Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Aquaporin3 (AQP3) ja Aquaporin4 (AQP4) on tärkeä rooli transsellulaarinen ja epiteelin veden liikkuvuutta Vesikanavan kalvon proteiineja. Vähän tiedetään niiden ilmaisun ja merkityksen ihmisen kilpirauhasen kudoksissa. Siten tutkimme ilmaus AQP3 ja AQP4 normaalissa, hyperplastisiin ja neoplastiset kilpirauhasen kudoksia yhdessä ihmisen kilpirauhassyöpä solulinjoissa.

Menetelmät ja tulokset

immunohistokemiallinen analyysit osoittivat AQP3 vuonna solukalvon normaalien C soluja, mutta ei follikulaarinen soluissa. Sen sijaan, AQP4 ei löytynyt C-soluissa, mutta havaittiin normaalin follikkelin soluissa. AQP4 oli positiivinen 92% Gravesin tauti kilpirauhasen ja 97% monikyhmyinen goiters, ja emme onnistuneet osoittamaan AQP3 näissä hyperplastic kudoksissa. Vuonna neoplastisia kilpirauhasen vaurioita, havaitsimme AQP3 91% medullary kilpirauhasen karsinoomat, mutta ei muissa follikulaarinen kasvaimia. AQP4 osoitettiin 100% follikkelien adenoomia, 90% follikkelien karsinoomien ja 85% papillaarisen karsinoomien, kun se oli negatiivinen kaikissa medullary karsinoomat ja erilaistumaton karsinoomat. RT-PCR (RT-PCR) analyysit paljastivat AQP3 mRNA: n ilmentymisen vain medullaarinen karsinoomat ja AQP4 mRNA: n ekspression follikulaarista johdettu kasvainten paitsi erilaistumaton karsinoomat. Kilpirauhassyövän hoitoon solulinjoissa, käyttäen RT-PCR: ää ja western-blottauksella, AQP3 mRNA: ta ja proteiinia havaittiin ainoastaan ​​TT-solulinja (ihmisen medullaarikarsinoomaan solulinja) ja AQP4 muissa solulinjoissa. Lisäksi AQP3 mRNA ilmaisu oli ajan säännelty FBS ja kalsium hallinnon sekä annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla TT soluissa.

Johtopäätös

ero ilmauksia AQP3 ja AQP4 voivat heijastaa biologinen luonne ja /tai toiminta normaali, hyperplastic, ja neoplastisia kilpirauhassolut ja lisäksi saattaa olla arvoa määritettäessä erotusdiagnooseissa kilpirauhasen kasvaimia.

Citation: Niu D, Kondo T, Nakazawa T, Kawasaki T, Yamane T , Mochizuki K, et ai. (2012) Differential ilmentäminen Akvaporiinit ja sen Diagnostic Utility kilpirauhassyöpä. PLoS ONE 7 (7): e40770. doi: 10,1371 /journal.pone.0040770

Editor: Alfredo Fusco, Consiglio Nazionale delle Ricerchen (CNR), Italia

vastaanotettu: 28 huhtikuu 2012; Hyväksytty: 13 Kesäkuu 2012; Julkaistu: 10. heinäkuuta 2012

Copyright: © 2012 Niu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kilpirauhassyöpä on yleisin maligniteetti hormonitoimintaa elimiä, joilla ilmaantuvuus kasvaa tasaisesti viime vuosikymmenten. Yli 95% kilpirauhasen karsinoomat ovat peräisin munarakkuloiden soluista, joiden kirjo erottautua verrattain indolent karsinoomat, kuten follikulaarisen kilpirauhassyövän ja papillaarinen kilpirauhassyövän, huonosti eriytetty karsinooma ja erilaistumaton kilpirauhasen syöpä. Toinen kilpirauhaskarsinoomaa peräisin kilpirauhasen C solu on medullaarikarsinoomaan joka tapahtuu joko satunnaisesti tai osana perittyä, autosomaalinen dominantti, useita hormonitoimintaa neoplasia (MEN) tyyppi 2A ja kirjoita 2B [1].

Akvaporiinit ( AQPs) ovat perheen pieni (-30 kDa /monomeeri) kalvo toimivat proteiinit Vesikanavan proteiineja, jotka on tärkeä rooli transsellulaarinen ja epiteelin veden liikkumista [2] – [4]. AQP perhe voidaan jakaa 3 alaryhmiin niiden ensisijaisen sekvenssit: akvaporiineja (AQP0, AQP1, AQP2, AQP4, AQP5, AQP6 ja AQP8), joka kuljettaa vain vettä, aquaglyceroporins (AQP3, AQP7, AQP9 ja AQP10), jotka ovat vastuussa kuljettavat veden, glyserolin ja muut pienet liuenneita aineita [5], ja superaquaporins kuuluu uuteen alaperheeseen (AQP11 ja AQP12) [6], [7].

Aquaporin3 (AQP3) on tyypillinen aquaglyceroporin kuljettavat veden, glyserolin ja urea, jolla on merkittävä rooli nesteen homeostaasin normaaleissa kudoksissa [8] – [10]. Tällä hetkellä, AQP3 on osoitettu monissa epiteelisolujen virtsan, ruoansulatuskanavan ja hengitysteiden [11] – [14], munuaisen [15] – [17], orvaskeden [18], [19], silmän [20], aivojen [17], haiman [21], ja eturauhasen [22], näissä solutyypeissä, korkean veden läpäisevyys on liitetty määritellään fysiologisen funktion takaisinimeytyminen tai erittymistä. Viime aikoina on raportoitu, että AQP3 ilmentyminen voidaan liittää kasvainten synnyssä ja proliferaatioon karsinoomat useiden elinten, kuten ihon [23], [24], paksusuolen [25], munuaisen [26], ja munasarja [27].

AQP4 on transmembraaninen proteiini, joka säätelee veden pääsyn sisään ja ulos tiettyjen solujen; se saadaan pääasiassa munuaisissa ja keskushermostoon myös aivoissa, selkäytimessä, ja hermoratoja [28]. Alas sääntely AQP4, joka on aiemmin kuvattu, johtaa tukahduttaminen aivojen turvotuksen vastauksena vesimyrkytys ja aivohalvauksen joka parantaa kliinisen indeksit selviytymisen ja neurologisen statuksen [29], [30]. Korkea ekspressiotaso AQP4 on raportoitu gliooman [31]. glioblastooma [32], [33], ja meningeooma [34]. Kuitenkin mekanismi AQP4 osallistuminen aivokasvaimia on edelleen tutkittavana.

Tietääksemme hyvin vähän tietoa ilmoittamista koskevia tai merkitystä AQP3 ja AQP4 kilpirauhasen kudoksissa. Lisätä ymmärrystä tämän biologisesta mekanismi normaaleissa ja sairaissa kilpirauhassoluja tutkimme akvaporiini lauseke (AQP3 ja AQP4) normaalissa, hyperplastic, ja neoplastiset ihmisen kilpirauhasen kudosten yhdessä useiden kilpirauhassyöpä solulinjoissa käyttäen immunohistokemia ja molekyylitekniikkaa. Keskustelemme myös hyödyllisyyttä ja vaikutuksia akvaporiini ilmaisun diagnosoimiseksi ja kehittää hoitomuotoja kilpirauhasen kasvaimia.

(A) Immunofluoresenssi kaksinkertainen värjäys osoittaa AQP3 (FITC: vihreä) ilmentävien että sytoplasmamembraaneilla normaalia ihmisen C solut, jotka ovat positiivisia kalsitoniinin (TRCR: punainen), mutta ei follikulaarinen soluissa. (B) immunoperoksidaasivärjäys osoittaa myös, että AQP3 on positiivinen vain C-soluissa eikä follikulaarinen soluissa. (C) Immunofluoresenssianalyysi osoittaa AQP4 proteiinia (FITC: vihreä) on sytoplasmamembraaneilla follikkelien soluja. Ytimet värjätään DAPI (sininen). (D) AQP4 proteiinin positiivisuutta yleensä vahvempi pitkä follikulaarinen soluissa pieniä munarakkuloita. Hyperplastinen follikulaarinen solut Gravesin tauti (E) ja monikyhmyinen struuma (F) näyttö näkyvä positiivisuus AQP4 niiden sytoplasmamembraaneilla. (Suurennus: A, C, 1000x, B, D, E, F, 400x).

Materiaalit ja menetelmät

Case Selection

Tutkimme 164 kirurginen yksilöt, joilla oli erilaisia ​​kilpirauhasen vaurioita, mukaan lukien 12 tapausta Gravesin tauti kilpirauhasen, 38 monikyhmyinen struuma, 20 follikulaarinen adenoomia, 52 papillaarinen karsinoomat, 10 follikulaarinen karsinoomat, 10 erilaistumaton karsinoomat, ja 22 medullaarinen karsinoomat. Tutkimme myös normaali kilpirauhasen kudoksia vieressä kasvaimia. Normaalit ihmisen munuaiskudokset saatiin potilailta, joille tehtiin subtotaalinen tai kokonaan nephrectomy munuaisten syöpä. Snap-pakastetut kudokset varastoitiin -80 ° C: ssa ennen seuraavaa eristämistä niiden proteiinia.

immunoreaktiivisuus AQP3 on negatiivinen follikulaarinen adenooma (A), follikulaarinen karsinooma (B), ja papillaarinen karsinooma (C). Sen sijaan, AQP3 on selvästi immunopositiivista in sytoplasmisen kalvoja medullaarikarsinoomaan soluja (D). (Suurennus: 400x).

Kaikki diat saivat hematoksyliini- eosiinilla (HE) värjäys, ja vauriot todettiin läpi rutiini kirurgiset patologinen diagnoosi perusteella Maailman terveysjärjestön luokitus [1]. Tutkimuksessa protokollat ​​hyväksyi Institutional eettinen hallitus yliopiston Yamanashi.

AQP4 on hajanaisesti immunopositiivista neoplastisissa soluissa follikkelin adenoomien (A), follikulaarinen karsinoomat (B), ja papillaarinen karsinoomat (C), mutta negatiivinen medullaarikarsinoomaan (D). (Suurennus: 400x).

Cell Lines and Cell Culture

käytetään 8 ihmisen kilpirauhasen karsinooma-solulinjat: KTC-1, TPC-1, WRO, 8305C, 8503C ja TT on aiemmin kuvattu [35], [36], ja UA-1 ja UA-2 alun perin vakiintuneet solulinjat, jotka ovat peräisin ihmisen erilaistumaton karsinooma [37]. Soluja ylläpidettiin RPMI 1640 (GIBCO, Grand Island, NY, USA) ja jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS), streptomysiinisulfaatilla (100 mg /l), ja G-penisilliini (100 mg /l). Soluja viljeltiin tavallisessa kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa 5% CO

2 ilmakehässä.

RT-PCR osoittaa AQP3 mRNA ainoastaan ​​medullary karsinoomat (MC), ja poissa normaalissa kilpirauhasessa kudoksissa ( NT), monikyhmyinen goiters (MG), follikulaarinen adenoomia (FA), papillaarinen karsinoomat (PC), ja eriytymättömiä karsinoomat (UC). Sen sijaan AQP4 mRNA osoitettu NT, MG, FA, ja PC, ja negatiiviset kaikissa UC ja MC.

TT-solut ympättiin 10 cm: n maljalla, kunnes 80% konfluenssiin ja jälkeen seerumistarvaatio 24 tuntia. Sitten ne käsitellään väliaineessa arvostellaan pitoisuuksilla FBS (0%, 1%, 5% ja 10%) 24 tuntia. Soluja viljeltiin myös elatusaineessa, jossa oli 5% FBS: ää ja eri aikoina 0, 4, 8, 12, 16, 24 ja 36 tuntia. Käsittelimme TT solulinja sarja kalsiumin pitoisuudet (0, 0,1, 1 ja 10 uM) (Wako, Tokio, Japani) ja 10 uM kalsiumia 0, 4, 8, 12, 16, ja 24 tuntia .

(A) RT-PCR-analyysi osoittaa, että AQP3 mRNA erikseen mainittu TT solulinjassa, kun taas AQP4 havaitaan follikkelisolujen johdettuja linjoja (KTC-1, TPC-1, WRO, UA -1, UA-2, ja 8505C). (B) VVestern-blottaus osoittaa, että AQP3 proteiini nähdään TT-solulinjassa, ja ei toisessa solulinjoissa. AQP4 proteiini on tunnistettu viisi solulinjoissa (KTC-1, TPC-1, UA-1, UA-2, ja 8505C), samalla kun läsnä on kolme solulinjoissa (TT, 8305C ja WRO).

immunohistokemia

Suoritimme immunohistokemiallisella värjäyksellä 3 um osat formaliinilla kiinnitetyt ja parafinoidut kudoksiin. Yksityiskohtainen protokolla on kuvattu aiemmin [37], [38]. Lyhyesti, parafiini poistettiin leikkeitä inkuboitiin affiniteettipuhdistetun kanin polyklonaalinen vasta-aine rotan /ihmisen AQP3 on 1:500 laimennus [39] tai affiniteettipuhdistetun kanin polyklonaalinen vasta-aine ihmisen AQP4 on 1:1000 laimennuksen (Sigma, St. Louis, USA) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Huuhtelun jälkeen 3 kertaa PBS: llä, leikkeitä inkuboitiin leimatulla polymeerin (Envision /piparjuuriperoksidaasi, DAKO, Glostrup, Tanska) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Käytimme normaalit solut /kudosta kokoojakanavaan munuaisten positiivisena kontrollina ja jätetty pois primaarinen vasta-aine ja negatiivisen kontrollin. Määrät immunoreaktiivisuus AQP3 ja AQP4 arvioitiin käyttäen arvosteluasteikkoa 0 3+: 0, ei immunoreaktiivisuus; 1+, polttoväli immunoreaktiivisuus (1%: sta 9% positiivisia soluja); 2+, väli immunoreaktiivisuus välillä 1+ ja 3+; 3+, diffuusi immunoreaktiivisuus (yli 50% positiivisia soluja).

(A) AQP3 mRNA taso on merkittävästi kasvanut 5% ja 10% FBS hoitoja. (B) AQP3 mRNA taso on merkittävästi ajan säätelee kalsiumin anto annoksesta riippuvaisella tavalla. Virhepalkkien keskihajonta. Merkittävä ero, *

P

0,05, **

P

0,01.

Immunohistofluorescence

Teimme myös kaksinkertainen immunohistofluorescence 3 um osat formaliinilla kiinnitetyt ja parafinoidut kudosten läpi juokseva lähestymistapa ensisijaisen vasta-aineet samasta lajista. Käsitelty leikkeitä inkuboitiin ensimmäinen ensisijainen vasta-aine, kanin polyklonaalinen vasta-aine rotan /ihmisen AQP3 on 1:500 laimennuksen huoneen lämpötilassa 1 tunti, sitten sian anti-kani-fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) on 1:20 laimennus (DAKO, Tokio, Japani) huoneenlämpötilassa 1 tunnin ajan. Huuhtelun jälkeen 3 kertaa, leikkeet uudelleen kiinnitettiin formaliinissa huoneenlämpötilassa 1 tunnin ajan ja inkuboitiin kanin polyklonaalinen vasta-aine ihmisen kalsitoniinia (DAKO, CA, USA) on 1:5000 laimennuksen huoneenlämpötilassa 1 tunnin ajan, sitten anti -rabbit fluoresenssi Rhodamine klo 01:40 laimennus (DAKO, Tokio, Japani) huoneenlämpötilassa 1 tunnin ajan. Tumat vastavärjättiin 4 ’, 6-diamiono-2-fenyyli (DAPI). Me visualisoitu fluoresenssin käyttäen epi-valonlähteen fluoresenssimikroskooppia (BX50, Olympus, Tokio, Japani).

Protein eristäminen ja Western-blottaus

Culture soluja ja munuaiskudoksista hajotettiin polytronissa homogenisaattoria radioimmunosaostuskokeella (RIPA) lyysipuskuria proteinaasi-inhibiittorit (1 x fosfaattipuskuroitu suolaliuos (PBS), 1% Nonidet P40, 0,5% natriumdeoksikolaatti, 0,1% natriumdodekyylisulfaatti (SDS), 1 mmol /l fenyylimetyylisulfonyylifluoridia (PMSF), 12 ug /ml aprotiniinia, ja 1 mmol /l natriumortovanadaatti).

Yhtä suuret määrät proteiinia (30 ug) liuotetaan näytepuskuriin erotettiin 10% SDS-polyakryyliamidigeeleillä ja siirrettiin elektroforeettisesti polyvinylideenidifluoridi (PVDF) kalvot. Membraanit blokattiin Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa (TBS), joka sisälsi 0,05% Tween 20 ja 5% rasvatonta kuivamaitoa 1 tunti huoneen lämpötilassa ja tutkittiin primaarisilla vasta-aineilla 4 ° C: ssa yön yli.

Ensisijainen vasta-aineita käytettiin määritetyn laimennokset: kanin anti-AQP3 polyklonaalisen vasta-aineen 1:2000 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA) ja affiniteettipuhdistetun kanin polyklonaalinen vasta-aine ihmisen AQP4 on 1:2000 (Sigma, St. Louis, USA) ja hiiren monoklonaalinen beta aktiini at 1:5000 laimennus (Abcam, Cambridge, UK). Membraanit pestiin kolme kertaa 10 min kukin TBS, joka sisälsi 0,05% Tween-20, ja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi (HRP) konjugoitua vuohen anti-kani tai anti-hiiri-vasta-ainetta 1:2000 laimennus (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Kohdennettu proteiinit visualisoitiin käyttämällä tehostettua kemiluminesenssidetektiolla (Amersham, Buckinghamshire, UK).

RNA uuttaminen, cDNA Synthesis, RT-PCR ja kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR

eristettiin kokonais-RNA ja kilpirauhasen kudosten 10 um: n leikkeiksi formaliinilla kiinnitetyille ja parafiiniin upotetut kudokset käyttäen palauttaa kaikki ™ Yhteensä Nucleic Acid Isolation Kit (Applied Biosystems, New Jersey, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kokonais-RNA: Viljeltyjen solujen eristettiin käyttäen TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, USA), ja cDNA luotiin käyttäen TaqMan käänteistranskriptio (RT) reagenssipakkauksen (Applied Biosystems, New Jersey, USA). PCR-alukkeet suunnattu AQP3, AQP4, glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) ja PGK1 suunniteltiin lueteltu taulukossa 1. GAPDH [40] ja PGK1 [41] käytettiin sisäisen valvonnan. Monistaminen tehtiin käyttämällä HotStarTaq DNA-polymeraasia (Qiagen, Tokio, Japani). PCR-olosuhteet olivat seuraavat: (1) 95 ° C: ssa 15 min; (2) 30 sykliä 94 ° C 30 s, 56 ° C: ssa tai 58 ° C: ssa 30 s, ja 72 ° C 1 min; (3) 72 ° C: ssa 10 min; ja (4) 4 ° C pitoon. Negatiiviset kontrollit jättämällä pois RT tai ilman cDNA ja asianmukaisia ​​positiivisia kontrolleja sisällytettiin kuhunkin PCR-reaktiossa.

Reaaliaikainen PCR suoritettiin MyiQ ™ yksivärisiä Reaaliaikainen PCR tunnistusjärjestelmä (Applied Biosystems, CA, USA ). Noin 2,5 ui cDNA monistettiin kukin 25 pl PCR-reaktioseosta, jossa oli 12,5 ui 2X SYBR Green Master Mix (Qiagen) plus 0,75 ui kutakin 10 mmol eteen ja taakse alukkeita ja 8,5 ui DEPC käsiteltyä vettä. Reaktion kokonaistilavuus oli 25 ui. Aloitimme monistaminen 95 ° C: ssa 15 minuutin ajan, kuten ensimmäisessä vaiheessa, ja sen jälkeen peräkkäin 45 PCR-sykliä 95 ° C: ssa 30 s, 58 ° C: ssa 30 s ja 72 ° C: ssa 60 s. MRNA: n määrä kohdegeenin oli normalisoitu GAPDH käyttäen ACt menetelmällä, kuten on kuvattu valmistajan protokollan.

Tilastot

Tulokset esitetään keskiarvona ± SD. Tilastollinen merkitsevyys asetettiin

p

0,05. Tiedot analyysit suoritettiin käyttäen SPSS versio 13.0 for Windows (SPSS Inc., Tokio, Japani).

Tulokset

AQP3 ja AQP4 Protein Expression in Kilpirauhasen kudokset

Immuunihistokemialliset tulokset ja AQP3 ja AQP4 käyttäen ihmisen kilpirauhasen kudoksia on esitetty taulukossa 2. immunohistokemiallinen tutkimukset, löydettiin AQP3 proteiinin solukalvon normaalin kilpirauhasen C-solut, jotka olivat positiivisia kalsitoniini, kun se oli täysin negatiivinen follikulaarinen soluissa (Fig. 1A ja B). Meidän ei myöskään osoittanut immunopositivity of AQP3 vuonna hyperplastista follikulaarinen soluissa Gravesin tauti kilpirauhasen ja monikyhmyinen struumat.

Sen sijaan, AQP4 oli positiivinen solukalvon normaalien kilpirauhasen follikulaarinen solut ja negatiivinen C-soluissa (kuvio. 1C). AQP4 oli yleensä positiivinen korkeissa follikulaarinen soluissa pienten munarakkuloiden ja negatiivinen tasainen follikulaarinen soluissa suuria munarakkuloita (Fig. 1 D). Hyperplastinen follikulaarinen soluja useimmissa Gravesin tauti kilpirauhasen ja monikyhmyinen struumat olivat positiivisia AQP4 niiden sytoplasmamembraaneilla; positiivinen taajuus oli 92% vuonna Gravesin tauti kilpirauhasen (Fig. 1 E) ja 97% vuonna monikyhmyinen struuma (Fig. 1 F).

neoplastiset kilpirauhasen kudoksissa, immunoreaktiivisuus AQP3 oli usein osoitettiin solukalvon of medullaarikarsinoomaan solut (Fig. 2D). Yleinen positiivinen taajuus AQP3 vuonna medullary karsinoomien oli 91% (20/22). Niistä 20 medullary karsinoomat positiivinen AQP3, jakelu malleja AQP3-positiivisten solujen vaihtelivat: 55% (11/20) in hajanainen, 40% (8/20) väli-, ja 5% (1/20) in polttovälin medullaarisista karsinoomat . AQP3 ei tunnistettu follikkelisolujen johdettu kasvaimia (Fig. 2A-C).

Sen sijaan, me havaitaan usein AQP4 soluissa follikkelin adenoomien (100% tapauksista), follikulaarinen karsinoomien (90% tapauksista), ja papillaarinen karsinoomien (85% tapauksista) (Fig. 3A-C). Useimmat AQP4-positiivisia, neoplastiset kudokset näytteillä väli- tai hajanainen positiivinen solu jakeluun. Emme havainneet AQP4 soluissa erilaistumattoman karsinoomien tai medullaarinen karsinoomat (Fig. 3d).

AQP3 ja AQP4 mRNA ilmentäminen Kilpirauhasen kudokset

Kuten on esitetty kuviossa 4, RT-PCR-analyysit käyttäen oligonukleotidialukkeita paljasti, että kaikki normaalit ja hyperplastic kilpirauhasen näytteet tutkitaan ilmaisivat bändi viittaavia AQP4, kun taas AQP3 ei tunnistettu.

neoplastiset kilpirauhasen kudoksissa, tunnistimme AQP3 mRNA: n ilmentymisen vain medullaarisista karsinoomat. Havaitsimme AQP4 mRNA: n ekspression follikulaarisen adenoomien ja papillaarinen karsinoomia, mutta ei eriytymättömissä karsinoomien tai medullaarisista karsinoomat. Nämä tulokset tukevat tuloksia myös immunohistokemiallisissa määrityksissä.

AQP3 ja AQP4 ilmentäminen kilpirauhaskarsinoomaa Cell Lines

tutkittiin mRNA: n ilmentymisen profiilit AQP3 ja AQP4 kahdeksan kilpirauhasen karsinooma solulinjoja käyttämällä RT-PCR- (Fig. 5A). Me nimenomaan havaittu ilmentyminen AQP3 mRNA TT solulinjassa, joka perustettiin ihmisen medullaarikarsinoomaan. Sen sijaan, nähtiin AQP4 mRNA: n ekspression KTC-1, TPC-1, WRO, UA-1, UA-2, ja 8505C solulinjoissa, mutta ei TT ja 8305C solulinjat.

western blotting analyysit, olemme havainneet AQP3 proteiinin ainoastaan ​​TT-solulinjassa, mutta ei muita solulinjoja, kun taas AQP4 proteiini tunnistettiin solulinjojen KTC-1, TPC-1, UA-1, UA-2, ja 8505C mutta ei TT. Kumpikaan AQP3 eikä AQP4 havaittiin WRO tai 8305C solulinjoissa (kuvio. 5B).

naudan sikiön seerumia (FBS) ja kalsium Säätelee AQP3 mRNA Expression TT Solut

päättää, että AQP3 on erityisesti havaittu TT-soluissa, tutkimme stimuloiva vaikutus vaihtelevilla FBS väliaineen AQP3 mRNA-tasot käyttämällä sarjaa FBS pitoisuuksien (0%, 1%, 5% ja 10%) 24 tunnin aikana (Fig. 6A) . AQP3 mRNA tasot olivat merkittävästi lisääntynyt 5% ja 10% FBS hoitoja verrattuna ei FBS hoitoa (

P

0,01).

Seuraavaksi tutkimme vaikutus stimulaation ajan (0, 4, 8, 12, 16, 24, ja 36 tuntia), TT-soluja viljeltiin 5% FBS: ää. AQP3 mRNA-tasot 12, 16 ja 24 tuntia lisääntyivät merkitsevästi (

P

0,05 vs. kontrolli 0 tunti), huipussaan 24 tuntia (

P

0,01) .

Kuten kuviossa 6B on esitetty, soluja käsiteltiin eri annoksilla kalsiumia (0, 0,1, 1, 10 ja 100 uM). AQP3 mRNA-ekspressio oli merkitsevästi ajan säätelee kalsiumin anto annoksesta riippuvalla tavalla verrattuna kontrolliryhmään (

P

0,05). Havaitsimme korkein AQP3 mRNA: n ekspression 10 uM kalsiumia, eli 6-kertainen lisäys kontrolliin verrattuna (0 uM kalsiumia).

tutkittiin, mikä vaikutus stimulaation kertaa (0, 4, 8, 12 , 16, ja 24 tuntia) ja 10 uM kalsiumkäsittely TT soluissa ja löysi merkittävä kasvu AQP3 mRNA ilmaisun ajan; se saavutti huippunsa 12 tuntia (

P

0,01).

Keskustelu

AQP3 on kalvo kuljettaja vettä ja glyserolia ilmaistuna solukalvojen solujen ylläpitämiseksi tasapaino nestettä aineenvaihduntaan. AQP3 ilme on raportoitu eri elimiin rotilla ja hiirillä [11], [12]. Normaaleissa kudoksissa /solujen ihmisten, Mobasheri et ai. [42] raportoitu vahva ilmaus AQP3 vuonna basolateraalisessa kalvoja distaalisen nephron (medullaarinen kokoojatiehyiden), distaalinen paksusuoli, ylähengitysteiden epiteelin, siirtymävaiheen epiteelin virtsarakon, henkitorven, keuhkoputkien ja nenänielun epiteelin, ja ositettu squamous epiteelisolujen ruokatorven ja peräaukon. Viimeaikaisten immunohistokemiallinen tutkimus, jossa käytettiin suuren joukon ihmisen kudosten paljasti lisäksi solua /kudosten tuottavat AQP3 kuten aivolisäkkeen soluja, kateenkorvan epiteelisolut, fundic rauhanen soluja vatsaan, saarekesolujen haiman, spermatogeenisten soluissa kiveksen, sudoriferous rauhanen solut, talirauhasten soluja, ja apocrine rauhanen soluja ihon [39].

AQP4 on yksi vettä selektiivisen isoformien AQP perheen. Tämä vesi kanava proteiini on raportoitu pääasiassa ilmaistaan ​​aivokudoksessa kuten glia limitans, ependymal vuori, pikkuaivot, hippokampuksen denate gyrus, sekä supraoptic ja paraventricular ytimet hypotalamuksen [28]. Lisäksi, pieni mutta merkittävä AQP4 ilmentymistä on myös havaittu, että neocortex, hippokampuksen alueilla CA1-CA3, ytimen stria päätelaitteiden ja mediaalinen habenular ydin [31] – [33].

Tietääksemme , AQPs ”ilmaisun kilpirauhasen ei ole raportoitu tähän asti. Tässä nykyisessä tutkimuksessa, jossa käytettiin immunohistokemiaa, olemme osoittaneet, että ilmentyminen AQP3 ja AQP4 normaaleissa ihmisen kilpirauhasen kudoksissa. Mielenkiintoista, AQP3 oli tiukasti ilmaistu C-soluissa, osoittaa kaksinkertainen värjäystä AQP3 ja kalsitoniinin. Sen sijaan, AQP4 ilmentyminen osoitettiin follikulaarinen soluissa, mutta ei C-soluissa. On yleisesti tunnettua, että C-solut tuottavat kalsitoniini ja follikulaarinen tuottavien solujen T3 ja T4 ovat peräisin eri alkuperää; C-solut ovat peräisin soluista, jotka liittyvät neljännen tai viidennen nielun pussi, mikä myötävaikuttaa ultimobranchial kehon ja follikulaarinen solut ovat enimmäkseen peräisin Endodermi juuressa kielen. Siksi on mahdollista, että ero ilmentyminen AQP3 C soluissa ja follikulaarinen soluja voisi liittyä niiden kehitykseen alkuperä ja /tai toiminto.

hyperplastic kilpirauhasen kudoksissa kuten kilpirauhasen kanssa Gravesin tauti tai monikyhmyinen struuma, meidän immunohistokemiallista analyysit paljastivat AQP4 proteiinin useimmissa kudoksissa: positiivinen taajuus 92%: in Gravesin tauti kilpirauhasen ja 97%: in monikyhmyinen goiters. Olemme pystyneet osoittamaan AQP3 proteiiniin ja mRNA on hyperplastic kudoksissa. Nämä havainnot viittaavat siihen, että AQP4 voi olla tärkeä rooli nesteen homeostaasin hyperplastisiin follikulaarinen soluissa sekä normaalin follikkelin soluja.

Viime paperi kuvattu hajanainen immunoreaktiivisuus AQP3 monenlaisia ​​ihmisen kudoksissa, kuten okasolusyöpä ihon, ruokatorven ja kohdun limakalvon kohdunkaulan, urothelial karsinooma, syljen karsinooma jne Medullary kilpirauhasen karsinoomat on myös raportoitu positiivisiksi AQP3 [39]. Tässä tutkimuksessa osoitimme, että AQP3 oli positiivinen useimmissa medullary kilpirauhasen karsinoomat ja negatiivinen follikkelisolujen johdettu kasvaimia käyttäen immunohistokemia yhdessä RT-PCR. Lisäksi löysimme AQP3 ilmaisun TT solulinjassa, joka on peräisin ihmisen medullaarikarsinoomaan. Siksi suosittelemme, että AQP3 voidaan liittyy biologiseen luonteeseen ihmisen medullaarinen kilpirauhasen syöpä soluja.

Tämän perusteella erityinen ilmaisu AQP3 TT-soluissa, olemme osoittaneet, että AQP3 mRNA-tasot kasvoivat merkittävästi FBS hoitoon. FBS on yhteinen osa eläinten soluviljelyväliaineiden; useita kasvainsolutyypit stimuloidaan käyttäen FBS [43], [44]. Tämä ehdotti meille, että tietyt komponentit FBS ovat mukana säännellä AQP3 ilmaisun, mutta tarkka biologinen molekyylimekanismin on vielä selvennettävä. Olemme myös havainneet, että AQP3 mRNA indusoitiin kalsiumin annoksesta riippuvalla tavalla TT-soluissa. Kalsiumhomeostaasissa in vivo on säätelevät sekä kalsitoniinin ja lisäkilpirauhashormonin [45]. Tuloksemme viittaavat siihen, että AQP3 saattaa olla mukana kalsiumin aineenvaihduntaa medullaarinen kilpirauhassyöpä soluja.

AQP4 ilmentymistä on raportoitu useita aivokasvainten, kuten gliooma, glioblastooma ja astrosytooma [31] – [33]. Tutkimuksemme on ensimmäinen raportti osoittaa että AQP4 ilmaisee kilpirauhasen kasvaimet; follikkelisolujen johdettu kasvaimia, paitsi erilaistumaton karsinooma, tuottavat usein AQP4. Positiivinen taajuus AQP4 oli 100% vuonna follikulaarinen adenoomia, 90% vuonna follikulaarinen karsinoomat ja 85% vuonna papillaarisen karsinoomia. Meidän RT-PCR-tulokset AQP4 mRNA täysin tukemaan näitä immunohistokemiallinen analyysit; tunnistimme AQP4 mRNA follikkelisolujen johdettuja sinoomasolulinjoja. Siksi ehdotamme, että AQP4 vesi aineenvaihdunta mekanismi on hyvässä kunnossa aikana neoplastisen transformaation. Koska roolia AQPs ihmisen kasvaimissa, useat tutkijat ovat raportoineet, että AQPs voivat koskea muuttoliike, invaasion ja kasvainsolujen lisääntymistä [46] – [49]. Tästä näkökulmasta, on mahdollista, että ilmaus AQP3 ja /tai AQP4 voivat edistää biologista käyttäytymistä kilpirauhasen kasvaimia.

Lisäksi on harkittava mahdollisuutta muiden AQPs eriytymättömissä kilpirauhaskarsinoomaa, jossa ei AQP3 eikä AQP4 ilmaistiin. Nämä havainnot antavat vihjeitä että muut AQP alatyyppejä saattaa olla mukana veden liikkumista eriytymättömissä kilpirauhasen karsinoomat ja lisätutkimuksia on suositeltavaa.

Yhteenvetona havaintomme osoittavat, että ero ilmaukset AQP3 ja AQP4 saattaa kuvastaa biologisen luonto ja /tai toiminta normaali, hyperplastic, ja neoplastisia kilpirauhassolut ja lisäksi on jonkin verran arvoa diagnosoimiseksi kilpirauhasen kasvaimia.

Kiitokset

Haluamme ilmoittaa seuraavaa josta saimme kilpirauhassyöpä solulinjoissa: KTC-1, TPC-1, Dr S Yamashita (Nagasakin yliopiston Graduate School of biolääketieteen Sciences, Nagasaki, Japani); WRO, tohtori J Fagin, (University of Cinicinnati, Cincinnati, OH) ja perustettu tri G Juillard (University of California, Los Angeles, CA); UA-1, UA-2, Dr T Kondo (University of Yamanashi, Yamanashi, Japan).