Krooninen sairaus

tiivistelmä

Aktivointi hypoksian indusoituvan transkriptiotekijän HIF ja NF ĸB polku edistää tulehdusvälitteisen syövän etenemiseen. Solu transkriptiotekijä ZNF395 on toistuvasti todettu yli-ilmentyy erilaisissa ihmisen syövissä, erityisesti vastauksena hypoksia, mikä toiminnallinen merkitys. Ymmärtää biologinen aktiivisuus ZNF395 tunnistimme kohdegeenien ZNF395 läpi genomin laajuinen ilmentymisen näyttö. Indusoi ZNF395 ilmentyminen johti säätelyä geenien tiedetään olevan rooli syövän sekä osajoukko interferoni (IFN) stimuloduista geenejä (ISG) mukana antiviraaliset vasteet, kuten IFIT1 /ISG56, IFI44 ja IFI16. Soluissa, joista puuttuu ZNF395, IFN-α-välitteistä stimulaatiota näistä tekijöistä oli heikentynyt, mikä osoittaa, että ZNF395 tarvitaan koko induktion näiden viruslääkkeiden geenejä. Lyhytaikaisissa transfektioissa paljasti, että ZNF395-aktivaatio IFIT1 /ISG56 promoottori riippuu kahden IFN-stimuloidun vaste-elementtien sisällä promoottorin ja DNA-sitovan domeenin ZNF395, ns C-clamp. Samalla osoitetaan, että IĸBα kinaasi (IKK) -signaling on tarpeen, jotta ZNF395 transkription aktivoimiseksi ja samalla parantaa sen proteolyyttisen hajoamisen. Siten ZNF395 aktivoituu tasolla proteiinin muutokseen, IKK. Lisäksi olemme vahvistavat, että ilmentyminen ZNF395 indusoidaan hypoksia. Tuloksemme luonnehtia ZNF395 uutena tekijä, joka edistää maksimaalista stimulaatiota osajoukko ISGs. Tämä transkriptionaalinen aktiivisuus riippuu IKK signalointi edelleen tukee roolia ZNF395 että synnynnäisen immuunivasteen. Näiden tulosten perusteella on mahdollista, että hypoksisissa olosuhteissa, kohonneet ZNF395 voi tukea tulehduksen ja syövän etenemistä aktivoimalla kohdegeenien mukana synnynnäisen immuunivasteen ja syöpä.

Citation: Jordanovski D, Herwartz C, Pawlowski A, Taute S, Frommolt P, Steger G (2013) Hypoksia-indusoituva transkriptiotekijä ZNF395 ohjataan IĸB kinaasi Merkinanto ja aktivoi geenien synnynnäisen immuunivasteen ja syöpä. PLoS ONE 8 (9): e74911. doi: 10,1371 /journal.pone.0074911

Editor: Karen L. Mossman, McMaster University, Kanada

vastaanotettu: 14 maaliskuu 2013; Hyväksytty: 07 elokuu 2013; Julkaistu 23 syyskuuta 2013

Copyright: © 2013 Steger et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Deutsche Forschungsgemeinschaft (avustus G. Steger, numero STE604 /5-1), Deutsche Krebshilfe ja Köln Fortune Program /Lääketieteellinen tiedekunta, University of Cologne, Saksa, myöntää numero 220/2010. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä olemassa.

Johdanto

Geenien ilmentyminen paneelit toistuvasti havaittu ilmentyminen solun tekijän ZNF395 (aiemmalta nimeltään PBF varten papilloomavirus sitova tekijä) lisäsi merkittävästi erilaisissa syövissä kuten munuaiskarsinoomia osteosarkoomia ja Ewing sarkoomat [ ,,,0],1,2,3,4]. Erityisesti vuonna glioblastoomat ja neuroblastoomat, ZNF395 oli yksi harvoista ilmen- tymisen lisääntymisen geenejä, jotka olivat ominainen niukkahappiseen vasteen ja liittyy tautiin tulos [5,6]. ZNF395 kuului myös geenit yliaktiivista eri syöpäsolulinjoissa hypoksia ja yliekspressiolla hypoksian indusoitavissa transkriptiotekijä-1α (HIF-1α) [7,8,9]. Nämä tiedot merkitsevät sitä, että ZNF395 on funktionaalinen rooli reittejä mukana hypoksia ja syöpä. Kuitenkin lähes mitään ei tiedetä biologista aktiivisuutta ZNF395 solun sisällä.

Hypoksia heijastaa hapenpuute esiintyy usein kehittää kasvaimia ja on myös ominaista akuutin pesäkkeitä kudoksen tulehdus. Prolyyli hydroksylaasien (tohtoreita) hydroksylaatiksi HIF-α-alayksiköiden ja kohdistaa ne ubikitiinistä riippuvainen hajoamista. Hypoksian olosuhteissa, tohtoreita estyvät. HIF-α-alayksiköiden sitten kerätä ja tumaan, jossa ne dimerisoimaan kanssa vakaa kumppani HIF-1β, ja sitoutuvat niiden kohdesekvenssin tunnetaan hypoksiavaste elementti (HRE). HIF indusoi yli 100 säätelevien geenien glukoosiaineenvaihdunnan, solujen lisääntymisen ja solujen eloonjäämistä sekä geenit, jotka ajavat angiogeneesiä ja indusoi immuunitoleranssiin (tarkistetaan [10]). Poikkeava NF-ĸB, avain immuunivasteen säädin, on toinen ominaisuus moniin syöpiin. Sitä edeltää IĸB kinaasin (IKK) -välitteisen fosforylaation estäjät NF-ĸB, The IĸBα proteiineja, jolloin niiden proteasomin riippuva hajoamista (tarkistetaan [11,12]). IKK kompleksi koostuu kahdesta katalyyttisestä alayksiköstä IKKβ ja IKKα ja sääntely IKKγ. NF-ĸB reitti on ratkaiseva synnynnäistä immuunivastetta. Tämä aloitetaan tunnistaessaan ei-itse taudinaiheuttajista liittyvien molekyylitason kuviot (PAMPs) jotka havaitaan isäntä hahmontunnistus reseptorit (PRR), kuten Toll-kaltainen reseptori 3 (TLR3). Ligandin sitoutuessa, eli virus-RNA, TLR3 laukaisee aktivointi kinaasien TBK1 ja IKK, mikä johtaa fosforylaatioon ja aktivointi transkriptiofaktoreiden IRF3 ja NF-ĸB, vastaavasti. IRF3 ja NF-ĸB aiheuttaa antiviraalisen vasteen lisäämällä ilmentymistä tyypin I interferonien (IFN) IFN-α: n ja IFN-β, jotka erittävät infektoituneet solut. Niiden sitoutuminen tyypin I IFN-reseptorin stimuloi JAK-STAT-reitin aktivoida transkriptiotekijä ISGF3. Monimutkainen sitten translokoituu tumaan, sitoutuu IFN-stimuloidun vaste-elementti (ISRE) ja edistää transkription IFN-stimuloidun geenien (ISGs), jotka koodaavat proteiineja, joilla on antiviraalisia vaikutuksia (katsaus [13]). Luontainen immuunivaste ja hypoksinen vaste on yhdistetty, koska hypoksia ei ainoastaan ​​stabiloi HIF1-α, mutta stimuloi myös NF-ĸB [14]. Aktivoitu NF-ĸB osoitettiin ajan säätelemään HIF-1α [15,16,17,18]. IKKβ paljastaa myös NF-ĸB riippumaton pro-tuumorigeenisiä toimintoja, käsittäen IKKβ välittämän fosforylaation tuumorisuppressorien FOXO3a ja p53, vastaavasti, mikä laukaisee niiden proteolyyttisen hajoamisen [19,20].

Olemme eristäneet avoimen luku- kehyksen (ORF) ja ZNF395 kyvyllään sitoutua säätelysekvenssien valvonnassa alueella useita papilloomaviruksen tyyppiä (PV) [21]. Lisäksi todettiin, että proteiini sitoutuu valvonnan alueelle Huntingtonin tauti (HD) geeni ja nimettiin HDBP2 (HD sitova proteiini 2) Tässä tutkimuksessa [22]. ORF varten ZNF395 on fylogeneettisesti säilynyt selkärankaisilla. Se on hyvin samanlainen kuin GLUT4 edistäjän tekijä (GEF, HDBP1), joka aktivoi geenin ilmentymisen GLUT4, glukoosin kuljettajaa, ja hiiren glukokortikoidin indusoiman geenin 1 (GIG1, ihmisen geenin ZNF704). Erityisesti, nämä proteiinit jakavat kolme erittäin konservoituneita alueita CR1, CR2 ja CR3 ja on mahdollista muodostaa yhden sinkkisormipolypeptidiin rakenne. ZNF395 luonnehdittiin tuma-sytoplasma-shuttling proteiini [22,23]. Yli-ilmentyminen ZNF395 solukuolema [24] ja tukahdutettu sekä HD-promoottori ja ihmisen PV tyyppi 8 (HPV8) promoottori, joka riippui DNA sitoutumiseen ZNF395 ja kohdistaminen SiN3 /HDAC1 /2 kompleksin [25,26] . Olimme kiinnostuneita tunnistamaan muita kohdegeenien ZNF395 ja ymmärtäminen valvonnasta sen transkriptionaalisen aktiivisuuden.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

Ihmisen ihosyöpä solulinja RTS3b on kuvattu [27] ja sen ystävällisesti I. Leigh, London, UK. RTS3b soluja pidettiin E-liuoksesta ja monosyyttistä U937 [28] RPMI1640, U87-MG ja C33A solujen DMEM, kaikki media oli täydennetty 10% FCS ja antibiootteja. U937, U87-MG ja C33A-solut hankittiin ATCC: ltä. Ohimenevä transfektiot suoritettiin X-tremeGENE reagenssia (Roche Diagnostics), mukaisesti valmistajan protokollaa. 48 tuntia myöhemmin lusiferaasi-aktiivisuus määritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [29]. Valon suhteellista yksikköä normalisoitiin proteiinin pitoisuudet näytteistä. Milloin on osoitettu, polyI: C (Invivogen) lisättiin 10 ng /ml 24 h, TNFa (Cell signalointi) on 1 ng /ml 24 h, BMS-345541 (Sigma-Aldrich) kanssa 5 uM 24 tunnin ajan, MG132 (Biomol) at 25 uM varten 24, ja IFN-α (Biomol) at 1000 U /ml 6 h. RTS3b-TR-ZNF395 solulinja transfektoimalla pcDNA6 /TR, jonka jälkeen pcDNA4 /vektori (molemmat Invitrogen), joka koodaa FLAG-leimatun ZNF395 ohjauksen alaisena tet-operaattorin elementtejä. Solulinja inkuboitiin doksisykliiniä (Dox) (1 ug /ml) 24 tunnin ajan ja indusoida FLAG-ZNF395. Hypoksia vaste tuotettiin injektoimalla N

2 kaasu inkubaattoriin, jotta saadaan O

2-pitoisuus oli 2%. Sitten soluja inkuboitiin 12 tuntia ja välittömästi talteen.

Plasmidit

pcDNA3.1-FLAG-ZNF395, pcDNA3.1-FLAG-ZNF395ΔCR1 ja pcDNA3.1-FLAG-ZNF395mtCR3 kuvattiin aiemmin [ ,,,0],23,25]. pcDNA3.1-FLAG-ZNF395mtNES muodostettiin kohdennetulla mutageneesillä. ISG56-pGL3-Luc-konstrukti kuvataan Grandvaux [30]. Poistot ja pistemutaatiot otettiin käyttöön joko kloonaamalla tarkoituksenmukainen PCR-tuotteiden pGL3-Luc tai mutageneesillä. IFI44-Luc saatiin kloonaamalla PCR-fragmentti tuotetaan genomi-DNA, joka koodaa 560 nukleotidiä ylävirran säätelyalueen, kuten + 1 osaksi pGL3-Luc. Ekspressiovektorin IRF3-5D kuvanneet Lin et ai. [31]. HA-IKKα (Addgene plasmidi 15469), HA-IKKβ (Addgene plasmidi 15470) ja FLAG-IKKβ, FLAG-IKKβ-K44M, FLAG-IKKβ-S177 /181E (Addgene plasmidit 11103, 11104, 11105), on julkaistu [32, 33].

RT-PCR: llä, microarray

Kokonais-RNA valmistettiin RNeasy Mini Kit Qiagen. cDNA-synteesi ja hybridisoimalla Affymetrix eksoni 1.0 ST array suoritti ryhmä Prof. Nürnberg (CCG, Köln, Saksa). Raakadata käsiteltiin käyttäen Affymetrix Power Tools, versio 1.12.0 ja Robust Multiarray keskiarvo (RMA) algoritmi [34]. Loppupään tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen R kielen tilastollinen tietojenkäsittely, versio 2.10.0. Kvantitatiivista tosiaikaista PCR: ää, 2 ug RNA: ta käänteistranskriptio käyttäen satunnaista aluketta ja SuperScript Vilo cDNA Synthesis Kit (Invitrogen). Reaaliaikainen PCR: t suoritettiin SybrGreen ja LightCycler järjestelmä (Roche Diagnostics). Merkityksen laskettiin t-testillä, jossa pariksi näytteitä. Alukesekvenssejä esitetään taulukossa 1. Meidän microarray kokeilun tiedot sijoitettiin GEO-tietokanta (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) ja joihin liitetään hakunumerolla GSE44327.

Gene

eteenpäin pohjamaali (5’to 3′) B Käänteisaluke (5’to 3´)

IFI16TGCACCCTCCACAAGCCATGGCTGTGGACATGIFI44TGGCAGTGACAACTCGTTTGACCGCTTCCCTCCAAAAISG56TCATCAGGTCAAGGATAGTCTGGGTGTTTCACATAGGCTAGTAGMEF2CGCCCTGAGTCTGAGGACAAGAGTGAGCTGACAGGGTTGCTPEG10AACAACAACAACAACTCCAAGTCTGCACCTGGCTCTGCAGIFIT2ACTGCAACCATGAGTGAGAACGCCTCGTTTTGCCCTTTGAGZNF395CGAAAAAGAAAGAACTCTGTGCTGTGTCCCCCAGATGGAGHPRTTGACACTGGCAAAACAATGCAGGTCCTTTTCACCAGCAAGCTTable 1. käytetyt alukkeet qRT-PCR.

CSV Lataa CSV

Sirna häiriöitä

Pieni häiritsevät RNA: t (siRNA, siGenome SMARTpool) saatiin altaan neljän kaksijuosteista RNA ( dsRNA) oligonukleotideja: IKKα (M-003473-02) ja IKKβ (M-003503-02) päässä Dharmacon, ZNF395 (sc-77820) Santa Cruz. kontrollina, siRNA vastaan ​​onkogeenin E6 HPV8 (8E6) [35 ] käytettiin samoja määriä kuin erityiset siRNA: t, vastaavasti. 6 cm-annoksia U87-MG ja RTS3b solut transfektoitiin 150pmol siZNF395, 250 tai 500pmol siIKKα, β tai sopiva määrä ohjaus siRNA käyttäen Lipofectamine RNAiMax (Invitrogen) .

Antibodies, Kromatiini immunosaostus (chip) Pitoisuus, geeli shift

kanin polyklonaalinen vasta-aine ZNF395 oli kuvattu aiemmin [21]. M2 FLAG-vasta-aine oli Sigma-Aldrich, anti- HA-vasta-aine Rochelta, anti-aktiini-vasta Santa Cruz, ja vasta-aineet IKKα ja IKKβ olivat Cell Signaling. Valmistaminen kokosoluekstraktien ja yhteistyötä immunosaostukset suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [36]. Defosforylaatio reaktiot suoritettiin λ-fosfataasin (Santa Cruz) mukaan valmistajan protokollaa. ChIP määritys tehtiin mukaan siru Pitoisuus protokolla Upstate Biotechnology. Läsnäolo ISG56 promoottorin fragmenttien sakka analysoitiin qPCR käyttämällä LightCycler järjestelmä (Roche Diagnostics) ja pohjamaali reunustavat sekvenssit -173-+1 että ISG56 promoottorin (eteenpäin 5′- TGAGATCTGGCTATTCTGTCTTGTGG-3, käänteinen 5′- ATGGTTGCAGGTCTGCAGTTTATCTG -3′). Gel siirtymät suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [25] seuraavien ds oligonukleotidi (vain päällyspunoksen annetaan): ISRE-wt: 5′-TTTAGTTTCACTTTCCCCTTTCGGTTTCCCTAGGT-3′; ISRE-mut114 /101: 5′-TTTAGTGTCACTTTCCCCTGTCGGTTTCCCTAGGT-3′, joka leimattiin

32P-γ-ATP tai käyttää kilpailijoita.

Tulokset

ZNF395 aktivoi geenejä, jotka liittyvät synnynnäisen immuunivasteen ja syövän

Olemme eristäneet cDNA ZNF395 alkaen HaCat soluista [21]. Tästä syystä, käytimme ihmisen keratinosyyttisolulinjan tutkia transkription tapahtumien vuoksi ilmentymisen ZNF395 oligonukleotidi mikrosiruja. Koska olemme havainneet aikaisemmin, että yli-ilmentyminen ZNF395 indusoi solujen kasvun esto [23], me syntyy solulinja, joka perustuu ihosyöpä johdettu RTS3b line [27], jolloin indusoituvan ilmentymisen ZNF395 ohjataan doksisykliiniä (Dox). Viisi riippumatonta viljelmiä inkuboitiin joko läsnä ollessa tai poissa ollessa Dox. Kun taas yhteensä proteiiniuute valmistettiin yksi näyte asetetaan vahvistaa ilmentymisen ZNF395 immunoblottauksella (IB) (kuvio 1A), jäljelle jäänyt neljä käytettiin eristäminen kokonais-RNA, joka oli transkriboitu cDNA: ksi, jota seuraa hybridisaatio GeneChip ihmisen eksoni 1.0 ST array Affymetrix. Geenien ilmentyminen erot arvioitiin Studentin t-testiä. Geenit on väärä löytö korko p 0,05 ja kertamuutos 1,5 katsottiin ilmentyä erilailla. Kymmenen tunnettujen geenien, jotka on lueteltu taulukossa 2, johdetaan nämä kriteerit. Kuusi ZNF395 aiheuttaman geenien tiedetään säätelevän IFN, jotka ovat IFIT1 (ISG56), IFIT2 (ISG54), IFI16, IFI44, CARD6, ja SAMD9. Geenit MACC1, PEG10, CALCOCO1, ja MEF2C on todettu olevan osallisena syövän (taulukko 2). ZNF395 aktivaatio IFIT1 /ISG56, IFIT2 /ISG54, IFI44, IFI16, PEG10, ja MEF2C näissä soluissa vahvistettiin kvantitatiivinen (q) RT-PCR RNA valmistettiin Dox-käsiteltyjen RTS3b-TR-FLAG-ZNF395 soluja verrattuna RNA käsittelemättömät solut (kuvio 1 B). On hyvin yllättävää, että ei ole havainnut mitään geeniä tukahdutettu ZNF395 vaikka reportterigeenin määritykset ZNF395 tehokkaasti tukahduttaa promoottorit [25].

(A) Stabiilisti transfektoidut RTS3b solut, jotka ilmentävät tet-repressorin ja FLAG-merkittyä ZNF395 hallinnassa tet indusoituvan promoottorin (kaistat 3, 4) tai tyhjän vektorin pcDNA4 /TO (kaistat 1, 2) kasvatettiin joko ilman (kaistat 1, 3) tai läsnä Dox (kaistat 2, 4) ja 24 . Uutteet käytettiin immunoblot (IB), joka kehitettiin FLAG-vasta-aineen ja anti-aktiini-vasta-aineen kontrollina. ns (ei tietyllä taajuusalueella) (B) Kokonais-RNA eristettiin RTS3b TR-FLAG-ZNF395 soluja, joko kasvatettu tai ilman Dox käytettiin qRT-PCR: n ekspression analysoimiseksi tekijät on esitetty kaaviossa. Vastaavat arvot normalisoitiin arvot housekeeping-geeni hypoksantiini bosyylitransferaasi (HPRT), ja ne, jotka saatiin soluista, joita kasvatettiin ilman Dox asetettiin 1 jokaista tekijä. Käyrä edustaa kahdella erillisen kokeen kukin suoritettiin kaksinkertaisina. Virhe palkit edustavat keskihajonnat. (C, D) RTS3b ja U87-MG-solut transfektoitiin kontrolli-siRNA tai siRNA kohdistaminen ZNF395 kahtena kappaleena. Yksi näytesarja käsiteltiin liuotin ja muut IFN-α, ennen kokonais-RNA eristettiin. QRT-PCR suoritettiin spesifisellä alukkeella monistaa ISG56, IFI44, IFI16 ja ZNF395 transkriptit. CP-arvot, jotka on saatu eri tekijät vakioitiin niitä vastaan, että taloudenhoito geeni HPRT. Arvoa RNA liuottimella käsitellyistä soluista, jotka on transfektoitu siControl asetettiin 1 kussakin tapauksessa. Kansi aktivoinnit laskettiin vertailevan kynnyksen kuvatun menetelmän Pfaffl et ai. [64]. QPCRs suoritettiin neljä kertaa ja standardipoikkeamat on esitetty. Arvot annetaan kuvassa heijastavat ei aiheuttama perusekspression tasolla puuttuessa ZNF395 (** p 0,01).

Gene nimi; liittymistä

kertainen ind.

t-testin

koko nimi; toiminto

interferoni säännelty: IFIT1 /ISG56; NM_0186602.940.0087Interferon aiheuttama proteiinin tetratricopeptide toistaa 1, antiviraalista [38] IFI16; NM_0055311.510.0278Interferon aiheuttama proteiinin 16, (Hin200), luontainen anturi DNA indusoi vanhenemista [43] IFI44; NM_0064172.890.0280Interferon aiheuttama proteiini 44, antiproliferatiivista ja antiviraalista [42] IFIT2 /ISG54; NM_0015471.60.044Interferon aiheuttama proteiinin tetratricopeptide toistaa 2, indusoi apoptoosin, antiviraalista [60] CARD6; NM_0325871.580.058Caspase rekrytointi verkkotunnuksen perhe, jäsen 6, NF-ĸB aktivaattori, liittyy karsinoomien [61] SAMD9; NM_0176541.60.066Sterile alfa motiivi verkkotunnuksen sisältävien 9; synnynnäinen viruslääke tekijä, TNFa reagoiva [62] Syöpään liittyvä: CALCOCO1; NM_0208981.670.0087Calcium sitova ja rulla-kela domain 1, transkription koaktivaattorikompleksien TCF /LEF ja β-kateniinin [58] MEF2C; NM_0023971.640.0087Myocyte tehostajana tekijä 2C, mahdolliset onkogeenin T-solujen akuutti lymfaattinen leukemia [57] PEG10; NM_0150681.570.0278Paternally ilmaisi 10, osallistuminen maksasolukarsinoomassa [63] MACC1; NM_1827621.590.0352Metastasis liittynyt paksusuolensyöpä 1; liittyvä paksusuolensyöpä etäpesäkkeitä [59] Tuntematon: ARMCX6; NM_0190071.660.0435Armadillo toista sisältävät, X-sidottu 6; unknownTable 2. ZNF395 aiheuttama geenien, jonka tunnuksena on mikrosiru, ovat mukana synnynnäisen immuunivasteen ja syövän etenemisessä.

RNA puhdistettiin neljä käsitellyn ja käsittelemättömän solujen näytteet, vastaavasti, käänteiskopioitiin ja hybridisoitiin kahdeksan itsenäistä oligonukleotidisirujen. Keskimääräinen kertainen muutos ja FDR q arvo Studentin t-testiä tarjotaan. Geenit jossa ilmentyminen indusoitiin yli 1,5 kertaisesti q 0,05 luetellaan myös niiden tallennusnumero ja tunnettuja toimintoja. CSV Lataa CSV

Havainto, että kuusi geenien tunnistettu microarray tunnetaan säännellyn IFN-geenien hiljaista roolin ZNF395 IFN-α-välitteistä stimulaatiota näiden kohdegeenien. Jotta analysoida osuus ZNF395 me transfektoitiin ohimenevästi normaalit RTS3b soluja ohjaus siRNA (siControl), joka on suunnattu HPV8E6 onkogeenin, joka ei ilmenny näillä soluilla, tai siRNA kohdistaminen ZNF395 (siZNF395) ja inkuboitiin solujen 40h myöhemmin IFN-α 6 h. QRT-PCR osoitti, että ilmentyminen ZNF395 ei ole muutettu, että siControl transfektoiduissa soluissa, koska IFN-α, mikä osoittaa, että ZNF395 ei säädetä tämän signaalin. ZNF395-spesifinen siRNA vähentää ZNF395 ilmaisu yli 90% (kuvio 1C). IFN-α indusoi ilmentymistä ISG56 190-kertainen kontrollisoluissa. Kun transfektio siRNA kohdistaminen ZNF395, IFN-α-aktivaatio oli vain 43-kertainen. MRNA tasolla IFI44 nousi 20-kertaiseksi IFN-α, kun taas tukahduttaminen ZNF395 tuotti 7,4-kertainen induktio IFN-α. Analysoimme myös ilmentymisen IFI16, joka on vain heikosti indusoitui microarray esitetty taulukossa 2. IFI16 transkriptien kasvoi 5-kertaiseksi vasteena IFN-α in siControl transfektoiduissa soluissa ja soluissa, joissa ZNF395 tukahdutettiin, IFN-α aktivoitu 2,2 kertainen (kuvio 1C). Näin ollen, ei ole ZNF395 voimakkaasti heikentynyt IFN-α-välitteisen induktion ISG56, IFI44 ja IFI16 on epiteelin RTS3b soluja. Olemme vahvistaneet osuus ZNF395 IFN-α riippuva stimulaation ISG56 ja IFI44 ilmentymistä astrosytoomassa solulinjassa U87-MG. Valitsimme tämän solulinjan koska Murat et al. kertoi, että ZNF395 indusoituu hypoksia U87-MG-soluissa [5]. Tukahduttamista ZNF395 siRNA laski pohjapinta taso selostukset ISG56 ja IFI44 noin 40 ja 50%, vastaavasti, stimuloitumattomassa soluissa (kuvio 1 D). ISG56 ilmentyminen indusoitiin 15-kertainen kontrollisoluissa ja 12-kertaisesti siZNF395-transfektoiduissa soluissa IFN-α, kun IFI44 ekspressio kasvoi vain 2-kertainen, koska IFN-α, ja 1,6-kertainen, kun ZNF395 pudotettiin . IFI16 tuskin aktivoitu riippumaton siitä ZNF395 oli läsnä tai ei. Näin ollen yleinen vaikutuksia IFN-α sekä knockdovvn ZNF395 olivat heikompia U87-MG verrattuna RTS3b soluihin. Kuitenkin, nämä tulokset osoittavat, että ZNF395 tarvitaan koko IFN-α vastaus indusoida IFI44, ISG56 ja IFI16.

ZNF395 vaatii CR3 DNA: ta sitova alue ja kaksi ISREs edistää ISG56 promoottorin

roolin tutkimiseksi ZNF395 induktioon ISG56, analysoimme rekombinantti ZNF395 ohimenevän transfektion määrityksissä, jossa reportteri-konstrukti, joka sisältää 654bp ylävirran säätelyalue on ISG56, joka sisältää promoottorin. Yliekspressio ZNF395 indusoi ISG56 promoottori 4-kertaiseksi, joka on alueella havaittu microarray (kuvio 2A). Olemme tunnistaneet alueet ZNF395 tarvitaan aktivointi ISG56 promoottorin. CR3 on ZNF395 on tarpeen sekvenssi-spesifisen DNA-sitoutumisen CG-rikas osa läsnä HPV8 ja Huntingtonin taudin geenin promoottori [22,23]. ZNF395mtCR3, jossa pistemutaatioita poistamista DNA sitoutumisen HPV8 promoottori [23] menettänyt kyvyn aktivoida ISG56-Luc ilme. Lisäksi ZNF395ΔCR1, josta puuttuu CR1 alueella, ei aktivoida. Nuclear-sytoplasminen sukkuloimisen ZNF395 osoitettiin vaatia tumasta signaali (NES) sijaitsee CR1 [22,23]. Jotta ero roolia NES ja CR1, me esitteli kaksi pistemutaatioita tuhota NES. ZNF395mtNES aktivoitu ISG56 promoottorin jopa 10-kertaiseksi (kuvio 2A). Siten jäännökset läsnä CR1 harjoittavat ZNF395 aktivaatio transkription, jota ei ole vielä käsitelty täällä. Korkeampi aktivointi ZNF395mtNES korreloi yksinoikeudella ydinvoiman lokalisoinnin ZNF395mtNES (julkaisemattomat tulokset) [22]. Ekspressio mutatoidun proteiinien on aiemmin osoitettu [23,25]. Vahvistusta aktivoinnit, me paljasti vaikutus endogeenisen ZNF395 promoottorista toimintaan saatiin ISG56-Luc ohimenevästi kotransfektoimalla siZNF395 tai siControl kanssa ISG56 Luc reportterikonstruktio. Tukahduttaminen ZNF395 johti 20% vähentäminen Luc toiminnan RTS3b ja C33A soluja, vastaavasti (kuvio 2B). Ektooppisesti ilmaisi ZNF395 pystyi myös aktivoida IFI44 promoottori läsnä reportterikonstruktio. Tämä sisältyi 590bp ylävirtaan aloituspaikan kahdella päällekkäin ISREs alkaen pos. -46–64 Että kartoitettiin aiemmin välittävän induktio IFN-α ja IFN-β [37]. Jälleen ZNF395mtNES osoittivat lisääntynyttä aktivoinnin, vaikka koko vaikutuksia pienempi kuin ISG56-Luc (kuvio 2C).

(A) RTS3b Solut siirrostettiin kuusi-kuoppalevyille ja transfektoitiin lyhytaikaisesti 500 ng ISG56- luc-reportterin konstrukti ja kasvavia määriä (5, 10, 20 ng) ekspressiovektorin ja FLAG-ZNF395 tai eri mutanttien per kuoppa, kuten on osoitettu. Rakenne ZNF395 sen konservoituneiden alueiden CR1, CR2 ja CR3 on kuvattu alla kuvaajat, mukaan lukien sekvenssin C-päätteen 25 aminohappoa, jotka ovat konservoituneita E-tail TCF-1E ja TCF-4E [52]. M at pos. 169 ja 172 muutettiin A mtNES kun ΔCR1 aminohapot 165-188 on poistettu. Aminohapot, jotka mutatoitiin mtCR3 ja mikä johtaa DNA: ta sitovaan on merkitty. (B) RTS3b ja C33A-solut transfektoitiin ensin siControl tai siZNF395 ja 24 myöhemmin kanssa ISG56-Luc reportteri-konstrukti. Kaikki kuvaajat ovat tulosta vähintään kolmen itsenäisen kokeen. Keskihajonnat annetaan. (C) RTS3b solut transfektoitiin väliaikaisesti lusiferaasireporttiterilla konstrukti, joka sisältää IFI44-promoottorin, mukaan lukien 560bp emästä ylävirtaan aloituskohdasta. Segmentin satamat kaksi päällekkäistä ISREs, joiden on osoitettu välittävän IFN-riippuvainen induktion IFI44. Ekspressiovektorin ZNF395 ja ZNF395mtNES kotransfektoitiin kuten A.

jälkeen määritetään sekvenssin vaatimukset ZNF395 on ISG56 promoottori. Kuten kuviossa 3A on esitetty, vaikka se on jonkin verran huonompi aktiivisuutta, poistamalla sekvenssejä jopa -117 ei poista aktivointi ZNF395. Poisto segmentin välillä -117 -93 dramaattisesti vähentynyt pohjapinta promoottorin aktiivisuutta, ja poisti stimulaation yliekspressoidun ZNF395. Tämä DNA-segmentti suhtautuu IFN-stimuloidun-vaste-elementtien (ISRE) I ja ISREII jotka välittävät induktio ISG56 jonka IRF3 ja IFN-α herkkä transkriptiotekijä ISGF3 [38]. Kahden pisteen mutaatioita ISREs, jotka olivat osoittautuneet poistaa vastata IRF3 [30], ja IFN-α (tuloksia ei ole esitetty) poistetaan aktivaation yliekspressio ZNF395 (kuvio 3B), mikä osoittaa, että ZNF395 toimii joko toinen tai molemmat ISRE elementtejä. Kaksi modifioitua konstrukteja, jotka sisältävät joko kaksi kopiota ISREII (ISG56-2x ISREII) tai kaksi kopiota ISREI (ISG56-2x ISREI), ZNF395 saadaan puolet aktivoinnin verrattuna wt-promoottori. Muutokset eivät vaikuta merkittävästi IRF3-5D, konstitutiivinen jatkuvasti aktiivisen mutantin IRF3 [31], sen kyky lisätä lusiferaasi-aktiivisuutta (kuvio 3C). Siten sekvenssi koostumus ISREI ja -II läsnä paino promoottori on optimaalinen ZNF395 aktivoimiseksi. Testata, onko ZNF395 sijaitsee endogeenisen ISG56 promoottorin, siru määrityksessä RTS3b-TR-FLAG-ZNF395 soluissa suoritettiin. Määrä fragmentti, joka sisältää ISG56-spesifinen ISREs, joka on vedetty alas FLAG-vasta-aineen uutteissa määritettiin qPCR. Otteita kasvatettujen solujen läsnä ollessa Dox indusoida ilmentymisen FLAG-ZNF395, FLAG-vasta-aine saostui 288% tulo (+ Dox, kuva 3D), joka edustaa 2,3-kertainen lisäys verrattuna IgG-ohjain, joka otetaan talteen 127 %: n tulo. Sen vahvistamiseksi, että ZNF395 voivat suoraan sitoutua ISREs, suoritimme geeli vuorossa. His-merkitty puhdistettiin ZNF395 siirtynyt radioaktiivisesti oligonukleotidi, joka koodaa kaksi ISREs on ISG56 promoottorin (ISRE-wt). Yllättäen oligonukleotidi, joka koodaa näiden kahden ISREs kanssa mutaatiot T-G pos. 114 ja 101 (ISRE-mut) oli yhtä hyvin sidottu ja pystyi kilpailemaan sitovia lisätään ylimäärin (kuvio 3E). Suora sitoutuminen ZNF395 varmistettiin ydin- otteita valmistettu RTS3b-TR-FLAG-ZNF395 soluja joko kasvatettu tai ilman Dox ja polyI: C, eli matkia dsRNA, vastaavasti. Yksi merkittävä bändi oli nähtävissä kaikkien otteita, riippumatta polyI: C ja Dox. Homologit ISG56-ISRE-p- oligonukleotidi, mutta ei mutatoitunut ISRE-mut oligonukleotidi pystyi kilpailemaan tämän monimutkaisen. Kun induktio ZNF395 ilmentymisen Dox ylimääräinen heikko juova, joka liikkuu yläpuolella suuret monimutkainen ilmestyi (kuva 3E, kaistat 9, 12). Tämä monimutkainen katosi, kun läsnä on ylimäärä leimaamatonta ISRE-wt sekä ISRE-mut oligonukleotidi. Koska tämä bändi vain havaittiin otteita solujen yli-ilmentävät rekombinantti ZNF395 ja käyttäytyi kuin puhdistettu ZNF395 koskien sekvenssispesifisyytensä, se voisi edustaa ZNF395 sidottu ISREs. Nämä havainnot merkitsevät sitä, että ZNF395 on suoraan sijaitsee ISREs. Kuitenkin sekvenssi spesifisyys havaittu lyhytaikaisissa transfektioissa voi nojautua ZNF395 sitoutumisen.

(A) Sequential deleetioita alkaen 5’loppuun ISG56 ylävirran säätelyalue tuotu ISG56-Luc rakentaa kuten on osoitettu kuvassa. Vastaava lusiferaasireportteri- konstruktit transfektoitiin yhdessä 5, 10 ja 20 ng FLAG-ZNF395 ekspressiovektoriin. Suhteellinen lusiferaasiaktiivisuus täyspitkän ISG56-Luc (= ISG56-654) konstrukti oli asetettu 1. yläpuolella olevat numerot kutakin edustaa kertaiseksi aktivointien aiheuttama ZNF395 kanssa suhteellinen aktiivisuus kunkin mutatoidun reportteri-konstrukti asetettu 1. (B ) konstrukti ISG56Δ117-93 sisältää deleetion kahden ISREs puitteissa täyspitkän ISG56-Luc rakentaa joka satamat ylävirran jopa -654bp kun ISG56-mtISRE I /II T kussakin ISRE on muuttunut G, kuten on esitetty alla kaaviossa. Kaikki reportteri konstruktit kotransfektoitiin uudelleen 5, 10 tai 20 ng ja ekspressiovektorin FLAG-ZNF395. Sekvenssi kahden ISREs läsnä ISG56 promoottorin pistemutaatiot, jotka on otettu käyttöön tarjotaan. (C) lyhytaikaisten transfektioiden ISG56-Luc reportterikonstrukteja joka muutettiin sisältämään joko kaksi kopiota ISRE I (ISG56-2x ISRE I) tai kaksi kappaletta ISRE II (ISG56-2x ISRE II) ja 5 ng: lla ekspressiovektoria varten ZNF395 tai IRF3-5D, vastaavasti. (D) ChIP-määrityksessä. RTS3b-TR-FLAG-ZNF395 soluja kasvatettiin läsnä ollessa tai ilman Dox, ristisilloitettu, ja altistettiin ChlP määrityksessä vasta-ainetta FLAG-tag ja ohjaus hiiri-IgG. Saostunut DNA-segmentit monistettiin LightCycler käyttäen alukkeita, jotka reunustavat ISREs on ISG56 promoottorin. ISG56-Luc toimittaja konstrukti vakiona mahdollistamiseksi kvantifiointiin. Kopioluvun saatu tulo oli asetettu yksi kutakin uutetta ja taitekohdan rikastamiseen laskettiin. PCR: t suoritettiin kolmena kappaleena (* p = 0,05). (E) Gel shift analyysi. Bakteereissa ilmaisi-merkitty puhdistettua Dn-ZNF395 (josta puuttuvat aminohapot 1-114) inkuboitiin 200 pg ISREI-p- (kaistat 1-4) tai ISRE-mut oligonukleotidi (kaistat 5-7), sekä radioaktiivisesti merkitty

32P -γ-ATP ja sitoutuminen analysoitiin natiivi PAA geeli. Kaistoilla 3 ja 6, 250-kertainen ylimäärä leimaamatonta ISRE-p- ja kaistoissa 4 ja 7, ja ISRE-mut oligonukleotidia lisättiin kilpailijoina. Geelin muutos näkyy oikealla tumauutteet valmistettiin RTS3b-TR-FLAG-ZNF395 soluja, joko inkuboitiin puuttuessa tai läsnä ollessa Dox ja polyI: C, kuten on esitetty, inkuboitiin leimatun ISRE-paino- oligonukleotidi ja 250 kertainen ylimäärä leimaamatonta ISRE-wt tai ISRE-mut oligonukleotidi. Kannan oletetun ZNF395-ISRE kompleksi on merkitty nuolella.

IKK arvosanat ZNF395 varten proteasomaalisten hajoamista

tulokset Tähän asti kuvattu osoittavat, että ZNF395 tarvitaan koko induktion of ISG56, IFI44 ja IFI16. Nämä IFN-stimuloidun tekijöiden tiedetään olevan osa jotain antiviraalista luontaisen immuunivasteen. Lisäksi, ISG56 voidaan aktivoida suoraan IRF3 kun TLR3 signalointi vasteena dsRNA. TLR3 on ilmaistu solujen immuunijärjestelmän ja epiteelisolut, jotka ovat RTS3b (tuloksia ei ole esitetty).

halusimme analysoida kohtalo ZNF395 tämän reitin mukaan lyhytaikaisissa transfektioissa.