Krooninen sairaus

tiivistelmä

Monoklonaalinen vasta (McAB) on keskeinen väline syövän immunodiagnoosia immunoterapiassa. McAB immunoterapian, joka kohdentuu kasvain antigeenejä on ollut suuri achivement. Tässä tutkimuksessa, solun klooni, joka piti erittävät korkean tiitterin IgG1-tyypin McAB nimetty NJ001 ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) soluihin saatiin. Tiitteri puhdistettua NJ001 oli 2 x 10

6. Antigeeni nimetty SP70 NSCLC erikseen tunnistaa NJ001 oli osoittautunut proteiinin suhteellinen molekyylimassa (Mr) 70 kDa. Tulokset immunohistokemiallisella värjäyksellä osoitti, että NJ001 voi positiivisesti reagoida NSCLC, mutta heikko positiivisesti tai negatiivisesti reagoi ihmisen pienisoluisen keuhkosyövän (SCLC), keuhkojen pseudotumor ja muita kasvaimia. Pehmeällä agarilla määrityksessä pesäkkeiden muodostumista tehokkuutta NJ001 ryhmissä väheni annoksesta riippuvalla tavalla. Pitoisuudeksi 100 ug /ml, 200 ug /ml ja 400 ug /ml, inhibition suhteen pesäkkeiden muodostuminen oli 23,4%, 62,5% ja 100%: lla. Samaan aikaan NJ001 aiheutti merkittävä väheneminen kasvaimen tilavuuden ja kasvaimen paino vertailuryhmän hiiret keuhkosyövän ksenograftimallissa. Kasvaimen kasvun estymisen suhdeluku 200 ug, 400 ug ja 800 ug NJ001 ryhmät oli 10,44%, 37,29% ja 44,04% vastaavasti. NJ001 johti myös cytomorphological muutoksiin ja indusoi apoptoosin ihmisen keuhkojen adenokarsinoomasolulinja SPC-A1 merkittävästi. Äskettäin kehitetty NJ001 valikoivasti reagoi NSCLC ja osoittivat antituumorivaikutus sekä

in vitro

ja

in vivo

. NJ001 on erittäin arvokasta koskevat immunodiagnostiikkaan ja immunoterapian NSCLC ja lupaava jatkotutkimuksen mekanismin osalta taustalla kasvaimen etenemistä NSCLC.

Citation: Pan S, Wang F, Huang P, Xu T, Zhang L, Xu J, et al. (2012) Tutkimus on äskettäin kehitetty McAB NJ001 Nimenomaan ei-pienisoluinen keuhkosyöpä ja sen biologiset ominaisuudet. PLoS ONE 7 (3): e33009. doi: 10,1371 /journal.pone.0033009

Editor: Vladimir V. Kalinichenko, Cincinnati Lasten Hospital Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 5. marraskuuta 2011; Hyväksytty: 2. helmikuuta 2012 Julkaistu: 30 maaliskuu 2012

Copyright: © 2012 Pan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Natural Science Foundation of China (30972821, 30901344 ja 30901262), Key Laboratory Medicine Jiangsun maakunnassa Kiinassa, Priority Academic ohjelmasuunnitteluosastolta Jiangsun korkeakouluissa. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on yksi yleisimmistä syövistä, ja on johtava syy syövän kuoleman vuoksi ei ole validoitu tai tehokasta seulontaan varhaista havaitsemista. Tämä kansanterveyden taakka on ilmeinen maailmanlaajuisesti 1,5 miljoonaa keuhkosyöpään liittyvien kuolemien vuonna 2010 [1]. Ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) osuus on yli 85% keuhkosyöpää ja useimmat potilaat NSCLC on edennyt sairauksien diagnosointiin. Viiden vuoden eloonjäämisaste rinta-, paksusuolen ja eturauhasen syöpä, jossa seulonta testit ovat käytettävissä, on neljästä kuuteen kertaa kauemmin kuin keuhkosyöpä. Korkea sairastuvuus /kuolleisuus- ja epäonnistuminen saavuttaa varhainen diagnoosi tulos synkkä ennuste [2], [3].

hoitomuotoja keuhkosyöpä perustuvat pääasiassa perinteisiä tiloja kuten kirurginen resektio, kemoterapiaa, ja sädehoito; kuitenkin, parantava vaikutus, joka on vähemmän kuin tyydyttävä [4] – [6]. Äskettäin immunoterapiaa syöpä on tullut menetelmä hyödyntää jatkoa perinteiseen terapiaan. Vasta-aineet ovat tulossa merkittävä lääke toimintatavat niiden suuren spesifisyyden ja affiniteetin tavoitteisiin. Yli kaksi tusinaa terapeuttista monoklonaalista vasta-ainetta (McAbs) on nykyisin hyväksytty syövän ja muiden ihmisen sairauksien [7] – [9]. Tunnistaminen romaani antigeenejä entisestään parantaa kasvaimen immunoterapiaa. Vasta-aine-pohjainen immunoterapia, joka kohdistuu kasvaimen antigeenejä tai solunpintamarkkereiden on saavuttanut jonkin verran menestystä syövän hoidossa, mukaan lukien NSCLC, aineilla kuten setuksimabi, panitumumabi, matuzumab, ja trastutsumabi [10] – [14].

esillä olevassa tutkimuksessa olemme tuotettu monoklonaalinen vasta-aine on nimetty NJ001, syntyy immunisoimalla hiiriä ihmisen SPC-A1 keuhkojen adencarcinoma elävien solujen antigeenin. Anti-kasvain aktiivisuus McAB NJ001 oli näytteillä sekä

in vitro

ja i

n vivo

.

Tulokset

tuotanto ja karakterisointi NJ001

Kun immunisoimalla BALB /c-hiiriä ihmisen keuhkon adenokarsinooma soluja, 3-positiivisten monoklonaalisten hybridoomasolulinjoja (NM001, NM004, NM005) vahvistettiin toistettiin epäsuoran solujen ELISA testaus jatkuvasti tuottamaan vasta-aineita, ja näin ollen on valittu laajentamiseen ja recloning. Kromosomi määrä kunkin hybridooman karyotyyppi oli yli 95. Kuvio 1A oli karyotyyppi NM001 hybridoomasolun. Puhdistettu McAbs Vesivatsanesteestä hankittiin proteiini A affiniteettipuhdistuksella. McAB alkaen NM001 oli suurin tiitteri kolmesta vasta saavuttaen 2 x 10

6. NM001 ja NM004 pidetään erittävät IgG1, κ- tyyppi McAB, kun taas NM005 erittyy IgG2b, κ- tyyppi McAB.

(A) Karyotyyppi on NM001 hybridoomasolulinjaan (x 400). (B) Sitovat aktiivisuus McAbs ihmisen maligant ja nonmaligant viljelmässä. Laimentamaton supernatantit hybridoomien NM001, NM004, NM005 testattiin kolmena rinnakkaisena epäsuora solun kuvatussa Elisa ”Materiaalit ja menetelmät”. Kukin numero edustaa keskimääräistä absorbanssia alustan lopputuotteen 450 nm. Kontrollit ilman McAbs näytteillä keskimäärin absorbanssi 0,02. NM001 valittiin jatkotutkimukseen, koska sillä oli suurin sitova suhde keuhkojen kasvainsolujen ja suurin spesifisyys keuhkosyövän solulinjat verrattuna muihin kasvainsolulinjat. (C) Western blot analyysi reaktio NJ001 tuotettu hybridooman NM001 eri solujen (ihmisen maligant ja nonmaligant solut) viljelmässä. (Kaista 1, SPC-A1, kaista 2, A549, kaista 3, NCI-H520, kaista 4, NCI-H460, kaista 5, HepG2, kaista 6, ZR-75-30, kaista 7, COLO 205, kaista 8, WI-38, kaista 9, PBMC; kaista 10, Marker). GAPDH: ta käytettiin latauskontrollina. Tulokset osoittivat, että ilmentyminen proteiinin spesifistä vasta-ainetta NJ001 ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solulinjoissa, ei muissa syöpäsolulinjoissa ja normaalit solut. (D) edustaja positiiviset ja negatiiviset tulokset on saatu IIF-analyysi reaktion NJ001 eri solujen havaita fluoresenssia ja konfokaalimikroskopialla analyysi (x 400). (A, SPC-A1, b, ZR-75-30, c, HepG2, d, Wi-38). Läsnäolo NJ001 voidaan visualisoida solujen sytoplasmassa SPC-A1-solut, mutta muita solulinjoja ei havaittu fluoresenssia. Lokalisaatio antigeenin spesifinen NJ001 voi olla solun sytoplasmassa SPC-A1-soluja.

Jokainen McAB karakterisoitiin tulokset sitoutumisen paneelin normaalien ja pahanlaatuisten solujen listattu kuviossa 1B. ELISA-analyysi, huomasimme, että McAbs tuottama hybridoomasolulin- NM001, NM004 ja NM005 oli korkeampi sitovia suhteita kanssa NSCLC solulinjojen SPC-A1, A549, NCI-520 ja NCI-H460, mutta näytteillä yleensä pienempi sitovia suhdelukuja SCLC solulinjaa NCI-H446, muut syövän ja normaali solulinjoissa. NJ001, jonka on tuottanut hybridoomasolulinja NM001, valittiin jatkotutkimuksiin, koska se osoitti korkeinta spesifisyyttä keuhkosyövän solulinjat verrattuna muihin tuumorisolulinjoja.

Western blot-analyysi Tulokset olivat yhdenmukaisia ​​(kuvio 1C) . Voisimme havaita vain proteiinin ekspression nimettiin SP70 erityisiä NJ001 NSCLC solulinjoissa, mutta ei muissa syöpäsolulinjoissa ja normaalit solut.

epäsuoralla immunofluoresenssilla Tulokset on esitetty kuviossa 1D. SP70, tunnustettu NJ001, paikallistettiin solun memberane ja solujen sytoplasmassa SPC-A1 soluissa, kun taas muita solulinjoja ei esiintynyt fluoresenssia.

immunohistokemiallinen analyysi

immunohistokemiallinen analyysi Tulokset osoittivat, että ilmaus SP70 oli vahva positiivinen keuhkoadenokarsinooma kudosten ja suomuinen keuhkosyöpä kudoksen (kuvio 2A, 2B), kun taas heikko positiivinen tai negatiivinen ekspressio havaittiin kudoksen SCLC, rintasyöpä, mahasyöpä, paksusuolen syöpä, munasarjasyöpä ja maksan syöpä (kuvio 2C, 2D, 2E, 2F, 2G, 2H). SP70 ei löytynyt kudoksissa keuhkojen pseudotumor ja viereisten nontumourous keuhkojen kudoksiin (kuvio 2 I, 2J).

edustaja alueita tuumorisektioiden alkaen (A) NSCLC keuhkoadenokarsinooma; (B) NSCLC levyepiteelikarsinooma keuhkosyöpä; (C) SCLC; (D) Rintasyöpä; (E) Mahasyöpää; (F) Colon syöpä; (G) Munasarjasyöpä; (H) Maksasyöpää; (I) Keuhkojen pseudotumor; (J) vieressä nontumourous keuhkojen kudoksiin.

SP70 ilmaisuja kudoksen keuhkon adenokarsinooma, levyepiteelikarsinooma keuhkosyöpä, SCLC, rintasyöpä, mahasyöpä, paksusuolen syöpä, munasarjasyöpä, maksasyöpä, keuhkojen pseudotumor ja vierekkäisten nontumourous keuhkojen olivat 58/58, 48/48, 2/21, 3/21, 1/5, 0/5, 0/5, 1/5, 0/25 ja 0/8 (taulukko 1).

estovaikutus NJ001 SPC-A1 leviämisen ja Colony Formation

vaikutus NJ001 proliferaatioon SPC-A1 soluissa arvioitiin kautta [

3H ] tymidiinin lisääntymisen määritys. Kontrolliin verrattuna käsiteltyjä soluja, leviämisen taso NJ001 käsitellyn SPC-A1 soluissa merkittävästi vähentynyt kuluttua 48 h ja 72 h (

P

0,001,

P

0,001) (Kuva 3).

verrattuna kontrolli käsitellyissä soluissa, taso leviämisen NJ001 käsitellyn SPC-A1 soluissa merkittävästi vähentynyt kuluttua 48 h ja 72 h (**

P

0,001).

SPC-A1-solut maljattiin pehmeälle agarille matriisi, käsiteltiin NJ001 tai MCA2849 (merkityksetön McAB) (0, 100, 200, 400, 800 tai 1000 ug /ml) ja inkuboitiin kunto 37 ° C 5% CO

2. Jälkeen 14 päivää, pesäkkeiden määrä laskettiin, ja edustavat kuvat saatiin (kuvio 4). Kuten on esitetty taulukossa 2, NJ001 esti pesäkkeiden muodostumista annoksesta riippuvalla tavalla, jolla 23,4% inhibition suhde 100 ug /ml, 62,5%: n inhibition suhteen 200 ug /ml. Kun konsentraatio saavutti 400 ng /ml tai enemmän, ei ollut pesäkkeitä suurempi kuin 50 solua, joka osoittaa 100%: n inhibition suhteen. Kuitenkin, MCA2849 ei estänyt pesäkkeiden muodostumista SPC-A1.

Solususpensiot (2 x 10

4-solut) sekoitettiin 0,3% agaroosia ja eri pitoisuuksia NJ001 tai MCA2849 oli kerrostettu alkuun viljelyalustaan ​​6-kuoppaisille viljelylevyille ja annettiin kasvaa 2 viikkoa ennen pesäkkeet laskettiin. Edustavia kontrasti kuvia näytettiin. (A) 0 ug /ml NJ001, (B) 100 ng /ml NJ001, (C) 200 ug /ml NJ001, (D) 400 ug /ml NJ001, (E) 0 ug /ml MCA2849, (F) 100 ug /ml MCA2849, (G) 200 ug /ml MCA2849, (H) 400 ug /ml MCA2849.

Nämä tulokset viittaavat siihen, NJ001 tehokkaasti esti SPC-A1 soluproliferaatiota

in vitro

.

estovaikutus NJ001 Human SPC-A1 keuhkoadenokarsinooma Mouse ksenograftimallia

esiselvityksen jälkeen 3 viikon rokotus, hiiret lopetettiin. Kudokset pistoskohdasta inkubointilaitteistossa ryhmässä ja kasvaimia kontrolliryhmän leikattiin. Histopatologia ei havaittu kasvaimen kasvua kudoksissa inkuboinnin ryhmän ja kasvaimen kasvua kudoksissa kontrolliryhmän (kuvio 5).

edustaja alueilla kudososat inokulaatiopaikasta in NJ001 ryhmän (A) ja leikattiin kasvaimia kontrolliryhmä (B).

tulos

in vivo

kokeessa kuvassa 6A. Anto NJ001 aiheutti eriasteisia vähentäminen kasvaimen tilavuuden verrattuna suolaliuoskäsiteltyihin kontrollihiiriin. Kasvain volyymit 400 ug ja 800 ug NJ001 ryhmä olivat merkittävästi pienempiä kuin kontrolliryhmässä 17 päivää inokulaation jälkeen; Lisäksi ero säilyi loppuun hoidon (

P

= 0,004,

P

= 0,003). 3 viikon kuluttua hoidon, tuumorit leikattiin ja punnittiin. 200 ug, 400 ug ja 800 ug NJ001 ryhmiä, kasvaimen kasvun inhibition suhteen [(C-T) /C%] oli 10,44%, 37,29%, ja 44,04% vastaavasti. Inhibition suhde 400 ug ja 800 ug NJ001 ryhmässä oli tilastollisesti merkitsevä verrattuna kontrolliryhmään (kuvio 6B,

P

= 0,032,

P

= 0,015). Lopussa 3 viikkoa, keskimääräinen kasvaimen paino 200 ug ja 800 ug NJ001 ryhmässä oli (1,51 ± 0,20) g ja (0,94 ± 0,19) g, ja ero näiden kahden hoidon välillä oli myös tilastollisesti merkitsevä (

P

= 0,048).

(A) Kasvaimen kasvukäyrä. Eläimet injektoitiin subkutaanisti 2 x 10

6 SPC-A1-solujen ja intraperitoneaalisesti normaalia suolaliuosta, 200 ug, 400 ug tai 800 ug NJ001. Tuumoritilavuudet mitattiin 4 päivän välein. Virhepalkit edustavat keskihajonta. (B) Keskimääräinen kasvaimen paino vasta ja kontrolliryhmiin. 3 viikon kuluttua hoidon, tuumorit leikattiin ja punnittiin. Virhepalkit edustavat keskihajonta. *

P

0,05 verrattuna kontrolliryhmään. ∧

P

0,05 verrattuna 200 ug NJ001 ryhmä.

apoptoosi SPC-A1 indusoiman NJ001

Kuten kuviossa 7A, SPC -A1 solujen NJ001 ryhmä osoitti syrjäytyneitä ja tiivistetyn chromatin matriisi, sekä kutistuminen ja kupliminen sytoplasman ja hajanainen ytimet, jotka ovat tyypillisiä piirteitä apoptoosin. Sitä vastoin solut joko MCA2849 ryhmä tai McAB vapaa ryhmä ylläpidetään normaali morfologia ja säilytetään riittävä kyky lisääntyä.

SPC-A1 soluja viljeltiin kanssa tai ilman 200 ug /ml NJ001 tai MCA2849 24 tuntia ja 48 h. (A) Morfologiset muutokset SPC-A1-solujen havaittiin alle käänteismikroskooppi (x 100). a, 24 h NJ001; b, 24 h MCA2849; c, 24 h McAB ilmaiseksi; d, 48 h NJ001; e, 48 h MCA2849; f, 48 h McAB ilmaiseksi. (B) Apoptoosi analysoitiin virtaussytometrialla. (C) Jokainen pylväs ja virhe on keskiarvo ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta (**

P

0,001). Määrä myöhään apoptoosin määritettiin prosenttiosuutena anneksiini V

+ /PI

+ solut.

Verrattuna MCA2849 ryhmään ja McAB vapaa ryhmä, korkea prosenttiosuudet anneksiini V

+ solut (yhteensä apoptoottinen) välistä NJ001 ryhmässä havaittiin ajanhetkellä 24 h ja 48 h (

P

0,001 molemmille ajankohtina). Ero koko apoptoottisten kurssi NJ001 ryhmässä välillä 24 tunnin aikapisteessä ja 48 h ajankohta oli myös tilastollisesti merkitsevä (

P

= 0,002, kuvio 7B).

Kuten kuviossa 7C, prosenttiosuudet anneksiini V

+ /PI

+ soluja (myöhäinen apoptoottiset) välistä NJ001 ryhmässä, MCA2849 ryhmä ja McAB vapaa ryhmä oli 30,89%, 2,80% ja 3,58% 24 tunnin aikapisteessä vastaavasti. Edesmennyt apoptoottiset korko NJ001 ryhmässä oli myös korkeampi kuin muissa ryhmissä 48 tunnin aikapisteessä (

P

0,001,

P

0,001). Lisäksi myöhään apoptoottiset kurssi NJ001 ryhmässä merkittävästi lisääntynyt kuluttua 24 h (24 h 48 h ajankohtana) (

P

0,001).

NJ001 indusoi apoptoosin SPC- A1 solujen ajasta riippuva tavalla.

keskustelu

hybridomateknologiaa on saatavilla työkalu, joka mahdollisesti voi tuottaa anti-kasvain vasta-aineita ja tunnistaa uusia kasvaimen antigeenejä. Viimeisten vuosien ajan huomattavaa edistystä on tapahtunut tunnistamisessa kasvaimeen liittyviä antigeenejä tunnustettu McAbs tai autovasta-aineita potilailta. Tällä hetkellä yli 1000 kasvaimeen liittyviä antigeenejä on raportoitu [15] – [20].

Esillä olevassa tutkimuksessa, 3 McAbs tuotettiin 3 positiivista monoklonaalinen hybridoomasolulinjoja (NM001, NM004, NM005), jotka reagoivat vaihtelevassa määrin keuhkosyövän soluja, normaalit solut, ja muut syövän solulinjat. McAB NJ001 valittiin jatkotutkimukseen, koska se osoitti korkeimman sitova suhde keuhkosyöpä soluja ja niillä on myöskin suurin spesifisyys keuhkosyövän solulinjat verrattuna muihin syövän solulinjat. Tulokset immunohistokemiallisella värjäyksellä osoitti, että NJ001 voi positiivisesti reagoida NSCLC, mutta heikko positiivisesti tai negatiivisesti reagoi ihmisen pienisoluisen keuhkosyövän (SCLC), keuhkojen pseudotumor ja muita kasvaimia.

Lisäksi korkean affiniteetin ja spesifisyys, NJ001 myös näytteillä antituumorivaikutus sekä

in vitro

ja

in vivo

. Havaitsimme vaikutus NJ001 proliferaatioon keuhkojen adenokarsinoomasolulinja SPC-A1. Tulokset pehmeän agarin määrityksen osoittavat, että pesäkkeen muodostumisen tehokkuutta NJ001 ryhmissä vähentää annoksesta riippuvalla tavalla. Ksenograftikudoksista perustettiin ihonalaisella SPC-A1-solujen ja NJ001 annettiin intraperitoneaalisesti 3 eri annoksilla. NJ001 aiheutti eriasteisia lasku kasvaimen tilavuuden ja kasvaimen paino verrattuna ohjaus hiirillä. Lisäksi, kun ruiskutetaan sama määrä SPC-A1-soluja viljeltiin NJ001 2 h samalla tavalla, ei ollut kasvaimen kasvua nude-hiirissä. Olemme myös havainneet, että NJ001 indusoi cytomorphological muutoksia ja merkittävästi indusoi apoptoosia SPC-A1 solujen ajasta riippuva tila. Tämä viittasi siihen, että solun indusoiman apoptoosin NJ001 on mahdollisesti mekanismi antituumorivaikutus. Apoptoosin induktio välittyy joko kuolema reseptoreita kohtaan (ulkoinen tie), tai mitokondrion tasolla (luontainen polku) [21] – [23]. Edelleen tunnistaminen apoptoottisten signalointireittien SPC-A1 soluja käsiteltiin NJ001 olisi hyödyllistä selvittämisessä mekanismeja, joilla NJ001 aiheuttavat antituumorivaikutus sekä

in vitro

ja

in vivo

. Katsovat, toiminnalliset analyysit tutkimuksessamme tehtiin vain SPC-A1 soluja käytetään tuottamaan NJ001. Seuraavassa tutkimuksessa, teemme enemmän työtä tarkkailla kasvua estäviä vaikutuksia NJ001 ulottaa yhden solulinjan ja tehdä selväksi, onko biologinen aktiivisuus on nimenomaan solulinjan testattu tai edustaa yleisempi NSCLC vastausta.

merkitys kasvaimen antigeenejä piilee niiden diagnostisia ja tehokkaan terapeuttisen hyödyn [24] – [33]. Lisäksi kasvaimen antigeenejä voi myös tarjota prognostista tietoa syöpäpotilaiden [34]. Kasvaimeen liittyviä antigeenejä ihmisen keuhkosyöpä on tunnistettu monia vuosia; Kuitenkin vain harvat raportit ovat tutkineet yhteisen antigeenejä tai yhteisiä epitooppeja keuhkosyöpään [35], [36]. Tässä tutkimuksessa, antigeeni, joka on lopulta nimettiin SP70 tunnustettu NJ001 on osoittautunut proteiini, jonka Mr on 70 kDa. Visualisointi NJ001 sitoutumisen epäsuoralla immunofluoresenssilla osoitti, että SP70 sijaitsi sytoplasmassa SPC-A1. SP70 on potentiaalinen biomarkkereiden ja terapeuttinen kohde immunoterapiaa NSCLC.

Jotta tutkia toiminta NJ001 ja vastaavan Ag, enemmän työtä tarvitaan arvioida kliinistä sovellettavuutta. Lisäksi avioliitto kohde tunnistamisen vasta-lisälaite tekniikoita lopulta käännetään uusia ja parannettuja hoitoja syöpäpotilaille, mikä tarjoaa lisätukea siitä, kuinka tärkeää on jatkuva tutkimus NJ001 [7], [37] – [39].

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

tutkimus toteutettiin tiukasti mukaisesti suosituksia opas Hoito ja käyttö Laboratory Animals of National Institutes of Health. Protokolla hyväksyi valiokunnan Ethics Animal Experiment ensimmäisen Affiliated sairaala Nanjing Medical University (Luvan numero: 19A5-2373). Kaikki pyrittiin minimoida kärsimyksen.

Mononukleaarisolut (PBMC) heparinoidusta ääreisveren otettiin talteen terveillä aikuisilla luovuttajien ensimmäisen sidoksissa sairaalaan Nanjing Medical University. Immunohistokemiaa määritystä, NSCLC kudoksissa (n = 106), SCLC kudoksissa (n = 21), rinnan karsinooma kudoksissa (n = 21), mahasyöpä kudoksissa (n = 5), paksusuolen syövän kudoksissa (n = 5), munasarjasyöpä kudosten (n = 5), maksasyöpä kudoksissa (n = 5), keuhkojen pseudotumor kudokset (n = 25) ja viereisen nontumourous keuhkojen kudoksiin (n = 8) saatiin patologian osaston samassa sairaalassa välillä heinäkuussa 2009 ja kesäkuu 2010 .

tutkimus hyväksyi valiokunnan etiikka ihmisten hoitoon ensimmäisen Affiliated sairaala Nanjing Medical University, ja kirjallinen suostumus saatiin myös jokaiselle osallistujalle.

soluissa ja solulinjoissa

kymmenen eri ihmisen solulinjoja tai viljelmät (listattu kuviossa 1 B), jotka edustavat eri normaalien ja neoplastisten kudosten käytettiin kuvaamaan vasta-aineita tässä tutkimuksessa. Kaikki solulinjat ostettiin solusta pankin Kiinan Academy of Sciences Shanghaissa. Ihmisen keuhkosyövän solulinjat SPC-A1, NCI-H520, NCI-H460, ja NCI-H446, koolonkarsinoomasolulinja COLO 205 ja normaali sikiön keuhkojen solulinja WI-38 kasvatettiin RPMI1640 täydennettynä 10% (tilavuus /tilavuus ) naudan sikiön seerumia (FBS) (Gibco Invitrogen, Carlsbad, CA). Ihmisen keuhkosyövän solulinjat A549, rinsyöpäsolulinja ZR-75-30, maksan karsinooma HepG2 viljeltiin RPMI1640 täydennettynä 10% (v /v) FBS: ää. Mononukleaarisia soluja (PBMC) heparinoidusta ääreisveren otettiin talteen tervettä aikuista luovuttajien (ensimmäisestä sidoksissa sairaalaan Nanjing Medical University) Ficoll-Hypaque heysgradienttisentrifugoinnilla.

Generation McAB

Monoklonaaliset vasta-aineet valmistettiin seuraavasti. 6-8 viikkoa vanhat BALB /c-hiiriä intraperitoneaalisesti immunisoitiin 1 x 10

6 SPC-A1-soluja kolme kertaa 3-4 viikon välein, sitten pernasolut hybridisoitiin SP2 /0 (BALB /c-hiirten myeloomasolujen solulinja) 50% PEG-4000 (Sigma, USA) kasvatettiin HAT-väliaineessa RPMI 1640 (GIBCO, USA). Viljelmän supernatantit seulottiin vasta-aineen reaktiivisuus Wi-38 ja SPC-A1 soluihin käyttämällä elävien solujen, kiinteä- faasi-ELISA. Kohdesoluja (1 x 10

5) ensimmäisen kerran 96- kuoppiin ja inkuboitiin 18 h 24 h 37 ° C: ssa 5% CO

2. Kasvualusta imettiin pois ja solut kiinnitettiin 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa 95% etanolilla. Solukalvojen rikottiin Triton X-100: ssa 20 minuuttia ja sitten solut estettiin 5% BSA 60 min huoneenlämmössä.

Positiiviset hybridoomasolut subkloonattiin käyttäen rajoittavan laimennuksen. Monoklonaalinen hybridoomasoluja, joilla on korkea valenssi vastaan ​​SPC-A1-soluja laajennettiin ja transfusoidaan vatsaonteloon BALB /c-hiirten valmistamiseksi askites. McAbs puhdistettiin edelleen askitesnesteestä kautta proteiini A-affiniteettikromatografialla.

Positiiviset hybridoomasolut solujen hoidettiin kolkisiini. Sen jälkeen, kun 10% Giemsa värjäys, havaitsimme puolivälissä ydin- solut ja analysoitiin karyotyypin mikroskoopin.

karakterisointi McAbs

raskaan ja kevyen ketjun koostumus 3 McAbs määritettiin käyttäen ISO Strip Kit (Santa Cruz Biotechnology, Inc, USA).

laajuus McAbs sitoutumisen erilaisissa normaaleissa ja pahanlaatuisten solujen (listattu kuviossa 1B), määritettiin 0,1 ml viljelmäsupernatanttia positiiviset hybridoomasolut ja 1 x 10

5 kohdesoluja käyttäen ELISA seulontaan edellä kuvatulla tavalla, ja tuotanto substraatin mitattiin spektrofotometrisesti 450 nm: ssä.

Epäsuora Immunofluoresenssianalyysi

Epäsuora immunofluoresenssi suoritettiin seuraavasti. Lyhyesti, soluja kasvatettiin 80% konfluenssiin peitinlaseja ja kiinnitettiin sitten 95% etanolia huoneenlämpötilassa. PBS-pesun jälkeen, solukalvot rikottiin Triton X-100: ssa 20 min ja pysäytettiin 5% BSA 60 min huoneenlämmössä, ja sitten inkuboitiin puhdistetun NJ001 (1:80) 37 ° C: ssa 1 h. Tätä seurasi inkubointi FITC-konjugoidulla vuohen anti-hiiri-IgG (1:100) 45 min ajan huoneenlämpötilassa. Objektilasit vastavärjättiin Hoechest. Immunofluoresenssivärjäyksen tuloksia saatiin fluoresenssi ja konfokaalimikroskopialla (Zeiss LSM 710, Saksa).

Western Blot analyysi

Jotta suorittamiseksi Western blot-analyysi, yhdeksän solulinjat perin säröillä RIPA-lyysipuskuria (50 mM Tris-HCI: ää, 1% NP-40, 0,25% Na-deoksikolaattia, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 mg /ml aprotiniini, 1 mM Na-

3Vo

4, 1 mM NaF). Seuraavaksi 25 ug kokonais-proteiinin yhdeksän solulinjojen ajettiin elektroforeesissa 12% SDS-PAGE-geelissä ja siirrettiin PVDF-kalvolle (Amersham Pharmacia Life Science, USA). Sen jälkeen kun esto 10% rasvatonta maitoa TBST, PVDF kalvo inkuboitiin NJ001 (1:300) ja anti-GAPDH vasta-ainetta (Zhongshan Biological, Peking, Kiina) yli yön 4 ° C: ssa vahvistamaan vastaavaa proteiinia lastaus kukin kaista. Tätä seurasi inkubointi HRP-konjugoitua vuohen anti-hiiri-IgG: tä 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. PVDF kalvo pestiin vielä 3 kertaa TBST-liuoksella 15 minuutin ajan kutakin, ja lopuksi kehitettiin ECL (Amersham Life Science) on röntgenfilmille.

immunohistokemia

NSCLC kudoksissa (n = 106 ), SCLC kudoksissa (n = 21), rinnan karsinooma kudoksissa (n = 21), mahasyöpä kudoksissa (n = 5), paksusuolen syövän kudoksissa (n = 5), munasarjasyöpä kudoksissa (n = 5), maksasyöpä kudoksissa ( n = 5), keuhkojen pseudotumor kudokset (n = 25) ja viereisen nontumourous keuhkojen kudoksiin (n = 8) saatiin patologian osaston ensimmäisessä sidoksissa sairaalaan Nanjing Medical University. NSCLC kudoksiin keuhkojen adenokarsinooma kudoksia (n = 58) ja suomuinen keuhkosyöpä kudoksia (n = 48). Kudosleikkeet käsiteltiin 0,3% vetyperoksidaasin 5 min, jota seurasi 30 min estämällä normaali vuohen seerumia huoneenlämmössä. NM001 (1:200) levitettiin estetty osiin ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa. Leikkeitä inkuboitiin 30 min 37 ° C: HRP-leimattua vuohen anti-hiiri-IgG-vasta-ainetta (1:2,000), ja positiiviset signaalit visualisoitiin kehitys diaminobentsidiinitetrahydrokloridilla (DAB) liuos. Leikkeitä tarkasteltiin Olympus Ax-70 DMC Eli CCD-kamera kytketään tietokoneen näyttönä.

proliferaatiomääritystä

SPC-A1-solut ympättiin 96-kuoppalevylle 5000 solua kuoppaa kohti. Viljelmäsupematanteista Positiiviset hybridoomasolut ja SP2 /0-soluja lisättiin. Viimeisellä 16 h 24 h, 48 h ja 72 h inkuboinnin jälkeen 37 ° C: ssa, soluja pulssitettiin 0,5 uCi /kuoppa [

3H] tymidiiniä. Proliferaatiomääritykset suoritettiin nestetuikelaskennalla korjatun soluja. Tulokset SPC-A1 soluproliferaatiota mittaus esitettiin count per minuutti (cpm).

Soft Agar Pitoisuus

Pesäkkeenmuodostusta analysoitiin pehmytagar määrityksessä. käyttämällä kiinnittämisestä riippuvaisia, keuhkojen adenokarsinoomasolulinja SPC-A1 kasvainsolun malli, menettelyjen mukaisesti Hong KW [40]. Lyhyesti, pohjakerroksen 0,5% agaroosia (Promega, USA), joka sisälsi 2 ml viljelyalustaa alun perin kiinteytynyt 6-kuoppaiselle viljelylevylle. Seuraavaksi 2 ml 0,3% agaroosia, joka sisälsi 2 x 10

4-soluja eri pitoisuuksilla NJ001 tai MCA2849 (merkityksetön McAB) (0, 100, 200, 400, 800 tai 1000 ug /ml) kerrostettiin . Kukin annos testattiin kolmena kappaleena. Kun oli inkuboitu 37 ° C: ssa, 5% CO

2-ilmakehässä 2 viikkoa, pesäkkeet, jotka sisälsivät yli 50 solua laskettiin mikroskoopilla. Pesäkkeiden muodostumisen tehokkuus ja eston suhde pesäkkeen lasketaan seuraavien kaavojen mukaisesti: pesäkkeenmuodostus tehokkuus = (keskimäärin pesäkkeiden /keskimääräinen solujen lukumäärä kuoppaa kohti) x 100%; esto suhde pesäkemuodostuksen = (1- keskimäärin siirtomaiden NJ001 tai MCA2849 ryhmä /keskimäärin siirtomaiden McAB vapaa ryhmässä) x 100%. Tämä koe toistettiin 3 kertaa.

Anti-jäykkäkouristus McAB (MCA2849) (ABD Serotec, Saksa) käytettiin merkityksetöntä McAB tässä tutkimuksessa.

Vieraslajisiirteen Experiment

Kolmekymmentä BALB /c-nude-hiiriä 6 viikon ikäisiä ostettiin Shanghai SLAC Laboratory Animal Co Ltd (Shanghai, Kiina). SPC-A1-soluja ylläpidettiin 10% FBS: ää RPMI 1640-väliaineessa, kunnes solut saavuttivat 80% konfluenssin. Kaikki toimenpiteet suoritettiin mukaisesti eläinten hoidon ja käytön komitea ohjeita Nanjingin Medical University.

Alustavassa tutkimuksessa SPC-A1 soluja inkuboitiin NJ001 37 ° C: ssa 5% CO

2-inkubaattorissa 2 tuntia. Siten kukin 200 ui suolaliuosta sisälsi 2 x 10

6 SPC-A1 soluja ja 400 ug NJ001. Sivusuunnassa kainaloon 5 nude-hiiriin istutettiin ihonalaisesti liuosta, ja kontrolliryhmän, johon kuuluu myös 5 hiirtä, injektoitiin vastaava SPC-A1 solujen samassa asemassa. Sen jälkeen, kun kolmen viikon inokulaation, hiiret lopetettiin ja kudokset saatiin H & E-värjäystä.

hiiret jaettiin satunnaisesti 4 ryhmään, 5 hiirtä ryhmää kohden. Ksenograftikudoksista perustettiin ihonalaisella 2 x 10

6 SPC-A1 solua /200 ui per hiiri sivusuunnassa axilla. Vasta-aineita annettiin vatsakalvonsisäisesti 3 eri annoksilla (200 ug, 400 ug tai 800 ug hiirtä kohti). Käsittely aloitettiin samanaikaisesti istutusta ja koostui kahdesta vaiheesta: päivittäin injektio ensimmäisen viikon, jonka jälkeen injektiota kahdesti viikossa menettelyn kaksi viikkoa. Kontrolliryhmä sai steriiliä suolaliuosta injektiota samassa tilassa. Eläimiä seurattiin tuumorin koon 4 päivän välein. Kasvaimen tilavuus (mm

3) laskettiin seuraavan yhtälön avulla: Volume = leveys

2 x pituus /2 [28], [41]. Kaikki hiiret lopetettiin kolmen viikon kuluttua hoidon aloittamisesta, ja tuumorit poistettiin ja punnittiin. Kasvaimen kasvun esto laskettiin kaavalla: tuumorikasvun inhibitio suhde = (1-kasvainten keskimääräinen paino NJ001 ryhmässä /kasvainten keskimääräinen paino vertailuryhmässä) x 100%. Hoito myrkyllisyys arvioitiin fysikaalisen eläimistä.

H & E-värjäys

Kudokset saadut kiinnitettiin 10% formaliinilla ja upotettiin parafiiniin. Sulautettu kudokset myöhemmin leikattiin 4 um: n leikkeiksi ja asetetaan lasi dioja H & E-värjäystä.

apoptoosimäärityksessä

SPC-A1-solut ympättiin 12-kuoppaiseen levyyn 1 × 10

5 solua kuoppaa kohti. Yön yli inkuboinnin jälkeen, SPC-A1 soluja viljeltiin kanssa tai ilman 200 ug /ml NJ001 tai MCA2849 24 h ja 48 h. Kunakin ajankohtana testattiin kolmena kappaleena. Morfologiset muutokset jälkeen solut havaittiin ja apoptoosin määritettiin virtaussytometrialla. Lyhyesti, solut kerättiin, pestiin PBS: llä ja resuspendoitiin 500 ul: aan sitovaa puskuria, joka sisälsi 10 mmol /l HEPES-NaOH: ta (pH 7,4), 140 mmol /l NaCI: a, ja 2,5 mmol /L CaCl

2. Seuraava, 5 ui anneksiini V-FITC: tä (Bender MedSystems, Itävalta) ja 5 ui propidiumjodidia (PI) liuos (Bender) lisättiin ja soluja inkuboitiin sitten pimeässä 15 min. Fluoresenssi analysoitiin sitten virtaussytometrialla.