Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tausta ja tarkoitus

ashwagandha on suosittu ayurvedic yrtti käytetty Intian perinteisen kodin lääketiede . Se on annettu erilaisia ​​terveyttä edistäviä vaikutuksia, joista mekanismeista eivät ole tiedossa. Olemme aiemmin raportoitu selektiivisen tappamisen syöpäsolujen lehtiuutteen ashwagandha (i-Extract) ja sen puhdistettua komponenttia Withanone. Esillä olevassa tutkimuksessa tutkimme sen mekanismi loss of-function seulonta (kumoamisen i-Pura aiheuttama syöpäsolun tappaminen) matkapuhelinverkon tavoitteet ja geenin polkuja.

Menetelmät /Principal Havainnot

Satunnaistetut ribotsyymi kirjasto vietiin syöpäsolujen ennen hoidon i-Pura. Ribotsyymit otettiin talteen soluista, joka selviytyi i-Extract hoitoa. Geenikohteet valitun ribotsyymejä (kuten ennustaa tietokantahaku) analysoitiin bioinformatiikan ja polku analyysejä. Tavoitteet validoitu niiden roolia i-Ote aiheuttama selektiivinen tappaminen syöpäsolujen biokemialliset ja molekyylitason määritykset. Viisitoista geeni-tavoitteita tunnistettiin ja tutkittiin niiden roolia erityisten syövän soluntappamisaktiivisuutta i-Pura ja sen kaksi pääosaa (Withaferin A ja Withanone) ryhtymällä shRNA välittämä geenien lähestymistapaa. Bioinformatiikka valitun geenin-tavoitteet paljasti osallistumista p53, apoptoosin ja insuliini /IGF signaalinvälitysreittien liittyy ROS signalointi. Tutkimme osallistumista ROS-signalointi komponentit (ROS tasoilla, DNA-vaurioita, mitokondriarakenne ja kalvojännite) ja osoittaa, että selektiivinen tappaminen syöpäsolujen välittävät induktioon oksidatiivisen stressin.

Johtopäätös

ashwagandha lehtiuutetta ja Withanone aiheuttaa valikoivan tappamisen syöpäsolujen induktion ROS-signaloinnin ja siten ovat mahdollisia reagensseja, jotka voivat ottaa palvelukseen ROS välittämän syövän kemoterapiaa.

Citation: Widodo N, Priyandoko D, Shah N, Wadhwa R, Kaul SC (2010) Valikoiva tappaminen syöpäsolujen ashwagandha lehtiuutetta ja sen Component Withanone Koskee ROS Signaling. PLoS ONE 5 (10): e13536. doi: 10,1371 /journal.pone.0013536

Editor: Vladimir N. Uversky, Indiana University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 20 heinäkuu 2010; Hyväksytty 23 syyskuuta 2010 Julkaistu: 21 lokakuu 2010

Copyright: © 2010 Widodo et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain avustuksia New Energy ja Industrial Technology Development Organization (Japani). N. S. on vastaanottaja MEXT Scholarship, Japani. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Intian perinteinen koti lääketieteen järjestelmä, Ayurveda on tunnettu sen vanhimman historian maailmassa. Ashwagandha (

rohtokoisio

; Solanaceae) yrtti, ylpeänä nimeltään Queen of Ayurveda on yksi yleisimmin käytetty kasveja Ayurveda erilaisia ​​vaikutuksia, jotka vaihtelevat kipulääke, supistava, adaptogen, tulehdusta, anti -stress, antispasmodic, diabeteksen, immunostimulanttiyhdistelmän ja sydäntä [1] – [4]. Otteita eri kasvien osia kuten root, ampua, siemenet ja marjat ovat olleet käytössä erilaisia ​​kodin-korjaamiseksi reseptit; root erityisen yhteinen lähde terveyttä edistävät alkaloideja, withanolides ja antioksidantteja. Tärkein aktiivinen rakenneosien ashwagandha lehdet ovat alkaloideja ja steroidiset laktonit (yleisesti tunnettu Withanolides) [5] – [7]. Olimme aiemmin tutkineet biologinen aktiivisuus alkoholipitoisen uutteen ashwagandha lehtiuutteen (i-Extract) ja osoitettiin, että sillä on vahva syövän vastainen vaikutus. Kemiallinen fraktiointi, aktiivisuus määrättiin sen osatekijän Withanone (i-Factor), joka on osoitettu aiheuttavan aktivoitumisen tuumorisuppressoriproteiinia p53 syöpäsoluissa vain [8], [9]. Normaalit ihmisen fibroblastit osoittivat säätely alaspäin p53-toiminto ja viivästynyt vanhenemista [10].

Tässä tutkimuksessa, odotimme, että selektiivinen syöpäsolu-tappamisen vaikutus i-Extract tai Withanone todennäköisesti välittyvän useampia geenejä /polkuja ja siten toteutti puolueeton menettämisestä perustuvaa lähestymistapaa, jossa geeni knockdown saavutettiin vasarapääribot- ribotsyymejä. Ribotsyymi väestö pelastettiin satunnaistetussa ribotsyymi kirjastosta-tartunnan ihmisen rintasyövän soluja, jotka selvisivät i-Extract hoidon ominaista. Bioinformatiikka, biokemialliset ja visuaalinen määrityksiä käytettiin tutkimaan tunnistettu geeni tavoitteet ja paljastaa niiden osallistumista i-Ote aiheuttama syöpäsolun tappaminen. Osoitamme, että valikoiva tappaminen syöpäsolujen i-uute ja sen komponenttien Withanone liittyy ROS signalointi.

Tulokset ja keskustelu

Hammerhead ribotsyymejä (HH-Rz) ovat pieniä katalyyttinen RNA: ita, jotka omistavat säilyneitä hammerhead kuten sekundaarinen rakenne. Ne taita osaksi aktiivisen konformaation sitoutumalla metalli-ionien ja hydrolysoivat fosfodiesterisidoksil- RNA säikeiden tietyissä kohteissa (NUX, jossa N voi olla mikä tahansa nukleotidi ja X voi olla A, C tai U) ja siten tunnetaan ”RNA sakset” [ ,,,0],11], [12]. HH-Rz on ollut käyttöä geeni- hiljentäminen työkaluja, koska niiden ominaisuudet, kuten korkea substraatin sitoutumisen spesifisyys, autokatalyyttinen toimintaa, joka ei vaadi muita entsyymejä, joustava rakenne mahdollistaa manipulointi ja puute interferoni vasteen nisäkässoluissa [13], [ ,,,0],14]. Jotta saadaan aikaan geenin tietyn ribotsyymi, sen tunnustamista varret (7-9 nukleotidia reunustavat kohdepaikkaan) on suunniteltu sisältämään sekvenssin, joka on komplementaarinen kohde-mRNA: han. Satunnaistaminen näistä 7-9 nukleotidin kussakin varren tuottaa monenlaisia ​​ribotsyymin, joka pystyy moniosaisia ​​mRNA alustoille [11]. Tällainen pooli degeneroitunut ribotsyymien ilmennetään eksogeeninen promoottori on käytetty välineenä tunnistamiseen liittyvien geenien apoptoosin, muuttoliike, invaasio, erilaistumiseen ja sairaudet [15] – [20]. Jotta voitaisiin tunnistaa solujen tavoitteet liittyvät syöpäsolujen cytotoxity ashwagandha lehtiuutteen (i-Extract), me tartunnan MCF7 solut retrovirus ajettu satunnaistettu ribotsyymi kirjasto ennen käsittelyä. Kuten on esitetty kuviossa 1, kun vektori tartunnan (kontrolli) soluissa, joita käsiteltiin i-uutetta johti solukuoleman, ribotsyymi kirjasto tartunnan kulttuurin osoitti solujen eloonjäämistä. Ribotsyymit pelastettiin näistä elossa solupopulaation ja ominaista kloonaaminen ja sekvenssianalyysi. Gene tavoitteet eristetyt ribotsyymin sekvenssit määritettiin tietokantahaku (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Mahdolliset geenikohteet ribotsyymin sekvenssit, jotka eristettiin useita kertoja on lueteltu kuviossa 1C. Voidakseen vahvistaa, että kyseisten geenien i-Ote aiheuttama syöpäsolujen tappaminen Sitouduimme kaksisuuntainen analyysit (i) geenispesifisistä shRNA välittämää hiljentäminen ja (ii) bioinformatiikan ja systeemibiologian suunnattu polku tutkimuksessa. Olemme valmistettu 7-geenin (IGF2R, SREBF2, AKAP11, TFAP2A, LHX3, TPX2 ja ING1) erityiset shRNAs ja tutkitaan niiden osallistumista i-Ote ja sen osat (Withanone ja Withaferin A) indusoi MCF7 solujen tappaminen. Jopa transfektion tehokkuus vaihtelee 40-60%, määritettynä transfektion GFP-proteiinia ekspressoivien plasmidi, hiljentäminen neljä geeneistä (ryhmä 1 – TPX2, ING1, TFAP2A ja LHX3) liittyi merkittävä (20-40%) lisätä solujen selviytymisen jälkeen i-Extract hoitoa (kuvio 2). Toinen kolme geeniä (ryhmä 2 – IGF2R, SREBF2 ja AKAP11) osoitti vain vähäistä (2-8%) kasvu selviytymisen. Lisäksi solut vaarantuu ekspression neljän ryhmän 1 geenejä karannut sytotoksista vaikutusta sekä Withanone ja Withaferin A. Nämä tiedot osoittivat, että nämä neljä geenit välittävät sytotoksisuutta i-Extract. Ne voivat kuitenkin olla kriittisesti mukana valikoiva myrkyllisyys i-Pura ja Withanone syöpäsolujen kuten kuvattu aikaisemmissa tutkimuksissa osoittaa osallistumista p53 tuumorisuppressorin väylän tätä ilmiötä [8]. Nämä tiedot osoittivat, että syöpäsolujen tappaminen i-uutetta välittämä, ainakin osittain, jonka TPX2, ING1, TFAP2A ja LHX3. TPX2 on mikrotubuluksiin liittyvää proteiinia, joka toimii allosteerinen säätelijänä Aurora-A, onkogeenin kanssa keskeinen rooli sentrosomimäärän kypsymisen ja kromosomi erottelu mitoosin aikana vaativat asennukseen ja kaksinapaisen kara [21] – [23]. Se on yli-ilmentynyt useissa ihmisen syövissä, ja on ehdotettu houkutteleva syövän tavoite [24]. TFAP2A on ratkaiseva merkitys kasvaimen kasvussa ja etenemisessä asetuksella E-kadheriinin, MMP-2, c-kit, p21

WAF-1, HER-2, BCL-2, insuliinin kaltainen kasvutekijä-reseptori-1 ja Smad signalointi [25]. LHX3 on homeodomeenin transkriptiotekijä ja pelaa myönteinen rooli alkion kehitykseen, solukohtalo- päättäväisyyttä ja oncogenesis [26], [27]. Toisaalta, ING1, joka on ING perhe proteiinia, on mukana ihmisen solujen vanhenemista, tuumorisuppressiogeeneksi ja apoptoosin [28], [29]. ING1 on osoitettu moduloivan p53 aktiivisuutta, ja sen alavirran efektoreja, p21

WAF1 ja Bax asetyloimalla ja stabilointi [30]. Yhdessä nämä tiedot osoittivat, että syöpäsolu tappaminen i-Ote saattaa liittyä tukahduttaminen TPX2, TFAP2A ja LHX3, ja aktivointi ING1 toimintoja; mekanismi ja selektiivisyys syöpäsolujen edelleen remian epäselvä.

Kaavamainen esitys menettämisestä toiminnon seulonta käyttäen satunnaistettu ribotsyymi kirjasto. Ohjaus solut käsiteltiin i-uute osoitti sytotoksisuutta (

). i-Pura käsitelty elossa Solut kerättiin (

B

). Ribotsyymit pelastettiin elossa soluista kloonaamalla ja karakterisoitiin sekvenssianalyysillä (

B

). Ehdokas geenikohteet on esitetty (

C

).

Solut transfektoidaan vektoreilla, jotka ilmentävät shRNA varten ilmoitettu geenejä. Vaikutus i-Extract arvioitiin solunelinkykyisyysmääritys. Tulokset edustavat keskiarvoa kolmesta kokeesta. Tilastollinen merkittävyys laskettiin varianssianalyysillä (ANOVA).

Jotta voitaisiin tunnistaa ratkaisevan solukohteita, me seuraavaksi sitoutui bioinformatiikan ja systeemibiologian lähestymistavan ja tutki verkko /polkuja tunnistetun geenin kuvatuista tavoitteista edellä (kuvio 3). Analyysit paljasti osallistumista eristetty geeni tavoitteiden useita erilaisia ​​biologisia prosesseja, kuten syövän synnyn, solusyklin, DNA: n korjaukseen ja nukleiinihapon aineenvaihduntaan (kuvio 3A). Kaksi ylintä tunnistettu väyliä olivat p53 tuumorisuppressorigeeni (geenikohteet – DDB2, CDKN1A, CDKN2B) ja apoptoosin (geenikohteet – IGF2R ja HSPA9). On huomioitava, että analyysit osoittivat, että 33%: n geenien p53-reitin ja sen sääntely, ja 7% geenien apoptoosin tunnistettiin viittaa siihen, että solukuolemaa i-uute sisältää kasvun pysähtymisen tai apoptoosin välittämän aktivoituminen kasvain p53-reitin. Lisäksi Ras, insuliini /IGF, angiogeneesi ja solun tukirangan säätelyreaktioissa jotka ovat tiiviisti sidoksissa apoptoosin ja kasvainten kehittymiseen tunnistettiin myös. Nämä tulokset osoittivat, että hiljentäminen kohdegeenien kumoaa i-Extract välittämä solun tappaminen suojaamalla soluja DNA-vaurioita, solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin. Verkon vuorovaikutus analyysi kohdegeenien suunniteltu neljä geeniklustereista – CDK4, TFAP2A, CDKN1A-p21 ja ING1 yhdistää p53 ja PCNA. Edistää näiden geeniryppäät aikana i-uute aiheuttama sytotoksisuuden viittaa siihen, että se voisi luonnehtia soluvasteita, mukaan lukien stressin vastaus (HSPA9, CDKN1A) ja DNA-vaurioita ja korjaus vastaus (ING1, DDB2 ja TFAP2A), joka huipentui kumpaankaan solusyklin pysähtymiseen tai apoptoosin (kuvio 3D). Näiden tietojen pohjalta tunnistetaan bioinformatiikan analyysissa ennusti, että i-Extract saattaisi aiheuttaa aktivoitumisen solujen stressiä signalointia ROS-välitteisen reittejä aloitettiin kahdella tasolla (i) mitokondrion stressi johtaa muutoksiin kalvojännite ja (ii) DNA-vaurioita stressi aktivoitumiseen johtavat DNA-vaurioiden ja kuntoutuskoneet (kuvio 3E). Huomattavaa on, että suurin osa tunnistetuista geenikohteet näytti mahtua ennustettu signalointipolkujen (kuvio 3E). Jotta testata tätä hypoteesia, me tutkimme, CDKNIA-p21 on kriittinen säädin i-Extract välittämä syöpäsolujen tappaminen. Kuten on esitetty kuviossa 4, i-uute välitteistä kasvun pysähtymistä MCF7-soluissa (kuvio 4A) on liittynyt aktivointi CDKN1A-p21 (kuvio 4B). Tutkimme myös tutkia CDKN1A-p21 oli kriittinen välittäjänä i-Pura aiheuttama selektiivinen syöpäsolun tappaminen. Kuten kuvioissa 4B ja 4C, kun taas CDKN1A-p21 lisääntyi MCF7-soluissa, se pysyi muuttumattomana normaaleissa (TIG-3) solujen vastauksena joko i-uute tai Withanone hoitoon. Sen sijaan Withaferin aiheuttanut sytotoksisuutta sekä syövän ja normaalin solun ja nähtiin aktivoida CDKN1A-p21 (kuvio 4C). Me tutkimme seuraavaksi aktivoinnin CDKN1A-p21 hallinnassa ja i-Pura käsitelty MCF7-soluissa transfektioiden neljän shRNAs että kumottu i-uute aiheuttama MCF7 soluntappokyky, ainakin osittain (kuva 2). Kuten kuvioissa 4D ja 4E, olemme huomanneet, että i-Extract indusoimaa CDKN1A-p21 ilmentymistä kumottiin pudotus kunkin näistä neljästä kohdegeenien. Nämä tiedot osoittivat, että CDKN1A-p21 on kriittinen välittäjä i-Pura aiheuttama selektiivinen kasvun pysähtymistä syöpäsoluissa. Olemme vihdoin testannut tätä hypoteesia käyttämällä isogeenisiin p53

+ /+, p53

– /-, p21

+ /+ ja p21

– /- HCT116 koolonkarsinoomasoluissa. Huomasimme, että taas p53

+ /+ ja p53

– /- solut osoittivat verrattavissa herkkyyttä i-uute (tuloksia ei ole esitetty), p21

– /- solut oli kaksi-kolme kertaa enemmän suvaitsevaisia i-Pura kohtelun kuin p21

+ /+ -soluista (kuvio 4F) myönteisen että CDKN1A-p21 on todellakin elintärkeä välittäjänä kasvun pysähtymisen aiheuttama i-uute syöpäsoluissa. Tiedot vastasi meidän ehdotetun mallin kuvassa 3E.

Biologiset prosessit, jotka olivat mukana i-Ote välittämä solukuolema ennustettiin sisältävän kasvaimen synnyssä, solujen lisääntymisen ja solusyklin (

) ja mukana p53, apoptoosin, ja insuliini /IGF signalointipolkujen (

B

). Useimmat hallitseva joukossa Näitä reittejä ovat p53 ja apoptoosin (

C

). Kohdegeenien esiintyi neljänä ryhmänä (CDK4, p21, ING1 ja TFAP2A), jotka oli kytketty p53 ja PCNA, osallistuvat solusyklin, DNA-vaurioita vastaus ja DNA korjaus geeni (

D

). Perustuu valittuun geenikohteet, ennustettiin, että i-Extract välittämä syöpäsolujen tappamista mukana ROS- välittämän vaurioita DNA ja mitokondrioiden tasolla CDKN1A kriittiseksi välittäjänä (

E

).

i-Pura aiheuttama kasvun pysähtymisen MCF7-solujen johtui heidän kiinni G2 solusyklin vaihe (

). Lisääntyminen CDKN1A-p21 ilmentymistä nähtiin MCF7-soluissa, kun niitä käsitellään i-Pura ja Withanone. Kasvua ei CDKN1A-p21 ilmentymistä nähtiin normaaleissa soluissa, kun läsnä on joko i-uute tai Withanone (

B

ja

C

). Knockdovvn kutakin neljää osoitti geenien vaarannu i-uute aiheuttamaa sytotoksisuutta myös palautui i-Extract aiheuttama CDKN1A-p21 säätelyä (

D

ja

E

). HCT116 p21

– /- solut olivat vähemmän herkkiä i-uute verrattuna niiden isogeenisiin p21

+ /+ soluja. Solujen elinkelpoisuus vasteena sarjaan kasvavien pitoisuuksien i-Extract (

F

).

Kuten ennustettiin reitin analyysi (kuvio 3E), tutkimme seuraavaksi osallistumista DNA-vaurion ja korjaus-signalointireitin in i-Ote aiheuttama syöpäsolun tappaminen. Kuten on esitetty, MCF7-solut osoittivat induktion γH2AX (varhainen markkeri DNA-vaurioita vastaus) vastauksena käsittely i-uute, Withaferin A ja Withanone (kuviot 5A ja 5B). Tutkimme myös fosforylaation γH2AX immunovärjäämällä fosforylaatio spesifisen vasta-aineen, ja todettiin, että solujen lukumäärä, jotka sisältävät fosforyloitua γH2AX oli 70% suurempi i-Extract käsiteltyjä soluja verrattuna kontrolliin (kuvio 5B). Kun taas Withaferin Hoidon aiheuttamaa γH2AX sekä normaaleissa ja syöpäsolujen, i-Pura ja Withanone aiheuttama γH2AX vain syöpäsoluissa (kuviot 5A ja 5C). Yhdessä nämä tiedot osoittivat, että valikoiva syöpäsolun tappaminen i-Pura ja Withanone välitti induktio DNA-vaurioita ja CDKN1A-p21, kuten on ennustettu kuvassa 3E.

DNA-vaurioita pesäkkeitä (

), induktio ja γH2AX fosforylaatiota (

B

) -assessed värjäämällä fosfo-spesifistä vasta-ainetta (100-200 solua per objektilasi laskettiin) havaittiin MCF7-soluissa käsiteltiin i-uute, Withaferin ja Withanone. Normaalit solut osoittivat DNA-vaurioita vasteen hoidossa vain Withaferin A (

ja

C

).

tutkimme seuraavaksi osallistumista stressin vastaus aloitettu mitokondriot i-Ote aiheuttama MCF7 solun tappaminen. Kuten kuvioissa 6A ja 6B, induktio ROS: n läsnä ollessa i-Extract havaittiin, sekä immunovärjäyksellä ja fluoresenssi Probe (HPF) menetelmiä. Yhdenmukainen sytotoksisuutta kaksi komponenttia (Withaferin A ja Withanone) i-uute, ROS induktio havaittiin sekä komponentit MCF7-soluissa, ja ainoastaan ​​Withaferin A TIG-3-soluja. Nämä tiedot osoittivat, että hoito i-Ote ja Withanone lukemiin induktion ROS, valikoivasti syöpäsoluissa, joten voi olla vastuussa valikoiva syöpäsolun tappaminen. Me seuraavaksi analysoitu mitokondrion kalvon potentiaalia, vaikuttaa suuresti ROS tasoilla. Kuten on esitetty kuvioissa 6C ja 6D, oli väheneminen mitokondrion kalvon potentiaalia MCF7-soluissa, kuten nähdään sekä JC-1-värjäys ja Rho-123 syrjäytymistä määrityksessä. Käsiteltäessä i-uute, MCF7-solut osoittivat muutosta JC-1 värjäystä punaisesta vihreäksi (kuvio 6C) ja negatiivinen Rho-123 värjäystä. Huomattavaa on, että normaali (TIG-3) solut tulenkestävät näihin muutoksiin, kun hoidettiin joko i-uute tai Withanone (kuvio 6C). Nämä tiedot meidät uskomaan, että i-Extract aiheuttama selektiivinen tappaminen syöpäsolujen mukana ROS stressi ja mitokondrioiden vaurioita. Saadakseen enemmän selvää näyttöä, tutkimme äärirakenteessa ohjaus ja i-Pura käsitelty MCF7-soluja yksisoluisia tason. Kuten kuviossa 6E, hallita MCF7-solut osoittivat tyypillisiä mitokondriaalisen morfologia, tunnettu kaksinkertainen kalvo, joka sisältää homogeenisen matriisin ja järjestelmä rinnakkaisten kristat. Withanone käsitellyt solut osoittivat turvoksissa mitokondrioita, joilla on muuttunut morfologia joka lyhentäminen ja määrän väheneminen kristat oli ilmeinen (kuvio 6E).

MCF7-solut osoittivat induktion ROS hoidetuilla i-uute, Withaferin A tai Withanone (

ja

B

). Normaalit solut osoittivat ROS induktio vain läsnäollessa Withaferin A (

). Mitokondrion kalvon potentiaalia MCF7 syöpäsoluja, kuten nähdään JC-1 värjäytymistä havaittiin i-Extract vain (

C

). Etuuskohteluun induktio mitokondrion transmembraaninen potentiaali MCF7-soluissa havaittiin virtaussytometrillä käyttäen RHO-123 kasvoi 0,2% populaatiosta ohjaimen 44% väestöstä käsiteltiin i-uute (

D

). Mitokondriovaurioita havaittiin Withanone saaneilla MCF7-soluissa. (

E

), Transmission elektronimikroskoopilla kuvia valvonta- ja Withanone käsiteltyjen MCF7-soluissa. Ohjaus solut osoittivat normaalia pitkänomainen mitokondrioiden (M) kanssa rinnakkain kristat (a) (laajentuneen boxed kuva,

b

), Withanone käsiteltyjä soluja osoittaa turvoksissa mitokondrioita kanssa vähensi numero kristat (c) (laajentuneen boxed kuva,

d

). N, Nucleus.

ROS ovat kemiallisesti reaktiivisia molekyylejä, joilla on keskeinen rooli signaalitransduktiossa, solujen kasvuun ja erilaistumiseen, sääntely entsyymin toimintaa ja immuunivastetta, mukaan lukien tulehduksen ja sytokiini tuotannon. Kun taas maltillista ROS edistää solujen lisääntymistä ja erilaistumista, sen liiallinen määrä aiheuttaa peruuttamatonta hapettumista DNA, proteiinit ja lipidit johtaa solun kuolemaan. Syöpäsolut usein osoittavat suurta oksidatiivista stressiä ja lisätä reaktiivisten hapen lajien (ROS) verrattuna normaaliin kanssa. Tämä korkeampaa ROS toimii selektiivinen terapeuttinen tavoite tekemällä syöpäsoluja alttiita ROS tuottavien reagenssien, ehdotetaan kemoterapia-reagenssit [31]. Pieni joukko tutkimuksia ovat esittäneet näyttöä ROS- välittämää valikoiva tappamista syöpäsoluja. Näitä ovat valikoivia apoptoosin syöpäsoluissa avokado uutetta [32], beeta-fenyylietyyli-isotiosyanaattia (PEITC) [33], talidomidi analogit [34] ja MKT077 [35] – [36]. Mielenkiintoista on, että suurin osa näistä reagensseista on osoitettu aiheuttavan mitokondrioiden disfunction [31] – [39]. Olemme osoittaneet, ensimmäistä kertaa, että Ashwagandha lehtiuutteen (i-Extract) ja sen komponenttien, Withanone toimivat ROS tuottavat aineet aiheuttavat DNA ja mitokondriovaurioita discriminately syöpäsoluja, ja siten ovat hyviä ehdokkaita turvallisen syövän hoidossa.

Materiaalit ja menetelmät

Solut ja satunnaistettu hammerhead ribotsyymin kirjaston seulonta

Ihmisen normaali fibroblasteja (TIG-3), rintasyöpä (MCF7), paksusuolen karsinooma (HCT116- p53

+ /+, p53

– /-, p21

+ /+ ja p21

– /-) ja hiiren pakkaus solut, PLAT-E saatiin japani Collection of Research Bioresources (JCRB) Cell pankin ja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen minimal essential (DMEM), kuten aiemmin on kuvattu [8] – [10]. Soluja käsiteltiin i-uute, Withanone ja Withaferin A 48-72 h elinkelpoisuuden, biokemiallisia ja visuaalinen analyysejä. Satunnaistettiin ribotsyymin kirjasto (pMX-puro-/Rz) valmistettiin ja infektoitiin MCF7-soluissa, kuten aiemmin on kuvattu [15]. Infektoidut solut valittiin puromysiiniä (2 ug /ml) -supplemented väliaineena 24-48 h, ja sitten käsiteltiin i-Extract. RNA valmistettiin, käyttäen Isogen (Invitrogen), mistä eloonjääneiden solujen jälkeen 4-5 päivää, kun kaikki solut ohjaus lautasen oli kuollut. Kokonais-RNA (2 ug) käytettiin RT-PCR: llä. Käänteistranskriptio suoritettiin pienempi aluketta (5′-TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTG GTA C-3 ’) ja MMLV transcriptase (42 ° C, 90 min) ja RT-tuotetta alistettiin PCR-monistus käyttäen ylemmän (5’ -tcc CCG GTT CGA aAC ​​CGG GCA-3 ’) ja alemman alukkeita (94 ° -52 ° -72 ° /30 s kukin, 20 sykliä). Monistettu PCR-tuote (~150 bp) kloonattiin TA-kloonausvektoriin (Promega) ja sekvensoitiin käyttäen T7-aluketta.

Geenispesifinen shRNA-vektorin kloonauksen

shRNA ekspressiovektoreita 7 geenien (IGF2R, SREBF2, AKAP11, TFAP2A, LHX3, TPX2 ja ING1) valmistettiin, kuten on kuvattu [15]. Kaksi kohdesivustot valittiin kunkin geenin. Kohdesekvenssien valittu ING1 olivat ATATGAAGTTTAAATTCTA ja GCCAAGACCTCCAAGAAGA, sillä TPX2 olivat GCAAGAAGGATGATATTAA ja GGGGAAGAATGGAACTGGA, sillä TFAP2A olivat GGAGGAAGATCTTTAAGAG ja GATCAAACTGTAATTAAGA, sillä AKAP11 olivat GAGTGAAGCTTTATCAAAT ja GCACAAACATGGAAAGTCA, sillä SREBF2 olivat GCCTCAACCTCAAACTCAG ja ATGCAAAGGTCAAAGATGA, sillä LHX3 olivat GCGACGAGTTCTACCTCAT ja GGGAGAGCGTTTACTGCAA sekä IGF2R olivat GGCAGAAACCCAAACTGAA ja GGAGGAAATACTACATTAA.

solunelinkykyisyysmääritys

Ihmisen rintasyöpä (MCF-7) transfektoitiin 50 ng osoitetun plasmidi-DNA. 24 tunnin kuluttua soluja käsiteltiin i-uute (6 ug /ml), Withaferin A (1 uM), Withanone (25 ug /ml) 48 tuntia. Tyhjä shRNA vektoria käytettiin kontrollina. Solujen elinkelpoisuus seurattiin WST-pohjainen soluproleferaatiomäärityksessä (Roche). Annokset i-Pura ja Withanone valittiin perustuu valikoivaan tappamiseen syöpäsolujen kuten aiemmin on kuvattu (8-10). Pienemmillä annoksilla i-Extract ja Withanone nähtiin erilaistumisen indusoimiseksi glioblastooma ja neuroblastoomasoluja [40, ja tietoja ei ole esitetty].

Western blotting

kokosolulysaatissa (10-20 ug) NP40 lyysipuskurissa, joka on saatu sentrifugoimalla 10000 rpm: ssä 20 minuutin ajan 4 ° C: ssa käytettiin immunoblottaus, kuten on kuvattu [8]. Käytetyt vasta-aineet olivat p53 (DO-1; Santa Cruz Biotechnology), anti-mortalin [8], p21 (C-19, Santa Cruz Biotechnology) ja anti-γH2AX-Fosforyloitu (Ser139) vasta-aine (Biolegend).

immunovärjäys

Solut pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), kiinnitettiin metanoli: asetoni (01:01), läpäiseviksi 0,2% PBST, blokattiin 2% BSA: ta (naudan seerumin albumiinia) /PBS: llä ja inkuboitiin jossa ensimmäinen ja toinen vasta-aine laimennettiin 2% BSA /PBS: ssä [8]. Sillä γH2AX värjäys, solut kiinnitettiin 4% formaldehydiä ja läpäiseviksi KCM liuosta (120 mM KCI, 20 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5, 0,1% Triton). Esto ja vasta-ainevalmiste tehtiin ABDIL liuosta (2% BSA: ta, 0,2% gelatiini, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, 20 mM Tris, pH 7,5, 0,1% natriumatsidi MilliQ veteen).

Detection reaktiivisten hapen lajien

reaktiivisia happiradikaaleja havaittiin fluoresenssivärjäys käyttäen Image-iT ™ LIVE Green reaktiivisen hapen (ROS) Detection Kit (Molecular Probes Inc., USA). Soluja viljeltiin lasipeitinlevyille sijoitetaan 12-kuoppaisille levyille ja käsiteltiin osoitetulla reagenssien 48 tuntia ja värjättiin ROS noudattaen valmistajien suosittelemien. Kvantifiointi ROS FACS-analyysi perustui HPF (2- [6- (4′-hydroksi) fenoksi-3H-ksanten-3-0n-9-yyli] bentsoehappo) fluoresenssin. Lyhyesti, MCF-7-soluja kasvatettiin 6 cm: n maljaa, kunnes 50% konfluenssiin, käsiteltiin i-uutetta 12 h, minkä jälkeen lisättiin HPF (10 mM). 4 tunnin jälkeen solut pestiin PBS: llä, kerättiin solukaapimella. Solujen fluoresenssi mitattiin Coulter Epic XL-virtaussytometrillä (Beckman).

Mitokondrioiden kalvon potentiaalia

Mitokondrioiden kalvon potentiaalia ohjaus ja käsiteltyjen solujen tutkittiin JC-1 ja RHO-123 [35] pohjainen solu-värjäys määrityksissä. JC-1-värjäys, MCF7-soluja viljeltiin 24-kuoppalevyillä (50-60% konfluenssi) käsiteltiin i-uutetta 48 h, mitä seurasi inkubointi JC-1-värjäys (10 ug /ml) 15 minuutin ajan 37 ° C CO

2-inkubaattorissa. Solut pestiin PBS: llä ja käsiteltiin mikroskopia. Sillä RHO-123 määrityksessä MCF-7-soluja kasvatettiin 6 cm: n maljaa, kunnes 50% konfluenssiin, käsiteltiin i-uutetta 48 tuntia. Käsitellyt solut inkuboitiin Rho123 (1 mM) -supplemented väliaineessa 1 tunnin ajan. Solut pestiin PBS: llä ja kerättiin solu- kaavin. Muutokset mitokondrion kalvon potentiaalia seurattiin Coulter Epic XL-virtaussytometrillä (Beckman).

Yhden solun Mikroskooppitutkimus analyysi

MCF7-solut maljattiin lasipeitinlevyille. 60% konfluenssiin, soluja käsiteltiin Withanone 24 tuntia. Ohjaus ja käsitellyt solut pestiin PBS: llä ja kiinnitettiin sitten 1,2% glutarldehyde 4 ° C: ssa 1 tunti. Sen jälkeen kiinnittämisen jälkeinen käsittely 1% OsO

4 4 ° C: ssa 1 h, solut pestiin PBS: ssä ja kuivattu läpi arvostellaan etanolikonsentraatiot kanssa loppuinkubointi n-butyyli glycidyel eetteri 15 minuuttia. Näytteet upotettiin Epoksihartsi (TAAB) ja leikattiin ohut kohdat, joiden Reichert ultramikrotomilla (Leica). Leikkeet värjättiin uranyyliasetaatilla ja lyijyn sitraatti ja tutkittiin Hitachi H-7000 elektronimikroskoopilla. Arvioida mitokondrion muutoksia, -50 solua näytettä kohti havaittiin kahdesta toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta.

bioinformatiikan ja tilastollisia analyysejä

Pathway analysointi ja biologinen prosessi yhdistys kartoitettiin käyttäen PANTHER-Expression data-analyysi [41] , [42], joka on käsitteellisesti yksinkertainen binomimallia testi verrata luokitusten useita klustereita valittujen luettelon viiteluettelo (NCBI:

Homo sapiens

Genes) tilastollisesti määrittää yli- tai aliedustus PANTHER luokitusluokkien. Biologinen prosessi tulos valittiin perustuen yliedustus arvo ja P-arvo on alle 0,5. Proteiini-proteiini vuorovaikutusten kohdegeenien suoritettiin Osprey perustuu yleisen Respository for Interaction Aineistot (ruudukko) ja Gene onthology (GO) [43].