Krooninen sairaus

tiivistelmä

Glyoxalase I (GLO1), joka on methylglyoxal vieroitus entsyymi, on sekaantunut etenemistä ihmisen syöpäsairauksia. Rooli GLO1 mahalaukun syövän kehittymisessä tai etenemisessä on tällä hetkellä epäselvä. Ilmentyminen GLO1 määritettiin ensisijainen mahasyövässä yksilöitä käyttämällä kvantitatiivista polymeraasiketjureaktio, immunohistokemia (IHC), ja Western blotting-analyysit. GLO1 ilme oli korkeampi mahasyövässä kudoksissa, verrattuna viereisillä noncancerous kudoksissa. Kohonnut ekspressio GLO1 oli merkitsevästi yhteydessä mahalaukun seinämän invaasio, imusolmuke etäpesäke, ja patologinen vaiheessa viittaa uutta roolia GLO1 mahasyövän kehittymisessä ja etenemisessä. 5 vuoden pysyvyys alemman GLO1 ilmaisua ryhmissä oli merkittävästi suurempi kuin korkeamman ilmaisun ryhmät (log rank

P

= 0,0373) in IHC kokeissa. Yli-ilmentyminen GLO1 mahasyövän solulinjoissa lisää solujen lisääntymistä, muuttoliike ja invasiivisuus. Toisaalta, alas-säätely GLO1 kanssa shRNA johti huomattavaan vähenemiseen muuttoliikettä ja invaasion kykyjä. Tuloksemme viittaavat vahvasti siihen, että korkea ilmentyminen GLO1 mahasyövän parantaa etäpesäkkeiden kyky syöpäsolujen

in vitro

ja

in vivo

, ja tukevat sen tehoa mahdollisena merkki havaitsemiseksi ja ennuste mahalaukun syöpä.

Citation: Cheng WL, Tsai MM, Tsai CY, Huang YH, Chen CY, Chi HC, et al. (2012) Glyoxalase-I on uusi ennuste Factor Associated mahalaukun syövän etenemisessä. PLoS ONE 7 (3): e34352. doi: 10,1371 /journal.pone.0034352

Editor: DunFa Peng, Vanderbilt University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 08 joulukuu 2011; Hyväksytty: 27 helmikuu 2012; Julkaistu: 29 maaliskuu 2012

Copyright: © 2012 Cheng et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia Chang-Keinutie University, Taoyuan, Taiwan (NMRPD 150311, NMRPD170441-42, CMRPG 640042-43, CMRPG 670291-93) ja National Science neuvosto Kiinan tasavallan (NSC 95-2314-B-182 -027, 97-2314-B-182-009-My2, 99-2314-B-182-022). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahasyöpä on neljänneksi yleisin syöpä ja toiseksi korkein syöpään liittyvää kuolleisuutta maailmanlaajuisesti [1]. Maligniteetti on kuudenneksi yleisin syy syöpään liittyvien kuolemien Taiwanissa [2]. Seulontaa voi helpottaa havaitsemista mahasyöpä ennen oireiden kehityksen parannettavissa vaiheessa [3]. Määrittäminen ilmentymisen profiilien keskeisten molekyylien useita reittejä mukana mahasyövässä etenemistä voi auttaa diagnoosi, ennuste ja ennustaminen syövän etenemisen.

Kasvaimen invaasio ja etäpesäkkeiden ovat elintärkeitä askelia määritettäessä aggressiivinen fenotyyppi ihmisen syövissä ja muodostavat pääasiallisen syövän syiden liittyvä kuolema [4]. Korkea ilmentyminen maahanmuuttoon liittyvät tekijät, kuten syklo-oksygenaasi 2 (COX-2) [5], endoteelikasvutekijä (VEGF) [6], CXC-kemokiini ligandi (CXCL) -8 [7], kemokiini (CXC-motiivin) -reseptorin (CXCR) -2, ja CXCL-1 [8], jotka liittyvät mahalaukun syövän etenemisessä. Useita mahdollisia onkogeeniset väyliä (lisäkasvu /kantasolu-, NF-KB, ja Wnt /β-kateniinin) on vapautettu useimmissa syöpien [9]. Siten edelleen selvittäminen tarkkaa molekyylitason tapahtumia, jotka johtavat syöpään etenemistä ja arvokkaiden diagnostisten tai prognostisia markkereita ja uusia terapeuttisia strategioita olisi kliinistä merkitystä.

Glyoxalase I (myös kutsutaan GLO1) on keskeinen osa on johtavia reittejä vieroitus Methylglyoxal (MG), joka on yksi sivutuotteiden glykolyysin [10], [11], [12]. GLO1 ilmentyminen lisääntyy useissa ihmisen paksusuoli-, rinta-, eturauhas-, ja melanooma [13], [14], [15], [16], [17]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat raportoineet, että yli-ilmentyminen GLO1 liittyy syövän etenemiseen ja lääkeresistenssin [17]. Meidän edellinen data, GLO1 säätelyyn ylöspäin havaittiin mahasyövässä yksilöiden käyttäen cDNA microarray [18]. Kuitenkin erityinen rooli GLO1 aikana mahalaukun kasvaimen kehittymisen ja sen kliinistä merkitystä vielä laadittu.

Kokeilumme osoittavat selvästi, että GLO1 on usein yli-ilmentynyt mahasyövän ja liittyy syövän etäpesäkkeitä. Erityisesti ilmaus GLO1 on merkittävästi suurempi pitkälle edennyt mahasyöpä. Lisäksi muutokset ilmaus GLO1 mahasyövän solulinjoissa vaikuttaa solujen vaeltaminen ja invaasion kykyjä.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

tutkimusprotokolla hyväksyi Medical etiikka ja Human Clinical Trial komitean Chang Gung Memorial Hospital (IRB NO. 95-0472B). Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta.

Oppiaineet

114 potilasta (64 miestä ja 50 naarasta, mediaani-ikä 66 vuotta välillä 28-86 vuotta) diagnosoitu mahalaukun syöpään Chang Gung Memorial Hospital 2000-2005 otettiin tässä tutkimuksessa. Kaikki potilaat saivat leikkauksen ensisijainen mahasyövän ilman edeltävää kemoterapiaa tai sädehoitoa. Kukin potilas altistettiin mahalaukun resektio (35 potilaalle tehtiin yhteensä gastrectomy ja 79 osittainen gastrectomy).

kliinis tutkimukset

resektoitiin näytteet tutkittiin patologisesti käyttäen kriteerit Japani yleiset säännöt mahasyövän Study [19] ja Amerikan sekakomitean Cancer (AJCC) (pTNM) luokitusjärjestelmä [20]. Kliinis parametrejä olivat potilaan ikä ja sukupuoli, kasvaimen sijainti ja koko, brutto (Borrmann n) kasvaimen tyyppi, seinä invaasio, resektio marginaali, histologinen tyyppi, imusolmuke etäpesäke, verisuonten invaasio, imusuonten invaasio, ja hermoa hyökkäystä. Kotiutuksen jälkeen, kaikilla potilailla oli ajoittain seurantakäynnit klo poliklinikalla Chang Gung Memorial Hospital, kunnes kuolema tai alkuun valmistelun tässä artikkelissa.

Reaaliaikainen kvantitatiivinen RT-PCR (qRT-PCR ) B

qRT-PCR suoritettiin kuten kuvattu aiemmassa raportissa [21]. Seuraavia alukkeita käytettiin: ihmisen

GLO1

qRT-PCR: llä (forward-aluke, 5′-TGAGGATAAAAATGACATCCCTA- AAGA-3 ’, ja reverse-aluke, 5′-TGTGTCAGCTCAAGTGTAGCTTTC-3′), ihmisen 18S rRNA qRT-PCR (forward-aluke, 5’-CGAGCCGCCTGGATACC-3 ’, ja reverse-aluke, 5′-CCTCAGTT CCGAAAACCAACAA-3’).

valmistus anti-GLO1 vasta-aineen

koodaava cDNA täyspitkää

GLO1

kloonattiin pGEX-4T1. Lysaatit

E. coli

BL21-kannan puhdistettiin kanssa glutationiagaroosihelmiin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Liukoiset proteiinit puhdistettiin käyttäen kromatografiaa, jossa glutationiagaroosihelmiin, mukaan valmistajan ohjeiden, emulgoitu adjuvanttiin, ja sitä käytettiin kaniinien immunisointiin. Polyklonaalisia vasta-aineita tuotettiin ja affiniteettipuhdistettua, kuten aiemmin on kuvattu [22]. Spesifisyys in-house GLO1 validoitiin käyttäen western blot-analyysi (kuva S1).

immunoblottianalyysi

kokosolulysaateista tumauutteet, ja ehdollinen media oli valmistettu ihmisen kudoksesta tai vakaa GLO1 knockdown solulinjat. Western blottaus suoritettiin käyttäen monoklonaalisia vasta-aineita ihmisen HIF-1α (Abcam, San Francisco, CA), p65 (Epitomic, Burlingame, CA), tai p50 (Millipore, Billerica, MA) tai polyklonaalisia vasta-aineita ihmisen GLO1 (in-house, laimennus, 1:500), CXCL1 (PeproTech. Inc., Rocky Hill, NJ), CXCL8 (R 0,05 pidettiin merkittävinä.

Tulokset

GLO1 mRNA ja proteiini tasot yläreguloituja mahasyöpäpotilaista

Käyttäen cDNA microarray, olemme tunnistaneet useita voimistunut geenit mahalaukun kudoksista, verrattuna viereiseen nontumorous kudoksiin [18]. Näistä geeneistä, keskityimme

GLO1

kuin molekyylikohteessa mahasyövän. Expression of GLO1 mitattiin syövän kudoksissa, ja niitä verrataan, että täsmäsi nontumorous mahan limakalvoa, käyttäen qRT-PCR: ää (n = 89) (taulukko 2) tai IHC (n = 114) (taulukko 1). Tiedot qRT-PCR kokeet paljastivat GLO1 yli-ilmentymisen (≥1.5-kertaisesti) 51 (57,3%) mahalaukun syövän kudoksissa verrattuna noncancerous kudoksiin. Keskimääräinen GLO1 ilmentyminen kasvaimen kudoksissa oli 2,87-kertainen in noncancerous kudoksissa. Tuloksemme vahvistivat merkittävä kasvu GLO1 ilmentyminen kasvaimen kudoksissa (

P

= 0,005, yhden otoksen Kolmogorov-Smirnov testi).

Expression of GLO1 proteiinin pariksi näytteistä oli edelleen analysoitiin western blotting. Kuva 1A esittää GLO1 ilmaisun kahdeksalla edustavasta potilaasta. Yhtä suuret määrät yhteensä proteiinien värjättiin Coomassie blue jälkeen SDS-PAGE käytettiin lastaus ohjaus. Kaikki syöpä kudoksia mahasyövän näytteistä (G1-G8) näytetään ilmen- tymisen lisääntymisen GLO1 ilme, verrattuna Hyväksytty noncancerous viereisen limakalvon (Fig. 1A).

yli-ilmentyminen GLO1 proteiinin mahakarsinoo-. (A) Western blot osoittaa, että läsnä on GLO1 proteiinin syöpäkudoksissa. GLO1 proteiinit yli-ilmentyy useimmissa tuumorikudoksissa (T), kun se täsmäsi noncancerous viereisen limakalvon (N). Kaikki syöpä kudoksia mahasyöpä yksilöt (G1-G8) näytetään säätelyä GLO1 verrattuna Hyväksytty noncancerous vieressä limakalvolla. Vastaavan määrän (30 ug) proteiinia lisättiin kunkin näytteen ja alistettiin 12% SDS-PAGE, jota seurasi värjäys Coomassie-sinisellä latauskontrollina. Kanin polyklonaalinen vasta-aine ihmisen GLO1 tuotetaan talon käytettiin. (B) Paneeli a, c, e, ja g kuvaavat noncancerous limakalvo, kun taas paneelit b, d, f, ja h esittävät mahasyövän kudoksiin. Positiivinen värjäys GLO1 on merkitty tumman ruskea väri. GLO1 ilmentyminen havaittiin etupäässä maha- syöpäsoluissa ja harvoin stroomasoluissa. Mittakaava edustaa 100 um.

Immunovärjäys osoittaa GLO1 proteiineihin-ilmentyminen mahalaukun syöpäkudokset

edelleen vahvistaa, onko GLO1 säätelyä korreloi kliiniseen etenemiseen mahasyövän, IHC suoritettiin parafiiniin kiinteän mahasyövässä kudosten ja Hyväksytty noncancerous limakalvon 114 potilasta. Neljä paria edustajan tapauksissa (a /b, c /d, e /f ja g /h), on esitetty kuviossa 1B. IHC tiedot noncancerous limakalvon kollegansa (a, c, e, ja g) ja syöpä kudoksiin (b, d, f, ja h) verrattiin pareittain. Tummanruskea immunovärjäys oli lähinnä yleistä syöpäsoluissa taas taso värjäys olivat alhaisempia stroomasoluissa tai fibroblasteja mahasyövän kudoksiin. Vahva värjäys GLO1 on usein havaittu pitkälle mahakasvaimen solut, toisin kuin vähän tai ei lainkaan värjäytymistä normaaleissa mahan epiteelisoluissa (Fig. 1 B, ylempi paneeli). Värjäys oli voimakkaampi on kehittynyt mahasyöpä vaiheiden [vaihe III kuviossa. 1B (f, h)], verrattuna vaiheissa I [Fig. 1B (b)] ja II [Fig. 1B (d)]. Niistä 114 potilasta analysoitiin, keskimääräinen IHC pisteet kasvainkudoksissa oli 139,8 ± 62,8, mikä oli merkittävästi suurempi kuin (36,7 ± 40,4) vastaavanvärisiin viereisen limakalvon (n = 87) (

P

0,001 , Wilcoxonin-rank-testi). Lisäksi pariksi vertailu immunoreaktiivisuus GLO1 (n = 87) osoitti, että IHC tulokset syöpäkudoksen olivat korkeammat kuin on nontumorous vastaavien 77 (88,5%) potilaista, yhtä potilasta (3,4%), ja alemman seitsemän potilaalla (8,0%).

GLO1 ilmaisun ja kliininen korrelaatio

GLO1 ilmentyminen kasvainkudoksessa ei merkittävästi liittynyt iän, kasvaimen sijainnin tai histologinen tyyppi (taulukot 1 ja 2). Korkeammalla GLO1 näkyivät T3 /T4 ryhmiä, joissa herakalvon pinta mahalaukun seinämän valtasivat syöpä, verrattuna että T1 /T2 ryhmissä, joissa ei invaasiota näkyi (

P

= 0.015 varten qRT – PCR ja

P

= 0,001 IHC, Fig. 2A, taulukot 1 ja 2). Expression of GLO1 oli merkittävästi lisääntynyt, metastasiaa imusolmukkeisiin (

P

= 0,001 qRT-PCR ja

P

0,001 IHC, Fig. 2B, taulukot 1 ja 2) . Korkeampi ilme näkyi potilailla, joilla lymfaattinen invaasio (

P

= 0,001 ja

P

= 0,016 varten qRT-PCR ja IHC vastaavasti, taulukot 1 ja 2) sekä hermoa invaasio (

P

= 0,024 varten qRT-PCR, taulukko 2). Lisääntynyt GLO1 ilmaisua ei liittynyt verisuonten invaasio tai kaukaisia ​​etäpesäkkeitä, myös vatsakalvon kylvö tai maksan etäpesäke, sekä qRT-PCR ja IHC kokeiluja. Expression of GLO1 oli merkittävästi suurempi potilailla, joilla kehittyneempien pathologic vaiheessa (III /IV) mahalaukun syövän, verrattuna aikaisemmassa patologi- vaiheissa (I /II) (

P

= 0,001 ja

P

0,001 qRT-PCR ja IHC, vastaavasti) (Fig. 2C, taulukot 1 ja 2).

(A) sirontakuvio mukaan syvyyteen seinän invaasio (

P

= 0,001, T1 /T2 vs. T3 /T4). (B) sirontakuvio mukaan imusolmuke etäpesäke (

P

0,001, N0 vs. N1-3). (C) sirontakuvio mukaan patologinen vaiheessa (

P

0,001, vaiheet I /II versus vaiheiden III /IV). (D) Kaplan-Meir eloonjäämiskäyristä kaksi ryhmää mahasyöpäpotilaista määritelty GLO1 ekspressiotaso raja-arvo 90, perusteella IHC pisteytys. 5 vuoden pysyvyys alemman ilmaisun ryhmät (n = 24) oli merkittävästi parempi kuin korkeamman ilmaisun ryhmät (n = 90; 69,6% vs. 43,3%; log rank

P

= 0,0373) .

Survival tulosten

keskimääräinen kesto seuranta-ajan 52 eloonjääneitä oli 70,4 kuukautta (vaihteluväli 28-119 kuukautta). Neljä potilasta kuoli leikkauksen jälkeisiä komplikaatioita ja kuusi muut syyt. Viisikymmentäkaksi potilasta kuoli johtuu mahalaukun syövän etenemisessä. Yleinen kumulatiivinen viiden vuoden eloonjäämisaste 114 potilaista oli 49,3%, kun gastrectomy. Määrittämään vaikutuksen GLO1 ilmaisun eloonjäämiseen lopputulokseen, potilas jaettiin kahteen ryhmään, korkeampi ja alempi ilmaisuja, mukaan kynnysarvon, joka osoittaa merkittävää eroa (log rank

P

0,05) eloonjäämisluvut välissä 2 ryhmien. Mediaani (= 140), yläkvartiili (= 180 tai 75

persentiilin), ja alakvartiili (= 90 tai 25

persentiilin) ​​IHC tulokset meidän potilaan alun perin testattiin määrittämään raja-arvot. Niistä vain alakvartiili voisi osoittaa merkitsevää eroa eloonjäämisen lopputulokseen. Kuva. 2D havainnollistaa kumulatiivinen eloonjäämiskäyrien potilaiden alemman ja korkeamman ilmaisun GLO1 ryhmään jaettuna mukaan sulku IHC pisteet 90. 5 vuoden pysyvyys alemman GLO1 ilmaisua ryhmissä oli merkittävästi suurempi kuin korkeamman ilmaisun ryhmiä ( 69,6% vs. 43,3%; log rank

P

= 0,0373) in IHC kokeissa. Univariate analyysi paljastaa useita merkittäviä ennustetekijät, kuten tila imusolmuke etäpesäke, kaukainen etäpesäke, vatsakalvon kylvö, verisuonten invaasio, imusuonten invaasio, syvyys invaasio, patologinen vaiheessa maksa etäpesäke ja hermoa invaasio lisäksi GLO1 ilme. Muut merkittävät muuttujat olivat histologinen tyyppi, kasvaimen koon, ja brutto tyypin (taulukko 1). Edelleen Monimuuttuja-analyysissä riippumattoman ennustetekijöitä vaikuttavia elossaololuku mukana imusolmuke etäpesäke (suhteellinen riski = 5,954, 95% CI = +1,183-+29,977,

P

= 0,031) ja kaukainen etäpesäke (suhteellinen riski = 2,464, 95% CI = 1,030-5,896,

P

= 0,043).

Yli-ilmentyminen GLO1 SC-M1 tehostaa solujen proliferaatiota, migraatiota ja invaasiota toimintaa.

vaikutusten määrittämiseksi yli-ilmentyminen

GLO1

SC-M1-solut, solujen proliferaatiota, migraatiota, ja invaasio toiminta testattiin. Kahden viikon kuluttua transfektion, stabiili ekspressio GLO1 proteiinin perustettiin. Kuvio 3A esittää 2,36-kertaiseksi ja 2,29 kertaa suurempi GLO1 ilme, vastaavasti. Solujen lisääntyminen määritettiin solujen laskenta ja ilmaistaan ​​taittaa valvonnan enintään viisi päivää.

GLO1

-overexpressing solut osoittivat merkitsevästi (

P

0,01) korkeampi lisääntymistä hinnat (1.86- tai 2.06-kertainen) kuin transfektoitu kontrollivektorilla päivänä 5 (Fig. 3B). Lisäksi

GLO1

-overexpressing soluilla merkitsevästi (

P

0,01) korkeampi siirtymänopeuksien (5.53- tai 4.57-kertainen) ja invasiivisia kyvyt (3.7- tai 3.47-kertainen) kuin niiden ohjaus kollegansa (kuviot. 3C ja D). Kuvia solutiheys oli esitetty kaksi ohjaus- ja kaksi yli-ilmentäviä solulinjoja (vasemmanpuoleiset paneelit kuvioissa. 3C ja D).

kaksi SC-M1-GLO1 over-kloonien (OG1 ja OG2), ja kaksi ohjaus solulinjoja (C1, C2) perustettiin. (A) ilmentyminen GLO1 määritettiin käyttämällä Western blot -analyysiä. β-aktiini on käytetty sisäisenä kontrollina. (B) Solujen lisääntyminen, (C) Migration, ja (D) Invasion kyvyt testattiin kuvatulla tavalla ”Materiaalit ja menetelmät”. Tulokset esitettiin taittuu ainakin kolmen erillisen kokeen suoritettiin päällekkäisiä. Taitteen muutokset (B-D), ja erot tutkittiin käyttäen Mann-Whitney U tapa verrata arvoihin vektorisäätötilassa. **

P

0,05.

Down-ilmentyminen GLO1 vuonna TSGH tai AGS solujen vähentää solujen vaeltamiseen ja invaasiota toiminta

Tulokset vahvistivat korkea ilmentymä GLO1 pitkälle mahasyövässä, verrattuna noncancerous mahan limakalvoa. Sen määrittämiseksi, onko GLO1 ilmentyminen liittyy invasiivisuus mahalaukun syövän solulinjat, vaikutukset GLO1 ehtyminen, joka käyttää lyhyen hiusneulan (sh) RNA plasmidit kasvainsolujen invaasio toimintaa TSGH tai AGS solut arvioitiin. ShRNA ekspressiovektoreita, jotka koodaavat antisense-GLO1-sekvenssi transfektoitiin TSGH ja AGS, jotka ilmentävät korkeita endogeenisten GLO1. GLO1 ilmentyminen oli merkittävästi tukahdutettu TSGH-KG1, -KG2 (0.32- ja 0,14-kertainen) ja AGS-KS1, -KS2 (0.26- ja 0,21-kertainen) alalinjoja, vastaavasti, verrattuna soluihin, jotka oli transfektoitu kontrollivektoreihin ( C1, C2, kuviot. 4A ja B). KG1 ja KG2 GLO1 vaje solujen eläintutkimuksissa merkitsevästi (

P

0,05) vähensi siirtymänopeuksien (0.16- tai 0,044-kertaisesti, vastaavasti) ja hyökkäys kyvyt (0.43- tai 0,29-kertaisesti, vastaavasti) kuin kontrolli vektori -transfected solut (kuviot. 4C ja D). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin AGS-KS-solujen (KS1 ja KS2) (kuviot. 4E ja F). Tuloksemme viittaavat yhdessä siihen, että GLO1 positiivisesti säätelee muuttoliike ja hyökkäys kyvyt mahalaukun syöpäsoluja.

Kaksi TSGH-GLO1-vaiennetaan klooneja (KG1 ja KG2), kaksi AGS-GLO1-vaiennetaan klooneja (KS1 ja KS2) alilinjat ja ohjaus solulinjoja (TSGH-C1 ja C2, AGS-C1 ja C2) perustettiin. (A, B) ekspressio GLO1 määritettiin käyttämällä Western blot -analyysiä. β-aktiini on käytetty sisäisenä kontrollina. Solujen vaeltamiseen (C, E) ja invaasio (D, F) kyvyt testattiin kuvatulla tavalla ”Materiaalit ja menetelmät”. Tulokset esitettiin taittuu ainakin kolmen erillisen kokeen suoritettiin päällekkäisiä. Taitteen muutokset (C-F), ja erot tutkittiin käyttäen Mann-Whitney U tapa verrata arvoihin vektorisäätötilassa. **

P

0,05.

Down-ilmentyminen GLO1 aiheuttaa alentuneen liittyvien geenien ekspressiota in etäpesäkkeitä liittyviä reittejä

Sen varmistamiseksi, että GLO1 proteiini vaikuttaa etäpesäkkeiden liittyviä geenejä, vertasimme genominlaajuisten ilmentymisen KG2 ja C1. Useita geenejä voimistunut (≥1.5-kertaisesti) C1, verrattuna KG2, valittiin. MetaCore ™ analyysi [28] osoitti, että kärkikastiin molekyyli reittejä muuttunut KG klooneista adhesion_cytokines ja tarttuvuus polkuja. Proteiinit [kuten matrix (MMP), CXCL8, ja CXCL1] mukana näitä väyliä olivat alassäädetty upon GLO1 hiljentäminen. Niistä sytokiini liittyvät reitit, korkea ekspressio VEGF, CXCL8, CXCR2, ja CXCL1 liittyy syövän etäpesäkkeitä ja etenemiseen [8], [29]. Aiemmin Daniel J.

et al.

[30] on raportoitu, että yli-ilmentyminen GLO1 voisi parantaa stroomasolujen peräisin oleva tekijä-1 (SDF-1), CXCR4, ja VEGF: n ilmentymisen hypoksinen endoteelisolujen kantasolujen kulttuuri korkea glukoosi. Näin ollen, analysoimme myös VEGF: n ilmentymistä in KG stabiileja linjoja.

edelleen vahvisti ekspressiokuvioita proteiinien VEGF tai sytokiinin liittyvien reittien kautta western blot-analyysi. Tasot kohdegeenien, kuten CXCL1, CXCL8, CXCR2, ja VEGF, oli merkittävästi inhiboitu TSGH-KG stabiileja solulinjoja (KG1 ja KG2), verrattuna vektori transfektoitiin valvontaa (Fig. 5A). Lisäksi tasot NF-KB: n ja HIF1-α, tunnettu transkriptiotekijät pro-angiogeenisten kasvutekijöiden (kuten CXCL8, CXCL1, ja VEGF) [31], vähenivät ytimet TSGH-KG stabiileja solulinjoja verrattuna kontrolli-soluissa (kuvio. 5A). MMP2 ja MMP-9, avain entsyymit alentava tyypin IV kollageenia, uskotaan olevan keskeinen rooli kasvaimen invaasio ja etäpesäkkeiden [32]. Erityisesti ehtyminen GLO1 johti selvästi tukahduttamista MMP2 ja MMP-9 toimintaa (kuvio. 5B). Meidän tiedot osoittavat, että GLO1 säätelee aktivointi etäpesäkkeiden liittyvien signalointireittien mahalaukun syöpäsoluja. Näiden tulosten perusteella ehdotamme, että GLO1 välittää mahasyövässä solumigraatioon ja invaasiota ainakin osittain välittyvät aktivoitumisen CXCL1, CXCL8, ja VEGF.

(A) HIF-1α, NF-kB, VEGF, CXCL8 , CXCL1, ja CXCR2 proteiinin tasot TSGH transfektoiduissa soluissa GLO1 shRNA (KG1 ja KG2) ja valvonta shRNA (C1 ja C2). Geeli värjättiin Coomassie-sinisellä (CB), joka käytettiin latauskontrollina ehdollisen media. β-aktiini käytettiin sisäisenä kontrollina kokosoluliuotteissa ja Lamin A /C ydinvoiman proteiineja. (B) knockdovvn GLO1 tukahdutti aktivoinnin MMP2 ja MMP-9. Ehdollinen mediaa C1, C2, KG1 ja KG2 solut kerättiin ja niille suoritettiin gelatiinitsymografialla. (C) §: formaliinilla kiinnitetyille ja parafiiniin upotetut kudokset kolmesta ihmisen mahalaukun kasvainkudoksissa immunovärjättiin anti-GLO1 (a ja b), anti-CXCL1 (c ja d) tai anti-CXCR2-vasta-aineita (e ja f). -parin GLO1, CXCL1, ja CXCR2 proteiinit havaitaan ihmisen mahasyövän kudoksissa (b, d, ja f). Noncancerous mahalaukun limakalvo negatiiviset tai pienempi ilmaus GLO1, CXCL1 ja CXCR2 proteiinit (a, c, ja e). Scale palkki edustaa 200 um.

IHC osoittaa -parin GLO1 kanssa CXCL1 ja CXCR2 proteiinit ja sen yli-ilmentyminen mahalaukun syöpäkudokset

Aiemmat tutkimukset ovat raportoineet, että sytokiinireseptorille vuorovaikutus ja VEGF signalointipolkujen liittyvät pahanlaatuisuuden ominaisuuksia mahasyövässä [8], [33]. Aiemmin ryhmämme osoitti merkittävää yhdistyksen CXCR2 ja CXCL1 yli-ilmentyminen (n = 116), jossa mahalaukun syövän etenemisessä [8]. Johdonmukaisesti, vuonna IHC analyysi, positiivinen merkittävää korrelaatiota ei havaittu yksinomaan välillä tulokset GLO1 ja CXCL1 tai CXCR2 syövän kudoksissa (Spearmanin korrelaatiokerroin = 0,238 ja 0,293;

P

= 0,013 ja

P

= 0,003, vastaavasti). Lisäksi immunovärjäys peräkkäistä leikettä paljasti merkittävää ilmentymistä GLO1, CXCL1, ja CXCR2 proteiineja kasvaimen epiteelisoluissa [Fig. 5C (b), (d), ja (f)], toisin lainkaan tai heikkoa ilmentymistä noncancerous kudoksissa [Fig. 5C (a), (c), ja (e)].

Keskustelu

Koska toiseksi yleisin syy syövän liittyvät kuolemat, mahasyöpä edelleen haastava sairaus. Tiedot Tässä tutkimuksessa osoitettiin, että säätelyä GLO1 mahasyövän kudoksissa liittyy merkittävästi taudin etenemiseen ja pitkälle edennyt tauti. Yhtäpitävästi, potilaat, joilla on alhaisempi GLO1 tasoilla oli parempi sairaus ennusteeseen. Lisäksi qRT-PCR ja IHC kokeiluja paljastaa korrelaatio lisääntyneen GLO1 ilmaisun paikallisten kasvainprogression ja imusolmuke hyökkäystä. Havaitsimme heikkenee huomattavasti etäpesäkkeitä ja invaasiota kyvyt GLO1-vajaiden solujen samanaikaista ja vähentäen samalla useiden etäpesäkkeiden liittyvien tekijöiden, kuten VEGF, CXCL1, CXCL8, MMP, ja CXCR2. Vuonna IHC tutkimuksessa positiivinen merkittävä korrelaatio GLO1 ja CXCL1 ilmentymismalleja havaittiin resektoitiin yksilöiden mahasyövän. Lisäksi kohonnut GLO1 ja samanaikainen CXCL1 yli-ilmentymisen potilailla, joilla on mahalaukun syövän merkittävästi korreloi selviytymisen. Tuloksemme antaa suoraa näyttöä osallistumisen tukeminen GLO1 mahalaukun syövän etenemisessä ja mahtia kautta vuorottelu sen loppupään muuttoliikkeen ja invaasion polkuja.

korkea ilmentymä GLO1 on yhdistetty useisiin syöpiin [16], [17] . Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, keskeinen rooli GLO1 useissa syöpätyypeissä poistossa methylglyoxal (MG), joka pidetään karsinostaattisten, jolloin kehitys GLO1 estäjien syöpälääkkeitä [34], [35]. Näin ollen, korkea ekspressio GLO1 on osallisena syöpäsolujen vastustuskyky indusoiman apoptoosin syöpälääkkeitä [36]. Sakamoto

et al.

[36] ehdotetaan, että GLO1 ei ole ainoastaan ​​kasvain vaan myös lääkeresistenssimarkkeri. Johdonmukaisesti, The GLO1 pudotus-kloonit olivat herkkiä useita kemoterapia-aineisiin, kuten kamptotesiini, etoposidi (tuloksia ei ole esitetty). Kliinisesti, tuloksemme osoittavat, että GLO1 ilmentyy vahvasti mahasyövän ja merkittävästi liittyvät kasvaimen etenemiseen ja pitkälle edennyt tauti.

glykolyyttisissä muutoksia syöpäsolujen edustavat aineenvaihdunnan sopeutuminen hypoksinen kasvaimia toiminnan välityksellä hypoxia- indusoi transkriptiotekijä (HIF-1) [37], [38]. Lisäksi transkriptiotekijät, HIF1-α ja NF-KB, keskeisessä asemassa ovat erilaisia ​​prosesseja, kuten tulehdus, mikrobien tappaminen ja syövän etenemistä [39]. Kasvain hypoksia näyttää olevan voimakkaasti yhteydessä kasvain eteneminen, pahanlaatuinen etenemistä, ja kestävyys hoito. HIF-1α -systeemi selvästi mukana karsinogeneesi mahasyövän [39]. Lisäksi, immunohistokemiallinen ilmentyminen HIF-1α kohdegeenien (Glut1, VEGF, CA9, iNOS) liittyy mahalaukun syövän etenemistä [40]. Niistä onkogeeninen polkuja, NF-KB: n signalointi on kohonnut merkittävä osa mahasyöpä [9]. Lisäksi useita rivejä todisteita tuen välistä ylikuulumista NF-KB ja HIF-1α signalointireittien [41]. Meidän kokeissa tasot sekä HIF-1α: n ja NF-KB: n vähenivät ytimien päälle GLO1 hiljentäminen mahasyövän solulinjoissa, sekä alavirran kohdegeenien (VEGF, CXCL1, CXCL8, MMP).

meidän