Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

maksasolusyövän (HCC) on viidenneksi yleisin maligniteetti ja kolmanneksi yleisin syy syöpään liittyvät kuolemat maailmanlaajuisesti. Sorafenibi on ainoa lääke potilaille myöhäisvaiheen maksasolusyövän (HCC), jonka on osoitettu antavan selviytymisen hyötyä potilaille, joilla HCC; kuitenkin, se on monia sivuvaikutuksia. Siten vuorottelevat terapeuttisia strategioita, joilla on parantunut turvallisuus ja terapeuttinen teho hallintaan HCC tulisi kehittää.

menetelmät ja havainnot

osoittavat, että ote

Graptopetalum paraguayense

( GP) alassäädetty ekspressiotasot useiden onkopsykologista proteiineja, mukaan lukien AURKA, AURKB, ja FLJ10540, HCC-soluissa. Eristää aktiiviset komponentit GP uutteita, valmistimme otteita jakeet ja arvioidaan niiden vaikutuksia ekspressioon onkopsykologista proteiinien HCC-soluissa. Osa nimetty HH-F3 on rikastunut aktiivisia ainesosia, esillä sytotoksisia vaikutuksia, ja tukahdutti ilmentymisen onkopsykologista proteiinien HCC-soluissa. Rakenteen tärkein vaikuttava yhdiste HH-F3 havaittiin olevan samanlainen kuin proantosyanidiinin johdettuja yhdisteitä

Ruusujuuri

. Lisäksi erillinen uusi yhdiste runsaasti 3, 4, 5-trihydroksi bentsyylin osat tunnistettiin HH-F3 valmisteita. Mekaaniset tutkimukset osoittivat, että HH-F3 indusoiman apoptoosin HCC-soluissa edistämällä mitokondrion kalvon potentiaalin ja reaktiivisten hapen lajien. HH-F3 myös parannettu PTEN ilmaisun ja laski AKT fosforylaation Ser473 pitoisuudesta riippuvalla tavalla HCC-soluissa. Lisäksi yhdistelmä GP tai HH-F3 ja sorafenibia synergisesti estää leviämisen Huh7 soluja. Hoito rottamallissa kanssa diethylnitrosamine (DEN) aiheuttama maksasyövän otteita GP ja HH-F3 vähentynyt maksan kollageenin sisällön ja esti kasvaimen kasvua.

Johtopäätökset

Nämä tulokset osoittavat, että GP tiivisteet ja HH-F3 voi suojella maksassa estämällä kasvaimen kasvua; Näin ollen, nämä yhdisteet voidaan pitää hoitoon HCC.

Citation: Hsu W-H, Chang C-C, Huang K-W, Chen Y-C, Hsu S-L, Wu L-C, et al. (2015) arviointi Medicinal Herb

Graptopetalum paraguayense

kuin hoito maksasyövän. PLoS ONE 10 (4): e0121298. doi: 10,1371 /journal.pone.0121298

Academic Editor: Yuan-Soon Ho, Taipei Medical University, Taiwan

vastaanotettu: 19 elokuu 2014; Hyväksytty: 29 tammikuu 2015; Julkaistu 7 huhtikuuta 2015

Copyright: © 2015 Hsu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Taiwan National Science neuvoston alle lupanumeroita NSC102-2627-B-010-001-, MOST103-2627-B-010- 001- ja MOST103-2627-B-030-001-; Taiwanin talousministeriön myöntää numerot 99-EY-17-A-S1-152, 100-EY-17-A-S1-152, ja 101-EY-17-A-S1-152); ja avustusta opetusministeriön Tähtää Top yliopiston Plan (103AC-T503). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Alkoholismi, virushepatiitin ja alkoholiton rasvamaksatulehdus ovat kolme suurta syitä kroonisen maksatulehduksen ja vammoja. Krooninen maksatulehdus voi aiheuttaa maksa- fibroosia, maksakirroosi ja maksasyövän (HCC), joka on yleisin maksasyövän ja osuus 70%: sta 85% ensisijainen maksan syöpäsairauksia aikuisilla. Yli 80% potilaista, joilla HCC diagnosoidaan edennyt pitkälle taudin, jossa kirurginen hoito ei ole enää tarpeen. Yleensä potilaat, joilla leikkaushoitoon HCC on huono ennuste ja harvoin hyötyä nonsurgical hoitoja, kuten systemaattinen kemoterapiaa tai chemoembolization [1, 2].

Epänormaali signalointia PI3K /PTEN /AKT-reitin edistää kehitystä erilaisia ​​maksasairauksia, kuten alkoholittomat rasvamaksa (NAFLD), alkoholiton rasvamaksatulehdus (NASH), alkoholin aiheuttama maksasairaus (ALD), virushepatiitin ja HCC [3]. PI3K /PTEN /AKT reitin aktivoidaan epigeneettiset tukahduttaminen PTENin ja /tai mutaatioita tai monistamiseen yksittäisten komponenttien reitin noin 40-50%: lla HCC [4-6]. Kokeellisesti poistamista PTEN tai yli-ilmentyminen AKT että maksa hiirten tuloksia rasvamaksa ja kasvainten kehittymiseen [7, 8]. Nämä kokeelliset havainnot viittaavat vahvasti siihen, että PI3K /PTEN /AKT-reitin tärkeä rooli hepatotumorigenesis.

sorafenibi, multi-kohde estäjä, joka hyväksyttiin hoitoon HCC vuonna 2007 [9], on ainoa standardi kemoterapeuttisen lääkkeen potilaille myöhäisvaiheen HCC [10]. Tämä lääke on osoitettu estävän kasvainsolujen proliferaatiota estämällä Ras /Raf /MAPK-reitin ja angiogeneesin estämällä sekä VEGFR ja PDGFR-signalointia, mikä hidastaa kasvua uusien verisuonten tuumorin sisällä [11]. Vuonna kaksoissokkotutkimuksessa, satunnaistetussa, kontrolloidussa kliinisessä tutkimuksessa (RCT), jossa ensisijainen päätepiste kokonaiselinaika [12], sorafenibi lisääntynyt elinaika HCC potilaiden +7,9-+10,7kuukautta [13]. Sorafenibi on ainoa lääke, joka on osoitettu antavan selviytymisen hyötyä potilaille, joilla HCC; kuitenkin, se on monia sivuvaikutuksia. Nykyisin hoitovaihtoehtoja potilaille, joilla on edennyt HCC ovat rajalliset. Siten vuorottelevat terapeuttisia strategioita, joilla on parantunut turvallisuus ja terapeuttinen teho hallintaan HCC tulisi kehittää.

Rohdosvalmisteet on käytetty tuhansia vuosia hoitoon monenlaisia ​​sairauksia, kuten tulehdussairaudet ja kroonisten maksasairauksien (mukaan lukien hepatiitti, maksan fibroosi ja HCC). Tässä tutkimuksessa olemme keskittyneet

Graptopetalum paraguayense

(GP), perinteinen kiinalainen yrtti, jolla on käytössään useita terveyshyötyjä. Sen arkaainen Kiinan reseptiä, GP pystyy lievittämään maksasairaudet, alentaa verenpainetta, valkaista iho, lievittää kipua, infektioiden hoitoon, estävät tulehduksen ja parantaa aivotoimintaa [14-16].

In vitro

tutkimukset ovat osoittaneet, että otteita lehtien GP estää tyrosinaasi ja angiotensiinikonvertaasientsyymin ja sieppaavat vapaita radikaaleja [14-16]. Otteita varsi GP viljeltiin soluja ihmisen HCC HepG2-solulinja on myös osoitettu olevan hapettumisen ja antiproliferatiivisia ominaisuuksia [17]. Vesi-pohjainen uutteet GP on myös osoitettu olevan antioksidatiivisia ja anti-inflammatorisia ominaisuuksia, jotka suojaavat soluja CCI

4-indusoidun oksidatiivisen maksavaurio [18]. Tiedot aikaisemmista mikrosirujen profilointia tutkimus osoitti, että ilmaus erilaisten geenien liittyvät aineenvaihduntaan, solujen kasvuun ja /tai huolto palautui lähes normaalitasolle DMN saaneilla rotilla käsitelty GP [19]. Aikaisemmat tutkimus osoitti myös, että anto GP lieventää kemiallisten aiheuttama maksavaurio ja fibroosia

in vivo

ja tukahdutti maksan tähtisolut solu (HSC) ja Kupfferin solujen aktivaation

in vitro

.

Edellä mainitut havainnot viittaavat siihen, että GP voi edustaa terapeuttista vaihtoehto hoitoon maksan tulehdusta ja fibroosia [20]. Tässä tutkimuksessa osoitamme, että GP ja sen HH-F3 osa on syövän vaikutuksia rottamallissa diethylnitrosamine (DEN) aiheuttama maksasyöpä. Olemme sittemmin osoittavat, että uutteet GP ja HH-F3 aiheuttaa apoptoottista solukuolemaa HCC-soluissa, mikä viittaa siihen, että GP ja HH-F3 voidaan käyttää ehkäisyyn tai hoitoon HCC.

Materiaalit ja menetelmät

solulinjat

Huh7 ja PLC5 solulinjat saatiin tri Zhong-Zhe Lin, National Taiwan University Hospital, Taiwan. HepG2-solulinja hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, https://www.atcc.org/en.aspx). Mahlavu solulinjat saatiin Dr. Muh-Hwa Yang, Kliininen laitos, National Yang-Ming University, Taiwan. Ihmisen maksasolujen ostettiin ScienCell Research Laboratories (https://www.sciencellonline.com/).

GP ja

Ruusujuuri

louhinta, puhdistus ja karakterisointi

GP lehdet jauhettiin ja lyofilisoitiin jauheeksi -20 ° C: ssa ja varastoidaan kosteutta buster 25 ° C: ssa ennen uuttoa. Ensimmäinen, 1,5 g GP jauhetta vorteksoitiin 10 ml: lla 100% metanoli (MeOH) 5 minuutin ajan ja sentrifugoitiin 1500

g

5 min. Supernatantti poistettiin ja erilaisia ​​uutteet valmistettiin uudelleen suspendoimalla pellettejä 10 ml: aan H

2O, 100% asetonia, 100% metanoli, 100% etanolilla, 70% etanolilla, 50% etanolilla, 100% DMSO: ssa tai 30 % DMSO: ta. Suspensiota vorteksoitiin 5 minuuttia, sentrifugoitiin kahdesti 1500

g

5 min, sentrifugoitiin uudelleen 9300

g

5 min ja suodatettiin 0,45 um: n suodattimen laminaarivirtauskaapissa huoneen lämpötilassa. 30% DMSO: supernatantti joko säilytettiin -20 ° C: ssa 150 mg /ml kantaliuosta (kutsutaan 30% DMSO: ta GP uutteet) tai fraktioitiin neljään fraktiot (F1-F4) käyttäen Sephadex LH-20 (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Ruotsi) pylvääseen (menetelmä I). Yksinkertaistaa valmistelu protokollia, suora dialyysi 30% DMSO GP uutteita vastaan ​​vettä myös sitoutunut (menetelmä II). Kolorimetrisiä määrityksiä on 30% DMSO GP otteita tunnistamiseen hydrolysoituvia ja tanniinien suoritettiin [21]. HCC-solut käsiteltiin uutteet, ja AURKA, AURKB ja FLJ10540-proteiinin tasot analysoitiin Western blot; aktiivisia molekyylejä F3 osa (kutsutaan HH-F3-fraktio) havaittiin. HH-F3-fraktio analysoitiin edelleen HPLC: llä UV-detektorilla (Shimadzu SPD-M10A), normaali-HPLC-pylvääseen (Phenomenex Luna 5u piidioksidi (2) 100A, 4,6 x 250 mm) ja

1H- ja

13C-NMR-spektrit tunnistaa rakenteen aktiivisia molekyylejä. GP tiivisteet ja HH-F3-fraktio altistettiin myös dialyysi vettä vastaan ​​käyttäen dialyysikalvoa (MWCO 12-14,000) (Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA), jolloin saatiin aktiivisia yhdisteitä.

Ruusujuuri

kasveja lyofilisoitiin jauheeksi ja varastoida kosteutta Buster 25 ° C: ssa ennen uuttamista. 1,5 g: n näyte

Ruusujuuri

jauhe liuotettiin 10 ml: aan H

2O, sentrifugoitiin 1500

g

5 min ja suodatettiin 0,45 um: suodatin laminaarinen virtaus huppu huoneenlämmössä. Näytteitä säilytettiin -20 ° C: ssa 150 mg /ml kantaliuoksesta.

Western blot

lysaatit HCC solut altistettiin SDS-PAGE ratkaista ekspressoidut proteiinit ja siirretään polyvinylideenidifluoridista (PVDF) käyttäen Bio-Rad siirtojärjestelmä. Siirron jälkeen kalvot värjättiin Ponceau S vahvistaa tehokkuutta ja yhtenäisyyttä proteiinin siirtoa. Membraanit blokattiin 5% rasvatonta kuorittua maitoa huoneenlämpötilassa 30 minuutin ajan ja inkuboitiin ensisijaisen vasta-aineen kanssa 4 ° C: ssa yön yli. Tämän jälkeen kalvot pestiin kolme kertaa (10 min kukin) 1x Tris-puskuroidulla suolaliuoksella, joka sisälsi Tween-20 (TBST) ja inkuboitiin HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineilla 2 tunnin ajan. HRP-substraattia vetyperoksidiliuosta /luminolia reagenssit (Immobilon Western kemiluminesenssisubstraatilla, Millipore, sekoitettu suhteessa 1: 1) lisättiin, ja toisen vasta-aineen signaalit kalvot visualisoitiin Fujifilm LAS4000 luminoiva kuva-analyysi-järjestelmän. Seuraavat ensisijainen vasta-aineita käytettiin: anti-PTEN, anti-AKT, anti-p70S6K, anti-kaspaasi 3 ja anti-PARP (Cell Signaling); anti-BCL2, anti-Bcl-XL ja anti-kaspaasi 9 (GeneTex); anti-AURKA ja anti-AURKB (BD Biosciences); ja anti-FLJ10540 (Abnova). Kaikki vasta-aineet käytettiin laimennoksena 1: 1000.

elinkyvyn

Solut ympättiin 24-kuoppalevyille (4000-5000 solua /kuoppa) yön yli ja sitten käsiteltiin 30% DMSO GP otteita tai HH-F3 murto 0, 24, 48 tai 72 tuntia. Käsittelyn jälkeen solut varovasti pestiin 3 kertaa 1 x PBS: llä (137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 10 mM Na

2HPO

4, 2 mM KH

2PO

4) ja inkuboitiin sitten 0,5 ug /ml 3- (4,5-cimethylthiazol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT, Sigma-Aldrich) 2 tunnin ajan. Väliaine poistettiin, ja syvän sininen kiteet liuotettiin 100% DMSO: ssa, huoneenlämpötilassa 10 minuutin ajan. OD-arvot mitattiin 570 nm: ssä ELISA-lukijalla.

Cell laskemalla

Solut ympättiin 12-kuoppalevyille (10,000-20,000 solua /kuoppa) ja inkuboitiin yön yli. Seuraavana päivänä solut käsiteltiin HH-F3 osa 0, 24, 48 tai 72 tuntia. Sitten solut trypsinoitiin, käsiteltiin 0,4% trypaanisinisellä ja laskettiin.

Solusyklianalyysiä ja virtaussytometria

Sen jälkeen, kun solut oli trypsinoitiin ja pestiin kolme kertaa PBS: llä, ne sentrifugoitiin 800

g

5 min. Sitten solut suspendoitiin uudelleen 70% etanolia PBS: ssä ja pidettiin -20 ° C: ssa yli 16 tuntia. Solut sentrifugoitiin 800

g

5 min, ja solupelletit suspendoitiin uudelleen kylmään PBS: ään, joka sisälsi 100 ug /ml RNaasi A: ta (Sigma-Aldrich) 20 min. Sitten solut värjättiin 20 ug /ml propidiumjodidia (PI, Sigma-Aldrich) ja 20-30 min, ja DNA-pitoisuus mitattiin ja analysoitiin käyttämällä BD FACSCanto ja Flow Jo analyysin ohjelmisto, vastaavasti.

mitokondrioiden kalvojännite määrityksessä

mitokondrion kalvon potentiaali analysoitiin 5, 5 ’, 6, 6′-tetrakloori-l, 1′, 3, 3’-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine jodidia (JC-1) hankittiin Cayman Chemical Co viljellyt solut ympättiin 96-kuoppaisille mustille levyille tiheydellä 7000 solua /kuoppa, inkuboitiin yön yli ja käsiteltiin kanssa tai ilman HH-F3 osa 48 tuntia. JC-1-värjäys-liuosta lisättiin kuhunkin kuoppaan ja sekoitettiin varovasti 37 ° C: ssa 15-30 minuutin ajan pimeässä. Levyjä sentrifugoitiin 400

g

huoneenlämpötilassa 5 minuutin ajan ja supernatantti poistettiin kustakin kuopasta. JC-1-määritys-puskuria lisättiin kuhunkin kuoppaan, levyjä sentrifugoitiin 5 minuutin ajan 400

g

huoneenlämpötilassa ja supernatantti poistettiin kustakin kuopasta. Lopuksi, JC-1-määritys-puskuria lisättiin kuhunkin kuoppaan ja levyjä analysoitiin käyttäen fluoresoivaa levylukijaa.

mittaus ROS tasoilla

solunsisäinen sukupolven superoksidiradikaalien (O

2

-) arvioitiin hydroetidiini fluoresenssi (AAT Bioquest, Inc.). Soluja käsiteltiin kanssa tai ilman HH-F3 osa 48 tuntia. Hydroetidiini (10 uM) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja sekoitetaan varovasti 30-60 minuutin ajan 37 ° C: ssa pimeässä. Cellular fluoresenssia seurattiin eksitaatioaallonpituudella 520 nm ja emissio aallonpituudella 610 nm. Solunsisäiset peroksidia mitattiin käyttämällä dikloorifluoreskiiniliuoksella (DCFH) diasetaatti (Marker Gene Technologies, Inc.). Sen jälkeen, kun solut oli käsitelty HH-F3 osa 48 tunnin ajan, väliaine aspiroitiin ja solut pestiin kahdesti PBS: llä. Sitten soluja inkuboitiin DCFH lopullisessa pitoisuudessa 20 uM seerumivapaassa väliaineessa 30-60 minuutin ajan 37 ° C: ssa pimeässä, pestiin jälleen PBS: llä ja pidettiin 200 ui: aan viljelyalustaa. Cellular fluoresenssia seurattiin eksitaatioaallonpituudella 485 nm ja emissio aallonpituudella 528 nm.

Eläimet, kokeellinen ympäristö, ja protokolla

Animal Care ja käyttö komitea College of Medicine , National Taiwan University, hyväksyi kaikki koemenettelyn. Kaikki kokeet tehtiin mukaan eläinten hoito ohjeita yliopiston.

Satakaksikymmentä kuuden viikon ikäiset Wistar albiinorottaa (150-180 g) käytettiin. Kaikki eläimet annettiin sopeutua seitsemän päivää, ja standardin ruokaa ja vettä

ad libitum

kokeiluajanjakson ajan.

Rotat jaettiin satunnaisesti normaalin (N = 10) diethylnitrosamine (DEN) ryhmä (N = 30), alhaisen annoksen GP ryhmässä (N = 30) tai suuren annoksen GP ryhmässä (N = 30). Viisi ylimääräistä rottaa sisällytetty HH-F3-hoidetussa ryhmässä. Kaikille ryhmille lukuun ottamatta normaalia ryhmä, joka on ainoa lähde juomaveden 63 päivää oli vesiliuosta 100 ppm (tilavuus /tilavuus) DEN (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), joka oli vaihdettiin päivittäin; alkaen päivänä 64, rotat varustettu vesijohtovedellä vielä 14 päivää. DEN valmistettiin viikoittain ja koostui yksilöllinen annos lasketaan painonnousu /tappio eläimen kokema vastauksena edellisestä annoksesta. Maksakasvaimet havaittiin alkaen päivänä 42, ja todettiin maksafibroosia alkaen päivänä 63. aikana koeajaksi, eläimet punnittiin viikoittain laskea painonnousua; Lisäksi veden määrä kuluttaman rotilla mitattiin joka viikko. Rotat matalan annoksen ryhmässä sai 0,6 g /rotta lyofilisoitua GP jauhe; rotat korkean annoksen ryhmä sai 1,8 g /rotta lyofilisoitua GP jauhe; rottien HH-F3 ryhmä sai 0,036 g /rotta lyofilisoitua HH-F3 jauhe päivittäin kolmen viikon ajan alkaen päivänä 42.

Sadonkorjuu menettely sekä morfologisia arviointi maksan

Kaikki eläimet tapettiin päivänä 84. eläinten annettiin paastota yön yli ja tapetaan CO

2 hengitettynä. Kun rotat oli uhrattu, kehoaan, maksa ja pernat punnittiin; keskiviivan laparotomy tehtiin ja ehdot elimet havaitaan ruumiinavauksessa. Kaikki lohkoa maksassa otettiin nopeasti talteen ja tutkittava perusteellisesti kuvaamaan pinnan maksan ja kuvailla kehittämiseen maksan pesäkkeitä, pysyviä kyhmyjä (PNS) tai syöpään jokaisessa aikapisteessä. Sen jälkeen maksa leikattiin 5 mm: n jaksoissa. Kaikki makroskooppisesti näkyvä kyhmyt maksaan pinta ja 5 mm: n leikkeet laskea ja mitata.

Tuumorirasitusta arviointi

Jotta voitaisiin aikana kasvainten kehittymistä eläimet altistuvat DEN, kaikki lohkoa maksassa oli nopeasti korjattu, ja kaikki makroskooppisesti näkyvä kyhmyt maksaan pinta ja 5 mm: n leikkeet laskea ja mitata. Maksa kasvaintaakat määritettiin arvioimalla summia volyymit kaikkien kasvain kyhmyt yli 3 mm halkaisijaltaan kullekin eläimelle; kasvain taakka verrattiin sitten ryhmien kesken.

Bile virtausnopeus

Ennen lopettamista eläimet nukutettiin 80 mg /kg ketamiinia ja niiden sapen virtaus mitattiin PE10 piin putki sijoitetaan yhteisen sappitiehyen ja yhdistetty laskettu polyetyleeniputkeen. Sappineste putkeen mitattiin 5 minuutin välein.

histopatologisissa

Kun veri oli valutettu, 5 mm paksun kudosta viipaleiksi sisältäviä kasvaimia leikeltiin kustakin koru maksa. Osiot (5 pm) leikattiin ja värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla histopatologista analyysiä käyttäen julkaistuja diagnostiset kriteerit.

immunohistokemiallinen värjäys α-sileän lihaksen aktiini (α-SMA) B

Maksa Näytteet olivat kiinnitetään formaliinilla, upotettiin parafiiniin ja leikattiin 5-um: n leikkeitä. Osat poistettiin parafiini, vedettömät ja käsiteltiin 0,03% vetyperoksidia 10 minuutin sammuttamiseksi endogeenisen peroksidaasin aktiivisuus. Kahden pesun jälkeen PBS: llä, leikkeitä inkuboitiin 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa hiiren anti-ihmis-α-SMA monoklonaalinen vasta-aine (1:50 laimennos, Dako Cytomation, Tanska). Sillä α-SMA värjäys, osioista, pestiin ja niitä inkuboitiin sekundaarisella kanin anti-hiiri-IgG-vasta-ainetta (1: 200 laimennos) huoneen lämpötilassa 1 tunnin ajan. Sitten leikkeitä kehitettiin samalla tavalla. Värjäyksen jälkeen leikkeet vastavärjättiin hematoksyliinillä mikroskopiaan analyysejä. Prosenttiosuus α-SMA-positiiviset alueet (mm

2 /cm

2 maksan §) määritettiin käyttäen HC-2500 digitaalikamera (Fuji Photo Film), Adobe Photoshop versio 5.0J ja Image-Pro Plus versio 3.0.1J.

määritys Hydroksiproliinipitoisuus maksassa

maksa näytteet punnittiin, ja 20 mg jäädytetyt näytteet hydrolysoitiin 20 ml: ssa 6 N HCl ja huolellisesti kentällä; 6 N HCI: a lisättiin sitten, jolloin saatiin kokonaistilavuudeksi 30 ml /mg kudosta. Jauhettua kudosta hydrolysoitiin 120 ° C: ssa 16 tunnin ajan. Jälkeen lyhyen ajan jäillä jäähdyttäen ja sentrifugoimalla 8000

g

10 min, supernatantti poistettiin ja laitettiin uuteen putkeen; äänenvoimakkuus haihtumaan täydennettiin vedellä. Yhtä suuri tilavuus 6 N NaOH: a lisättiin ja sekoitettiin, ja liuoksen pH säädettiin pH-arvoon 4-9 käyttäen lakmuspaperilla. Neljäkymmentä mikrolitraa neutraloitua näytettä lisättiin kuoppiin 96-kuoppaisen ELISA-levyn ja hapetetaan käyttäen liuosta, joka sisältää 5 ml 7% kloramiini-T (Sigma-Aldrich) ja 20 ml etyyliasetaatti /sitraattipuskuria. Sata ja viisikymmentä millilitraa Ehrlichin lisättiin. Lopullista seosta inkuboitiin 60 ° C: ssa 35 min ja huoneenlämpötilassa 10 min; absorbanssi määritettiin sitten 560 nm: ssä. Standard liuoksia, jotka sisältävät 100, 80, 60, 40, 20 ja 0 mg /ml aitoja 4-hydroksi-L-proliinia (Sigma-Aldrich) käsiteltiin samalla tavalla. Standardikäyrä oli lineaarinen tämän konsentraatioalueella (

r

= 0,99). Maksan Hydroksiproliinipitoisuus taso ilmaistiin mg hydroksiproliinin /g märkää maksan paino. Kaikki määritykset suoritettiin kolmena kappaleena.

Tilastollinen analyysi

Kaikki tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskivirhe keskiarvon. Tasot merkitys arvioitiin kaksisuuntaisella pariksi Opiskelijan

t

-testi tai yksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA).

P

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Antiproliferatiivistä vaikutuksia eri GP valmisteiden Huh7 ja Mahlavu solujen

Voit testata mahdollisia biologisia vaikutuksia GP, eri GP uutteet valmistettiin käyttämällä vettä, butanoli, asetoni, metanoli, 100% etanolilla, 70% etanolilla, 50% etanolilla, 100% DMSO: ssa tai 30% DMSO: ta ja käyttää hoitamaan ihmisen HCC-soluissa. Kasvu esto aiheuttama eri GP otteita tutkittiin. Tiedot MTT tutkimukset osoittivat, että 30% DMSO otteita vähensi elinkelpoisuus Huh7 ja Mahlavu soluja (kuvio 1A); tarkemmin, pitoisuuksien 500 ja 250 ug /ml johti 50%: n inhibition solujen elinkelpoisuuden (IC

50) 72 tuntia hoidon jälkeen ja Huh7 ja Mahlavu soluja, vastaavasti (kuvio 1 B).

Huh7 ja Mahlavu soluja käsiteltiin GP uutteet valmistaa veteen, butanoli, asetoni, metanoli, 100% etanolilla, 70% etanolilla, 50% etanolilla, 100% DMSO: ta, tai 30% DMSO: ssa pitoisuuksina 100, 150, 250, 500, 750 , 1000 ja 1500 ug /ml 72 tuntia. Elinkelpoisuuden käsiteltyjen solujen määritettiin käyttäen MTT-määrityksissä. 30% DMSO GP otteita liittyi eniten kasvun esto Huh7 ja Mahlavu soluja jälkeen 72 tuntia. (B) Huh7 ja Mahlavu soluja käsiteltiin pitoisuuksilla 0, 250, 500, 750 ja 1000 ug /ml, 30% DMSO: ta GP uutteet 24, 48, ja 72 tuntia, ja MTT-testit suoritettiin. IC

50 pitoisuudet 30% DMSO: ta GP uutteet kasvun inhibition Huh7 ja Mahlavu solut olivat noin 500 ja 250 ug /ml, vastaavasti, sen jälkeen, kun 72 tuntia hoidon jälkeen. (C) HepG2 ja Huh7-soluja käsiteltiin GP uutteet valmistettiin 30% DMSO: ta, vettä tai butanoli (BuOH) 48 tunnin ajan. Tasot AURKA, AURKB ja FLJ10540 mitattiin Western blot-analyysi. Ilmentymistasojen AURKA, AURKB ja FLJ10540 HepG2 ja Huh7-solut tukahdutti 30% DMSO: ta GP uutteet mutta ei fraktiot valmistettiin veteen tai butanolia. (D) HepG2-soluja käsiteltiin 75 ng /ml synkronoinnin aineen nokodatsoli (NOC) 18 tuntia; sitten solut käsiteltiin 750 ug /ml, 30% DMSO: GP-uutteet tai ajoneuvon ohjaus (30% DMSO) vielä 3 tunnin ajan. Western-blottaus suoritettiin käyttäen anti-FLJ10540, anti-AURKA ja anti-AURKB vasta-aineita. (E) HepG2-soluja käsiteltiin 30% DMSO GP tiivisteet ja sen jakeet (HH-F1, HH-F2, HH-F3 ja HH-F4) 3 tuntia. AURKA ja AURKB ekspressiotasot HepG2 solut tukahdutti HH-F3 murto, mutta ei muiden jakeet. (F) Huh7, Mahlavu ja PLC5 soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla HH-F3 48 tuntia. Ilmaus AURKA ja FLJ10540-proteiinien arvioitiin immunoblot-analyysillä. HH-F3 pienentää AURKA ja FLJ10540 proteiinin tasot pitoisuudesta riippuvalla tavalla.

GP vähentää AURKA, AURKB ja FLJ10540 proteiinin ekspressiotasot aikana sekä interphase ja mitoosia aktivoitu maksan tähtisolut ja HCC solulinjoja

AURKA, AURKB ja FLJ10540 ovat onkogeenien, jotka ovat yleisesti yliekspressoituvat HCC [22-24]. Vahingossa, huomasimme, että 30% DMSO GP otteita esti proteiinin ekspressiotasot FLJ10540, AURKA ja AURKB HCC solulinjoissa (HepG2 ja Huh7) pitoisuutena riippuvalla tavalla (kuvio 1 C, S1 kuvio). Sen sijaan, GP uutteet valmistettiin joko vettä tai butanoli ei estänyt proteiinin ekspressiotasot AURKA tai AURKB HepG2-soluissa sen jälkeen, kun 72 tuntia hoidon jälkeen (kuvio 1C). On tunnettua, että ekspressiotasot AURKA, AURKB ja FLJ10540 ovat korkeammat aikana metafaasissa kuin vuoden interphase [25-27]. Siksi tutkittiin, 30% DMSO: ta GP uutteet voi estää näiden proteiinien ilmentymisen aikana mitoosin HCC-soluissa. HepG2-soluja käsiteltiin ensin 75 ng /ml nokodatsoli 18 tuntia; näitä soluja käsiteltiin sitten 30% DMSO GP otteita 3 tuntia (pesemättä pois nokodatsoli). AURKA, AURKB ja FLJ10540 ekspressiotasot olivat korkealla mitoosin aikana. Käsitellyissä soluissa 30% DMSO: ta GP uutteet, proteiinin ekspressiotasot AURKA, AURKB ja FLJ10540 laskivat aikana välifaasi ja metafaasissa (kuvio 1 D); ei sen sijaan ole merkittäviä muutoksia ekspressiotasot muiden mitoottisen proteiinien (PIN1, hURP ja PLK) havaittiin (tuloksia ei ole esitetty).

HH-F3 tukahduttaa AURKA proteiinin ilmentymistä HCC solulinjoissa

Seuraavaksi käyttäen Sephadex LH-20 pylväs, saimme neljä jakeet 30% DMSO GP uutteet (S2A kuvio). Western blot analyysi 3 tuntia hoidon jälkeen osoitti, että vain kolmas osa (HH-F3) tukahdutti ilmentymistä AURKA ja AURKB HepG2-soluissa (kuvio 1 E). Seuraava, Huh7, Mahlavu ja PLC5 soluja käsiteltiin ilman tai 25, 50 ja 75 ug /ml, HH-F3 osa 48 tuntia. Ilmentyminen AURKA ja FLJ10540 kaikissa kolmessa HCC solulinjoissa oli merkitsevästi tukahdutti HH-F3 (kuvio 1 F). Tutkia, onko estäviä vaikutuksia HH-F3 tapahtui transkription tasolla, tarkastelimme vaihtelu geeniekspressiotasot on

FLJ10540

ja

AURKA

,

AURKB

ja

AURKC

(jäsenet Aurorakinaasi geeniperheellä). HepG2-soluja käsiteltiin 50 ug /ml, HH-F3 osa 6 tuntia, ja geenin ilmentyminen ja proteiinin tasot mitattiin mikrosiru (U133A siru, Affymetrix) ja Western blot, vastaavasti. Ei ollut lähes mitään muutosta geenin ekspressiotasot tahansa edellä mainituista geeneistä käsittelyn jälkeen HH-F3; kuitenkin, proteiiniin heikkenee tasot havaittiin (tuloksia ei ole esitetty). Nämä tulokset viittaavat siihen, että HH-F3 murto säännelty ilmaus FLJ10540 ja Aurorakinaasi perheen molekyylien translaation tasolla mieluummin kuin transkription tasolla.

tunnistetiedot aktiivisten komponenttien GP

yksinkertaistaa valmistelu protokollia, toinen menetelmä (menetelmä II) suoralla dialyysi 30% DMSO GP uutteita vastaan ​​käytettiin vettä. Fysikaalis-yhdisteiden ominaisuuksia saatiin käyttäen menetelmää II on lueteltu S1 taulukossa, ja nämä tiedot osoittivat, että saaduista fraktioista menetelmällä I (menetelmä alun perin käytettiin valmistamaan HH-F3), ja menetelmä II olivat identtisiä. Lyofilisoinnin jälkeen, ominaisuus vaaleanpunainen väri ja osittainen hopea metalli hohteen HH-F3-fraktio havaittiin. Mukaan laajennettu aromaattiset signaalit

1 H ja

13C NMR-spektri, olennaisimpia HH-F3-fraktio havaittiin polyfenoliyhdisteiden; tarkemmin sanottuna, tanniinit. Kolorimetrinen määritys (OD

500) kvantifiointiin lyhennetyt tanniinin käyttäen katekiini standardina osoitti, että yhteensä tanniinipitoisuus HH-F3 osa oli noin 68% (dataa ei ole esitetty). HPLC-sormenjälki HH-F3 osa (S2 kuviossa 2B), paljasti, että tämä fraktio sisälsi kaksi ryhmää yhdisteiden (ryhmät A ja B), jossa erilliset alueet molekyylipainot; Ryhmä B sisälsi yhden suuren ja yksi pieni osa. Nämä havainnot paljasti HH-F3 jae oli runsaasti tanniinien ja sisälsi yhdisteitä, joilla on suuri molekyylipaino.

(A) Ihmisen maksasolujen käsiteltiin erilaisilla pitoisuuksilla 30% DMSO GP uutteiden /HH-F3 72 tuntia. Data on ilmaistu keskiarvo ± keskihajonta (SD) kolmesta itsenäisestä kokeesta. Huh7, Mahlavu ja PLC5 soluja käsiteltiin 5, 25, 50 ja 75 ug /ml, HH-F3-fraktio 24, 48 ja 72 tuntia sen jälkeen suoritettiin MTT-määritystä (B) ja trypaanisinisen määritys (C). IC

50 pitoisuuksia HH-F3 kasvun inhibition Huh7, Mahlavu ja PLC5 solut olivat noin 50, 37,5 ja 75 ug /ml, vastaavasti, sen jälkeen, kun 72 tuntia hoidon jälkeen.

koska mitään polymeerisiä yhdisteitä ole vielä eristetty GP, polyfenoliyhdisteiden alkaen

Ruusujuuri

(kultainen root), toinen yrtti Crassulaceae perhe, käytettiin viitteenä yhdisteitä rakenteellista tunnistamista yhdisteiden HH- F3 osa.

R

.

rosea

on raportoitu sisältävän tanniinien (CT). Kemialliset ominaisuudet tärkeimpien yhdisteiden HH-F3a Alafraktio, niin menetelmät I ja II, olivat hyvin samanlaisia ​​kuin virtamuuntajien in

R

.

rosea

(kultainen root). Lisäksi, koska CT yhdisteet esiintyvät usein monia yhteisiä rypäleen lajit,

Vitis vinifera

CT käytettiin myös referenssinä yhdisteitä. S1 Taulukko yhteenvedot fysikaalis ominaisuudet polymeerisen proantosyanidiinin alkaen

R

.

rosea

ja

Vitis vinifera

. Sen korkea suhde 3, 4, 5-trihydroksi bentsyylin substituenteista HH-F3a (tunnistetaan

13C kemialliset siirtymät 105 ppm ja 109 ppm C-2 ’/6’ ja C-2 ”/6” of egcg yksikkö, vastaavasti; spektri ei kuvassa) oli hyvin samankaltainen kuin yhdiste löydetty

R

.

rosea

, mutta paljon korkeampi kuin yhdiste löydetty rypäleiden nahat ja siemenet (katso S1 taulukko). Näin ollen CT esitetty HH-F3a ehdotettiin polymeeristä proantosyanidiinin kanssa dominative prodelphinidin toistuvaa yksikköä ja (4 → 8) -linkages (katso S2C kuvio). Kemialliset ominaisuudet HH-F3a ja rakenteellinen selvittäminen toistuvan yksikön jälkeen kemiallista hajoamista thiolysis julkaistaan ​​erikseen.

HH-F3 murto vähentää elinkelpoisuus HCC solujen

vaikutusten tutkiminen