Krooninen sairaus

tiivistelmä

Vastustuskyky keltarauhashormonia hoito on merkittävä este hoidossa kehittynyt ja toistuviin kohdun limakalvon syöpä. Fenretinidi on synteettinen retinoidi joka on arvioitu kliinisissä tutkimuksissa syövän terapeuttista ja Chemo estävän aineen. Fenretinidi on perustettu olla sytotoksisia monenlaisia ​​syöpäsoluja. Tässä tutkimuksessa osoitamme, että fenretinidi laski solujen elinkelpoisuuden ja indusoi apoptoosia Ishikawa-soluja, jotka ovat kohdun limakalvon syöpä-solulinjasta, annoksesta riippuvaisella tavalla

in-vitro

. Tämä vaikutus

havaittiin olevan

riippumaton retinoiinihapon tumareseptori signalointireitin.

Edelleen

, olemme osoittaneet, että tämä induktion apoptoosin fenretinidi voi johtua lisääntynyt retinolia otto kautta STRA6. Hiljentäminen STRA6 osoitettiin vähentävän apoptoosin joka estyi knockdovvn STRA6 ilmaisun Ishikawa soluissa. Tulosten perusteella

in vivo

tutkimus osoitti, että injektiot fenretinidi endometriumin syövän kasvaimet (luotu Ishikawa soluja) hiirissä esti kasvaimen kasvua tehokkaasti. Immunohistokemia hiirten kasvainten väheni Ki67 ilmaisun ja lisätä lohkaista kaspaasi-3 värjäyksen jälkeen fenretinidi hoidon verrattuna vehikkelillä käsiteltyihin hiiriin. Yhdessä tuloksemme ovat ensimmäinen luoda teho fenretinidi antituumoriaineena varten kohdun limakalvon syöpä sekä

in vitro

ja

in vivo

, joka tarjoaa arvokasta perustelut aloittamiseksi lisää prekliinisissä tutkimuksissa ja kliinisissä tutkimuksissa fenretinidi hoitoon endometriumin syövän.

Citation: Mittal N, Malpani S, Dyson M, Ono M, Coon JS, Kim JJ, et al. (2014) fenretinidi: uusi hoitomuoto endometriumsyöpään. PLoS ONE 9 (10): e110410. doi: 10,1371 /journal.pone.0110410

Editor: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 19 helmikuu 2014; Hyväksytty: 15 syyskuu 2014; Julkaistu: 23 lokakuu 2014

Copyright: © 2014 Mittal et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: rahoittajien ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Nämä tutkimukset tukivat antelias varoja John ja Diane O’Donnell (ja jako Naistenklinikka Oncology, NU) ja Reproductive Biology Division, NU. Tutkimukset tuki myös K12HD050121 ja ASRM urakehitystä palkinnon, joka myönnettiin Mary Ellen Pavone. Keskusta Support Grant (NCI CA060553) käytettiin upottamisen, leikkaamista ja värjäys tuumorikudoksissa. NU Cell Imaging Facility tuki häntä anteliaasti NCI CCSG P30 CA060553 joka myönnettiin Robert H Lurie Kattava Cancer Center.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kohdun limakalvon syöpä on yleisin gynecologic syöpä Yhdysvalloissa, oli arviolta 49560 uutta tapausta ja 8190 – kuolemista tapahtuu vuonna 2013 [1]. Todennäköisyys, että naisen on diagnosoitu tämä syöpä elinaikanaan on noin yksi 38 [2]. Ilmaantuvuus Tämän lisääntymiselin maligniteetti on kasvanut keskimäärin 1,1% vuodessa 2004-2008 ja kuolleisuus ovat lisääntyneet keskimäärin 0,3% vuodessa 1998-2007 [3]. Leikkaus, kemoterapiaa ja sädehoitoa ovat kolme perustettu lähestymistapoja hoitoon kohtukarsinooma [4], [5]. Kirurginen poisto kohdun ja adjuvanttihoitona johtavat yli 90% viiden vuoden pysyvyys. Toistuminen vastustuksen vuoksi kemoterapian tai sädehoidon aiheuttaa toinen suuri haaste terveydenhuollon ammattilaisille. Siksi on erittäin tärkeää tunnistaa uusia ja tehokkaita hoitoja kohdun limakalvon syöpien.

Kliinisesti, progestiinit, kuten megace (megestroliasetaatti), on käytetty hoitamaan kohdun pahanlaatuisten kasvainten, koska antagonistinen vaikutus progesteronin estrogeenin toimintaa . Progestiineja käytetään ensisijaisesti hoitava edennyt tai uusiutuva sairaus, köyhiä ehdokkaita leikkausta ja nuorilla naisilla, jotka haluaisivat säilyttää tulevaa hedelmällisyyttä. Täydellinen vaste voidaan saavuttaa, kun progestiinia hoito annetaan naisille kohdun limakalvon liikakasvu ja hyvin erilaistunut kohdun limakalvon adenokarsinooma; kuitenkin tehokkuutta progestiinia hoidon laskee kasvun kanssa sairauden vakavuuden. Lisäksi toistuminen voi tapahtua, kun progesteronin hoito lopetetaan [6], [7].

Etsiessään kohdennettua terapeuttista ainetta vastaan ​​kohdun limakalvon syöpä, edellinen

in-vitro

tutkimukset meidän lab osoittautunut huomattavan esto leviämisen kohdun limakalvon syöpä Ishikawa solulinjassa retinoiinihapon (RA) ja RA agonisti AM580 yhdiste [8]. Kuitenkin niiden kliininen käyttö on ollut tähän mennessä rajoittaa niiden epäsuotuisa sivuvaikutuksia profile [9]. RA ja niiden johdannaiset (joko luonnollisia tai synteettisiä yhdisteitä) on tunnustettu rooli sääntelyn solujen kasvua, erilaistumista ja apoptoosia. RA on mahdollista, että hoitoon ja ehkäisyyn syöpien [10], [11]. Retinolia (hallitseva retinoidien muodossa ihmiskehossa) pitää muuntaa retinoiinihappo osoittamaan biologista aktiivisuutta. Ensisijainen lähde RA on ravinnon A-vitamiinin, joka otetaan sisään suolesta ja pakattu retinyyliestereitä maksassa. Nämä retinyyliestereitä erittyvät liikkeeseen sitoutuu retinolia sitovan proteiinin (RBP) ja sen jälkeen otetaan soluihin

STRA6

(Kannustanut RA 6), on keskeinen solun pinnan reseptorin RBP [12]. Aiemmin laboratoriossamme ovat osoittaneet, että STRA6 on pääasiallinen säätelijä retinolin sisäänottoa kohdun limakalvon ja että vähentynyt tämän geenin ilmentyminen on endometrioosi voi edistää laski hydroxysteroid (17-beeta) dehydrogenaasi 2: (HSD17β2) mRNA: n ekspressio [13], joka johtaa on pysyvästi kohonneet estradioli. Olemme myös osoittaneet, että retinoidit vähentävät estrogeenin tuotantoa indusoimalla HSD17β2 ekspression endometriumin Ishikawa-soluja [14].

STRA6 on tärkein solun pinnan reseptoriin vastuussa retinolin ottoa. Kun solun sisällä, retinolin voidaan hapettaa biologisesti aktiivinen RA alkoholidehydrogenaaseja. RA ohjataan sitten sytoplasmasta erityisiä nukleaarihormonireseptorit RA-reseptoreihin (RAR) ja retinoidi-X-reseptorit (RXRs) on kaksi sisäistä sytoplasmisen kantajaproteiineja, erityisesti solun RA sitova proteiini 2 (CRABP2) ja rasvahappo sitovan proteiinin 5 (FABP5 ) [15]. Lopuksi, käyttämätön RA metaboloituu ja hävitetään pois soluista CYP26 entsyymien perheen, [16].

fenretinidi [N-4-hydroksifenyyli retinamidi (4-HPR)], synteettinen johdannainen all-trans retinoiinihappo on kyky aloittaa solujen apoptoosin jopa ATRA kestävä solulinjojen kanssa lisäetuna on vähäisempi sivuvaikutuksia profiilin. Ihmisen tutkimuksissa on havaittu, että merkittäviä sivuvaikutuksia ovat vähentynyt sopeutumista tummuutta silmien, ihon ja limakalvojen kuivumista, kutina, nokkosihottuma, ruoansulatuskanavan epämukavuus ja muutosta silmän pinnoille. Nämä haittavaikutukset olivat melko usein, mutta lieviä. Sellaisena se on tulossa yksi lupaavimmista antituumoriaineina [17]. Tutkimukset ovat osoittaneet, että fenretinidi voi aiheuttaa sytotoksisuutta useita ihmisen syövän solulinjoissa

in vitro

[18] – [23]. Kliinisesti fenretinidi on käytetty sekä chemopreventive agentti rintojen [24], virtsarakon [25] ja suun limakalvon syöpiä [26], ja kun kemoterapeuttinen aine lapsipotilailla [27], [28] ja aikuisten syövistä [29] – [31]. Vaikutusmekanismi on fenretinidi solukuolema ei ole vielä täysin selvitetty. Kuitenkin on ehdotettu, että sen inhiboivia vaikutuksia voi välittää sekä retiinihapporeseptorin riippuvainen riippumattomien mekanismien kautta [17].

Tässä tutkimuksessa tutkittiin terapeuttista potentiaalia fenretinidi antituumoriaineena sekä sen potentiaali vaikutusmekanismi vastaan ​​kohdun limakalvon syöpä sekä

in vitro

ja

in vivo.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

Kaikki eläinkokeet hyväksyttiin Northwestern University animal Care ja käyttö komitea.

kohdun limakalvon syövän solut kulttuuriin

kohdun limakalvon epiteelisolujen Ishikawa solulinjoja (ystävällinen lahja Dr. Masato Nishida Kasumigaura National Hospital , Tsuchiura, Ibaraki, Japani), olivat peräisin ihmisen pahanlaatuisia kohdun limakalvon epiteelisolujen [32]. Ishikawa-soluja viljeltiin monolayers 37 ° C: ssa, 5% CO 2-inkubaattorissa seoksessa DMEM ja F12 (01:01) väliaineessa, jossa 5% naudan sikiön seerumia (FBS), 1% natriumpyruvaattia ja 1% penisilliini-streptomysiiniä, hygromysiini antibiootit liuos (Life Technologies, Grand Island, New York).

sirna (siRNA) pudotus

Ishikawa-soluja kasvatettiin noin 80%: n konfluenssiin, sitten transfektoitu nontargeting negatiivisen kontrollin siRNA (siCTL) tai siRNA: ita vastaan ​​STRA6 (Life Technologies), 30 nM konsentraatio käyttäen Lipofectamine RNAiMAX mukaan valmistajan suositusten (Life Technologies). Transfektoituja soluja käsiteltiin joko DMSO: ssa tai 6 uM fenretinidi (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) liuosta 60 tuntia transfektion jälkeen. Solut kerättiin 24 tunnin kuluttua hoidon ja käsitellä reaaliaikaista PCR tai Western-blottauksella.

solunelinkykyisyysmääritys

Prestoblue (Life Technologies) solujen elinkelpoisuus reagenssia käytettiin arvioida solujen elinkykyä. Prestoblue on resatsuriini – pohjainen läpäisevä membraani ratkaisu, joka pelkistämällä, muuntuu resorufiini, punainen fluoresoiva yhdiste, joka voidaan kvantitatiivisesti mitata solujen elinvoimaisuuden määrittämiseen [33]. Ishikawa-soluja siirrostettiin (5 x 10

3 solua per kuoppa) 96-kuoppalevyille ja viljeltiin 24 tuntia 37 ° C: ssa. Sitten soluja seerumia 16-18 tunnin ajan [34], [35]. Sitten soluja kasvatettiin tuoreessa väliaineessa ja käsiteltiin eri pitoisuuksilla fenretinidi ja megestroliasetaatin (Sigma-Aldrich) 24 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Sytotoksisuuden fenretinidi ja megestroliasetaatin mitattiin lisäämällä Prestoblue reagenssin valmistajan ohjeiden mukaan. Fluoresenssisignaali mitattiin määrittämään solujen elinkelpoisuuden Synergia HT levylukijaa Bio-Tek kanssa KC4 3.4 ohjelmistoa 530/590 nm.

Western blot-analyysi

Ishikawa soluja käsiteltiin eri pitoisuuksia fenretinidi ja megestroliasetaatin (Sigma-Aldrich), tai ajoneuvon, lyysattiin RIPA [50 mM Tris, pH 8.0,150 mM natriumkloridia, 1,0% Triton X-100, 0,5% natriumdeoksikolaatti, 0,1% SDS: ää (natriumdodekyylisulfaatti ) täydennettynä proteaasi ja fosfataasiestäjät (Sigma-Aldrich). Selkeä lysaatit jälkeen saatu sentrifugoimalla 14000 rpm: ssä 15 minuuttia, ja proteiinikonsentraatio mitattiin käyttäen Micro BCA-pakkausta (Thermo Scientific, Rockford, Illinois). Proteiinit erotettiin natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidi- geelielektroforeesilla NOVEX NuPAGE 4-12% Bis-tris geelit (Life Technologies) ja siirrettiin polyvinylideenidifluoridi kalvoja (Whatman, GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ). Membraanit blokattiin 5% rasvatonta kuivamaitoa, yhden tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja hybridisoitiin erityisiä primaaristen vasta-aineiden kokonaismäärän ja pilkotaan PARP [poly (ADP-riboosi) polymeraasin], kaspaasi-9 lohkaista Kaspaasi-9 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) yön yli 4 ° C: ssa. Proteiinivyöhykkeet visualisoitiin käyttämällä tehostettua kemiluminesenssi- reagenssin ECL Super Signal West Femto detektioreagenssipakkaus (Thermo Scientific) hybridisaation jälkeen piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua vuohen anti-kaniini-vasta-ainetta (Cell Signaling Technology). Kalvot stripattiin Palauta Western Blot kuoriminen Buffer (Thermo Scientific) ja koetettiin beeta-aktiini (β-aktiini) vasta-ainetta (Sigma-Aldrich) Proteiinilisäyksen valvontaa.

Reaaliaikainen PCR

Kokonais-RNA eristettiin Ishikawa-soluja käyttäen Qiagen RNaeasy Kit (Qiagen, Valencia, CA) valmistajan protokollan. Puhtaus ja pitoisuus uutetaan RNA määritettiin käyttäen ND-1000 spektrofotometri (NanoDrop). 1 ug RNA: ta käänteistranskriboitiin Q-skripti cDNA Super sekoitus (Quanta Biosciences Inc., Gaithersburg, MD, USA) valmistajan protokollan mukaisesti. Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR suoritettiin ABI 7900 Sequence Detection ja ABI Virta Syber Green geenin ilmentymistä järjestelmät (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). MRNA kvantifioitiin käyttämällä kaupallisesti saatavilla olevia alukkeita STRA6, CRBP1, CYP26A1, CRABP2, FABP5, RAR-α, RAR-β, ja RXR-α (Qiagen) ja siivous GAPDH (Integrated DNA Technologies, Chicago, IL). Taitteen muutos ilmaisun laskettiin ΔΔCt menetelmää [36] kanssa GAPDH sisäisenä kontrollina. PCR: t suoritettiin ABI PRISM 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems) 40 sykliä (95 ° C: ssa 15 s, 60 ° C 1 minuutti), kun oli inkuboitu 10 minuuttia 95 ° C: ssa.

Vieraslajisiirteen hiiri malli

nainen CD-1 kateenkorvattomia nude-hiiriin (4-5 viikkoa vanhoja, Charles River Laboratories International Inc., Wilmington, MA) ylläpidettiin spesifisissä patogeenivapaissa olosuhteissa suuntaviivojen perusteella perustettu Northwestern University, Institutional Animal Care ja käyttö komitea. Hiiret poistettiin munasarjat, ja estradiolin pelletti (1,7 mg /pelletti, 60 päivää release) (Innovative Research of America, Sarasota, Florida) istutettiin ihon alle. Ishikawa ihmisen kohdun limakalvon syöpäsolu-line-solut (2 x 10

6 /0,1 ml) suspendoitiin 01:01 PBS /matrigeelin (BD Biosciences, San Jose, Kalifornia) ja injektoitiin subkutaanisesti sekä oikean ja vasemman sivun kunkin hiiren kasvainten annettiin kasvaa, ja kun tuumorit saavutti 50-150 mm

3 (joka tapahtui noin 2 viikkoa), hiiret jaettiin 4 ryhmään: 1. ajoneuvon, 2. megestroliasetaatti, 3 fenretinidi (Tocris Bioscience, Bristol , UK) ja fenretinidi + megestroliasetaatti. Megestroli actate pelletit (21 mg, 21-päivän luovutus 1 mg /vrk) (Innovative Research of America) istutettiin ihon alle. Hiirille annettiin 120 mg /kg fenretinidi tilavuudessa 10 ml /kg kehon painoa, 5 kertaa viikossa 3 viikkoa kautta intraperitoneaalisen injektion. Ohjaus hiiriä samalla hoidettiin i.p. injektiot 5% etanolia 0,9% NaCl, joka sisälsi 1,65 mg /ml naudan seerumialbumiinia. Ei ollut näyttöä paikallisen tai systeemisen toksisuuden i.p. hoidon annokseen [37] (Fig. S2). Hiiret punnittiin ja kasvainten koot mitattiin mittaharpilla kahdesti viikossa koko hoitojakso. Hiiret lopetettiin käyttämällä CO2 tukehtumisen ja kasvaimia resekoitiin. Kasvaimen kudoksissa hiiret punnittiin sitten upotettu parafiiniin lohko ja altistettiin immunohistokemia tai hematoksyliinillä ja eosiinilla (H 0,05 käytettiin kriteerinä tilastollista merkittävyyttä.

Tulokset

fenretinidi vähenee solujen elinkelpoisuutta ja lisää apoptoosia kohdun limakalvon syöpä Ishikawa solujen

in vitro

hoito Ishikawa solujen fenretinidi esti merkitsevästi solujen elinkelpoisuuden ja lisääntynyttä apoptoosia annoksesta riippuvalla tavalla (1A 1D). Fenretinidi 6 20 pm aiheutti laskua 38%: sta 99%: lla solujen elinkelpoisuutta ja apoptoosin lisääntyminen kuin ilmeistä nousu proteiinin tasot pilkkoa kaspaasin -9 ja halkaistut-PARP verrattuna ajoneuvon sekä käsiteltyihin soluihin. Fenretinidi havaittiin olevan myrkyllisiä soluille suurempia annoksia 2 uM 24 tunnin kuluttua käsittelystä (aineistoa ei esitetty). Jotta voidaan määrittää vaikutukset megace, Ishikawa-soluja käsiteltiin megace yksin eri pitoisuuksina ja yhdessä fenretinidi 24 tuntia ja solujen elinkelpoisuus apoptoosin arvioitiin. Megace ei ollut mitään vaikutusta Ishikawa solujen elinkelpoisuuden ja apoptoosin jopa 10 uM yksin tai yhdessä 6 uM fenretinidi (kuvio 1 B, 1 C 1E). Nämä tulokset viittaavat siihen, että fenretinidi vähentää solujen elävyyden ja indusoi apoptoosia Ishikawa soluissa

in vitro

tehden lupaava ehdokas testata sen teho

in vivo

.

Ishikawa soluja käsiteltiin DMSO (Veh), (A) 2-20μM fenretinidi, (B) 0.1-10μM megace tai (C) yhdistelmä megace + fenretinidi 24 tuntia ja solujen elinkyky mitattiin käyttäen Prestoblue reagenssia. Tiedot esitetään kertainen muutos suhteellisessa fluoresenssin yksiköissä DMSO käsiteltyjen näytteiden ja edustavat keskiarvoa ± SEM 4-5 itsenäisestä kokeesta. Tähti osoittaa merkittävää (*

P

0,05) lasku solujen elinkelpoisuuden Ishikawa käsitellyissä soluissa fenretinidi verrattuna DMSO hoidetussa ryhmässä. (D) Ishikawa-soluja käsiteltiin DMSO (Veh) tai 1-10 uM fenretinidi, joka indusoi apoptoosia annoksesta riippuvalla tavalla 24 h hoidon osoituksena nousu katkaistun kaspaasi-9 ja pilkotaan-PARP-proteiinin tasot western-blottauksella. (E) hoito Ishikawa solujen megace ei ole mitään vaikutusta näiden markkereiden apoptoosin. Aktiini käytettiin latauskontrollina. Blots edustavat 3 itsenäistä koetta.

fenretinidi kohdistaa kasvuun retinolia oton kautta STRA6 ja CRBP1

vaikutuksen määrittämiseksi fenretinidi annetun retinoiinihapon signalointireitin endometriumin syöpä, reaaliaikainen RT PCR suoritettiin. MRNA-tasot on STRA6, CRBP1 ja CYP26A1 huomattavasti kanssa fenretinidi hoitoon [kuvio 2 (A-C)]. MRNA näistä geeneistä pysyi muuttumattomana megace hoito yksinään tai yhdessä fenretinidi [Kuvio 3 (A-C]. Kuitenkin, fenretinidi ei ollut mitään vaikutusta mRNA: n tasot tumareseptorin geenien (RAR-α, RAR-β , RXR- α), tai sisäinen sytoplasman kantajaproteiinille CRABP2 ja FABP5 (kuvio S1).

Kokonais-RNA eristettiin Ishikawa-soluja käsiteltiin DMSO: ssa (Veh) tai 0.25-10μM fenretinidi 24 tuntia ja liittyvien geenien ekspressiota in retinoli sisäänotto mitattiin RT-qPCR. tiedot esitetään kertainen muutos suhteellisessa mRNA: n ilmentymisen on fenretinidi käsiteltyjen solujen DMSO käsiteltyjen näytteiden solujen ja edustavat keskiarvoa ± SEM 3 riippumattomasta kokeesta. tähti osoittaa merkittävää ( *

P

0,05) lisäys mRNA: n ilmentymisen (A) STRA6, (B) CRBP1 ja (C) CYP26A1 geenien Ishikawa-soluja käsiteltiin fenretinidi verrattuna DMSO: lla käsitellyssä ryhmässä.

Kokonais-RNA eristettiin Ishikawa-soluja käsiteltiin DMSO: ssa (Vehicle), megace, fenretinidi ja yhdistelmä megace ja fenretinidi molemmat. Suhteellinen mRNA ilmauksia (A) STRA6, (B) CRBP1 ja (C) CYP26A1 analysoitiin RT- qPCR. Tiedot esitetään kertainen muutos suhteellisessa ilmauksia mRNA DMSO käsiteltyjen näytteiden ja edustavat keskiarvoa ± SEM 5 riippumattomassa kokeessa. Tähti osoittaa merkittävää (*

P

0,05) lisäys mRNA näiden geenien ilmentymistä Ishikawa-soluja käsiteltiin fenretinidi tai megace + fenretinidi soluja verrattuna DMSO käsitellyissä soluissa.

STRA6 pudotus vaikutteita fenretinidi välittämää apoptoosia endometriumin Ishikawa soluissa

STRA6 on ensisijaisen solun pinnan retinolia reseptoriin soluissa vastuussa retinolia ottoa. Sen selvittämiseksi STRA6 on välttämätöntä fenretinidi aiheuttaman apoptoosin Ishikawa soluissa, endogeeninen STRA6 ilmaisu, joka pudotettiin käyttämällä siRNA. Kuten on esitetty kuviossa. 4A, pystyimme merkittävästi pudotus (76%) ilmentymistä STRA6 Ishikawa soluissa. Knockdovvn STRA6 kumoaa fenretinidi aiheuttaman apoptoosin Ishikawa soluissa (Kuva. 4B), kuten on esitetty pienentyneestä tasot pilkotun kaspaasi-9 ja halkaistut PARP kun STRA6 on vaimennettu. Nämä tulokset vahvasti tukevat hypoteesia, että STRA6 on ratkaiseva fenretinidi indusoiman apoptoosin endometriumin Ishikawa soluissa.

Ishikawa-soluja transfektoitiin 30 nM siCTL (nontargeting negatiivinen kontrolli siRNA) tai siSTRA6. (A) Kokonais-RNA eristettiin käsittelemättömien Ishikawa-soluja 3 peräkkäistä päivää transfektion jälkeen ja ilmentyminen STRA6 geenin mitattiin RT-qPCR. Tiedot esitetään kertainen muutos suhteellisessa mRNA: n ilmentymisen on STRA6 in siSTRA6 transfektoiduissa soluissa ja siCTL transfektoituja soluja ja edustavat keskiarvoa ± SEM 5 riippumattomassa kokeessa. Tähti osoittaa merkittävää (*

P

0,05) lasku mRNA ilmaus STRA6. (B) Transfektoituja Ishikawa-soluja käsiteltiin DMSO (Veh) tai 6 uM fenretinidi 24 h kuluttua ja immunoblottaus apoptoottisen markkereita suoritettiin. STRA6 geenien ilmentyminen pudotus esti fenretinidi aiheuttaman apoptoosin Ishikawa soluissa osoituksena proteiiniin heikkenee tasojen pilkotun kaspaasi-9 ja halkaistut-PARP. Blots edustavat 3 itsenäistä koetta.

fenretinidi estää syövän etenemisen: hiiren ksenograftimallia

Initial

in vitro

havainnot viittaavat siihen, että syövän vastaisen aktiivisuuden fenretinidi voivat johtua yhtiön mahdollisuuksia edistää apoptoosia kasvainsoluissa. Tarkastella tätä antituumorivaikutuksen fenretinidi

in-vivo

hiiret Siirto tehty ihonalaisiin kasvaimia. Fenretinidi hoito suppressoi merkittävästi syövän etenemisen hiirissä verrattuna vehikkelillä käsiteltyihin hiiriin (kuvio 5B), joka perustuu kertainen muutos tuumorin koon. Alenemiset kasvaimen tilavuuden olivat myös merkittäviä megace käsitellään sekä megace + fenretinidi käsitelty (kuvio 5B) verrattuna ja ajoneuvon käsitellyillä hiirillä. Lisäksi hiiret näyttivät sietää fenretinidi ja megace hoitoja ilman näkyvää toksisuuden oireita tai vakavan painon menetys verrattuna vehikkelillä käsitellyn ryhmän (kuvio S2).

(A) Munasarjat poistettu nude CD-1-naarashiiret injektoitiin jossa Ishikawa solujen sekä kylkien ja estrogeenin pelletit istutettiin. Kasvainten annettiin kasvaa 2 viikkoa. 2 viikon kuluttua kasvaimen perustamista, hiiriä käsiteltiin vehikkelillä (20 hiirtä), megace (19 hiirtä), fenretinidi (21 hiirtä) tai megace + fenretinidi (20 hiirtä) ja kasvaimet kerättiin talteen 3 viikkoa hoidon. (B) Kuvia edustajan leikattiin kasvainten kustakin ryhmästä. (C) Kansi muutos kasvaimen tilavuus (päivästä 1 hoito päivä uhrata) ajoneuvon, fenretinde, meagce tai molemmat fenretinidi + megace käsiteltyjen hiirten piirrettiin 3 viikon hoidon. Tiedot esitetään keskiarvoina ± min max kahdesta eri kokeissa. P-arvot osoittavat merkittävää inhibitiota fenretinidi, megace tai megace + fenretinidi sekä kasvaimen kasvuun (* P 0,05). Suurin lasku kasvaimen koon havaittiin käsitellyissä hiirissä fenretinidi yksin.

Hoito fenretinidi vähenee leviämisen ja lisää apoptoosia hiirillä kasvaimia

Vaikutus fenretinidi soluproliferaatioon ja apoptoosi arvioitiin immunohistokemiallisesti ja H

in vivo

.

Leikatut kasvaimet kiinnitettiin formaliiniin, parafiiniin ja leikattiin. (A) H E värjäys ja immunohistokemiallisella värjäyksellä anti-Ki67 vasta-aine (leviämisen markkeri) ja anti-katkaistuun kaspaasi -3 (apoptoosin merkki) on kokonaisia ​​tuumoriksenograftien. (B) Kuvat ovat 100

μ

m.

Keskustelu

fenretinidi on jo osoitettu olevan tehokas terapeuttinen ja chemopreventive vaihtoehto rinta- ja munasarjasyövän syövät [17]. Tämä tutkimus osoittaa käyttöä fenretinidi mahdollisena anti kasvain aineena endometriumsyöpään käyttäen sekä

in vitro

ja

in-vivo tutkimuksissa

. Fenretinidi vähentynyt ihmisen kohdun limakalvon syöpä Ishikawa solujen elävyyden indusoimalla apoptoosin osoituksena kasvu solukuoleman merkkiaineiden (pilkkoutuu kaspaasi-9 ja halkaistut PARP). Se inhiboi myös kasvaimen kasvua

in vivo

katsottuna väheneminen solujen lisääntymisen (Ki67) ja apoptoosin lisääntyminen (pilkkoutuu kaspaasi-3) hiirillä tuumoriksenograftien. Lisäksi olemme osoittaneet, että antituumorivaikutukset fenretinidi välittyvät lisääntyminen retinoli sisäänottoa, lisääntynyt ilmentyminen STRA6 nähdään fenretinidi käsitellyissä soluissa.

Viime aikoina tutkimukset Carrera, et al ovat osoittaneet rooli STRA6 p53-välitteisen solukuoleman vasteita normaaleissa ja syöpäsoluissa, joka on samanlainen kuin meidän tutkimustuloksia ja todettu olevan riippumaton loppupään aktivointi RA tavoitteet [38]. He osoittivat, että transfektio STRA6 indusoi merkittävän määrän apoptoosin RA herkkien munasarjasyöpäsoluja (erityisesti PA-1 ja A1847) sekä RA erottelua HCT116 paksusuolen syöpäsoluja. Lisäksi kirjoittajat havaitsivat, että STRA6 transfektio indusoi sekä pro-apoptoottisten ja tuumoria tukahduttavan vaikuttaa. Nämä havainnot yhdessä havaintojen Tutkimuksessamme viittaavat siihen, että STRA6 induktio voi olla potentiaalinen rooli tuumorisuppressiogeeneksi.

Edellinen kirjallisuus viittaa vuorovaikutuksen onnistuneen syövän solujen kemoterapia-lääkkeet ja niiden voisi käynnistää apoptoottisia reittejä. On vielä epäselvää, biologisista vaikutuksista kemoterapia-aineiden välittyvät suoraan vuorovaikutuksessa ydin- Retinoidireseptorit kautta tai uusia tumareseptorin riippumatonta reittejä [39]. Huomasimme, että hoito Ishikawa solujen fenretinidi johti solujen apoptoosin kautta induktion Caspase-9, kaspaasi -3 ja PARP. Induktio Näiden apoptoottisten reittien on havaittu myös rintasyövän [17] ja munasarjasyöpä [40]. Mielenkiintoista, vaiheen III rintasyöpä ehkäisy tutkimuksessa naisilla ennen vaihdevuosia on osoittanut, että hoito fenretinidi vähensi ilmaantuvuus toinen rinta maligniteettien ja munasarjasyöpäpotilaiden [41].

Toisin nykyisen tutkimuksen, muut tutkimukset ovat osoittaneet, että RA analogit voivat myös toimia aktivoimalla tumareseptoreihin. Tarkemmin, Ishikawa solujen lisääntymistä väheni ja apoptoosin aiheutettiin kautta RA signaloinnin mukana RAR /RXR aktivointi [8].

Progestiineja on pitkään käytetty lisääntymis- ikäiset naiset, jotka haluavat säilyttää hedelmällisyyttä sekä kehittyneissä ja toistuva kohdun limakalvon syöpä tapauksia, joita ei käsitellä syöpälääkkeiden, kuitenkin vähintään 30% potilailla, joilla on kohdun limakalvon syöpä resistenttejä hormonivalmisteiden, käytön rajoittaminen progestiinia hoidon [42]. Esillä olevassa tutkimuksessa, megace yksinään ei aiheuttanut apoptoosia meidän kohdun limakalvon syöpä malli, eikä se voimistaa anti kasvain aktiivisuuden fenretinidi

in vitro

tai

in vivo

.

rajoitukset tämän tutkimuksen ovat käytössä yhdellä hiiren malli ja käyttö viljeltyjen endometriumin Ishikawa solujen sijasta ensisijainen kohdun limakalvon syöpä soluja. Käyttämällä primääriviljelmässä on vaikeaa, koska kyvyttömyys kasvaa ensisijainen syöpäsoluja strooman tekijöitä. Lisätutkimukset ovat perusteltuja luomaan antitumor kapasiteettia fenretinidi eri kohdun limakalvon syövän solulinjoissa ja kasvain hiiri malleja.

Yhteenvetona olemme osoittaneet, että fenretinidi vähenee solujen elinkykyä, lisää apoptoosin, ja aiheuttaa lasku kasvaimen kokoa. Uskomme, että fenretinidi aiheuttaman apoptoosin vuoksi kasvu retinolia oton, erityisesti lisäämällä geenin ilmentymistä STRA6. Uskomme, että tämä tutkimus on ensimmäisten joukossa osoittaa, että fenretinidi on anti-kasvain potentiaalia vastaan ​​kohdun limakalvon syöpä. Uskomme, että tulevaisuudessa prekliinisissä ja kliinisissä kokeissa tarvitaan vahvistamaan sen potentiaalia uutena mahdollista terapeuttista ehdokas hoitoon endometriumin syövän.

tukeminen Information

Kuva S1.

käsittely Ishikawa solujen fenretinidi at 0,25-10

μ

M pitoisuuksia 24 tuntia ei muuttanut ilmaus retinoiinihapon tumareseptorin geenejä. Aineisto edustaa keskiarvoja ± keskivirhe kolmesta eri kokeita.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0110410.s001

(TIF) B Kuva S2.

Hoidot joko fenretinidi tai megace ole vaikutusta hiiren painon. Kehon paino mitattiin Vehicle käsitelty tai huumeiden hoitoa saaneiden hiirten kahdesti viikossa koko kokeen rime.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0110410.s002

(TIF) B