Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

microRNA-200 perhe osallistuu ylläpito epiteelin fenotyypin ja menetys sen ilmentymistä voi aiheuttaa epiteelin ja mesenkymaalitransitioon (EMT). Lisäksi menetys ilmentymisen miR-200 perheenjäsenten liittyy aggressiivista syövän fenotyyppi. Sääntely miR-200 perheen ilmentyminen normaaleissa ja syöpäsolujen ei ole täysin ymmärretty.

Menetelmät /Principal Havainnot

Epigeneettiset mekanismit osallistuvat valvontaan miR-200c ja miR-141 ilmentyminen sekä normaali ja syöpäsolujen. CpG saaren lähellä ennustettua mir-200C /mir-141 transkription aloituskohdasta näyttää silmiinpistävää korrelaatiota miR-200c ja miR-141 ilmaisun ja DNA: n metylaation sekä normaaleissa ja syöpäsolujen, määritettynä MassARRAY tekniikkaa. CpG Saari on metyloitumaton ihmisen miR-200 /miR-141 ilmentävien epiteelisolujen ja miR-200C /miR-141 positiivisia kasvainsoluja. CpG Saari on voimakkaasti metyloitu ihmisen miR-200C /miR-141 negatiivinen fibroblastit ja miR-200C /miR-141 negatiivinen syöpäsoluja. Hiiren solut osoittavat vastaavaa käänteinen korrelaatio DNA: n metylaation ja miR-200c ilmentymistä. Rikastaminen salliva histonimodifikaation, H3 asetylaatio ja H3K4 trimethylation, nähdään normaaleissa miR-200C /miR-141-positiivisten epiteelisolujen, määritettynä kromatiinin immunosaostuksella kytketty reaaliaikainen PCR. Sen sijaan, tukahduttava H3K9 dimetyloimalla merkit ovat läsnä normaalissa miR-200C /miR-141-negatiivinen fibroblastit ja miR-200C /miR-141 negatiivinen syöpäsolujen ja salliva histonimodifikaation ovat poissa. Epigeneettisenä muokkaaja lääke, 5-atsa-2′-deoksisytidiini, aktivoi miR-200C /miR-141 ilmaisu osoittaa, että epigeneettisellä mekanismit olla toiminnallinen rooli niiden transkription valvonta.

Johtopäätökset /merkitys

Kerromme että DNA: n metylaatio on rooli normaalissa solutyyppispesifiselle ilmentymistä miR-200c ja miR-141 ja tämä rooli näyttää evolutionarily säilytetty, vaan samanlaisia ​​tuloksia saatiin hiiren. Poikkeava DNA metylaatio miR-200C /141 CpG saari liittyy läheisesti niiden sopimatonta hiljentäminen syöpäsoluissa. Koska miR-200c klusteri on merkittävä rooli EMT, tulokset viittaavat siihen, tärkeä rooli DNA: n metylaation kontrolliryhmässä fenotyyppisten tulosta normaaleissa soluissa.

Citation: Vrba L, Jensen TJ, Garbe JC, Heimark RL, Cress AE, Dickinson S, et ai. (2010) Rooli DNA Metylointi asetuksessa Mir-200c ja miR-141 ilmentäminen Normaali ja syöpäsoluja. PLoS ONE 5 (1): e8697. doi: 10,1371 /journal.pone.0008697

Toimittaja: Catherine M. Suter, Victor Chang Sydämen Research Institute, Australia

vastaanotettu: 13 lokakuu 2009; Hyväksytty: 21 joulukuu 2009; Julkaistu: 13 tammikuu 2010

Copyright: © 2010 Vrba ym. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Grants R01CA65662 että BWF tukenut tätä työtä. Centerin Avustukset P30ES06694 ja P30CA023074 ja BIO5 tieteidenvälistä biotekniikan keskuksessa UA tukenut Genomics palvelukeskuksen. J.C.G. ja M.R.S. tukivat NIH U54 CA112970, DOD BCRP BC060444, ja Office of Energy Research, Office of Health and Biological Research, US Department of Energy alle sopimuksessa nro DE-AC03-76SF00098. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

miRNA ovat yksijuosteisia, 20-24 nt pitkä RNA: ita, jotka säätelevät geenin ilmentymistä on posttranskriptionaalisella tasolla. miRNA usein kohdistaa 3 ’UTR mRNA, ja koska miRNA kohde kuviot eivät edellytä täydellistä homologiaa, satoja mRNA tavoitteet voivat olla kullekin miRNA. Nykyiset arviot ovat, että on olemassa lähes 900 ainutlaatuisia miRNA koodattu ihmisen perimässä, ja nämä miRNA ohjaus, osittain ilmentymisen yli kolmasosa ihmisen geenien [1]. Useat miRNA väärin säädellystä ihmisen syövässä on osoitettu olevan onkogeenisia tai tuumoria tukahduttavan aktiivisuuden [2], [3], [4]. Näihin kuuluvat miRNA lajit, jotka ovat spesifisiä solutyypin ekspressiokuviot, joista jotkut ovat tärkeitä ylläpito solun tunnisteen [5], [6]. Tämäntyyppiset miRNA ovat ensisijassa epigeneettiset valvontaa, ja varhainen tutkimukset miRNA-ohjaimen tuki tätä mahdollisuutta [7], [8].

miR-200c ja miR-141 ovat jäseniä miR-200 perhe ja ovat tärkeitä säätelijöitä epiteelin ja mesenkymaalitransitioon (EMT) [5], [9], [10], [11]. Sen lisäksi, että asema miR-200c ja miR-141 fenotyyppisten muuntaminen normaalien solujen, dysregulaatio normaaleille miR-200c ilmentyminen tapahtuu useita syöpäsolujen ja liittyy kasvaimen etenemistä [2], [6] , [12], [13], [14], [15]. Mekanismi vastaa valvonnasta miR-200c ilmentymistä sekä normaaleissa ja syöpäsolujen ei ole täysin ymmärretty. Tässä tutkimuksessa osoitetaan, että epigeneettiset tila liittyy läheisesti normaalia solutyypin erityinen ilmaisu miR-200c ja miR-141, ja tämä epigeneettiset tila väärin säädellystä karsinoomassa soluissa, joissa menetys miR200c /141 ilmentyminen liittyy poikkeava DNA metylaatio ja histonimodifikaation. Lopuksi löysimme että miR-200c sääntelyn DNA metylaatio evoluutiossa konservoitunut ihmisellä ja hiirillä. Koska miR-200c on merkittävä rooli EMT, tulokset viittaavat siihen, että DNA: n metylaatio on tärkeä rooli valvonnassa fenotyyppisten tuloksia normaalien ja syöpäsolujen.

Tulokset ja keskustelu

miR -200 perhe koostuu viidestä miRNA, joita koodaa kahden klustereita. Jokainen klusterin koodaa polykistroniseen geeniä. Yksi ryhmä sijaitsee ihmisen kromosomissa 1 ja koodaa miR-200b miR-200a, ja miR-429, kun taas toinen ryhmä sijaitsee ihmisen kromosomissa 12, ja koodaa miR-200c ja miR-141. Pieni RNA kirjasto sekvenointitulosten (kuvio 1A) osoittavat, että miR-200 perhe on erittäin ilmaistaan ​​viljellyissä normaalin ihmisen rintarauhasen epiteelisolujen (HMEC) johdettu kolmesta eri henkilöitä, kun taas isogeenisissä ihmisen rintarauhasen fibroblastisoluja (FB) puuttuu miR-200 perheen ekspressio (kuvio 1A). Se ilmenee pieniä RNA-kirjasto sekvensointi tiedot (kuvio 1A) että eniten ilmaistuna jäsenet miR-200 perheen HMEC ovat miR-200c ja miR-141. Me vahvistivat ilmaus miR-200c ja miR-141 samalla joukko normaalin rintarauhasen näytteiden reaaliaikaisella PCR, ja sitten laajeni näiden tulosten paria epiteelisolujen ja fibroblastien eturauhasen ja ihoa sekä (kuvio 1 B, kuvio S1). Kaikissa tapauksissa, miR-200c ja miR-141 olivat erittäin ilmaistaan ​​epiteelisoluissa, mutta joita ei ole ilmaistu fibroblasteissa.

. miR-200 perheen ilmaisun mukaan massiivinen rinnakkaissekvensointijärjestelmät pienten RNA-kirjastojen asettaa kolme isogeeninen paria ihmisen rintarauhasen epiteelisolujen (HMEC) ja fibroblasteissa (FB). Ilmaisu on mir-200b-200a-429 klusteri sijaitsee ihmisen kromosomissa 1, ja ilmaus mir-200c-141 klusteri sijaitsee ihmisen kromosomissa 12 on esitetty. Kun keskimäärin 63829 laskee ulos 3.926.984 kohti kirjaston HMEC, miR-200c muodostaa 1,625% kaikista pieniä RNA: iden näissä soluissa. B. Reaaliaikainen PCR arviointi miR-200c ilmentyminen normaaleissa solutyypeissä. Vasemmassa paneelissa näkyy ilmentymisen miR-200c samoista näytteistä kuin paneeli A. näkyy ruudun oikeassa reunassa ilmentymistä miR-200c ihmisen eturauhasen epiteelisolujen (PREC), eturauhasen strooman fibroblasteja (PSF), ihmisen ihon keratinosyyttejä (Kcytes) ja ihon fibroblastit (HFF). Aineisto on normalisoitu suhteessa anna-7a, joka on ilmaistu vastaavilla tasoilla eri näytteiden mukaan pieniä RNA-sekvensoinnilla tietoja. Reaaliaikainen PCR-analyysi miR-141 ilmentymistä näistä näytteistä on esitetty kuviossa S1.

mir-200c hiusneula koodaavan sekvenssin ja noin 300 emäsparia ylävirtaan genomisekvenssin on CpG rikas. Mukaan meidän laskelmat ohjelmaa CpG Cluster [16] Tämä alue on erittäin tilastollisesti merkitsevä CpG klusteri (kuvio 2A). Tämä CpG klusteri (pituus 334 emäsparia, GC% 68,56, O /E-luku 0,58, 21CpGs, p-arvo 8,44 x 10

-11) on ominaisuuksiltaan lähes CpG Island määritelmä koon perusteella, GC-pitoisuuden ja CpG taajuus [17], sekä sen sijainti suhteessa transkription yksikköön [18]. Lisäksi, tällä alueella pidetään CpG-saarekkeen, joka perustuu äskettäin julkaistussa todennäköisyyksiin määritelmä [19]. Analysoimme tätä aluetta mahdollisena kohteena epigenetic valvontaa.

. Kaavio genomisen alueen HSA-mir-200c. Yläpalkki näyttää erityisiä fragmentteja analysoitiin MassARRAY. Punainen fragmentit nimetty CpG sivustoja osoittaa fragmentit, josta DNA: n metylaatio tiedot saatiin. Nämä tiedot on esitetty paneeli B. Tämän alapuolella on alue, analysoitiin MassARRAY suhteessa genomisen sijainnin (sininen), jonka jälkeen alueen reaaliaikainen PCR-amplikoni ja kromatiinin immunosaostusanalyysille (ChIP), ja CpG-saarekkeen tunnistettu ohjelman CpGcluster. Alueet koodaava mir-200c ja mir-141 hiusneuloja ja oletetun transkription aloitus (TSS) alue päätellä ihmisen EST kirjaa UCSC genomin selaimen näytetään, ja kunkin ympyrän tällä radalla edustaa asemaa CpG. Hallitsija alareunassa näyttää sijainnin ihmisen kromosomissa 12 mukainen ihmisen genomin kokoonpano hg18. B. Yhteenveto 5-metyylisytosiinin tasot saadaan MassARRAY analyysi HSA-mir-200c-CpG-saarekkeen näytteistä tunnettu kuviossa 1B. Y-akseli esittää prosenttia sytosiinin metylaation yksittäisten CpG yksiköt on merkitty x-akselille. CpG yksiköistä MassARRAY amplikonin on numeroitu päinvastaiseen suuntaan, jossa CpG 2 sijaitessa miR-200c koodaussekvenssin.

epigeneettiset tila miR-200C /141 CpG-saarekkeen selviä ja laaja solutyyppispesifisiä eroja normaalin miR-200C /141-positiivisia ja miR-200C /141-negatiivisia soluja. Käytimme MassARRAY teknologiaa analysoida DNA metylaatiotilaa MIR-200c klusteri-CpG-saarekkeen (kuvio 2B). Tulokset osoittavat, että CpG sivustot ovat metyloitumattomia kolmessa erillisessä kantoja miR-200C /miR-141-positiivisia HMEC. Sen sijaan kaikki CpG sivustot ovat erittäin metyloitavaa isogeenisissä miR-200C /miR-141-negatiivinen fibroblastien kantoja. Käänteinen korrelaatio miRNA ekspression ja DNA: n metylaation ulottuu muihin miR-200c /miR-141-positiivinen /negatiivinen paria normaalien solujen, kuten eturauhasen epiteelisolujen ja ihon keratinosyyttien ja niiden mesenkymaalisten solujen tyyppi kollegansa, eturauhasen ja ihon fibroblasteissa. Siten miR-200c klusteri CpG saari on metyloitumaton normaalissa miR-200C /miR-141-positiivisten epiteelisolujen, samalla tiheään metyloitavaa pariksi normaalissa miR-200C /miR-141-negatiivinen fibroblasteissa (kuvio 1 B, kuvio 2B, Kuva S2).

miR-200c ja miR-141 ilmentyminen menetetään erityyppisissä syöpäsoluja [5], [11], [20], [21], ja pyrimme onko tämä tappio ilmaisun liittyi epigeneettiset muutokset miR-200C /miR-141-CpG-saarekkeen. Analysoimme 11 rintasyövän solulinjoissa, ja kussakin tapauksessa, miR-200c ja miR-141 ilmentyminen liittyy läheisesti DNA metylaatio tila CpG-saarekkeen (kuvio 3A, kuvio S3). Seitsemän rintasyövän solulinjat testattiin express miR-200c ja miR-141 ja jokainen on metyloimattoman mir-200c-CpG-saarekkeen. Muut neljä rintasyövän solulinjat testattiin eivät ilmennä miR-200c ja miR-141 ja näytteille tiheään metyloitu mir-200c-CpG-saarekkeen. Vastaava kuva muodostuu suhteessa syöpäsolujen. Osoitamme kaksi eturauhassyövän solulinjoissa (PC3 ja PC3 B1), jossa menetys miR-200c ja miR-141 ilmentyminen liittyy poikkeava DNA: n metylaatio on mir-200c /141-CpG-saarekkeen (kuvio 3B, kuvio S3), ja kaksi eturauhasen syöpäsolun linjat (LNCaP ja DU145), jotka säilyttävät miR-200C /miR-141 ilmaisun ja metyloimattoman mir-200C /141 CpG-saarekkeen. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että syöpäsoluja, jotka ovat peräisin normaalista miR-200c /miR-141-positiiviset epiteelisolujen voi replikoitua solutyyppi-spesifisen DNA: n metylaatio miR-200c /141-CpG-saarekkeen nähdään normaaleissa miR-200c /miR-141 -negatiivinen soluja, ja että poikkeava DNA metylaatio miR200c /141-CpG-saarekkeen näissä syöpäsoluissa liittyy sen transkription hiljentämisen masoluja.

. miR-200c ilmaisun ja mir-200C-CpG-saarekkeen metylaation yhdessätoista rintasyövän solulinjoissa. B. miR-200c ilmaisun ja mir-200C-CpG-saarekkeen metylaation neljässä eturauhassyövän solulinjoissa. Yläpaneelissa kunkin kuva esittää ilmentymisen miR-200c syöpänäytteissä havaittuna reaaliaikaisella PCR: llä, normalisoitu päästää-7a. Alapaneelissa näyttää metylaatio taso mir-200c CpG saarialuetta samassa syöpänäytteissä. Taso metylaatio yksittäisten CpG yksiköistä MassARRAY amplikoni näkyy lämpökarttana on pienin metylaation keltaisella ja korkein metylaation sinisellä. Y-akselilla merkitsee yksittäisten CpG yksiköitä.

osoittamiseksi toiminnallinen merkitys epigeneettisenä tilan miR-200c /mir-141-CpG-saarekkeen syöpäsoluissa, olemme alttiina syöpäsolujen epigeneettisenä modifier ja DNA-metyylitransferaasin inhibiittori 5-atsa-2′-deoksisytidiini (5-ADC). MIR-200c /miR-141-rintasyöpäsolujen solulinjat MDA-MB-231 ja BT549 ja eturauhassyövän solulinja PC3 käsiteltiin 3 uM 5-ADC 96 h ja miR-200c /141 ilmentyminen arvioitiin real- PCR. Kuvio 4 esittää 5-AdC uudelleen miR-200c ilmentyminen kaikissa kolmessa syöpäsolulinjoissa. Taso miR-200c kasvoi 4,3-kertaiseksi MDA-MB-231 (p-arvo = 0,0004), 6,4-kertaisesti BT549 (p-arvo = 0,0107) ja 4,2-kertaisesti PC3-soluissa (p-arvo = 0,0072) . Samanlainen aktivoituminen miR-141 lauseke (p-arvo 0,01) havaittiin myös näissä syöpäsolulinjoissa jälkeen 5-AdC hoito (kuva S4). Nämä tiedot viittaavat siihen, että epigeneettisiä mekanismit osallistuvat sopimatonta tukahduttaminen miR-200c /miR-141 ekspressio syöpäsoluissa.

Soluja käsiteltiin 3 uM 5-atsa-2′-deoksisytidiinin 96 tuntia. Taso ilmentymisen miR-200c mitattiin reaaliaikaisella PCR: llä. Keskimääräinen 4 yksittäisen näytteen näkyy, virhepalkkien osoittavat mittauksen keskivirhe. Arvot normalisoitiin käsittelemättömiin kontrolleihin (100%). Kuva S4 esittää 5-atsa-2′-deoksisytidiini välittämää aktivoituminen miR-141 samoissa näytteissä.

histonimodifikaation tila mir-200c klusteri-CpG-saarekkeen osoittaa myös solun tyyppihyväksynnän erot, jotka liittyvät läheisesti ilmentymisen tilan miR-200C /141 normaaleissa ja syöpäsoluissa. Kuvio 5 esittää tulokset kromatiinin immuunisaostukset kytketty kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR-analyysi, joita käytettiin tutkimaan histonimodifikaation tilan miR-200c /141-CpG-saarekkeen normaaleissa ja syöpäsoluja. CpG saari mir-200C /141 kolmessa eri kantoja miR-200C /miR-141-positiivisia HMEC olemassa kopiointia toimivaltaisen valtion; se on rikastettu varten kopiointia salliva muutoksia histoni H3 asetylointi (H3Ac) ja lysiiniä 4 trimethylation (H3TriMeK4), kun taas kopiointia tukahduttava Histonimerkki histoni H3 lysiinin 9 dimetyloimalla (H3DiMeK9) on aliedustettuna (kuva 5). Sen sijaan isogeenisissä miR-200C /miR-141-negatiivinen rintarauhasen fibroblastit salliva histonimodifikaation ovat poissa, ja tukahduttavaa H3 lysiinin 9 dimetyloimalla merkki on läsnä (kuvio 5). Samoin rintasyövän solulinjat, jotka olivat menettäneet miR-200C /141 ilmaisu menetetty histoni H3 asetylaatio ja K4 trimethylation ja hankkinut tukahduttavaa histoni tilassa, rikastettu H3 lysiinin 9 dimetyloimalla merkki (kuva 5). Ei rikastuminen trimethylation histoni H3 lysiinin 27 havaittiin miR-200C /141 CpG saari tutkitusta näytteestä (kuvio S5). Yhdessä tulokset analyyseistä miR-200C /141 ilmaisua, DNA: n metylaatio, ja histonimodifikaation valtioiden monelta normaalin ja syöpäsolutyyppien osoittaa läheinen yhteys ilmentymisen mir-200C /141 ja epigeneettiset tila niihin liittyvät CpG-saarekkeen.

Salliva histonimerkkien edustaa asetylaatio histoni H3 (H3Ac) ja trimethylation lysiiniä 4 histoni H3 (H3TriMeK4) sekä tukahduttava Histonimerkki dimetyloimalla lysiiniä 9 histoni H3 (H3diMeK9 ) analysoitiin käyttämällä kromatiinin immunosaostuksella, joka on kytketty real-time PCR alueen kuvattu kuviossa 2A. HMEC näytteet näkyvät vihreinä, isogeenisiin FB näytteet näkyvät punaisina, ja kaksi miR-200-negatiivinen rintasyöpä solulinjat ovat sinisiä. Y-akseli esittää kertainen rikastaminen kunkin Histonimerkki yli tulo DNA sisällä mir-200c-CpG-saarekkeen.

Lopuksi pyrittiin määrittämään, jos epigeneettiset sääntelyn miR-200c ilmentyminen normaaleissa soluissa on säilytetty evoluutiossa, päättely, että DNA: n metylaatio sidottu valvonta miR-200c ilmaisumuotoja yli nisäkäslajeja antaisi edelleen kokeellista tukea epigeneettisellä valvonta solutyyppispesifisten ilmentymistä miR-200c. Koko genomista klusteri joka sisältää mir-200c ja mir-141 on hyvin konservoitunut ihmisen ja hiiren genomissa. Samanlainen ihmisen mir-200C /141 genomin alueella, hiiren mir-200C /141 genomin alueella sisältää myös CpG-saarekkeen (kuvio 6A; pituus 325 emäsparia, GC% 66.77, O /E-luku 0,58, 19 CpG: t, p-arvo 1,06 × 10

-10). Arvioida mahdollinen rooli DNA: n metylaation valvonnassa miR-200c /141 hiirillä, CpG metylaatio ja miRNA ilmentyminen analysoitiin hiiren epiteelisoluissa (orvaskeden SKH-1 hiiren ja keratinosyyttisolulinjoissa 308 ja 6R90) ja hiiren fibroblasteissa ( solulinjat NIH 3T3, NIH 3T6, ja NR6). MassARRAY Amplikoni, jossa analysoidaan DNA metylaatiotilaa hiiren mir-200c /141 alueen homologinen analysoidaan ihmisen (kuvio 6A). Hämmästyttävän samanlaiset tulokset miR-200c välillä havaittiin ihmisen solujen ja hiiren soluissa. Hiiren keratinosyyttejä ilmaistuna merkittäviä määriä miR-200c, kun taas hiiren fibroblasteissa ei näihin havaittavia tasoja miR-200c (kuvio 6B). DNA: n metylaatio analyysi MassARRAY kävi ilmi, että miR-200c-positiivisia keratinosyyttejä oli minimaaliset DNA metylaatio mir-200c-CpG-saarekkeen, kun taas miR-200c-negatiivinen hiiren fibroblasteissa osoittivat laaja DNA: n metylaatio kaikkien CpG sivustoja alueella (kuvio 6B) . Merkittävä suojelun DNA-sekvenssin, malleja solutyyppispesifiselle DNA: n metylaatio, sekä niihin liittyvät miR-200c ekspressiokuvioiden välillä ihmisen ja hiiren genomeja, jotka on erotettu 75 miljoonalla vuosien evoluution [22], antaa näyttöä, että epigeneettiset mekanismit pelata toiminnallinen rooli valvonnassa miR-200c ilme.

. Kaavio hiiren MMU-mir-200c genomista välein. Yläpalkki näyttää alueen analysoitiin MassARRAY. Alueet koodaava hiusneulat of mir-200c ja mir-141 ja oletetun transkription aloitus (TSS) päätellä hiiren EST raita näkyy UCSC genomin selain näkyvät, ja kunkin ympyrän tällä radalla edustaa sijainti on CpG. Samanlainen ihmisen HSA-mir-200c, hiiren mmu-mir-200C sisältää CpG-saarekkeen, tunnistaa ohjelman CpG Cluster. Hallitsija alareunassa näyttää sijainnin hiiren kromosomissa 6 mukainen genomiin kokoonpanoon mm9. Geenit koodataan (-) lohkon. B. Hiiren solut osoittavat vastaavaa solutyyppispesifisellä kuvio miR-200c ilmaus ihmisen soluja, ja tämä ilmaisu liittyy DNA: n metylaation tilan CpG-saarekkeen. Vasemmassa paneelissa esitetään ekspression miR-200c hiiren epiteelisoluissa (308, 6R90, SKH-1 epidermis) ja hiiren fibroblastisolulinjat (NIH 3T3, NR6, NIH 3T6) havaittuna reaaliaikaisella PCR: llä. Oikea paneeli esittää metylaatio taso mir-200c CpG saarialuetta samalla hiiren näytteistä. Taso metylaatio yksittäisten CpG yksiköistä MassARRAY amplikoni näkyy lämpökarttana on pienin metylaation keltaisella ja korkein metylaation sinisellä. X-akseli merkitsee yksittäisten CpG yksiköitä. CpG yksiköt MassARRAY amplikonin on numeroitu päinvastaiseen suuntaan, jossa CpG 1 sijaitessa miR-200c koodaussekvenssin.

Yhteenvetona havaintomme tarjoavat useita rivejä todisteita siitä, että epigeneettiset mekanismit osallistuvat sääntely miR-200C /141 ilmentymistä sekä normaaleissa ja syöpäsoluja. Ensinnäkin on johdonmukainen käänteinen korrelaatio ilmaisu ja DNA: n metylaation valtioiden normaaleissa ihmisen ja hiiren solu- tyyppejä, samoin kuin ihmisen rinta- ja eturauhassyövän solulinjoissa. Toiseksi, eri histoni-koodien välillä on miR-200c /141 ilmentävien että ei-ilmentävien solujen että tarkasti peili ja ilmentävät DNA: n metylaation todetaan. Kolmanneksi epigeneettiset muokkaaja 5-atsa-2′-deoksisytidiinin vapauttaa tukahduttaminen miR-200C /miR-141 syöpäsolulinjoissa. Neljänneksi välinen yhteys DNA: n metylaation ja ilmaisun valtioiden tapahtuu koko nisäkäslajeista, koska se nähdään ihmisen ja hiiren. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että miR-200C /141 on evoluutiossa säilyneitä epigeneettiseltä labiili miRNA klusteri.

häiriöstä miR-200c ja miR-141 ilmenee useissa syöpätyypeissä [5], [11], [ ,,,0],20], [21], [23], [24], [25], [26], ja tämä säätelyhäiriö liittyy kompromissi epigeneettiset tilan CpG-saarekkeen liittyy miR-200c ja miR141. Tulokset viittaavat siihen, että nämä karsinoomasoluja voi osallistua opt

de novo

DNA: n metylaation reittejä mukana epigeneettiset valvonnassa normaali solutyyppispesifiselle geenejä, kuten ne, jotka ohjaavat epigeneettiset tila miR-200C /miR-141 . Samanlainen näennäinen yhteistyön mahdollisuus solutyyppispesifisiä DNA: n metylaatio väylät syöpäsolut nähdään myös proteiinia koodaavan geenejä, kuten

maspiini

ja

14-3-3 sigma

[27] , [28]. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että väyliä vastuussa perustamista tai ylläpitoa normaalin solutyyppispesifiselle DNA metylaatio valtiot voi olla häiriö aikana syövän syntymistä.

Koska miR-200c ja miR141 tärkeä rooli EMT ja siksi solun identiteetti, keskeytyminen ohjaavien mekanismien solutyyppispesifisiä DNA metylaation aikana syövän synnyn voisi todennäköisesti vaikuttaa ilmaus miR-200c ja miR141 ja antaa fenotyyppinen plastisuus syöpäsoluihin. Tätä mahdollisuutta tukevat tulee fenotyypit syöpäsolujen analysoitiin tässä tutkimuksessa. Kaikki neljä rintasyövän solulinjoissa menetti miR-200c ja miR-141 ilmaisu on poikkeavasti metyloitua mir-200C /141 CpG-saarekkeen, ja jokainen näistä solulinjoista näyttää mesenkymaaliset fenotyyppi [11], [29]. Sen sijaan ne rintasyövän solulinjat, jotka ilmentävät miR-200c ja miR-141 ja on metyloimattoman CpG-saarekkeen näyttää epiteelin fenotyyppi [11], [29]. Samanlainen kuva muodostuu eturauhasen syöpäsolun linjat. PC3-solut, jotka ovat menettäneet miR-200c ja miR-141 ilmaisua, näyttää poikkeavasti metyloitua CpG saari ja mesenkymaaliset fenotyypin, kun taas LNCaP ja DU145 säilyttää miR-200c ja miR-141 ilmaisun ja epiteelin fenotyyppi [11], [30] . Nämä tulokset viittaavat siihen, että DNA: n metylaatio voi ohjata fenotyyppiset muutokset havaitaan syöpäsoluja.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja soluviljelmä

Finite elinikä pre-stasis HMEC maasta yksilöt 184 (erä D), 48R (erä T), ja 240L (erä B), olivat peräisin vähentäminen mammoplasty kudoksesta vuotiaiden naisten 21, 16, ja 19 vastaavasti. Solut aloitettiin organoids primääriviljelmässä seerumin sisältävässä M85 väliaineessa täydennettynä oksitosiinin (Bachem) 0,1 nM, ja ylläpidetään M87A väliaineessa täydennettynä oksitosiinin ja koleratoksiinin 0,5 ng /ml [31]. Fibroblasteista näytteet 184, 48, ja 240 L saatiin sama alennus mammoplasty kudosten ja kasvatettiin DMEM /F12, jossa oli 10% FBS ja 10 ug /ml insuliinia [31] ja edelleen kasvatettiin DMEM /F12, jossa oli 10% FBS: ää. Eturauhasen epiteelisolut saatiin Clonetics (San Diego, CA), ja sikiön ihon keratinosyyttejä Cell Applications (San Diego, CA) ja kasvatettiin mukaisesti toimittajien ohjeita. Ihmisen esinahan fibroblasteja (HFFS) ylläpidettiin ja viljeltiin jonka Arizona Cancer Center Cell Culture Shared Service. Ihmisen eturauhasen strooman fibroblasteissa (PSF) olivat viljeltiin kuten aiemmin on kuvattu [32]. Rintasyövän solulinjat BT549, Hs578T, MCF7, MDA-MB-157, MDA-MB-231, MDA-MB-453, MDA-MB-468, UACC893, UACC1179, UACC2087, ja UACC3199 viljeltiin kuten aiemmin on kuvattu [33] , [34]. Eturauhassyöpäsolulinjoissa PC3, PC3 B1, LNCaP, ja DU145 [35], [36], [37] pidettiin RPMI 1640 -elatusaineessa, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia, jota oli täydennetty 100 yksiköllä /ml penisilliiniä ja 50 ug /ml streptomysiiniä. Hiiren keratinosyyttisolulinjoissa 308 ja 6R90 viljeltiin, kuten on kuvattu [38], hiiren fibroblastisolulinjat NIH 3T3, NIH 3T6 ja NR6 [39], [40], [41] pidettiin DMEM-alustassa, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia. SKH-1 hiiren orvaskesi näytteet poistettiin nestemäisellä typellä jäädytettiin selkäpuolen iholle kaapimalla kuivajäässä.

miRNA kirjasto valmisteluun, sekvensointi ja analyysi

Kokonais-RNA eristettiin käyttäen Trizol. Pieni RNA fraktio puhdistettiin 15% polyakryyliamidi-urea-geelissä. Preadenylated adapteri ligoitiin 3′-päähän pienen RNA, jota seuraa puhdistus ligaation tuote 15% PAA-urea-geelissä. Illumina erityisiä 5 ’adapteri ligoitiin ja tuote puhdistettiin 10% PAA-urea-geelissä. Pieni RNA Ligatoidun sovittimien käänteiskopioitiin DNA käyttämällä RT alukkeen Illumina erityisiä laajennus. Sitten cDNA monistettiin PCR: llä käyttämällä Illumina spesifisiä alukkeita ja PCR-tuote puhdistettiin 3% agaroosigeelillä. Pieni RNA kirjastot toimitettiin Illumina vuorottelusta NCGR (Santa Fe, NM). Lukee Illumina GAII oli kartoitettu hg18 ihmisen genomin kokoonpano käyttäen ohjelmaa Novoalign (www.novocraft.com). Tuotosta Novoalign edelleen analysoitiin R (https://www.r-project.org). Lukemat Yksittäisten miRNA normalisoitiin keskimääräinen kirjastokoko (3.926.984 määrä).

Nukleiinihappojen eristäminen

RNA eristettiin käyttämällä joko Trizol (Invitrogen) tai RNeasy Mini Kit (Qiagen) ja määrällisesti absorption mittauksia 260 nm: ssä. Perimän DNA eristettiin käyttäen DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen) ja kvantitoitiin spektrofotometrisesti.

Reaaliaikainen PCR havaitseminen miRNA

Reaaliaikainen PCR havaitseminen MikroRNA suoritettiin periaatteessa edellä kuvatulla [42]. Käänteistranskriptio suoritettiin käyttäen TaqMan Reverse Transcription Reagenssit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Reaaliaikainen PCR suoritettiin ABI Prism 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) käyttäen PERFECTA SYBR Green SuperMix-, Low ROX (Quanta Biosciences, Gaithersburg, MD, USA) 95 ° C denaturaatio 3 minuuttia, jota seurasi 40 sykliä 95 ° C 15 sekuntia ja 60 ° C: ssa 45 sekunnin ajan. Erot ilmentyminen määritettiin käyttäen vertailevaa Ct kuvattua ABI käyttöoppaasta suhteessa päästää-7a. Alukesekvenssit on esitetty taulukossa S1.

CpG-saarekkeen ennustuksen

CpG-saarekkeiden ennustettiin käyttämällä ohjelmaa CpGcluster [16]. Tämä ohjelma käyttää tilastollista lähestymistapaa etsi alueille merkittävää rikastumista CpG dinukleotidejä sijaan parametrien liukuvan ikkunan. Asetamme kynnys 50 (mediaani etäisyys) ja p-arvo cut 10

-8.

DNA: n metylaatio analyysi MassARRAY

DNA: n metylaatio analyysin MassARRAY tehtiin kuten [ ,,,0],43]. Alukesekvenssit on esitetty taulukossa S1.

5-atsa-2′-deoksisytidiinin hoidon

Soluja käsiteltiin 3 uM 5-atsa-2′-deoksisytidiini (Sigma, St Louis, MO , USA) 96 tuntia, kuten aiemmin on kuvattu [44].

Kromatiini immunosaostuksella

Kromatiini immoprecipitation (ChIP) analyysi suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [33], [45], [46] vasta-aineilla asetyloitua histoni H3 (# 06-599, Millipore), trimetyloidaan histoni H3 K4 (# 05-745, Upstate), dimetyloitujen histoni H3 K9 (CS200587, Millipore), ja trimetyloidaan histoni H3 K27 (# 07-449, Millipore ). Yhtä suuret määrät (1 ng) ChIP ja tulo-DNA: ta käytettiin reaaliaikaista PCR-analyysiä. Alukkeet suunniteltiin käytettäväksi Human Universal Probe Kirjasto Set (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA). Reaaliaikainen PCR suoritettiin ABI Prism 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) käyttäen Perfecta qPCR SuperMix-, Low ROX (Quanta Biosciences, Gaithersburg, MD, USA) 95 ° C denaturaatio 3 minuuttia, jota seurasi 40 sykliä 95 ° C 15 sekuntia ja 60 ° C: ssa 45 sekunnin ajan. Primer sekvenssit on esitetty taulukossa S1.

tukeminen Information

Kuva S1.

Reaaliaikainen PCR arviointi miR-141 ilmentyminen normaaleissa solutyypeissä. Vasemmassa paneelissa näkyy ilmentymisen miR-141 kolmella isogeeninen paria rintarauhasen epiteelisolujen (HMEC) ja maitorauhasen fibroblasteissa (FB). Oikeassa paneelissa näkyy ilmentymisen miR-141 ihmisen eturauhasen epiteelisolujen (PREC), eturauhasen strooman fibroblasteja (PSF), ihmisen ihon keratinosyyttejä (Kcytes) ja ihon fibroblastit (HFF). Aineisto on normalisoitu suhteessa anna-7a, joka ilmentyy yhtäläinen eri näytteiden mukaan pieniä RNA-sekvensoinnilla tietoja.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0008697.s001

(0,13 MB TIF)

Kuva S2.

DNA metylaatio mir-200c-CpG-saarekkeen kääntäen korreloi miR-200c ilmentyminen normaaleissa ihmisen näytteitä. Tämä luku on yhteenveto tiedoista esitetään kuviossa 1B ja 2B. Ylempi paneeli esittää ilmentymisen miR-200c havaitsee reaaliaikaisen PCR. Alapaneelissa näyttää metylaatio tason mir-200c CpG saarialuetta samalla ihmisen näytteitä. Taso metylaatio yksittäisten CpG yksiköistä MassARRAY amplikoni näkyy lämpökarttana on pienin metylaation keltaisella ja korkein metylaation sinisellä. Y-akseli merkitsee yksilön CpG yksiköitä.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0008697.s002

(0,19 MB TIF) B Kuva S3.

Reaaliaikainen PCR arviointi miR-141 ilmentymisen rinta- ja eturauhassyövän solulinjoissa. Vasemmassa paneelissa näkyy ilmentymisen miR-141 yhdessätoista ihmisen rintasyövän solulinjoissa. Oikeassa paneelissa näkyy ilmentymisen miR-141 neljän ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0008697.s003

(0,14 MB TIF) B Kuva S4.

miR-141 ilmentymistä syöpäsolulinjoissa aktivoidaan 5-atsa-2′-deoksisytidiini hoitoon. Soluja käsiteltiin 3 uM 5-ADC 96 h. Taso ilmentymisen miR-141 mitattiin reaaliaikaisella PCR: llä. Keskiarvo 4 mittausten näkyy, virhepalkkien osoittavat mittauksen keskivirhe. Arvot normalisoitiin käsittelemättömiin kontrolleihin (100%).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0008697.s004

(0,06 MB TIF)

Kuva S5.

Histoni H3 K27 trimethylation tilan mir-200c-CpG-saarekkeen.