Krooninen sairaus

tiivistelmä

ihmisen papilloomavirus (HPV) on etiologinen tekijä kohdunkaulan syövän. Silti, HPV ei riitä aiheuttaa kohdunkaulan syöpää, koska useimmat tartunnan saaneet naiset kehittävät ohimenevä epiteelin dysplasioita että spontaanisti taantua. Etenemistä kohdunkaulan syöpä on kohdistettu erilaisia ​​isäntä tekijät, kuten immuuni tai hormonaalinen tila, koska mitään toistuva geneettisiä muutoksia on havaittu kohdunkaulan syöpiä. Niinpä nyt miettimään kuin biologisen perusteella kohdunkaulan syövän etenemisessä on jäänyt ratkaisematta, kehitystä vaikeuttavien Uusien hoitomuotojen sekä varoituksia testejä. Tässä osoitamme, että vähintään 20% kohdunkaulan syövistä satama somaattisesti hankittu mutaatioita

LKB1

kasvaimia estävä. Noin puolet kasvaimista mutaatioiden kanna yhden nukleotidin substituutioita tai microdeletions tunnistettavissa eksoni sekvensoinnilla, kun taas toinen puoli kanna suurempaa monoallelic tai kaksialleelisten poistot havaittavissa multiplex ligaatiolla koetin monistamisen (MLPA). Kaksialleeliset mutaatioita tunnistettiin Useimmissa kohdunkaulan syövän solulinjoissa; HeLa, ensimmäinen ihmisen solulinjassa, satamat homotsygoottinen 25 kb poistamista, joka tapahtui

in vivo

.

LKB1

inaktivaatiomenetelmät primaarikasvaimista kiihtyneen taudin etenemiseen. Mediaani elinaika oli vain 13 kuukautta potilailla, joilla on

LKB1

vajausta kasvaimia, mutta 100 kuukautta potilailla, joilla

LKB1

-wild tyypin kasvaimet (

P

= 0,015, log rank -testi; riskisuhde = 0,25, 95% CI = 0,083-0,77).

LKB1

on siis merkittävä kohdunkaulan kasvaimia estävä, osoittavat tiedot hankittu geneettisiä muutoksia ajaa etenemistä HPV aiheuttaman dysplasiat invasiivisia, tappavia syöpiä. Lisäksi

LKB1

tila voidaan hyödyntää kliinisesti ennustaa taudin uusiutumisen.

Citation: Wingo SN, Gallardo TD, Akbay EA, Liang M-C, Contreras CM, Boren T, et ai. (2009) Somatic

LKB1

Mutaatiot edistää kohdunkaulan syövän eteneminen. PLoS ONE 4 (4): e5137. doi: 10,1371 /journal.pone.0005137

Editor: Syed A. Aziz, Health Canada, Kanada

vastaanotettu: 20 helmikuu 2009; Hyväksytty: 10 maaliskuu 2009; Julkaistu: 02 huhtikuu 2009

Copyright: © 2009 Wingo et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoitettiin kautta Sidney Kimmel Translational Science Awards DHC, KKW, NB, ja NES, NIH NRSA F31 apurahan CMC, a Nuori tutkija palkinnon American Cancer Society /UT Southwestern Simmons Kattava Cancer Centerin DHC, ja National Center for Research Resources (K26RR024196) (DHC). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kohdunkaulan syöpä on yksi yleisimmistä syövistä maailmanlaajuisesti yli 500000 uutta tapausta ja 250.000 kuolemantapausta vuosittain. Kehitysmaissa, kohdunkaulan syöpä on johtava syy syöpäkuolemista naisten [1]. Infektio kohdunkaulan epiteelisolujen tarttuvan taudin, ihmisen papilloomavirus (HPV) -on kehittämiseen tarvittava kohdunkaulan syövän, kuten HPV-DNA-sekvenssit ovat havaittavissa 99% kohdunkaulan kasvaimista [2], [3]. Infektio ”korkean riskin” HPV-alatyyppien aloittaa syövän etenemiseen kumoamalla solusyklikontrollin ja apoptoosin tarkastuspisteiden läpi virus- onkoproteiineja E6 ja E7, jotka inaktivoivat p53 ja RB-tuumorisuppressorin väyliä vastaavasti [2]. Tämä johtaa muodostumista invasiivisen (

in situ

) kohdunkaulan dysplasioita tunnetaan Korkeatasoinen Squamous epiteelinsisäisen Vauriot, tai HSILs) [3], [4], [5]. Kuitenkin nämä HPV-indusoidun dysplasiat ovat oireettomia, ja useimmat häviävät, jotka osoittavat, että HPV ei ole riittävä saamaan aikaan kohdunkaulan syövän [2]. Etenemistä kohdunkaulan dysplasiat invasiivisia, tappava kohdunkaulasyövän syyksi on erilaiset tekijät, kuten immuuni, hormonaaliset ja ravitsemustila, tai koinfektointi muiden sukupuolitautien aineita, mutta tukevat tiedot ovat olleet moniselitteisiä [2]. Insertiomutageneesiin HPV on toinen ehdotettu kasvaimen edistämisen mekanismia, mutta viimeaikaiset tutkimukset ovat ei tue tätä olettamusta [6]. Ei yhteisiä, toistuviin geneettisiä muutoksia, jotka tekevät yhteistyötä HPV edistää kohdunkaulan syövän etenemistä on tunnistettu vuodesta Harald zur Hausen ensimmäinen tunnistettu HPV kausaalisena tarttuvan taudin kohdunkaulasyövän yli kolmekymmentä vuotta sitten [7]. Siten painamalla kysymyksen siitä, biologinen perusta kohdunkaulan syövän etenemisessä on jäänyt ratkaisematta.

ituradan mutaatioita

LKB1

tuumorisuppressorigeeniä (alias

STK11

) tulos Peutz-Jeghersin oireyhtymä (PJS), perinnöllinen ehto ominaista hyvänlaatuinen maha polyypit ja kohonnut ( 15 ×) pahanlaatuisten epiteelisyövissä eri anatomiset sivustoja [8].

LKB1

geeni on äskettäin osoitettu läpikäyvän somaattisen mutaation 30% ei-pienisoluisen keuhkosyövässä [9], [10], mikä viittaa siihen, että

LKB1

voi olla laaja kasvain vaimennin rooli. Tämä yhdistettynä meidän viimeaikaiset havainnot, että

Lkb1

inaktivaatiomenetelmät hiiren kohtuun tai orvaskeden edistää aggressiivinen kohdun limakalvon ja okasolusyöpää [11], [12] sai meidät tutkimaan rooliin

LKB1

vuonna kohdunkaulan syövän etenemiseen.

tulokset

somaattisesti-Hankittu

LKB1

Mutaatiot ovat yleisiä kohdunkaulan syöpä Across histologisen alatyypit

sekvensointi

LKB1

geenin ensisijainen kohdunkaulan kasvaimissa tunnistettu somaattisesti hankittu (non-ituradan) mutaatioita 8/86 (9%) näytteistä (taulukko 1, taulukko S1, kuvio 1A). Lisäksi muita esitettyjen havaintojen, useita havaintoja väittävät, että nämä mutaatiot ovat ryhmänä inaktivoivaa,

bona fide

syöpää aiheuttavia mutaatioita. Ensinnäkin, 4/8 kasvaimista kanna nonsensemutaatiota, deleetioita tai insertioita johtaen kehyksenvaihdon ja ennenaikaisesta päättämisestä. Loput neljä kasvaimia kanna kinaasialue mutaatioita jäämiä konservoituneita selkärankaisten lajien, ja kaksi näistä kasvaimista kanna tunnettu PJS mutaatio (p.Arg304Trp), joka kumoaa LKB1 kinaasiaktiivisuutta [13], [14], [15]. Lopuksi vain 1/9 koodaus variantteja olivat ituradan alkuperää, vs. 7/7 Koodaamattomat variantteja, ero, joka on tilastollisesti merkitsevä (p = 0,0014, Fisherin eksakti testi) varsinkin kun yksittäinen ituradan koodaavan variantti

c.2077C G

(p.Phe354Leu) on tunnettu ei-patologista neutraali variantti esiintyy terveillä henkilöillä [16]. Sekvensointi myös tunnistettu homotsygoottinen

LKB1

kinaasialue mutaatio kohdunkaulan syövän solulinja C4I (kuvio 1 B, taulukko S1).

(A) edustaja kromatogrammit primaarikasvainten. (B) C4I solulinjassa. Alempi paneeli, ohjaus DNA-näytteet jokaiselle potilaalle (varten C4I, ihmisen perifeerisen leukosyytti DNA). Villityypin sekvenssit on esitetty alla. Kromatogrammit edustavat eteenpäinjuoste paitsi tapauksessa # 41, jossa käänteinen komplementti näkyy selvemmin kuvaavat poisto. Mutaatiot Heterotsygoottisesti, ellei toisin mainita. (C)

LKB1

poistot ensisijainen kohdunkaulan kasvaimia MLPA. Bars = suhteellinen signaalin voimakkuus per anturi. Kuusitoista koettimia (musta) vastaavat

LKB1

lokukseen kromosomissa 19. Probe tunnukset alla. Koettimet 0.9M5 ”ja 0.6M5” ovat ~900 ja 600 kb 5 ’locus (telomeerinen), kun taas 10M3 ”on ~10000 kb 3’ (sentromeerisen); Loput 13 antureista vastaa

LKB1

Koodaamattomat /koodaus eksonia. Valkoiset pylväät vastaavat satunnaisesti valittu koettimien muista kromosomeista.

Vaikka yksi pieni (26 emäsparia)

LKB1

poisto edustaa täydellistä menettämisestä toiminnon tunnistettiin sekvensoimalla (Taulukko S1, kuvio 1A), suuremmat poistot olisi menetetty. Järjestelmällisesti seulomiseksi poistoista, multiplex ligaation riippuva anturi vahvistus (MLPA) kaikille 10

LKB1

eksonit ja kolme reunustavat koettimia käytettiin. Ottaa huomioon, että normaalin humaanin DNA: vertailunäytteet (n = 3) osoittivat johdonmukaisesti vastaavan signaalin voimakkuudet kaikkien koettimien, MLPA tunnistettu erillisiä

LKB1

deleetioita 10/86 kasvaimia (taulukko S1, kuvio 1C). Viidessä kasvaimet, poistot näytti olevan homotsygoottisia koska signaaleja vierekkäisiä antureista vähenivät 50% (kuvio 1 C, tapaukset 60 ja 22); jäännössignaalin näissä tapauksissa todennäköisesti heijastaa strooman saastuminen. Kasvainten kanssa näennäinen heterotsygoottista poistoja, yksi sisälsi myös merkittävän mutaation tunnistaa sekvensoimalla (asia 41, joka satamat 26 emäsparin deleetio, taulukko S1). Nämä havainnot ovat yhdenmukaisia ​​ihmisen ja hiiren tutkimukset osoittavat, että vaikka menetys toisen alleelin voi nopeuttaa syövän etenemiseen, mutaation yhden

LKB1

alleeli on itse tuumorigeenisia (eli

LKB1

voi olla haploinsufficient ) [9], [17]. On kuitenkin myös mahdollista, että jotkut mutaatiot meni huomaamatta, tai että strooman saastuminen johti aliarviointiin homotsygootista. Yhteenvetona, biologisesti merkittäviä

LKB1

mutaatiot, mukaan lukien deleetiot luonnehtia vähintään 20% (17/86) invasiivisen kohdunkaulan syövistä. Vain yksi tapaus tutkimuksessamme (tapaus 20, joka kanna somaattisesti hankittu

LKB1

mutaatio) diagnosoitiin minimaalinen-poikkeama adenokarsinooma (MDA), harvinainen, erittäin hyvin erilaistunut variantti kohdunkaulan adenokarsinooma liittyvä Peutz-Jeghersin oireyhtymä [18]. Siten

LKB1

mutaatioita kohdunkaulan syöpiä ei rajoitu tähän harvinaisen histologisen alatyypin mutta olivat läsnä koko pääasiallinen histologinen alatyyppejä kohdunkaulansyövän-adenokarsinooma, levyepiteelisyöpä, ja adenosquamous karsinooma (kuvio 2, taulukko S1) [ ,,,0],4].

(A) histologia edustavia tapauksia

LKB1

mutaatioita (SCC = levyepiteelikarsinooma; Adeno = adenokarsinooman; AdenoSq = adenosquamous karsinooma; MDA = minimaalinen poikkeama adenokarsinooma). Asteikko bar = 20 mikronia. (B) Suhteellinen jakautuminen kolmen pääasiallisen histologiset alatyypin joukossa

LKB1

-mutant (punainen) vs.

LKB1

-wild tyyppi (musta) tapauksessa (yhteensä = 100%) osoittaa, että histologiset spektri on käytännöllisesti katsoen identtinen

LKB1

null vs. villityypin kasvaimia.

poistot on

LKB1

luonnehtivat Suurin kohdunkaulan syövän solulinjoissa

ensisijainen kasvaimet ovat kloonaamalla erilaisia ​​ja sisältää vaihtelevia määriä soluja, kuten fibroblasteja, ja lymfosyyttejä, jotka voivat peittää näitä ja muita analyysejä. Tämän rajoituksen voittamiseksi ja saada edelleen oivalluksia rooliin

LKB1

kohdunkaulan syövän, paneeli seitsemän kohdunkaulan syövän solulinjoista (HeLa, HT 3, SiHa-, MS751, CaSki-, C33A, ja C4I) analysoitiin. Silmiinpistävän, viisi näistä seitsemästä solulinjojen kanna

LKB1

poistot, samoin kuin HeLa johdannainen HeLaS3 (kuvio 3A). Vain CaSki (kuvio 3A) ja C33A (ei esitetty) solulinjat eivät osoittaneet

LKB1

deleetioita. Suurin osa (4/7) kanna homotsygoottisia deleetioita, kun taas yksi solulinja, jossa on heterotsygoottinen poisto (C4I) myös kanna pistemutaatio (kuvio 1 B, taulukko S1) järkeistää Heterotsygotian menetys tälle mutaatio C4I. Southern-analyysi vahvisti menetys

LKB1

sekvenssejä (kuvio 3B), ja kuten odotettua, LKB1 proteiini ei ollut havaittavissa solulinjoissa kätkeminen homotsygoottisia deleetioita (kuvio 3C). Tämä usein homotsygoottisyyden

LKB1

mutaatioita solulinjoissa korostaa entisestään patogeeniset merkitystä

LKB1

tappio kohdunkaulan syöpä. Vaikka rivien käytettävissä ja siten analysoitu oli pieni, on huomattava, että suurin osa kohdunkaulan syövän solulinjoista kanna lopullista bialleleic

LKB1

mutaatioita. On myös mahdollista, että perustaminen ensisijaisen kohdunkaulan kasvain kulttuureissa painottuu

LKB1

vajausta kasvaimia.

(A) MLPA; katso kuva 1 anturin tiedot. HeLa, MS751, SiHa ja HT3 (ja HeLa alaklooni HeLaS3) sisältää erottuva homotsygoottisia deleetioita. C4I satamiin monoallelic poistetaan, mistä on osoituksena vierekkäisiä koettimien puoli-intensiteetin signaalit. (B) Southern-analyysi kontrolli-DNA, edellä solulinjat, C33 (ei poisto MLPA) ja HPV16 /E6E7 kuolemattomiksi endoservikaalisia solujen normaalin potilaan (Endo = End1 /E6E7; ATCC # CRL-2615). (C) Westem-analyysiä. LKB1 proteiini on huomaamaton linjat kätkeminen homotsygoottisia deleetioita ja laski -50% vuonna C4I, sopusoinnussa monoallelic menetys.

puuttuminen LKB1 proteiinin HeLa ja HeLaS3 on aiemmin todennut [19].

LKB1

geeni liittyy merkittävä CpG-saarekkeen, ja puute LKB1 proteiinia ja mRNA: n HeLa-soluissa oli aikaisemmin johtuvan promoottorin hypermetylaatio [20]. Emme kuitenkaan löytäneet mitään todisteita

LKB1

hypermetylaation by metylaatiospesifistä PCR missään solulinjassa tai primaarikasvaimen näytteitä. Päinvastoin, meidän tiedot osoittavat, että HeLa ja muut kohdunkaulan syövän solulinjat eivät ekspressoi

LKB1

koska homotsygoottisia deleetioita, sen sijaan seurauksena epigenetic hiljentäminen. Yhdenmukainen etukäteen tehtyjen tutkimusten HeLa [19] ja muut solulinjat [9], täytäntöön ilmentymistä villityypin LKB1 johti solusyklin pysähtymiseen ja kasvun estäminen, osoittamalla, että

LKB1

menetys näissä solulinjoissa on toiminnallisesti merkittäviä (tietoja ei näytetty).

määrittää poistetaan raja-arvot, PCR-reaktiot tuottavat pieniä amplikonien (100-200 bp), joiden tarkoituksena on kattaa lokuksen (kuvio 4A, B). Pisteytys (+/-) vahvistus kunkin tuotteen seuraa ylimääräisiä PCR-reaktioissa asteittain kapeampia tulosten perusteella alkuperäisen skannauksen sallitaan meitä kartoittamaan pysäytyskohtia muutaman kb (kuvio 4C). Jokainen neljästä solulinjojen kanna selvä deleetio (~20-110 kb) poistetaan osia

LKB1

ja enintään yksi muu reunustavat lokuksen (

SBNO

2).

(A)

LKB1

lokuksen (kromosomi 19p13.3). (B) 140 kb alue (Ensembl50; 1050000-1190000) virittävä

LKB1

ja välittömästi reunustavat loci; välein = 10 kb. (C) poistaminen breakpoints varten solulinjoja kätkeminen homotsygoottisia deleetioita. Vuonna MS751, poistetaan sekvenssit ovat epäjatkuvia, kuten on esitetty, mikä on yhdenmukaista monimutkaisempi uudelleenjärjestelyä. Nuolet = PCR alukkeiden HeLa PCR (400 bp). (D) HeLa PCR (400 bp) vahvistaa läsnäolo poiston HeLaS3. (E) HeLa geeninsisäiset

LKB1

poisto tapahtui

in vivo

. Arkistointi lohkot noukittiin varten DNA: n valmistus. Kaistat ovat seuraavasti: (-) kontrolli = templaattia sisältämättömään verrokkiin; kasvain = metastaattinen lisämunuaisen talletus; ei-kasvain = normaali lisämunuaisen (sama kudos lohko); (+) Kontrolli = HeLa-solulinjasta DNA.

Molecular kloonaus HeLa

LKB1

Poisto Junction ja

In vivo

alkuperä poistaminen

kloonaamiseksi koko HeLa risteyksessä, reunustavia alukkeita 5 ’ja 3’ raja-arvot kartoitetaan edellä PCR Skannausstrategialla oli suunniteltu monistamaan tietyn keskeytyskohta tuote. 2,8 kb: n liitok- sen fragmentti kloonattiin ja sekvensoitiin, mikä vahvistaa, että läsnä on deleetio (24662 bp, kuvio S1, kuvio 4C). Molemmat raja-arvot sijaittava Alu toistoja (kuva S1), mikä viittaa siihen, että kansainvälistä Alu homologisen rekombinaation tuotettu poisto. Luoda tehokas PCR-määritystä poiston, alukkeet välittömästi reunustavat toistuvat Alu sekvenssit kussakin murtuessa suunniteltiin (400 bp) (Kuva S1).

HeLaS3, klonaalinen johdannainen HeLa raportoitiin ensimmäisen vuonna 1955 [21 ], kanna sama

LKB1

poisto (kuvio 4D), perustamisesta 1955

terminus ante quem

alkuperälle poisto. Kuitenkin se pysyi virallisesti mahdollista, että

LKB1

poisto nousi

in vitro

perustamisen jälkeen HeLa ensisijaisesta kohdunkaulan adenokarsinooma 1951 [22]. Voit ratkaista tämän kysymyksen, HeLa kasvaimen DNA eristettiin arkistobittivirta parafinoidut kudosnäytekappaleessa valmisteltu aikana potilaan ruumiinavaus Johns Hopkins Hospital vuonna 1951. 400 emäsparin HeLa-spesifinen PCR-tuote monistettiin kasvain (kuvio 4E ), jossa todetaan, että

LKB1

poisto tapahtui

in vivo

.

esiintyminen

LKB1

HeLa poistetaan, kun potilas oli elossa ehdotettu, että

LKB1

inaktivaatio saattanut vaikuttaa tunnetusti aggressiivinen kasvu hänen kasvain sekä

in vivo

ja

in vitro

(katso alla ja keskustelua). Tutkia mahdollisuutta, että

LKB1

mutaatiot vaikuttavat sairauden tietenkin ilman taudin etenemistä dikäyrät potilaille, joiden kasvaimet kanna

LKB1

mutaatiot tunnistetaan sekvensoimalla tai MLPA (heterotsygoottinen tai homotsygoottinen) ja potilailla, joiden kasvaimet olivat villin tyypin

LKB1

. On silmiinpistävää, mediaani elinaika oli vain 13 kuukautta potilailla, joilla on

LKB1

vajausta kasvaimia, mutta 100 kuukautta potilailla, joilla

LKB1

-wild tyypin kasvaimet (kuva 5) (P = 0,015 , log-rank-testi; riskisuhde = 0,25, 95% CI = 0,083-0,77).

LKB1

vajausta kasvaimia ei ollut kehittyneempiä aikaan pysähdyspaikan, esimerkiksi, 28%

LKB1

-wild tyypin kasvaimet alun perin vaiheessa I (ainoastaan ​​kohtuun), vs. 43 % for

LKB1

vajausta kasvaimia, eikä korkeamman asteen (eli enemmän huonosti eriytetty). Siten

LKB1

mutaatioita kohdunkaulan kasvaimissa koituu vaiheessa-for-vaiheen lisääntynyt riski toistumista, mikä viittaa siihen, että määritykset on

LKB1

asema on kliinistä käytettävyyttä tunnistamisessa potilailla on lisääntynyt riski taudin eteneminen.

Kaplan-Meier käyrät osoittavat potilaiden osuus, joilla taudin etenemisen ajan. Käyrät vertaa potilaat, joiden kasvaimet olivat heterotsygoottinen tai homotsygoottisia mutaatioita /deleetioita (

LKB1

) vs. potilailla, joilla ei mutaatioita /deleetioita (paino). Potilaat, joilla on 1 Seurantakäynti otettiin mukaan analyysiin. P-arvo per log-rank-testi.

Keskustelu

tutkimus on ensimmäinen osoittaa, että toistuvia geneettisiä mutaatioita esiintyy kohdunkaulan syöpä. Aikaisempi tutkimus, joka tutki tätä kysymystä ei yksilöity

LKB1

mutaatioita satunnaista kohdunkaulan syöpiä, mutta vain vähän poikkeama adenokarsinoomat analysoitiin, kuten tavoite oli selvittää selvittää

LKB1

mutaatio taajuuksia gynekologiset maligniteetit tiedetään liittyvän PJS. Tämä aikaisempi tutkimus, tehdä ennen kynnyksellä MLPA, jonka tunnuksena LOH on

LKB1

19p13.3 alueella 3/8 tapauksissa, mikä viittaa siihen, että

LKB1

deleetiot voivat olla läsnä [ ,,,0],23]. Toisessa tutkimuksessa, jossa 26 kohdunkaulan kasvaimet analysoitiin yksijuosteisen konformationaalisen polymorfismi analyysi tunnistettu

LKB1

mutaatioita vain yhdessä tapauksessa [24]. Tämä tutkimus kuitenkin myös suuresti aliarvioitu taajuus

LKB1

mutaatioita keuhkosyöpä, nyt tiedetään esiintyvän 20%: ssa tapauksista. Kynnyksellä MLPA nyt helpottaa lopullisen tunnistamisen

LKB1

poistot, joiden osuus -50% mutaatioiden keuhkosyövän ja kohdunkaulan syövän (tämän ja muiden tutkimusten) [9]. Toinen tekijä mahdollisesti peittää ennen sekvenssianalyysit on epätavallisen korkea GC-pitoisuus

LKB1

eksoni alueilla. Kokemuksemme mukaan automatisoitu pohja puhelun ohjelmisto unohdetaan suuri osa mutaatioista, jotka edellyttävät suoraa tarkastus kromatogrammit.

Löydettiin homotsygoottinen

LKB1

poisto HeLa on huomionarvoista, koska historiallista merkitystä tämä solulinja biolääketieteen tutkimusta. HeLa oli peräisin vuonna 1951 alkaen kohdunkaulan adenokarsinooma. Koska ensimmäinen kuolemattomaksi ihmisen solulinja eristettiin ja onnistuneesti säilyttäneet

in vitro

, HeLa huomattavasti vauhdittanut biolääketieteellisen tutkimuksen toisella puoliskolla 20

luvulla [25]. HeLa-solut olivat epätavallisia kasvaa niin nopeasti kulttuuriin, mutta ensisijainen kasvain oli myös aggressiivinen. Primaarikasvaimen rajoittui kohdunkaula aikaan diagnoosi, mutta se etäpesäkkeitä aikaisin ja laajalti huolimatta aggressiivisen terapian kuten sädehoitoa, joka johtaa potilaan kuolemaan vain kuuden kuukauden kuluttua alustavan diagnoosin [26], [27], [28] . Tuloksemme viittaavat siihen, että homotsygoottinen deleetio olemme dokumentoitu

LKB1

osallistuneet tämän aggressiivinen kasvufenotyyppiä, järkeistää joitakin epätavallisia piirteitä HeLa primaarikasvaimen ja solulinjaa. Tämän mukaisesti ajatuksen, täytäntöön ilmaus

LKB1

cDNA HeLa- ja muut HeLa-puutosta solulinjoissa indusoi kasvun pysähtymisen (julkaisemattomia tietoja, katso myös [9], [19]).

Tämä on myös ensimmäinen raportti, joka

LKB1

mutaatiot antavat huonompi ennuste tietyn ihmisen syövän. Kuitenkin tämä havaintoja on linjassa geenitekniikalla hiiri malleja

LKB1

puutos jotka ovat johdonmukaisesti havaittu, että Lkb1 menetys edistää invasiivisen /metastaattinen kasvua. Vuonna

K-ras

ajettu hiiri malleja keuhkosyöpään,

Lkb1

inaktivaatiota edellyttäen vahvin yhteistyön suhteen kasvaimen latenssi ja tiheys etäpesäkkeiden (verrattuna klassiseen tuumorisuppressoreilla kuten

p53

ja

INK4a /Arf

). On myös huomattava, että

Lkb1

menetys keuhkojen liittyi laaja histologinen spektri (okasolusyöpää ja adenokarsinoomia), palauttaa mieliin, että

LKB1

inaktivaatio luonnehtii kohdunkaulan karsinoomat vaihtelevaa histologisten alatyyppien [9 ]. Samoin hiiret kohdennettuja inaktivaatio

Lkb1

endometriumin epiteelin kehittää erittäin invasiivisia (vielä paradoksaalisesti erittäin hyvin eriytetty) kohdun limakalvon adenokarsinooman [11]. Yhdessä nämä ja muut tulokset [12], [29], esittävät, että LKB1 estää eteneminen ja metastaasit, ja viittaavat siihen, että määritykset, jotka perustuvat LKB1 voi osoittautua hyödylliseksi ennustus erilaisia ​​syöpiä. On kiinnostavaa määrittää, jos

LKB1

mutaatiot ovat myös hyödyllisiä ennusteen muissa syövissä [9].

Se, että 99% kohdunkaulan syövistä sisältävät HPV-DNA [2] on näin useimpien kohdunkaulan syövän solulinjoissa jossa osoitimme homotsygoottinen

LKB1

poistoja (esim HeLa satamat integroitu HPV-18-sekvenssit) [30] viittaavat siihen, että

LKB1

ja HPV yhteistyötä jollakin tavalla . HPV-infektio edistää muodostumista

in situ

vaurioita, johtaa meidät ehdottamaan, että lisää mutaatioita geeneissä, kuten

LKB1

tarvitaan muuntamaan

in situ

dysplasiat ja invasiivisia karsinoomia, ajatus sopusoinnussa monipuolinen eläinmalleissa edellä. Lisätutkimuksia ts geenitekniikalla eläinmalleissa tarvitaan ymmärtää biologinen perusta vuorovaikutuksen HPV ja LKB1. Biologinen ja biokemiallinen perusta LKB1-välitteisen syövän synty vielä täysin selvitetty. Misregulation on AMPK-mTOR polku todennäköisesti edesauttaa LKB1 roolia tuumorisuppressorina, mutta luultavasti ei täysin huomioon sen rooli välittämisessä invasion [31]. Kuitenkin misregulation mTOR in LKB1 puutosta kasvaimet voivat aiheuttaa mahdollisuuksia täsmähoitoihin (esimerkiksi käyttämällä metformiinin tai rapamysiinianalogien) naisilla, joiden kohdunkaulan kasvaimet ovat vahvistaneet

LKB1

mutaatioita /poistot, ajatus siitä, että kannattaa vielä tutkimus tulevaisuudessa.

biologinen perusta etenemisen HPV-indusoidun precancers on määrittelemätön. Tämä tutkimus esittelee ensimmäisen lopullista näyttöä siitä, että toistuvat mutaatioita diskreetti isäntägeenejä esiintyä invasiivisen kohdunkaulan syövän. Vaikka muut tekijät todennäköisesti vaikuttavat eteneminen, tämä tutkimus osoittaa, että prosessi todennäköisesti stokastisia-nimittäin hankinnan erillisten geneettisten mutaatioiden-asemat etenemistä kohdunkaulan dysplasioita invasiivisia tappava karsinoomat ja että nämä mutaatiot on potentiaalia olla hyödyllinen prognosticators.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Tämä tutkimus suoritettiin periaatteiden mukaisesti ilmaistu Helsingin julistus. Tutkimuksen hyväksyi Institutional Review Board of UT Southwestern ja Johns Hopkins sairaaloissa.

Patient Näytteet ja Solulinjat

Potilaat potilaiden alaryhmässä diagnosoitu primääri kohdunkaulan syövän UT Southwestern yliopistollisen sairaalan välillä 2000-2007 ja jotka antoivat tietoisen suostumuksen. Histopatologinen diagnoosi tehtiin kohti vakioperusteita [4]. Riittäviä määriä kudosta primaarikasvaimen oli oltava käytettävissä, jotta DNA: n eristämiseen sekvensointia ja MLPA; muuten ei ollut poissulkukriteereitä. Useimmilla potilailla kontrolloida DNA valmistettiin verestä; pieni määrä potilaita, joille veri on käytettävissä, DNA valmistettiin parafinoidut kontrollisilkkipaperia. Kasvaimen vaihe määritettiin per FIGO kriteerit. Tiedot taudin etenemiseen analyysiä kohden RECIST kriteerien saatiin seurantakäyntejä. Suosittelemme, että potilailla on seurantakäynnit 3 kuukauden välein 2 vuoden ajan, sitten 6 kuukauden välein 3 vuotta, ja sen jälkeen vuosittain. Sillä ilman taudin etenemistä, aika loppuun ensisijainen hoito uusiutumiseen tai kuolemaan tallennettiin. Tietoja potilaista ilman kasvaimen uusiutumisen sensuroitiin aikaan viimeisen seurantakäynnin. Sillä HeLa kasvain-tutkimuksessa parafiiniblokkiin saatiin arkistoista Johns Hopkins Hospital. Solulinjat hankittiin ATCC: ltä.

DNA Sequencing

DNA valmistettiin käyttäen Qiagen genomista DNA: ta saraketta. Kahden askel ”boost /pesä” PCR strategiaa käytettiin jossa vauhtia reaktio tuotti suurempi fragmentti käytettiin mallina pesä reaktiota. Pesä tuotteet kaksisuuntaisesti sekvensoitiin ABI 3730 XL sekvensserit ABI Big Dye Terminator 3.1 kemiaa. Base kutsuvan suoritettiin Agent järjestelmä (Paracel). Sequence tracings tutkittiin visuaalisesti vahvistaa tarkka variantti havaitsemista pohja-kutsuvan ohjelmisto. PCR-sekvenssit /ehdot ovat saatavilla pyynnöstä. Coding variantit vahvistettu toista PCR-reaktioissa jättää PCR esineitä. Genbank NM_000455 käytettiin viitteenä cDNA nukleotidiasemia.

Multiplex Ligaatioseoksista Dependent Probe Vahvistus (MLPA) ja Etelä /Länsi-analyysi

MLPA tehtiin kuten [9]. Southern-analyysiä varten, 10 ug genomista DNA: ta oli

Xbal

-digested ennen geelielektroforeesi, siirrettiin membraanille, ja hybridisoitiin radioaktiivisesti-koettimien (1-2 kb), tuotettiin PCR: llä ja vahvistettiin lopussa sekvensoinnilla. Kalvo hybridisoitiin koetin A, suoritettiin autoradiografia, tislattiin kiehuvassa 0,1% SDS, ja uudelleenhybridi- soitiin koetin B. Western-analyysi, proteiini- uutteet valmistettiin tarttuneet solut homogenisoimalla hajotuspuskuriin + proteaasi-inhibiittoreita jäällä, altistettiin SDS -sivulta ja immunoblotat- kanssa LKB1 vasta-aineella (# 3047, Cell Signalling Technology) kohti valmistajan suositusten.

Kudosvärjäys ja immunohistokemia

parafiiniblokkiin 5 um: n leikkeitä poistettiin parafiini /sammutettua etanolisarjassa . Objektilasit värjättiin H p63-vasta-ainetta (# MS1081, LabVision) käytettiin 1:400 kanssa Immpress tunnistusjärjestelmä (Vector).

PCR Skannaus Määritä poistot ja HeLa-PCR

PCR-alukkeita (jotka tuottavat 100 -200 bp amplikonien) ulottuu

LKB1

alue suunniteltiin käyttäen Primer3. Alukeparia tuottavat tuotteita oikean koon, kun normaaleja ihmisen DNA: ta käytettiin templaattina käytettiin kartta poistot pisteyttämällä läsnäolo /poissaolo monistuksessa solulinjan DNA: ita templaattina. Muita reaktioita antaa vastaavat tuotteet asteittain pienempiä väliajoin suunniteltiin tarpeen. Alukesekvensseissä ja PCR-olosuhteet ovat saatavilla pyynnöstä. Arkistointia kudosnäytekappaleessa DNA valmistettiin, kuten on kuvattu [32]. Alukesekvenssit HeLa-PCR (400 bp) oli varten (5′-GGTTGCGATCAAGGCCCCGA-3 ’) ja Rev (5′-GCCTGTGGATGCCACACATG-3’). PCR-olosuhteet olivat 95 ° C x 10 ”; 94C × 30 ”, 58C x 30”, 72C x 30 ”(38 sykliä); 72C × 7 ’.

Tilastollinen analyysi

vertailun mutaatiotaajuudesta, Fisherin (kaksisuuntainen) parittomia tarkkaa testiä käytettiin. Survival dikäyrät GraphPad Prism5, jossa vertailu käyrät suoritettiin Log-rank (Mantel-Cox) testi. Riskisuhde ja sen luottamusväli laskettiin käyttämällä Mantel-Haenszel menetelmällä. P-arvot alle 0,05 katsottiin osoittavan tilastollista merkittävyyttä.

tukeminen Information

Kuva S1.

kloonaus ja karakterisointi

LKB1

geeninsisäiset poisto breakpoints HeLa /HeLaS3. 2,8 kb: n fragmentti ulottuu poistetaan murtuessa kloonattiin HeLa DNA: sta PCR, kuten on kuvattu tekstissä, 974 emäsparin Tämän sekvenssin näkyvät. Sequence lihavoitu punaisilla kirjaimilla vastaa Alu toista jossa oletetuilla homologisesta tuloksena HeLa poisto tapahtui. Nukleotidipolymorfismien kahdessa natiivi Alu-sekvenssit (ei kuvassa) olivat yhdenmukaisia ​​rekombinaatio tapahtumien sisällä 5 emäsparin laatikkoon merkitty sekvenssi (ts reunustavan G emäkset olivat polymorfinen ja informatiivinen). Sequence sinisellä vastaa erityistä järjestyksessä ihmisen genomista (Ensembl 50 19: 1145482-1145865). Tämä sekvenssi on ~11 kb 5 ’päähän

LKB1

geenin (transkription aloitus-). Sequence vihreänä (Ensembl 50 19: 1170845-1171115) sijoittuu

LKB1

introni 3-4. Nuolet osoittavat sijainnin alukkeet on suunniteltu HeLa-PCR (400 bp amplikoni). Genominen sijainti Näiden alukkeiden genomisessa kartalla on esitetty kuviossa 4C.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0005137.s001

(0,01 MB PDF)

Taulukko S1.

Täydellinen LKB1 mutaatioiden havaita sekvensoimalla tai MLPA.

doi: 10,1371 /journal.pone.0005137.s002

(0,01 MB PDF) B

Kiitokset

kiitollisuudenvelassa Grover Hutchins (Johns Hopkins University School of Medicine) ja Juanita Valenciana (UT Southwestern) apunaan näytteen hankintaa ja teknistä neuvontaa. Kiitämme myös Jennifer Sayne ja UT Southwestern Tissue Management Resource on Simmons Kattava Cancer Center for apua näytteen hankinta- ja kliinisten tietojen hallintaan.