili transfektio 1 ug: n Scal: pilkotun plasmidin suoritettiin Effectene® (Qiagen, Courtaboeuf, Ranska) ja noudattamalla valmistajan protokollaa. Tyhjän vektorin käytettiin nostamaan ohjaus klooneja kutsutaan Non kohdistaminen (NT). Valinta suoritettiin käyttäen puromycine (0,1 ug /ml, InvivoGen, Limoges, Ranska) ja kloonit eristettiin rajoitettu sarjalaimennuksella. MUC4-pudotti (KD) solut saatiin infektoimalla retroviruksia CAPAN-2-solujen pRetroSuper plasmidi (SA Biosciences ™), joka sisältää sekvenssin kohdistaminen MUC4 (5′-AAGTGGAACGAATCGATTCTGTTCAAGAGACAGAATCGATTCGTTCCACTT-3 ’). Tyhjän vektorin käytettiin nostamaan ohjaus klooneja kutsutaan

Mock

. Valinta suoritettiin käyttäen G418 /geneticine (300 ug /ml, Invitrogen, Cergy Pontoise, Ranska) ja kloonit eristettiin järjestysnumeroa raja laimennus.

Western blotting

Sytosoliset, ydin- ja solun kokonais uutteita valmistettiin kuten on kuvattu Van Seuningen

et al.

[21] ja Jonckheere

et al.

[22], vastaavasti, ja pidettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti. Valkuaispitoisuus (2 ui tumauutteiden) mitattiin 96-kuoppalevyillä käyttäen bikinkoniini- happoa kuvatun menetelmän valmistajan ohjekirjan (Pierce). Western-blottaus suoritettiin nitroselluloosamembraanille (0,2 um, Schleicher ja Schuell), kuten aikaisemmin on kuvattu [23]. Kalvot tutkittiin vasta-aineiden ErbB-2 (klooni Ab-1, laimennus 1/500), p27kip1 (laimennus 1/500) Lab Vision Neomarker, USA; fosfo-P42 /44MAPK (Thr202 /Tyr204) (klooni 20G11, laimennus 1/500), p42 /44MAPK (klooni I37F5, laimennus 1/500), fosfori-SAPK /JNK (Thr183 /Tyr185) (# 9251, laimennus 1 /500), SAPK /JNK (klooni 56G8, 1/500), fosfori-p38MAPK (Thr180 /Tyr182) (klooni D3F9, 1/1000), p38MAPK (# 9212, laimennus 1/1000), FAK (# 3285, laimennus 1 /1000), fosfo-Akt (Ser473) (klooni D9E, 1/1000), Akt (klooni C67E7, laimennus 1/1000), sykliini D1 (klooni DCS6, laimennus 1/500), EGFR (# 2232, laimennus 1 /500), kaikki Cell Signaling Technology, USA; ErbB-3 (klooni C-17, 1/500), erbB-4 (klooni C-18, laimennus 1/500), MMP2 (klooni H-76, laimennus 1/500), MMP-9 (klooni 6-6B, laimennus 1/500), Bcl-x (klooni H-5, laimennus 1/500), Bax (klooni N-20, laimennus 1/500), MUC4 (8G7, laimennus 1/500) kaikki Santa Cruz Biotechnology, USA; MUC1 (M8, antelias lahja tohtori D. Swallow, Lontoo), tai β-aktiini (A5441, laimennos 1/5000) Sigma, Ranska. Vasta-aineet laimennettiin Tris-puskuroitua suolaliuosta, joka sisälsi 5% (w /v) rasvatonta maitojauhetta ja Tween-20 (TBS-T), lukuun ottamatta MUC4 ja β-aktiini ja niitä inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa, ennen kuin käsittely immunovärjäyksellä. Peroksidaasikonjugoidun toissijainen vasta (Sigma) käytettiin ja immunoreaktiivisia kaistoja visualisoitiin käyttäen West Pico kemoluminesenssisysteemi alustan (Perbio, Brebieres, Ranska). Chemo-luminesenssi visualisoidaan LAS4000 laitetta (Fujifilm) ja tulokset integroitiin käyttäen Gel analyytikko software® (Claravision). Esitetyt tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen.

Co-immunosaostus MUC4-ErbB2-kompleksin

150 ug CAPAN-2 solu-uute inkuboitiin yön yli 1,5 ug anti-ErbB2-vasta-aineen (Kanin polyklonaaliset, Ab-1, Thermo Scientific). Proteiini-A on liitetty kovalenttisesti silloitettu 4% agaroosihelmiä (Sigma, Ranska), joka oli tasapainotettu 1 x sitomispuskuria (200 mM Tris-HCI, pH 7,5, joka sisälsi 1 M NaCl, 20 mM EDTA, ja 2% NP40 (v /v)) ja lisätään lysaatti-vasta-aine sekoitetaan ja inkuboitiin pyörivällä alustalla 2 h 4 ° C: ssa. Sitten helmet pestiin kolme kertaa 1 x sitomispuskuria. Kanin IgG: t (Millipore) käytettiin negatiivisena kontrollina. Pestiin helmet sekoitettiin sitten 2 x SDS-geelin latauspuskuria ennen elektroforeesilla 2% (w /v) agaroosigeelillä ja immunoblottauksella edellä kuvatulla tavalla [23].

rakentaminen GST-MUC4

EGF3 + 1 + 2 fuusioproteiini

koodaava cDNA MUC4

EGF3 + 1 + 2 sekvenssi monistettiin PCR: llä käyttämällä FLAG epitooppimerkittyjen versio MUC4β alayksikön [16] kutsutaan MUC4F2-CF2 kuin malli ja F_EGF3 (5′-CGCGGATCCGCCTGTGAGGAGCCG-3 ’) ja R_EGF1 (5′-TCCCCCGGG TCAGAAGCAGCGGCTGTC-3’) alukkeina. PCR-tuote, joka koodaa MUC4

EGF3 + 1 + 2 pilkottiin

BamHI

ja

SmaI

ja työnnetään pGEX-4T1 (GE Lifesciences). PGEX-4T1-GST-MUC4

EGF3 + 1 + 2 Sitten rakenne transfektoitiin B834pLysS

E. coli

(Novagen) käyttäen elektroporaatiota ja

E. coli

kasvatettiin Luria Bertani väliaineessa (Invitrogen) OD

600 0,8. GST-MUC4

EGF3 + 1 + 2 fuusioproteiinin ilmentyminen indusoitiin sitten lisäämällä 1 mM isopropylthiogalactopyranosyl (Ambion) 15 ° C: ssa yön yli. Solut kerättiin sentrifugoimalla 3800 x g 4 ° C: ssa, suspendoitiin uudelleen 60 ml: aan lyysipuskuria (1 x PBS, 1 mM DTT, 1 mM EDTA, 1% (v /v) Triton X /100), ja hajotettiin sonikoimalla (Branson Sonifier 250). Sentrifugoinnin jälkeen (20 000 x g, 90 min, 4 ° C), supernatantti otettiin talteen, ja GST-MUC4

EGF3 + 1 + 2 on erotettu koko solun lysaatti käyttäen glutationi-agaroosi-helmiä (Qiagen). Pesun jälkeen helmet lyysipuskurilla, GST-MUC4

EGF3 + 1 + 2-fuusioproteiini eluoitiin 40 mM pelkistettyä glutationia on 50 mM Tris-HCI, pH 8,0 puskurilla, joka sisältää 150 mM NaCl: a, 0,1% (v /v) Triton X /100 ja 1 mM DTT. Proteiini puhtaus määritettiin Coomassie blue-värjäys, kun 12% SDS-PAGE. Puhdistettu proteiini dialysoitiin 1 x sitomispuskurissa ja varastoitiin 4 ° C: ssa käyttöön asti.

GST pull-down

GST-MUC4

EGF3 + 1 + 2 oli ladattu tasapainotettu glutationi-helmiä (Qiagen,), kuten valmistaja on kuvannut. Yön yli sitova 4 ° C: ssa, kun läsnä oli ihmisen rekombinantti-ErbB2-proteiinia (5 ug, R 5) tilastollista merkittävyyttä (P 0,05) lajiteltiin käyttäen asymptoottisen P-arvo laskenta. Kaikki tiedot ovat MIAME yhteensopivia. Raakadata on talletettu Gene Expression Omnibus (GEO, hakunumero: GSE31322).

qRT-PCR

Yhteensä RNA: iden haimasyöpä solut valmistettiin käyttämällä NucleoSpin® RNA II Kit ( Macherey Nagel) ja noudattamalla valmistajan protokollaa. cDNA: t valmistettiin, kuten on aiemmin kuvattu [27]. PCR suoritettiin käyttäen SsoFast ™ Evagreen Supermix kit seuraavat valmistajan protokollaa käyttäen CFX96 reaaliaikainen PCR -järjestelmää (Biorad). Primer tiedot annetaan taulukossa S1.

Tilastollinen

Tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen Graphpad Prism 4.0 ohjelmisto (Graphpad ohjelmistot Inc., La Jolla, USA). Tiedot esitetään keskiarvona ± SEM. Erot keskiarvoa kahdesta näytteet analysoitiin opiskelijan

t

testiä tai yksisuuntainen ANOVA testi valitaan vertailtavaksi Tukeyn HSD post-hoc -testi eroja alle 0,05 pidettiin merkittävinä ja oli merkitty tähdellä *. ** Osoittaa p 0,01, *** osoittaa p 0,001. Erot vastuulausekkeita analysoitiin käyttäen Chi square testiä.

Tulokset

MUC4 ja ErbB2 fyysisesti vuorovaikutuksessa CAPAN-2 haimasyöpäsoluissa

immunosaostus CAPAN-2 solujen uutetta anti-ErbB2-vasta-aine tehtiin ennen immunoblottauksella anti-MUC4 vasta-aine. MUC4 Immunovärjäyksen osoittaa, että MUC4 yhteistyössä immunosaostettiin ErbB2 CAPAN-2-solut (kuvio 1A, kaista 1). Vuorovaikutuksen spesifisyyttä arvioitiin käyttäen merkityksetöntä kanin IgGs että ei osoittanut Immunopresipitoidun band (kaista 2). Sen osoittamiseksi suora fyysinen vuorovaikutus MUC4 ja ErbB2, ensin suorittaa GST avattavan määrityksessä. Sillä, että teimme GST-MUC4

EGF3 + 1 + 2 fuusioproteiini, joka sisältää kolme EGF-kaltaisen domeenin MUC4. Sitten valmistettiin kaksi affiniteettikolonneja joissa joko GST-MUC4

EGF3 + 1 + 2 fuusioproteiini tai GST yksin josta rekombinanttia ihmisen ErbB2 ladattiin. Sen jälkeen affiniteettikromatografialla, anti-ErbB2 immunoblottaus osoitti ErbB2 tietyllä taajuusalueella varten glutationihelmiin sarake joissa GST-MUC4

EGF3 + 1 + 2-fuusioproteiinia (kuvio 1 B, kaista 1). Ei vyöhykkeitä havaittiin glutationi sarakkeen laakerin yksin GST: tä (kaista 2).

(A) Co-immunosaostus 150 ug CAPAN-2 solu-uute, jossa anti-ErbB2-vasta-aineella (kaista 1) tai kaniinin IgG: iden ( kaista 2). CAPAN-2-uutetta yksin (kaista 3). (B) ErbB2 immunoblot GST pull-down rekombinantin ihmisen ErbB2-proteiinia GST-MUC4

EGF3 + 1 + 2 glutationihelmiin (kaista 1) tai GST glutationi-helmiä (kaista 2). Rekombinantti ErbB2 yksin (kaista 3). (C)

In situ

läheisyys ligandin pitoisuuden määrittäminen CAPAN-2-soluissa. MUC4 ja ErbB2 komplekseja (punaiset pisteet) on merkitty nuolella. Tumat värjättiin DAPI. Kontrollikoe tehtiin ilman primaarista vasta-ainetta. (D) Immunofluoresenssi havaitseminen MUC4 (punainen) ja ErbB2 (vihreä) konfokaalimikroskopialla osoitti kolokalisaation kahden proteiinin (keltainen). (E) Expression of MUC4 ja ErbB2 kahdessa edustavaa kloonia MUC4-KD ja ErbB2-KD solut ja niiden valvonta (Mock ja NT) Western-blottauksella.

vuorovaikutus MUC4 ja ErbB2 oli sitten varmistettiin käyttäen toista lähestymistapaa, joka on

in situ

läheisyydessä ligation määritykset (PLA). Tulokset osoittavat, että MUC4 ja ErbB2 muodostavat endogeeninen monimutkainen CAPAN-2-soluissa (punaisia ​​pisteitä, nuolet, kuvio 1C). Lopuksi konfokaalimikroskopia tutkimukset vahvistivat kolokalisaation MUC4 ja ErbB2 CAPAN-2-solut (kuvio 1 D). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittavat, että MUC4 ja ErbB2 fyysisesti vuorovaikutuksessa CAPAN-2 haimasyöpäsoluissa

kautta

MUC4

EGF3 + 1 + 2 alue, joka sisältää kolme EGF-kaltaiset domeenit. Sitten sitoutui tunnistamaan solumekanismeja ja solunsisäinen signalointi reittejä valvonnassa molemmille osapuolille.

Generation ja luonnehdinta vakaa ErbB2-KD ja MUC4-KD solujen klooneja

Viisi ErbB2- KD ja seitsemän MUC4-KD solujen kloonit osoittivat vastaavasti lähes täydellinen tai täydellinen esto ErbB2 ja MUC4 ilmaisun vertailuryhmän klooneja (kuvio 1 E). Western blot-analyysi toisen membraaniin sitoutuneen musiini, joka on tärkeä syövän, MUC1, osoitti, että inhibitio MUC4 dramaattisesti alentunut, että MUC1 kun taas inhibitiota ErbB2 ei ollut vaikutusta (kuvio S1). Kun tarkastelimme ilmaus kolme muuta jäsentä ErbB reseptoriperheen, esto MUC4 tai ErbB2 ilmaisun johti voimakkaaseen laskuun ErbB2 ja ErbB3 (MUC4-KD) ja ErbB3 (ErbB2-KD), tässä järjestyksessä, kun taas mitään vaikutus havaittiin varten erbb1 ja ErbB4 (kuva S1).

rooli ErbB2 ja MUC4 soluproliferaatioon ja apoptoosiin

MUC4-KD solut osoittivat vähentynyt proliferaatio iältään 48 h, joka säilyi 72 h ja tuli merkitsevä 96 h (44% vähemmän kuin Mock soluja, p 0,05). ErbB2-KD solut olivat myös vähemmän proliferatiivinen kanssa vähentynyt merkittävästi 27% 96 h (p 0,05) (kuvio 2A). Vahva solukierron pysähtymisen G1 vaiheessa (54,5% ± 0,13) havaittiin MUC4-KD soluissa verrattuna Mock soluihin (37,4% ± 7,2, *, p = 0,016) (kuvio 2B). Lisäksi G2M vaihe oli paljon lyhyempi MUC4-KD soluja (20,9% ± 4,7) verrattuna Mock ohjaus soluihin (39,6% ± 6,7, **, p = 0,0035) (yleinen *, p = 0,0102). In ErbB2-KD soluja, suuntaus kohti solusyklin pysähtymisen G1 tapahtui myös, että pysyi tilastollisesti merkitsevä (p = 0,119) (kuvio 2B). Jotta voitaisiin tunnistaa mekanismeja vastuussa tästä muutosta leviämisen, ilmaus solukierron markkereita arvioitiin Western-blottauksella (kuvio 2C). On selvää, vähentynyt proliferaatio in MUC4-KD soluissa liittyi tukahduttamisesta sykliini D1. In ErbB2-KD solujen vähentynyt proliferaatio liittyvät sekä lisääntyneen ilmentymisen p27

kip1 solusyklin estäjä ja lasku sykliini D1 (kuvio 2D), mikä viittaa solujen pidätys on G1 /S leviämisen tarkastuspiste.

(A) solujen kasvua arvioitiin solulaskennan 24, 48, 72 ja 96 h CAPAN-2 MUC4-KD tai ErbB2-KD ja niiden valvonta (Mock ja NT). * = P 0,05 käyttäen opiskelija

t

-testi. (B) Cell cycle jakelu profiilit MUC4-KD, ErbB2-KD ja niiden ohjaus klooneista (Mock ja NT) virtaussytometrialla inkuboinnin jälkeen propidiumjodi- iodure. Arvot on ilmaistu keskiarvona kolmesta itsenäisestä kokeesta. * = P 0,05 käyttäen Chi square testiä. ns = ei merkitsevä. (C) vaikutus MUC4 tai ErbB2 hiljentäminen analysoitiin solusyklin merkki sykliini D1 ja p27

kip1 Western blot. β-aktiini mitattiin sisäisen valvonnan. (D) kvantitoitiin densitometrillä. Histogrammit suhde (sykliini D1 tai p27

kip1 /β-aktiini) näkyvät. (E)% of subG1 väestöstä MUC4-KD, ErbB2-KD ja hallintalaitteet (Mock ja NT, vastaavasti) määritettiin virtaussytometrialla inkuboinnin jälkeen propidiumjodi- iodure (* = p 0,05). (F) Western blot suoritettiin pilkotun kaspaasi 3, Bcl

XL ja Bax in MUC4-KD, ErbB2-KD ja niiden valvonta (Mock ja NT). β-aktiini arvioitiin sisäisenä kontrollina. (G) Migration ominaisuudet MUC4-KD, ErbB2-KD ja ohjaus klooneja (Mock ja NT) arvioitiin käyttämällä Boyden kammioita. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvo vaeltavia solujen määrä per Näkökenttä (*** = P 0,001, ns = ei merkitsevä). (H)% invaasion (invasiivisen solua /vaeltavien solujen) määritettiin käyttäen Boyden kammiot päällystetään Matrigelillä®.

Sen arvioimiseksi, onko MUC4 tai ErbB2 esto voisi myös vaikuttaa apoptoosin mittaus apoptoottisten solupopulaation ( subG1 solut) virtaussytometrialla tehtiin (kuvio 2E). Tulokset osoittivat merkittävää lisäystä subG1 väestöstä (13,33% ± 2,1) in ErbB2-KD solujen verrattuna NT ohjaus klooneja (6,2% ± 0,4) (*, p = 0,017). In MUC4-KD-soluissa, ei ole eroja subG1 solupopulaation havaittiin verrattuna Mock ohjaus klooneja (ns, p = 0,19). Expression apoptoottisten merkkiaineiden immunoblottauksella osoitti, että Bax ja Bcl

XL ei muuttunut sekä MUC4-KD ja ErbB2-KD soluissa, kun taas kasvu katkaistun kaspaasi-3 havaittiin ErbB2-KD soluissa (kuvio 2F).

rooli MUC4 ja ErbB2 solumigraatio /invaasio /tarttuvuuden

arvioimiseksi roolin MUC4 ja ErbB2 solumigraatio /invaasio, kokeet suoritettiin Boyden kammioissa ilman tai Matrigelillä® pinnoite, vastaavasti . Tulokset osoittivat, että merkittävä pienempi määrä vaeltavia solujen havaittiin MUC4-KD soluja (37,8 ± 1,5) verrattuna Mock soluihin (60,1 ± 3,3) (p≤0.001), kun taas mitään merkittävää eroa todettiin ErbB2-KD soluja (53,5 ± 8,8) verrattuna NT ohjaus klooneja (56,2 ± 6,3) (kuvio 2G). Kun mittasimme invasiivisuus, MUC4-KD solut näyttivät merkittävästi enemmän invasiivisia (41,8% ± 1,5, n = 7), kuin solut, jotka ilmentävät MUC4 (mock) (19,5% ± 1,5, n = 5) (p = 0,029) (kuvio 2H). ErbB2-KD klooneja, toisaalta, oli hieman vähemmän invasiivisia (9,4% ± 1,15) kuin soluissa, jotka ilmentävät ErbB2 (NT, 14,14% ± 2,1), mutta tämä vähennys ei ollut merkitsevä (p = 0,09). Kyky MUC4-KD: n ja ErbB2-KD-solujen kiinni Matrigelillä® (valmistettu kahden komponentin haiman soluväliaineen kollageeni IV ja laminiini) tai kollageeni I arvioitiin myös, mutta ei havaittu merkittäviä eroja joko soluja (ei esitetty) .

rooli ErbB2 ja MUC4 solunsisäisen signaloinnin

vaikutus ErbB2 tai MUC4 suurista polkuja solunsisäisen signaloinnin tutkittiin Western blottauksella for: MAPK (P42 /44, p38 ja JNK ), Akt, ja Focal Adhesion Kinase (FAK) (kuvio 3 ja kuvio S2). Fosforylaatio p42 /p44 MAPK oli täysin poistettiin ErbB2-KD solujen verrattuna NT ohjaus klooneja, mikä osoittaa täydellistä esto tämän reitin jälkeen ErbB2 hiljentäminen. In MUC4-KD solujen verrattuna mock klooneja, konstitutiiviset p42 /p44 MAPK vähenivät, kun taas fosforyloitu p42 /44 lisääntynyt mikä viittaa aktivoitumiseen MAPK-reitin liittyy MUC4 tukahduttamista.

(A) Western blot analyysit tehtiin sytosolinen ote MUC4-KD, ErbB2-KD ja hallintalaitteet (Mock ja NT vastaavasti) ilmentämiseen sekä fosforyloidun ja konstitutiivista muodot p42 /p44, JNK ja p38 MAPK. β-aktiini käytettiin sisäisenä kontrollina. Kaksi edustavaa klooneja esittelyyn. (B) kvantitoitiin densitometrillä. Histogrammit suhde (fosforyloitua /konstitutiivinen muoto) ja p42 /p44, JNK ja p38 MAPK-kinaasien on esitetty.

Kun tarkastelimme JNK-reitin, yhteensä tukahduttaminen JNK fosforylaation havaittiin MUC4 -KD kloonit verrattuna Mock valvontaa viittaa siihen, että MUC4 ilmaisu dramaattisesti vaikutuksia JNK-reitin aktiivisuutta. Ei vaikutusta JNK-reitin havaittiin ErbB2-KD klooneja. p38 MAPK-reitin ei näytä merkittävästi muuttunut annettaessa joko ErbB2 tai MUC4 hiljentäminen (kuva 3). Samoin Akt ja FAK reittejä eivät muuttuneet merkittävästi (kuva S2).

Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittavat, että menetys MUC4 ja ErbB2 dramaattisesti heikentää JNK ja p42 /44 MAPK signalointireittejä, vastaavasti.

vaikutus ErbB2 ja MUC4 kasvainten ominaisuudet

in vivo

vahvista

in vitro

tiedot MUC4 ja ErbB2 vaikutuksia kasvainten solujen ominaisuudet, SC ksenografti tutkimuksia tehtiin . Tulokset osoittavat, että kasvaimen tilavuus oli merkitsevästi pienempi ksenosiirrettyjä hiirillä, joilla M4-2-1 tai M4-2-10 klooneja päivänä 22 (kuvio 4A), jossa ei ole MUC4 vahvistettiin IHC (kuvio 4B). Vähentäminen ErbB2 ilmaisun aiemmin osoitettu

in vitro

Western blottauksella vahvistettiin myös

in vivo

in MUC4-KD kasvaimet IHC (kuva 4B).