Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

uusi vesiliukoinen yhdiste STA-1474 metaboloituu ganetespib (ent STA-9090), joka on voimakas HSP90 estäjän aiemmin osoitettu tappavan koiran kasvainsolulinjoissa

in vitro

ja estää kasvaimen kasvua asettaminen hiiren ksenograftien. Tarkoituksena seuraavat tutkimuksen tarkoituksena oli laajentaa näitä havaintoja ja tutkimaan turvallisuutta ja tehoa STA-1474 koirilla spontaaniin kasvaimia.

menetelmät ja havainnot

Tämä oli vaiheen 1 tutkimuksessa, jossa koirat spontaanit kasvaimet sai STA-1474 johonkin kolmesta eri annostelun järjestelmiä. Farmakokinetiikka, toksisuudet, biologisten merkkiaineiden muutoksista, ja tuumorivasteita arvioitiin. Kaksikymmentäviisi koiraa erilaisia ​​syöpiä otettiin. Toksisuudet olivat pääasiassa ruoansulatuskanavaan koostuu ripuli, oksentelu, ruokahaluttomuus ja uneliaisuus. Voimistumista HSP70-proteiinin ilmentymisen todettiin sekä kasvain näytteet ja PBMC 7 tunnin kuluttua lääkkeen antamisesta. Mitattavissa tavoite vasteita havaittiin koirilla, joilla on pahanlaatuinen mastsolun tauti (n = 3), osteosarkooma (n = 1), melanooma (n = 1) ja kilpirauhaskarsinoomaa (n = 1), ja vastausprosentti oli 24% (6 /25). Vakaa tauti ( 10 viikkoa) havaittiin 3 koiraa, sillä tuloksena yleistä biologista aktiivisuutta 36% (9/25).

Johtopäätökset

Tämä tutkimus antaa näyttöä, että STA-1474 näyttelyissä biologinen aktiivisuus asiaan suuri eläinmallissa syövän. Koska yhtäläisyyksiä koiran ja ihmisen syövissä suhteen tuumoribiologiassa ja HSP90 aktivointi, on todennäköistä, että STA-1474 ja ganetespib osoittavat vertailukelpoisia syövän vastaista aktiivisuutta ihmisen potilailla.

Citation: London CA, Bear MD , McCleese J, Foley KP, Paalangara R, Inoue T et ai. (2011) I vaihe arviointi STA-1474, aihiolääkettä Novel HSP90 Inhibitor Ganetespib, Koirat kanssa Spontaani Cancer. PLoS ONE 6 (11): e27018. doi: 10,1371 /journal.pone.0027018

Editor: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 09 heinäkuu 2011; Hyväksytty: 07 lokakuu 2011; Julkaistu: 03 marraskuu 2011

Copyright: © 2011 London et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä kliininen tutkimus tukivat rahoituksella Synta Pharmaceuticals Corp. rahoittajille vaikutti tutkimuksen suunnittelu, farmakokineettinen analyysi ja valmistelu käsikirjoitus, mutta ei ollut roolia käsittelystä ja arvioinnista koirien tässä tutkimuksessa.

Kilpailevat edut: tällä kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

lämpöshokkiproteiini 90 (HSP90), molekulaarinen chaperone joka edistää konformationaaliselle kypsymisen ja vakauttamiseen monenlaisia ​​asiakkaan proteiineista, on lupaava kohde terapeuttiselle interventiolle syövän [1], [2], [3], [4]. Monet HSP90 asiakkaat ovat tunnettuja onkoproteiineja, kuten EGFR perheenjäsenet, Akt, Bcr-Abl, mutantti p53, Kit, ja Met, muiden muassa [1], [3]. Esto HSP90 toiminta edistää hajoaminen näiden asiakkaiden proteiineista useimmiten läpi ubikitiinipromoottori proteasomireitillä polku johtaa lopulta apoptoosin [2], [3], [4]. Selektiivisyys HSP90 estäjien malignia versus normaaleihin soluihin uskotaan siirrettävä se, että kertyminen yli-ilmentynyt ja mutatoitunut asiakkaan proteiineja edistää siirtymistä aktiivista, super-kaperonin monimutkainen muoto HSP90 syöpäsoluissa [5], [6 ], [7]. Tässä tilassa asiakas proteiini kumppaniaan HSP90 avulla yhteistyössä chaperones kuten p23, Hsp40, HOP, ja HIP [3], [5], [6]. Tämä super-kaperonin kompleksi on parannettu ATPaasiaktiivisuutta, ja näin ollen usein sitoo pieni molekyyli ATP-jäljittelijät, jolla on suurempi affiniteetti kuin ei-kompleksoidun muodon HSP90, joka johtaa kertyminen kasvaimissa verrattuna normaaleihin kudoksiin. Sellaisenaan, parannettu HSP90 aktiivisuus annetaan suurempi herkkyys pahanlaatuisten solujen menetys HSP90-toiminto [5]. Kohdistaminen HSP90 syövässä on myös houkutteleva kuin mitään mutaatioita on tunnistettu tässä proteiinia ihmisen syövissä, mikä viittaa se on suhteellisen vakaa tavoite lääkehoidon [8]. Koska HSP90 esto voi vaikuttaa useita polkuja, jotka usein edistävät onkogeenisel- prosessi, HSP90-inhibiittorit on mahdollista osoittaa laajaa toimintaa useissa kasvaintyypeille [1], [3].

Ensimmäisen luokan HSP90 estäjien perustui on geldanamysiini, joka on bentsokinoni ansamysiini antibiootti, joka sitoutuu N-terminaaliseen ATP-sitoutumistaskun HSP90, siten estäen sen ATPaasi-toiminto. Geldanamysiini ja sen puolisynteettisiä johdannaisia ​​17-AAG ja 17-DMAG estävät vakauttaminen asiakkaan proteiineja, mikä johtaa lopulta niiden hajoamiseen [9], [10], [11]. Kuitenkin geldanamysiinistä ja sen johdannaisilla on useita rajoituksia kuten muotoilu haasteita ja sivuvaikutuksia kuten maksatoksisuuden [12]. STA-1474 (Synta Pharmaceuticals Corp., Lexington, MA, USA) on erittäin liukoinen aihiolääke ganetespib (aiemmin STA-9090), uusi resorsinoli sisältävän yhdisteen liity geldanamysiini joka sitoo ATP-biding domeenin N-terminukseen HSP90 ja toimii voimakkaana HSP90 estäjä. Ganetespib indusoi hajoaminen useita HSP90 asiakkaan proteiineja, tappaminen monenlaisia ​​ihmisen syöpäsolulinjoja alhaisissa nanomolaarisina pitoisuuksina

in vitro

, ja sillä on voimakas syövän vastainen aktiivisuus ksenograftin kasvaimen malleissa hiirissä ([13], [ ,,,0],14], [15] ja julkaisemattomat tiedot, Synta Pharmaceuticals Corp.).

Aiemmissa tutkimuksissa osoitimme, että ganetespib ja sen vesiliukoinen aihiolääke STA-1474 tehoavat koiran kasvainsolulinjoissa [14], [ ,,,0],15]. Hoito osteosarkooman (OSA) ja syöttösolujen kasvain (MCT) solulinjoissa joko ganetespib tai STA-1474 aiheuttama kasvun estäminen, apoptoosin, joka oli caspase3 /7 riippuvainen, ja poistoa ja /tai alas-säätely pKit /Kit, pMet /Met , Pakt /Akt, ja pSTAT3. Sekä ganetespib ja STA-1474 osoitti ylivoimainen aktiivisuus kuin geldanamysiinistä johdannaisen 17-AAG. Ganetespib esti kasvaimen kasvua hiiren MCT ksenograftimallia, kun taas STA-1474 aiheuttama kasvaimen taantumiseen, kaspaasi-3 aktivaation ja downregulation fosfo-Met (pMet) /Met ja p-Akt /Akt sisään OSA ksenografteissa [14], [15] . Tarkoituksena seuraavat kliinisessä tutkimuksessa oli laajentaa

in vitro

ja hiiren tutkimuksia ja tutkimaan turvallisuutta ja tehoa STA-1474 koirilla spontaanit kasvaimet johdantona tuleviin kliinisen työn ihmisillä, joilla on syöpä.

Materiaalit ja menetelmät

kelpoisuus

Tämä kliininen tutkimus hyväksyttiin Ohio State University Veterinary Medical Center Hospital johtoryhmä heinäkuussa 2007. Kirjallinen suostumus omistajalta jokaisen koiran pyydettiin mukaan IACUC ja Ohio State University College of Veterinary Medicine suuntaviivoja. STA-1474 annettiin koirille spontaanit kasvaimet, jotka oli epäonnistunut tavanomaista hoitoa tai joille ei ollut hoitovaihtoehtoja, tai joiden tavanomainen hoito ei ollut haluttua omistaja. Voidakseen saada tutkimukseen, kukin koira on on diagnosoitu yksi valittu joukko histologisesti vahvistettu spontaani pahanlaatuisia kasvaimia, ja on täyttänyt kaikki sisällyttämisen kriteerit ja mikään poissulkemisperusteiden. Hyväksyttävät maligniteetit mukana karsinoomat, sarkoomat, syöttösolujen kasvaimet, histiosyyttisarkoomien tai lymfoomat. Muita kelpoisuusehdot sisältyvät: 1 vuotias tutkimuksen alkaessa; elinten toiminta oli riittävä; vähintään 2 viikkoa sen jälkeen ennen kemoterapiaa tai sädehoitoa täysin toipuminen välitön myrkyllisyys on näistä hoidoista (3 viikkoa kirurgisen toimenpiteen); vähintään 1 viikko alkaen aiemmin hoidettu muun tutkittavaa lääkettä; ei diagnoosia leukemia; ja mitään näyttöä etäpesäkkeistä aivoissa tai vakavia systeemisiä häiriö ristiriidassa tutkimuksen harkinnan mukaan tutkijan.

STA-1474 muotoilua

STA-1474, liukoinen aihiolääke ganetespib, toimitettiin by Synta Pharmaceuticals Corp (kuvio 1). Lyofilisoitu STA-1474 lääkkeen tuote säilytettiin 4 ° C: ssa ja valolta suojattuna, kunnes hoitopäivänä. Drug liuotettiin Plasmalyte 148 USP, ja pH säädettiin arvoon välillä 6,0-7,0, käyttäen 0,1 N NaOH-standardin liuoksen lopullinen pitoisuus on 3 mg /ml. Lääkeliuos steriilisuodatettiin 0,2 μ nylon suodatin ja ladattiin ei-DEHP fluiditiehyt IntraVia

TM 250 ml tyhjä säiliö. Ladattu infuusiopussiin sitten yhdistetty polyeteenivuorattu tuuletettu paklitakselia setti, joka sisältää 0,22 μ suodatin, annettavaksi. Sekä infuusiopussin ja linja katettiin suojaamiseksi valolta. Drug liuosta käytettiin 24 tunnin kuluessa valmistuksesta.

Kuvassa on kemiallinen rakenne STA-1474, vesiliukoista fosfaattia aihiolääke ganetespib.

Tutkimuksen suunnittelu

Tämä tutkimus oli vaiheen I annos kiihtyvän, avoimessa turvallisuuden arviointiin ja farmakokinetiikkaa STA-1474 in client omistaa koirien kanssa spontaani syöpäsairauksia. Koirat annettiin STA-1474 yksi kolmesta annostelua ja arvioitiin viikoittain tai kahdesti viikossa riippuvainen hoito käytetty. Arviointi toksisuutta kliinisesti ja kasvaimen vasteen suoritettiin jokaisen käynnin. Koirat arvioitiin hematologiset ja biokemialliset toksisuutta 7 päivän välein rutiinilla bloodwork. Alkuannoksen STA-1474 asetettiin 7 mg /kg perustuu aiempiin tietoihin laboratorion normaalia koirat (tuloksia ei ole esitetty) ja annoksen suurentaminen asetettiin 2,5 mg /kg kerrallaan kohortit 3 kunnes annosta rajoittava myrkyllisyys (DLT) oli tunnistettu. DLT pidettiin tahansa asteen 3 tai 4 hematologinen tai ei-hematologinen toksisuus perusteella vakiintuneen VCOG-CTAE kriteerien [16]. Lisäksi kaikki kroonisten ei-asteen 3 tai 4 toksisuutta katsotaan merkittävästi heikentää elämänlaatua (ts, uneliaisuus, ruokahaluttomuus) olivat päteviä kuin DLTS. Taudin etenemistä tai oireita varmasti liittyvien sairauksien ei pidetty haittatapahtumat (AE).

myrkyllisyys arviointi

Jokainen potilas koki lähtötilanteessa täydellistä historiaa, lääkärintarkastus, ja ennen annosta laboratorio arviointi, joka sisälsi täydellinen verenkuva (CBC), seerumin biokemia profiilin, ja virtsa-analyysi. Potilaat arvioitiin haittavaikutusten päivinä 8, 15, 22, ja 29, jolloin täydellinen verenkuva ero ja kliinisen kemian tehtiin. Virtsa suoritettiin lähtötasolla ja toistaa vain jos ilmoitettu. Ehtoja koskien minimaalinen hematologinen vaatimuksista jatkuvan annostelun sisältyivät protokolla: hematokriitti 25%, neutrofiilejä 1500 /L, verihiutaleita 100000 /l. Lisäksi transaminaasit piti olla 4X normaalin ylärajan normaalilla kokonaisbilirubiini ja seerumin kreatiniini jatkamaan STA-1474 terapia.

samanaikainen lääkitys

ehkäistä tai hoitaa huumeiden -aiheiset ruoansulatuskanavan toksisuutta, tukihoito annettiin tarvitaan koiria ilmoittautunut annostelujakson ikäryhmät. Tämä koostui tyypillisesti famotidiini, metronidatsoli, loperamidin, metoklopramidi, ondansetroni, ja /tai maropitantti. Antihistamiinit annettiin koirille masto kasvaimet, koska nämä kasvaimet ovat tiedossa vapauttaa histamiinia. Muut tukihoito annettiin koirille koostui prednisoni ja steroideihin kuulumattomien tulehduskipulääkkeiden lääkkeiden hoitoon kasvaimeen liittyvien tulehdus, ruokahaluttomuus, ja kivun hallintaan.

Tuumorivasteen arviointi

Kasvaimen arvioinnit valmistuivat ennen tutkimukseen osallistumista, ja päivän 8, 15, 22, ja 29. koirille että jatketaan yli suunnitellun 4 annosta STA-1474, vastaus arvioinnit tehtiin välein 3-6 viikkoa sen jälkeen, tai kun epäillään syövän etenemiseen. Vastaukset arvioitiin tutkijan mukaan ennalta määriteltyjen protokollaa kriteerit. Vastaus koirilla, joilla arvioitavissa tauti suoritettiin kliininen tutkimus, röntgen, ultraääni, tai TT. Monet vauriot eivät myöntyväinen kvantitatiiviseen röntgenkuvausta, mutta seurasi joko sarja- kliininen tutkimus (pinnallinen vaurioita; kouraantuntuva imusolmukkeiden) tai ultraäänitutkimus (vatsaontelon imusolmukkeiden). Rintakehä vauriot arvioitiin rintakehä radiografian ja nenän vaurioiden CT.

Vastaus koirilla, joilla mitattavissa oleva tauti arvioitiin tutkijan pohjalta RECIST kriteerien [17]. Täydellinen vaste (CR) määriteltiin katoavat kokonaan taudin kaksi mittausta erotettu vähintään 3 viikkoa. Osittainen vaste (PR) määritettiin yli 30%: n vähennys summa pisin halkaisija kohde vaurioiden dokumentoitu kahdella arvioinnit erotettu vähintään 3 viikkoa. Kasvua 20% koossa kaikkien mitattavissa kasvain alueilla mitattuna summa pisimmän halkaisijan kohde vauriot otetaan vertailukohdaksi pienimmän summan jälkeen hoidon aloittamisen tai ulkonäkö uusia leesio (t) täyttäisi kuten etenevä sairaus (PD). Seka-vaste (MR) määriteltiin PR joissakin kohde vaurioita PD muissa kohde vaurioita. Vakaa tauti (SD) oli määritelty puuttuminen kriteerit joko vastausta tai etenemistä. Koirat, joilla ei ollut näyttöä syövän etenemisen ja jotka eivät olleet kokeneet mitään hyväksyttävää myrkyllisyyttä olivat oikeutettuja pidennettyyn hoitojaksoa. Annosten suurentamista yksilössä koira oli sallittua, jos koira oli sietää hoitoa.

Ganetespib farmakokinetiikkaa

Plasma kerättiin päivänä 1 ja päivänä 22 hoidon määrätyin väliajoin: ennen ja jälkeen annostuksen 30, 60, 90, 120, 180, 300 (5 h), 540 (9 tuntia) ja 1440 (24 h) minuutissa suhteessa annostelun aloittamista. Päivänä 8, päivä 15, ja päivä 29, plasma kerättiin ennen annostelua vain. Noin 1 ml verta otettiin kestokatetrin, sijoitetaan natriumhepariinia tyhjiössä lasiputki, ja asetettiin jäille ennen sentrifugointia. Verinäytteet sentrifugoitiin 3300 rpm 10 minuuttia, 30 minuutin kuluessa kokoelma. Plasma siirrettiin pipetillä kahteen kylmäpulloon ja säilytettiin -80 ° C: ssa analyysiin asti.

Plasman ganetespib määritettiin käyttämällä pätevää nestekromatografia tandem-massaspektrometrialla (LC-MS /MS) menetelmällä. Näytteet analysoitiin HPLC-järjestelmään, joka koostuu Agilent HP1100 erottaminen moduuli (Santa Clara, CA), joka on kytketty AB SCIEX API400 MS /MS-detektorilla (Foster City, CA). Stabiili isotooppi-leimattu ganetespib käytettiin sisäisenä standardina. Näytteenottoa suoritettiin neste-neste-uuttomenetelmällä 25 ui plasma näytteitä ja 800 ui metyyli-tert-butyylieetteriä. Orgaaninen faasi näytteiden haihdutettiin kuiviin typen alla, ja liuotetaan vesi /asetonitriili liuos. Kromatografinen erotus saavutettiin käänteisfaasi-analyyttistä pylvästä (4 um hiukkaskoko, 50 x 2,0 mm i.d.) gradienttieluoimalla vesi /0,1% muurahaishappoa ja asetonitriili /0,1% muurahaishappo, virtausnopeudella 500 ul /min. Yhteenlaskettu ajoaika oli 4 min. Kvantifiointi saavutettiin MS /MS havaitseminen positiivisionisella tilassa useiden reaktionseuraamista. Alempi määritysrajan (LLOQ) oli 1,00 ng /ml, joiden pitoisuusalue 1,00-1000 ng /ml.

farmakokineettiset parametrit ganetespib määritettiin plasman tietoja käyttämällä Noncompartmental Analysis moduuli WinNonlin, versio 5.2 (Pharsight Corporation, St.Louis, MO). Ennen annostelua näytteiden mitattuna alle LLOQ (BQL) käsiteltiin nolla laskelmat. Suurin pitoisuus (Cmax) ja aika maksimi (Tmax) oli suoraan määritettiin havaittu pitoisuus-aika-profiilit. Pinta-ala plasmapitoisuus-aikakäyrän (AUC) arvioitiin lineaarisen puolisuunnikkaan sääntöä. Näennäinen puoliintumisaika (t

1/2) laskettiin t

1/2 = 0,693 /λ missä λ oli eliminaationopeusvakioon arviointiin regressio terminaalin kulmakerroin aikakäyrän.

arviointi HSP70 ilmaisun

Pieni koepalat kerättiin osajoukko potilaan kasvaimia, jotka olivat saatavilla osoitteessa 0, 7, ja 24 tuntia hoidon jälkeen. Koepaloja saatiin käyttämällä 3 mm: n lyönti koepalainstrumenttipatruuna tai 14 mittari Tru-cut neula. Kaikki näytteet asetettiin kylmäpulloon, välittömästi flash-jäädytettiin nestetypessä ja säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes HSP70-analyysi. Arvioida suhteellinen HSP70 tasot kerätään kasvainnäytteissä, kaupallisesti saatavilla HSP70-entsyymi immunosorbenttimääritys (ELISA, Assay Designs, Ann Arbor, MI) suoritettiin. Jäädytetyt kasvain näytteet jauhettiin käyttäen jäädytetty ja survimella. Saatu jauhe suspendoitiin nestemäiseen typpeen, kerätään, jaetaan kahdelle 15 ml conicals; yksi kartiomainen ELISA ja toinen Western blot (katso menetelmä alla). Kun nestemäinen typpi haihdutetaan pois, näytteiden annettiin sulaa jäällä. Näytteet ELISA suspendoitiin uudelleen (1 x) Extraction Reagent, joka sisälsi 1 ug /ml aprotiniinia, 1 ug /ml leupeptiiniä, 1 ug /ml pepstatiini A: ta, 1 mM PMSF, 1 mM natriumortovanadaattia, and10 mM natriumfluoridi, käyttäen 1 ml kutakin 0,5 cm

3 kudosta. Näytteitä inkuboitiin keinuttajassa 1 tunnin ajan 4 ° C: ssa, sentrifugoitiin 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa, ja sitten supernatantit kerättiin. Bradford-proteiinin määrän määritys suoritettiin uutteet käyttäen BioRad-reagenssia (BioRad, Hercules, CA). Näytteet tasata 250 ug /ml (1 x) Extraction Reagent, jaettiin eriin ja säilytettiin -80 ° C: ssa analyysiin asti. Myöhemmin, pakastetut näytteet jossa annettiin sulaa jäillä, sitten laimennetaan sarjoittain näytelaimenninta 2 (annetaan kit) ja 1:04, 1:16, ja 01:32. 100 ui kutakin laimennosta lisättiin sopiviin kuoppiin, kahtena kappaleena, ja 96-esipäällystetty ELISA-levylle. ELISA suoritettiin seuraten valmistajan ohjeita, ja absorbanssi mitattiin 30 minuutin kuluessa käyttämällä Spectramax mikrolevynlukijaa (Molecular Devices, Sunnyvale, CA), jonka aallonpituus on säädetty 450 nm: ssä ja korjaus aallonpituudella 540 nm.

arvioida HSP70 tasot ääreisveren mononukleaarisissa soluissa, 8 ml kokoverta kerättiin ennen annostelua ja 24 tunnin kuluttua altistuksesta (joissain tapauksissa myös 7 tuntia käsittelyn jälkeen) päivänä 1 ja päivänä 22 kaulalaskimosta kahteen 4 ml BD Vacutainer CPT putket (BD, Franklin Lakes, NJ). Näytteitä pidettiin huoneen lämpötilassa kunnes sentrifugointi 1 tunnin ajan 1600 RCF, 2 tunnin kuluessa kokoelma. Sentrifugoinnin jälkeen mononukleaaristen solujen kerros plasma siirrettiin 15 ml: n kartiomaiseen. PBMC: t pestiin lisäämällä 15 ml PBS: ää ja sentrifugoimalla 15 minuutin ajan 300 RCF. Kahden pesun jälkeen solujen pelletit suspendoitiin uudelleen 1 ml: aan PBS: ää ja siirrettiin 1,5 ml: n mikrosentrifugiputkeen. Solut pelletoitiin uudelleen sentrifugoimalla 13000 RCF 1 minuutin ajan. Supernatantti poistettiin ja solupelletit, jossa flash-jäädytettiin nestetypessä ja varastoitiin -80 ° C: ssa. Välittömästi ennen analysointia, PBMC pellettien annettiin sulaa jäillä, sitten kukin näyte resuspendoitiin 500 ui (1 x) uuttopuskuria proteaasinestäjien kanssa. Käyttäen edellä kuvattua menetelmää, näytteet analysoitiin suhteelliset pitoisuudet HSP70 käyttäen HSP70-entsyymi immunosorbenttimääritys (Assay Designs, Ann Arbor, MI).

arviointi tuumoribiopsioissa varten HSP90 ilmentymisen

Jäädytetyt kasvainnäytteet käsiteltiin kuten edellä on kuvattu, sitten uudelleen 100-150 ui: aan lyysipuskuria, joka koostuu 20 mM Tris-HCI, pH 8,0, 137 mM NaCl, 10% glyserolia, 1% IGEPAL CA-630, 10 mM etyleenidiamiinitetraetikkahappoa (EDTA), 1 mg /ml aprotiniinia, 1 mg /ml leupeptiiniä, 1 mg /ml pepstatiini A: ta, 1 mM phenylmethysulphonyl fluoria, 1 mM natriumortovanadaattia, 10 mM natriumfluoridia (kaikki Sigmalta, St. Louis, MO). Näytettä ravisteltiin 4 ° C: ssa 1 tunti ja sitten sentrifugoitiin 15 minuutin ajan 13000 RCF. Bradford-proteiinin määritys suoritettiin lysaatit käyttäen BioRad-reagenssia (Hercules, CA). 60-100 ug proteiinia erotettiin SDS-page, ja siirrettiin PVDF-membraaneille. Membraaneja inkuboitiin yön yli anti-HSP90-vasta-aineita (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pestiin, inkuboitiin sitten piparjuuriperoksidaasikonjugoituja sekundäärinen vasta-aine. Membraanit pestiin jälleen, altistetaan sitten Super Signal West Dura Extended Duration Substrate (Pierce, Rockford, IL) kalvot on poistettu, pestiin, ja uudelleenseulottiin ja β-Actin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) käyttäen SNAP i.d. laite (Millipore, Billerica, MA) mukaan valmistajan ohjeiden.

Tulokset

Oppiaineet

Yhteensä 25 koiraa erilaisia ​​spontaani syövistä otettiin tutkimukseen. Potilaiden demografiset ja kasvaimen tyyppi luetellaan taulukossa 1. Suurin osa koirista tähän tutkimukseen rekisteröidyt oli epäonnistunut ennen hoito-ohjelmaan (n = 18, 72%) kirurgia, sädehoito, kemoterapia, tai yhdistelmä näistä hoidoista. Koska aiemmat tiedot osoittavat biologista aktiivisuutta ganetespib koiran osteosarkoomaa (OSA) ja syöttösolujen kasvain (MCT) solulinjoissa, sekä kasvaimen regression /vakautuksen hiiren ksenograftimalleja koiran OSA ja MCT, koirat näillä kasvaintyypit olivat rikastettu tässä faasin I tutkimuksessa. Kasvaintyypeissä edustaa sisältyvät OSA (n = 10), MCT (n = 4), kilpirauhasen karsinooma (n = 3), lymfooma (n = 3), muut karsinooma (n = 2), nenän kondrosarkoomasta (n = 1), suun kautta pahanlaatuinen melanooma (n = 1), ja suun fibrosarcoma (n = 1).

hoito ryhmät ja farmakokineettinen analyysi

Koirat (n = 12) oli alun perin tekivät hoito joka koostuu STA-1474 laskimoon yhden tunnin kerran viikossa. Toinen kohortti koirien (n = 6) annettiin STA-1474 yli 8 tuntia kerran viikossa. Tätä annostusta valittiin perustuu osittain hoitovasteen havaittiin yhden koiran kanssa pahanlaatuisen melanooman ensimmäisen kohortin seuraavat huumeiden ekstravasaatio ja pitkäaikainen lääkealtistuksen hitaiden ihonalainen imeytyminen. Kolmas kohortti koirien (n = 7) sai STA-1474 annettiin yhden tunnin aikana kahdesti viikossa. Jokainen koira tuli tutkimus oli tarkoitus saada vähintään 4 annosta STA-1474 kanssa mahdollisuus jatkaa hoitoa edessä joko stabiili tauti tai objektiivinen kasvaimen vaste.

Farmakokineettiset tiedot on koottu taulukkoon 2 . Full farmakokineettiset näytteenotto suoritettiin kaikille koirille tässä tutkimuksessa ensimmäisenä päivänä lääkkeen annon. Keskimääräisestä plasmassa – aika profiilit koirille kolmessa hoitoryhmässä on esitetty kuvassa 2a, jossa edustava profiileja 6 koiraa (2 kummassakin hoitoryhmässä) kuviossa 2b. Koirille vastaanotetaan tahansa kolmesta hoito-ohjelmina, AUC oli suhteellisen samanlaisia, vaihdellen välillä 5013-5701 ng /ml-h ganetespib. Kuitenkin tuntikaavion lääkeinfuusioiden 9,25 mg /kg tai 5 mg /kg johti lyhyempi Tmax (0,7 h ja 1,1 h, vastaavasti) ja korkeamman Cmax (3982 ng /ml ja 3415 ng /ml, vastaavasti) verrattuna 8 tunnin infuusiona (Tmax 5,7 h, Cmax 802 ng /ml).

a) keskimääräinen ganetespib plasmapitoisuuden – aika profiilin kullekin annosteluohjelma b) edustaja ganetespib plasman – aika profiilit kaksi potilasta molemmissa annostusta.

Turvallisuus arviointi

haittatapahtumat aikana hoitojaksoa (yhteenveto taulukossa 3) muodostuu lähes kokonaan ruoansulatushäiriöitä (anoreksia, pahoinvointi, oksentelu, ripuli) ja uneliaisuus. Mitään lääkkeen aiheuttamia hematologista tai biokemiallisten toksisuutta havaittiin missään annoksilla. Yksi koira metastasoitunutta osteosarkooman kehittyi akuutti anuriasta kärsivällä munuaisten vajaatoimintaa johtaen eutanasian. Myöhemmät ruumiinavaus paljasti suuri kasvain embolusten molemmissa munuaisvaltimoiden, ei ollut näyttöä lääkkeen aiheuttama muutoksia munuaisten parenchyma ja sellaisena etenevä sairaus todettiin olevan syy havaittu munuaisten vajaatoimintaa. Toinen koira kehittyi akuutti maksan toimintakokeissa (ALAT, ALP) ja nousu hoidon 24 tunnin kuluttua lääkkeen antamisesta. Koira myöhemmin oksensi suuri roskan koostuu sideharsoa tyynyjä käytetään sitomisen katetrin päällä ja biokemiallisten arvojen palautuneet normaaleiksi 72 tunnin kuluessa; osittainen väliaikainen tukos sappitiekivistä johtuu ulkomaisen laitoksen määritettiin syy biokemiallisia muutoksia tässä tapauksessa.

Annoksen suurentaminen suoritettiin ja annosta rajoittavia toksisuuksia tunnistettiin käyttäen kerran viikko tunnin infuusiona. Vaikka lähes kaikki ruoansulatuskanavan toksisuutta olivat pääasiassa luokka 1 tai 2 luonnossa, annoksilla yli 9,5 mg /kg, koirilla havaittiin olevan uneliaisuus ja anoreksiaa, että omistajat tuntui merkittävästi heikentynyt elämänlaatu, keskeyttämiseen johtanut lääkkeen annon. Esimerkiksi kaikki kolme koiraa, jotka saivat 10,25 mg /kg lääkettä ilmeni asteen 2 ripuli, uneliaisuus ja ruokahaluttomuus ja sitten kukin sai vain yhden annoksen lääkettä. Sellaisenaan, 9,5 mg /kg pidettiin suurin siedetty viikoittainen annos lääkeainetta, kun sitä annetaan viikoittain yli 1 tai 8 tuntia. Tällä annoksella maha toksisuuksia olivat hallittavissa lisäämällä samanaikainen lääkitys koostuu ondansetroni, metoklopramidin ja /tai maropitantti varten pahoinvointia /oksentelua ja metronidatsolin ja /tai loperamidin ripuliin. Kaikki koirat jatkoivat hoitoa STA-1474 jälkeen alkuperäisen 4 hoitosykliä pysyi samanaikaisia ​​lääkityksiä ajaksi lääkehoidon.

hoitovaste

Vastemäärät määritettiin koiraa osaksi 3 eri annostelun ryhmään. Koirille, jotka saivat kerran viikossa tapahtuvan annostelun (n = 12), ole objektiivisia vasteita havaittiin paitsi yksi koira laaja suun pahanlaatuinen melanooma, joka koki ekstravasaation tapahtuman aikana 4

th hoidon STA-1474. Tämä koira oli osittainen vaste kasvaimen koon ja seuraavat farmakokineettinen analyysi (kuvio 3), määritettiin, että tahaton ihonalainen anto laajennettu Tmax, ilman merkittävää muutosta todellinen AUC (tuloksia ei ole esitetty).

Potilaan # 5 oli aggressiivinen suullinen pahanlaatuinen melanooma, että olivat tunkeutuneet nenäonteloon. Aikana 4

th hoitosyklin STA-1474, ekstravasaatiota sattui johtaen muuttuneeseen lääkkeen farmakokinetiikassa. Huomattava lasku suullinen massa havaittiin 7 päivää myöhemmin ja myöhemmin CT vahvisti osittaisen hoitovasteen. Näytössä on kolme edustavaa Hyväksytty CT-kuvia kasvaimen ennen ja jälkeen hoidon.

Perustuu todisteita biologinen aktiivisuus liittyy pitempi Tmax, farmakokineettisen mallinnuksen käytettiin määrittämään annostelun malli, joka saavuttaa samanlainen Tmax kun lääke annettiin pidemmän ajanjakson samalla annosnopeus. Se oli ennustettu, että 9,5 mg /kg STA-1474 annetaan yli 8 tunnin infuusiona johtaisi plasman ganetespib yli 100 ng /ml plasmaa 8-10 tuntia ja näin ollen seuraavan 6 koiraa merkittiin kohortin arvioidaan tämän annostusta. Lisäksi kaksi koiraa ensimmäisestä annostelusta kohortti (9,5 mg /kg kerran viikossa) on siirtynyt 8 tunnin infuusiona protokollan valmistumisen jälkeen suunnitellun 4 lääkeannoksia. Ja 6 koiraa hoidetaan aluksi enää infuusio oli kaksi osittaista vastetta (metastaattinen kilpirauhassyöpä, 36 viikkoa, kuvio 4a, metastaattinen OSA, 20 viikkoa, kuva 4b), joista toinen sekoitetaan vaste (metastaattinen MCT, 16 viikkoa), ja kaksi koirat kokenut vakaa tauti (molemmat metastaattinen OSA, 12 viikkoa). Yksi koira metastaattinen kilpirauhasen syöpä, joka kytketään pois 1 h 8 tunnin infuusiona kokenut stabiili tauti 40 viikon ajan, ja koira suun kautta pahanlaatuinen melanooma ja ekstravasaation tapahtuma kokenut jatkuvaa osittainen vaste 12 viikon aikana 8 tunnin infuusiona protokollaa.

a) Potilaan # 14 oli paikallisesti uusiutunut kilpirauhaskarsinoomaa etäpesäkkeitä keuhkoihin. Tämä potilas sai STA-1474 8 tunnin infuusiona protokolla ja kokenut osittaisen hoitovasteen sekä paikallisesti toistuvat ja etäpesäkkeitä. Esitetyt tulokset edustavat röntgenkuvia ennen ja jälkeen 15 hoitojen kanssa STA-1474. Keltainen nuolet osoittavat metastaattisen keuhkonoduluksia. b) Potilaan # 18, oli metastasoitunut OSA keuhkoihin seuraavat amputaatio ja kemoterapia varten appendicular OSA. Tämä potilas sai STA-1474 8 tunnin infuusiona protokolla ja kokenut osittaisen hoitovasteen. Esitetyt tulokset edustavat röntgenkuvia ennen ja jälkeen 4 hoitoja STA-1474. Keltainen nuolet osoittavat metastaattisen keuhkonoduluksia.

Koska enää infuusio protokollan näyttivät liittyvän biologista aktiivisuutta, halusimme selvittää useammin annon STA-1474 käyttäen 1 tunnin infuusiona protokolla olisi sekä siedettävä ja aiheuttaa tavoitteena vastauksia hoito. Annos 5 mg /kg annettuna yli tunnin kahdesti viikossa valittiin perustuvat alustaviin tietoihin siedettävyyden Terveillä koirilla ja farmakokineettisen mallinnuksen (tuloksia ei ole esitetty). Kuten on esitetty kuviossa 2a ja b, tämä annostusohje johti Cmax ja AUC hieman alhaisempi kuin syntyy 9,5 mg /kg: n annos. Toksisuuksia havaitaan olivat samanlaisia ​​kuin kerran viikossa suuremman annoksen STA-1474. Niistä 7 koiraa hallinnoi tätä protokollaa, 2 kokenut osittaista vastetta terapiaan (molempien MCT, kuva 5) ja molemmilla koirilla lähti olla jäljellä sairaus kirurgisesti poistettu. Yksi koira (metastaattinen OSA) koki stabiili tauti lyhyeksi aikaa mutta omistaja valitsi olla jatkamatta hoitoa ja sellaisenaan, tämä ei täyttänyt RECIST kriteereitä. Loput koirat (lymfooma, n = 3, metastaattinen OSA, n = 1) koki etenevä sairaus.

a) Potilaan # 19 oli toistuva 3. asteen ihon MCT. Tämä potilas sai STA-1474 on 1 tunnin infuusiona protokollan kahdesti viikossa ja kokenut osittaisen hoitovasteen että ihovaurioiden jälkeen 7 hoitoja. b) Potilaan # 24 oli suuri aiemmin hoitamaton ihon MCT. Tämä potilas sai STA-1474 on 1 tunnin infuusiona protokollan kahdesti viikossa ja kokenut osittaisen hoitovasteen että ihovaurioiden jälkeen 4 hoitoa.

Arviointi HSP90 ja HSP70 ilmaisun Tuumorinäytteissä ja PBMC

jälkeen inhibitio HSP90, nopea säätelyä HSP70 ilmentymisen havaitaan usein [14], [15], [18]. Sinänsä HSP70 säätelyä voi mahdollisesti toimia biomarkkeri menetyksen HSP90 toiminto. Sen määrittämiseksi, onko hoito STA-1474 muuttanut ilmaus HSP70, ja jos HSP70 voisi olla potentiaalinen herkkä korvike biomarkkeri HSP90 eston PBMC kerättiin ennen ja jälkeen hoidon ja Western blottaus varten HSP70 suoritettiin. Kuten kuviossa 6a, pienet lisäykset HSP70 ilmentyminen oli nähtävissä vuoden hoidon jälkeen PBMC näytteitä, vaikka nämä muutokset olivat vaikea tarkasti kvantitoimiseksi. Niinpä ELISA-määritystä käytettiin myöhemmin näytteitä enemmän lopullisesti arvioida säätelyä HSP70.