Krooninen sairaus

tiivistelmä

ksenograftimallia jolloin elävien munuaissyöpäsoluissa istutettiin munuaiskotelon alle hiirillä, paljasti 30-kertainen kasvaimen tilavuuden ajan 26 päivää ja tämä liittyi kanssa 32-kertainen nousu tasoa lactosylceramide (LacCer). Hiiret, syötetään D- treo-1-fenyyli-2-decanoylamino-3-morfolino-1-propanolia (D-PDMP), inhibiittori glukosyyliseramidisyntaasi ja lactosylceramide syntaasi (LCS: p-1,4-GalT-V), osoitti vähentynyt selvästi kasvaimen tilavuuden. Tähän liittyi lasku massa lactosylceramide ja kasvu glukosyyliseramidi (GlcCer) tasolla. Mekaaniset tutkimukset paljastivat, että D-PDMP inhiboi soluproliferaatiota ja angiogeneesiä estämällä p44MAPK, p-AKT-1-reitin ja nisäkkäiden tavoite rapamysiinin (mTOR). Yhdistämällä glykosfingolipidikertymäsairauksiin synteesi kasvaimen kasvuun, munuaissyövän etenemisen ja regression voidaan arvioida. Estäen siten glykosfingolipidin synteesi voi olla bonafide tavoite estää etenemisen muiden syöpien.

Citation: Chatterjee S, Alsaeedi N, Hou J, Bandaru VVR, Wu L, Halushka MK, et ai. (2013) käyttö glykolipidin Inhibitor lievittävät munuaissyövän hiirimallissa. PLoS ONE 8 (5): e63726. doi: 10,1371 /journal.pone.0063726

Editor: Rajeev Samant, University of Alabama at Birmingham, Yhdysvallat

vastaanotettu: 26 syyskuu 2012; Hyväksytty: 05 huhtikuu 2013; Julkaistu: 09 toukokuu 2013

Copyright: © 2013 Chatterjee et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Hanke rahoittivat kautta TEDCO, State of Maryland avustuksen, Johns Hopkins University institutionaalista tukea ja National Institutes of Health myöntää PO-1-HL-107153-01. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: SC palvelee tieteellisessä neuvottelukunnan Amalyte Pharmaceuticals eikä vastaanottaa honorarium hänen palveluja ja tällaiset tiedot tallennetaan institutionaalisten eOPC kirjaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja. Kaikki muut kirjoittajat eivät ole kilpailevia taloudellisia etuja.

Johdanto

Viimeaikaiset tutkimukset viittaavat siihen, että sfingolipidit voi aiheuttaa fenotyypit kuten leviämisen, tarttuvuus ja angiogeneesi-tunnusmerkkejä kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden [1] – [ ,,,0],6]. Soveltaminen estävien lääkkeiden glykosfingolipidikertymäsairauksiin synteesi antavat mahdollisuuden tutkia roolia näiden yhdisteiden eläinmalleissa ihmisen sairauden. Tässä osoitamme, että yhdistämällä glykosfingolipidikertymäsairauksiin synteesin ja sen esto hiirimallissa munuaisten syöpä, on mahdollista tarkkailla jalanjälki vuorovaikutuksen huumeiden ja glykosfingolipidikertymäsairauksiin metaboloivia entsyymejä ja ennustaa puhkeamista sairauden /taudin etenemiseen ja kasvaimen regressio. Tukkiminen glykosylaation seramiditasot syövän hoitoon on dokumentoitu solu- ja eläinmalleissa [2], [3].

Kasvaimet edellyttää uusien verisuonten muodostumista ennestään olevia (angiogeneesi) ja endoteelikasvutekijä (VEGF) on keskeisessä asemassa angiogeneesin erilaisissa kasvaimissa [4], [5]. Siksi me rationalisoidaan että kohdistaminen endoteelisolujen että linja kasvain verisuonia, jotka on rikastunut yhdellä isoformi LCS voi olla useita teoreettisia etuja, kuten huumeita toimitus useiden syöpätyyppien. Meidän logiikka perustuu aikaisempien havaintojemme kanssa, jossa VEGF osoitettu stimuloivan LCS: β-1,4-GalT-V vaikutus ihmisen valtimon endoteelisolujen LacCer, ja joka johti aktivointi ”hapen herkkien” signalointireitin johtaa angiogeneesi [4]. Lisäksi se, että pieniä häiritseviä RNA: n (siRNA) aiheuttaa LCS: p-1,4-GalT-V-geenin ablaation tai farmakologisen käsittelyn käyttämällä D-PDMP, estäjä uridiinidifosfaattiglukoosi keramidiin glukosyylitransferaasia (UGCG), ja LCS [7], huomattavasti lieventää VEGF: n indusoimaa angiogeneesiä [5]. Lisäksi havaitsimme, että D-PDMP voi merkittävästi (

P

0,0005) lieventää VEGF /β-FGF angiogeneesiä

in vivo

nude-hiirissä [4] ja estävät kokeellista etäpesäkkeitä hiiren Lewisin keuhkokarsinooma [8].

tämän tutkimuksen tavoitteena oli selvittää estämällä glykosfingolipidikertymäsairauksiin synteesiä myös estävät solujen lisääntymistä /pienentää kasvaimen tilavuus

in vitro

ja

in vivo

. Tämä tutkimus saavutti tavoitteen, joka estävä glykosfingolipidikertymäsairauksiin synteesiä myös estävät solujen lisääntymistä /pienentää kasvaimen tilavuus

in vitro

ja

in vivo

.

Materiaalit ja menetelmät

etiikka lausunto

tutkimus hyväksyttiin Johns Hopkins Medicine Institutional Animal Care ja käyttää komitean lupa # MO03M615. Asiaa pyrkimyksiin parantaa eläinten kärsimyksiä kuten anestesiassa (ketamiini ja Xylazine) ja leikkauksen jälkeisen seurannan (aikakauslehti tarkistaa eläimillä jopa 8 tuntia leikkauksen jälkeen). Antibioottivoiteella annettiin paikalla viillon ja optisen voidetta levitettiin estämään heidän silmänsä kuivu leikkauksen aikana.

Kokeet hiirillä

Hiiri munuaissyövän (RENCA) solususpensiota oli ladattu 1 ml: n ruiskuun. Vastaanottaja hiiriä (BALB /c-hiiriä) esi-nukutettiin i.p. injektio (100 ui) kantaliuosta ketamiini /ksylatsiinin (8 mg /kg), kiinnitetty maadoitettu levy selkään ajellaan ja valmistetaan steriiliin tavalla. Viilto tehtiin vasempaan kylkeen ja vasen munuainen ja exteriorized. 100 ui kasvainsolujen suspensiota (1 x 10

6 solua /ymppi) injektoitiin subkapsulaariseen tilaan vasen munuainen. Munuainen pantiin sitten alkuperäiseen asentoon ja viilto suljettiin steriilillä metalli turvallinen leikkeitä. Kokeellinen hoito aloitettiin 2 päivää sen jälkeen subkapsulaarista kasvaimen istutuksen. Hiiret syötetään letkulla suun kautta D-PDMP (3 ja 10 mg /kg kehon paino) päivittäin. D-PDMP liuotettiin 5% Tween-80 suolaliuoksessa. Kymmenen hiirtä (N = 10) käytettiin kussakin ryhmässä.

lumeryhmässä hiirten, joilla on kasvain implantti saivat päivittäin, yhtä suuri tilavuus 100 ui ajoneuvon. Tämän menettelyn jälkeen eläimiä tarkkailtiin päivittäin. Päätepiste tämän koesarja oli kasvaimen kasvua arvioidaan munuaisissa. Kasvaimen kasvua eläinten seuranta istutettu ortotooppisesti munuaisissa suoritettiin manuaalinen tunnustelu kahdesti viikossa. 4 viikon jälkeen (päivä 26-28 jälkeinen kasvaimen istutuksen), eläimet tapettiin CO

2 ja ruumiinavaus. Kasvaimen kasvu mittaus suoritettiin suoraan tuumorin paino arvioinnin lopussa kokeen.

histologiset tutkimukset

Ensisijainen kasvaimia lähetettiin histologiaa varten (N = 4). Kudosleikkeet värjättiin hematoksyliinillä -eosin ja vasta-aineilla CD31 (tärkeä merkkiaine angiogeneesi) ja kaspaasi-3 (tärkeä merkki apoptoosin). Lactosylceramide vasta-ainetta (CD17) hankittiin Ancell Laboratories, ja sitä käytettiin tunnistamaan lokalisoinnin LacCer munuaisissa kudoksessa. Kudokset kerättiin muista 4 hiirillä ja käytetään Biochemical /molekyyli, jotka on kuvattu tekstissä.

uuttaminen D-PDMP ja sfingolipidit

Näyte uutto suoritettiin käyttäen modifioitua Bligh ja Dyer menettelyä kuten aiemmin on kuvattu [9]. Kukin näyte homogenoitiin huoneenlämpötilassa 10 tilavuuteen deionisoitua vettä. Kolme tilavuutta 100% CH

3OH sisältävä 53 mM HCOONH

4, 17 ng /ml C

12:00 seramidiksi, ja 17 ng /ml C

12:00 sfmgomyeliini (sisäisiä standardeja, IS ) lisättiin, ja seosta vorteksoitiin. Neljällä tilavuudella CHCI

3 lisättiin, vorteksoitiin ja sentrifugoitiin sitten 1000 x

g

10 minuuttia. 100 ui CHCl

3-kerros erotettiin, kuivattiin typpivirrassa, ja jäännös liuotettiin 100% metanoli, joka sisälsi 10 ng /ml C

02:00 keramidin sisäisenä standardina kvantifiointiin D -PDMP. Sitten näytteet siirrettiin n lasipulloon insertit LC /MS /MS-analyysi; 10 ui injektoitiin LC /MS /MS: llä. Kaikki liuottimet ja kemikaalit olivat HPLC-laatua. Rasva-otot suoritettiin käyttäen borosilikaattilasi-pinnoitettu lasi putket ja pipetit, vähentää tarttumista lipidien pintoihin.

LC /MS /MS-analyysi sfingolipidit ja D-PDMP

tunnistaminen sfingolipidikeramidi lajien ja D-PDMP suoritettiin käyttäen 3000 PE Sciex nestekromatografia sähkösumutusionisaatiota tandem massaspektrometriä, toiminut positiivinen asetus (LC-ESI /MS /MS, Applied Biosystems, Thornhill, Ontario, Canada), ja menetelmien mukaan raportoitu aikaisemmissa tutkimuksissa [ ,,,0],10]. Järjestelmä koostuu kahdesta Perkin Elmer LC pumput liitetty HTC PAL automaattisen injektiolaitteen (CTC Analysis, Zwingen, Sveitsi) varustettuna 50 ui näytettä silmukka. Virtausnopeus oli 400 ul /min seramideja ja 1 ml /min sfingomyeliinit. Virtaus näytteestä injektori johti 2,6 um C sarakkeen seramideja ja D-PDMP, ja 5 um: C

18 sarakkeen sfingomyeliinit (Phenomenex, Torrance, CA). Pylväs tasapainotetaan ennal- 0,1 min liuotin A, joka koostui CH

3OH: dH

2O (85:15, v /v) 5 mM HCO

2NH

4, ja näyte eluoitiin liuottimella B, joka koostui CH

3OH: HCOOH (99:1, v /v) 5 mM HCO

2NH

4. Eluoitunut näyte automaattisesti syötettiin ionilähteen. Väline parametrit LC-ESI /MS /MS optimoitiin erikseen kunkin lajin keramidin, seramidi-1-fosfaatti, sfingosiini, sphinganine, sphigosine-1-fosfaatti, sfingomyeliiniä, ja D-PDMP useiden reaktion seurantaa. Ceramides ja sfingomyeliinit kvantitoitiin käyrän alla oleva ala (AUC) laskee sekunnissa (CPS) normalisoitu sisäisiä standardeja (keramidiin C

12:00 ja sfingomyeliinin C

12:00). D-PDMP pitoisuudet määritettiin luomalla standardikäyrää, joka oli rakennettu käyttäen suhteita viitestandardien (D-PDMP; 0,1-100 ug /ml) ja IS (seramidiksi C

02:00; 10 ng /ml) piirrettynä vastaan ​​suhteet viite- ja IS kokeellisista näytteistä. Kaikki kantaliuokset varastoitiin -20 ° C: ssa ja stabiili yli 6 kk.

glykosyylitransferaasivaikutus ja glycosylhydrolase aktiivisuusmääritysten

LCS aktiivisuutta munuaisessa valmisteissa mitattiin käyttämällä protokollaa yksityiskohtaisesti aiemmin [11] kanssa seuraavia muutoksia. Lyhyesti, pikajäähdytettiin munuaiskudos homogenoitiin Tris-HCI-puskuriin (pH 7,4), joka sisälsi Triton-X-100 ja sentrifugoitiin 10000 rpm 15 minuutin ajan. Proteiini massa supernatantissa mitattiin ja 100 ug näytettä proteiinia käytettiin entsyymitestejä, kolmena kappaleena. 14C-UDP-galaktoosia (amerikkalainen radioaktiivisen merkkiaineen Company, St. Louis, MO) toimi luovuttajan galaktoosi. Ja glukosyyliseramidin (Matreya Chemicals, PA) toimi akseptori tässä määrityksessä. 14C-LacCer tuotetaan tätä määritystä kvantifioitiin tuike- spektrofotometrisesti. Glukosyyliseramidisyntaasi aktiivisuus mitattiin käyttäen seramidia akseptorin ja [3H] UDP- glukoosia glukoosi luovuttaja. Glukosyyliseramidi hydrolaasi aktiivisuus mitattiin käyttämällä [3H] glukosyyliseramidi (amerikkalainen radioaktiivisen merkkiaineen Company), koska alustan mukaan aiemmin julkaistu protokollia.

Western immunoblot tutkimukset

Munuaiset otettiin ohjaus, plasebo, 3 MPK ja 10 MPK D-PDMP syötetään suun kautta ja päivittäin hiirille. Munuaisten kudokset homogenisoitiin RIPA-puskurissa (Sigma Aldrich), asetettiin jäille 15 minuutin ajan, sentrifugoitiin 13000 rpm, ja supernatantit kerättiin. Määrittää proteiinipitoisuus, Bradford-testillä. On 4-15% geeliä (Bio-Rad Ready Gel), 45-90 ug proteiinia näytteistä ja 10 ui alhaisen molekyylipainon proteiini standardi (Bio-Rad Dual Color Precision Plus) ladattiin. Sen jälkeen geelielektroforeesilla 1,5 tuntia, Immuno-Blot PVDF kalvoja (Bio-Rad) liotettiin kylmällä metanolilla dH

2O, ja siirto puskuri (Bio-Rad). Seuraavaksi geeli siirrettiin PVDF-kalvolle (Bio-Rad), 30 V yön yli. Kalvot blokattiin 3% maitoa, 1 x TBST (0,05% Tween-20), inkuboitiin ensisijaisen vasta-aineita: P-1,4-GalT-V, Beta aktiini, UGCG (Santa Cruz Biotechnology), GAPDH (glyseraldehydi 3- fosfaattidehydrogenaasi, US Biological), p44MAPK (Thr202 ja Tyr204), p-AKT-1 (Thr308) (Cell Signaling Technologies), ja mTOR (Sigma-Aldrich) 1 x TBS: ssä, jossa 1:200 laimennus ja 0,5% BSA: ta, ja inkuboitiin toisen vasta-aineen, vuohen anti-kani IgG HRP-konjugaattia (Sigma Aldrich) 5% maitoa, 1 x TBST: ssä, jossa 1:1000 laimennus. Kaikki primaaristen vasta-aineiden tarpeen inkuboimalla yön yli 4 ° C: ssa, kun taas sekundääriset vasta-aineet tarvitaan 1 h huoneenlämpötilassa inkuboinnin jälkeen. Seuraavaksi kalvot pestiin 1 x TBST: ssä 5-10 minuutin ajan ja toistettiin 2 kertaa ja kehitettiin käyttäen ECL (Amersham ECL Plus ™ Western-blottaus Detection Reagents).

Tietokoneavusteinen kvantitoimiseksi kaspaasi-3 ja CD31 positiiviset solut

Kaikki immunohistokemiallisesti värjätään Levyjä digitaalisesti skannattu käyttämällä Aperio CS ScanScope (Vista, CA). Kaspaasi-3 analyysi, harvinainen tapahtuma ja ydinvoiman algoritmeja Aperio Tool Box Kit käytettiin. Harvinaisessa tapauksessa ilmaisin tunnistaa kaspaasi positiivisia soluja jotka oli vahvistettu käsin kuratointiin. Tämä arvo jaettuna solumäärä alueen määräytyy ydin- algoritmilla. CD31-alue tunnistettiin jakamalla CD31 positiivinen maskin alueella elinkelpoiset kasvain peittoalueen jokaisen dian, kuten vastaavasti kuvataan [12].

Statistical tutkimukset

Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskihajonta ja keskiarvo ± keskivirhe mittaukseen. Merkittävä ero ohjaus, plasebo, ja koeryhmä arvioitiin käyttämällä opiskelijan

t

testi ja yksisuuntainen ANOVA. Pareittain vertailu tehtiin tehtävänä arvioida eri hoitoja. Eroja pidettiin merkittävinä osoitteessa

P

0,05.

Tulokset

Havaitsimme, että D-PDMP mutta ei L-PDMP esti kasvua RENCA-solujen (kuva S1 ). Siksi me arveltu, että estävä LCS toimintaa ja vähentää LacCer kuormitus saattaa hyvinkin vähentää munuaissyövän hiirillä. Tässä tutkimuksessa käytimme D-PDMP, koska se on myrkytön ja otetaan munuainen, aivot ja maksa, kun niitä annetaan suun kautta hiirille [13]. Lisäksi se poistuu elimistöstä nopeasti sytokromi P450-järjestelmän sen t

1/2 on -50 minuuttia [13]. Vaikka D-PDMP syntetisoitiin lieventämiseksi Gaucherin taudin estämällä UGCG aktiivisuutta, osoitimme, että se esti myös LCS aktiivisuus-LacCer tuotantoa ja siis angiogeneesiä

in vitro

ja

in vivo

, nude-hiirissä [5]. Tässä osoitamme, että estävä LCS aktiivisuutta ja LacCer tuotanto nimenomaan ovat keskeisiä signalointi tapahtumia, kuten angiogeneesin ja lisääntymistä, jotka johtavat merkittävän vähenemisen kasvaimen tilavuuden hiirimallissa munuaissyövän.

Viikon kuluttua hakemuksen, primaarikasvaimen oli makroskooppisesti näkyvää; 10 päivän kuluttua spontaanisti etäpesäkkeitä kehitetty paikallisiin imusolmukkeisiin, keuhko-, vatsakalvon, ja maksa, jolloin RENCA mallin järjestetään samalla tavalla kuin ihmisen munuaissyövän. Keskimääräinen elinaika RENCA kantavien hiirten on 32 päivää, jolloin 10

6 RENCA-solua injektoidaan. Sen ratkaisemiseksi, onko muutos glykosfingolipidikertymäsairauksiin profiili on tärkeä ominaisuus munuaisten syöpä, vertasimme taso näiden lipidien kontrollimunuaista (ei laakeri RENCA) ja lumelääkkeen hiiriä munuainen (laakeri RENCA). Samalla tutkimme vaikutuksia ruokinta D-PDMP kasvaimen tilavuuden ja lipiditasoja munuaisessa. Havaitsimme, että implantaation RENCA-solujen subkapsulaariseen tilaan vasemman munuaisen (plasebo hiiret, ja ei hoitoa) osaltaan -30-kertainen kasvaimen tilavuuden, aikana noin 26 päivää (kuvio 1A). Kehon paino ei muuttunut (kuvio 1 B) ja 20% hiiristä lumeryhmässä kuoli. Ruokinnalla suun kautta 3 MPK D-PDMP ja 10 MPK D-PDMP varten koeajaksi vähensi kasvaimen tilavuus -50% lumelääkkeen hiiren munuaisen kasvaimia. Tämä D-PDMP annoksesta riippumaton pieneneminen kasvaimen tilavuuden voisi osittain, selittää havaintomme, että taso D-PDMP (mitataan käyttäen LC-MS /MS) munuaisissa kudoksessa oli samanlainen (kuvio 1 C), koska se voi on erittyy nopeasti. Yksityiskohtainen tandem LC-MS /MS paljasti, että C24, C16 ja C22 olivat tärkeimmät rasvahappo molekyylilajeihin keramidi-, mono- ja hexosylceramide ja sfingomyeliini hallinnassa, plasebo, ja D-PDMP ruokitaan hiirten munuaisessa. Ja C20, C18 ja C26 olivat vähäisiä sisältävä rasvahappo sfingolipidit (kuva S2). Yhteenlaskettu keramidi taso nousi ~2.5-kertaiseksi lumelääkkeeseen hiiren munuaisissa vs. kontrolli. Mielenkiintoista, ruokinta 3 MPK D-PDMP ei muuttanut tasoa keramidiin munuaisen lumelääkkeeseen verrattuna (kuvio 2A). Kuitenkin 10 MPK D-PDMP syötetään hiiret, taso keramidiin laski kontrolloida tasolle. Näin ollen vaikka D-PDMP väitetään olevan erityinen estäjä UGCG ja siten edistämään kasvua Seramiditasojen, tässä tutkimuksessa se ei esittänyt kudoksen seramiditasot hiiren munuaisissa. Ja tämä havainto on sopimukseen aiemman raportin, joka osoitti, että D-PDMP (100 MPK) huonontunut munuaisten keramidiin level~9% 5 tuntia myöhemmin [13]. Pistäminen 40 MPK D-PDMP kahdesti päivässä 4 päivän ajan myös johti 23%: n lasku keramidiin munuaisessa [13]. Toisessa tutkimuksessa käyttämällä iminosugar N- (5-adamantinane-1′-yyli-metoksi) pentyyli-1-deoxynoijirimycin (AMP-DNM), estäjä UGCG myös ei esittänyt seramiditasoja maksassa ja ylläpiti plasman keramidia perustasolle ruokavalion aiheuttama hyperlipidemia apoE – /- hiirissä [14]. Syyt D-PDMP välittämää lasku keramidiin tasolla hiiren munuaisissa ei käy selvästi ilmi tässä tutkimuksessa. Koska seramidi on suora prekursori sfingomyeliinin synteesin, odotimme korkeampi sfingomyeliinin D-PDMP käsitellyissä hiirissä. Kuitenkin taso Sfingomyeliinin tutkimuksessamme ja aikaisemmassa tutkimuksessa [13] ei muuttunut merkittävästi (kuvio 2 H). Tämä saattaa johtua siitä, kun suuremman altaan seramiditasot saattavat aiheuttaa lisääntymiseen sfingomyeliini synteesissä; kuitenkin, koska D-PDMP myös lisää toiminnan sfingomyelinaasi, se saattaa auttaa ylläpitämään sfingomyeliini homeostaasin [13]. Ceramide voitaisiin myös hydrolysoida tuottaa sfingosiiniä ja sen johdannaiset (kuvio 2C-E). Esimerkiksi, meidän lisäksi tutkimukset osoittavat, että taso keramidin-1-fosfaatti (kuvio 2B), sfingosiini (kuvio 2C), sfingosiini-1-fosfaatti (kuvio 2D) ja sphinganine (kuvio 2E) vaihteli lumelääkkeellä hiiren munuaisissa verrattuna kontrolliin ja käsiteltäessä D-PDMP. Erityisesti 20-kertainen nousu tason sfingosiini-1-fosfaatti lumelääkettä hiiren verrattuna kontrolli todettiin. Hoito 3 MPK D-PDMP ei laskenut tasolle sfingosiini-1-fosfaatti lumelääkkeeseen verrattuna hiiren munuaisen. Kuitenkin kun ruokinta 10 MPK D-PDMP, havaitsimme 50% tason lasku tämän lipidejä. Taso monohexosylceramides nostettiin 5-kertaiseksi lumelääkkeeseen hiiren verrattuna, että valvonta hiiren munuaisen mutta ei muuttanut kun ruokinta 3 MPK D-PDMP (kuvio 2F). Yllättäen taso tämän lipidejä kasvoi jonkin verran, kun ruokinta 10 MPK D-PDMP. Tämä havainto voidaan tulkita osoittavan kompensoiva väheneminen tason LacCer hoidetuilla hiirillä 10 MPK D-PDMP mikä laski aktiivisuutta LacCer syntaasin. Siten odottamaton tulos tässä tutkimuksessa on, että pitkäaikainen (26 päivää) ruokinta D-PDMP ei laskenut tasolle monoglycosylceramides hiiren munuaisissa, vaikka D-PDMP on aikaisemmin osoitettu toimivan estäjä glukosyyliseramidin synteesin. Suurin kasvu tason dihexosylceramide, ~32-kertainen, esiintyi lumelääkettä munuaisissa verrattuna kontrolliin. Kuitenkin taso lactosylceramide väheni annosriippuvaisesti hiirillä ruokittu 3 MPK ja 10 MPK D-PDMP (kuvio 2G). Tämä on liitetty D-PDMP annoksesta riippuvainen väheneminen aktiivisuuden LacCer syntaasin (kuvio 3C), mutta ei GlcCer syntaasi (kuvio 3A). Sen sijaan havaitsimme, että aktiivisuus glukosyyliseramidin hydrolaasi väheni, ja kasvu annosta D-PDMP 3 MPK 10 MPK (kuvio 3B). Vähentynyt aktiivisuus glukosyyliseramidin glukosidaasin hoidetuilla hiirillä 10 MPK D-PDMP (kuvio 3B) on saattanut osaltaan tehostettuun GlcCer (kuvio 2F). Mielenkiintoista, taso Sfingomyeliinin ei muuttunut ohjaus, plasebo, ja D-PDMP ruokitaan hiiren munuaisen (kuvio 2 H). Yhteenvetona, kasvu munuaisten kasvaimen tilavuus RENCA hiirillä, ja sen väheneminen käsiteltäessä D-PDMP korreloi parhaiten tasoilla LacCer massa, verrattuna muihin sfingolipidi tässä tutkimuksessa.

Hiiret (BALB /C) esi-nukutettiin ja RENCA kasvainsolujen suspensiota (10

6 solua) injektoitiin subkapsulaariseen tilaan vasen munuainen. Kokeellinen hoito aloitettiin kaksi päivää sen jälkeen subkapsulaarista kasvaimen istutuksen. Hiiret, syötetään letkulla suun kautta D-PDMP (3 ja 10 mg /kg kehon paino, MPK) päivittäin. D-PDMP liuotettiin 5% Tween-80 suolaliuoksessa. Placebo hiiret saivat vehikkeliä (5% Tween-80 suolaliuoksessa 100 ui vain). Jälkeen 26 päivää, hiiret tapettiin. Oikea munuainen toimi kontrollina, ja vasen munuainen toimi lumelääkettä tai huumeiden käsiteltiin 3 ja 10 MPK D-PDMP. A: selvästi kohonneita hiiren munuaisen kasvaimen tilavuuden on jyrkästi vähentynyt syöttämällä D-PDMP. B. D-PDMP (3 ja 10 MPK) ei pienentänyt koko kehon painoa hiirillä. C: taso D-PDMP munuaisen hoidettujen hiirien 3 ja 10 MPK D-PDMP olivat samanlaiset.

taso Eri sfingolipidit mitattiin tandem LC-MS /MS: llä. V: D-PDMP laski tasolle keramidin, B: seramidi-1-fosfaatti, ja D: sfingosiini-1-fosfaatti. D-PDMP hieman korkeampi taso sfingosiinin; C, E: sphinganine ja F: monohexosylceramide. G: D-PDMP annoksesta riippuvaa laskua tason dihexosylceramide hiirillä munuaissyöpään. H: D-PDMP ei muuttanut tasoa Sfingomyeliinin hiiren munuaisten syöpään. (* P 0,05, ** p 0,01 N = 4).

mittaus lactosylceramide syntaasin aktiivisuus hiiren munuaisen suoritettiin käyttämällä UDP [14C] galaktoosia galaktoosin luovuttajan ja GlcCer kuin hyväksyjä, yksityiskohtaisena [11]. Havaitsimme, että ruokinta D-PDMP annosriippuvaisesti vähensi tämän entsyymin aktiivisuutta V: glukosyyliseramidisyntaasi aktiivisuus laski samassa määrin riippumatta siitä, onko 3 MPK tai 10 MPK D-PDMP syötettiin hiirille, joilla on munuaisten syöpä, B: glucosylceramidehydrolase aktiivisuus pieneni D-PDMP hoidon ja C: lactosylceramide syntaasin aktiivisuus oli annoksesta riippuvaa laskua D-PDMP syötetään hiirillä, joilla on munuaisten syöpä (N = 4; * p 0,05).

Seuraava käyttäen kaupallisesti saatavilla monoklonaalinen vasta-aine LacCer, päätimme onko LacCer oli merkittävä lipidien kertyminen munuaisten syöpään. Meidän immunohistokemiallista tutkimukset paljastivat kertyminen suuria määriä lactosylceramide sisällä sytoplasmisissa vesikkeleissä (valkoiset nuolet) ainoastaan ​​syöpäsoluissa (vertaa kuvio S3A, DAPI tahra vs. kuvio S3B; CD17-vasta-värjäytyneiden solujen). Aiemmin olemme osoittaneet, että ihmisen kasvainten munuaisen proksimaalisten tubulusten solujen aktiivisuus LCS on lisääntynyt, ja tämä on mukana kasvu tason LacCer verrattuna normaaliin ihmisen munuaisen [15]. Lisääntynyt taso LacCer on myös raportoitu ihmisen munuaisen syöpä [16]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että hiirimallissa munuaissyövän, kasvu lactosylceramide massa on parhaiten korreloi kasvu kasvaimen tilavuuden ja sairauden etenemisen. Näin ollen, glykolipidi synteesi, erityisesti LCS ja LacCer voi olla bonafide terapeuttinen lähestymistapa lieventämään munuais- syöpä.

ymmärtää molekyyli polkuja osaltaan vähentää kasvaimen tilavuuden vuoksi D-PDMP ruokinta hiirillä, meidän suoritettiin western immunoblot määrityksissä useita biomarkkereita, osoittaneet muille ja meille [5], [17], [18], [19] edistää solujen lisääntymistä, angiogeneesin, ja apoptoosin. Mekaanistetulle tutkimukset osoittivat, että D-PDMP vaikutti vähentynyt selvästi kasvaimen tilavuuden vähentämällä ilmentymistä eri signalointimolekyylien osallinen väyliä edistää solujen lisääntymisen ja angiogeneesiä. Esimerkiksi siellä oli merkittävä kasvu massa LCS lumelääkkeillä hiiren munuaisissa verrattuna valvontaa ja tämä havainto saattaa selittää selvästi lisääntynyt LacCer tasolla lumelääkettä munuaisissa kontrolliryhmään verrattuna. D-PDMP annosriippuvaisesti laski massa LCS (kuvio 4A). Sen sijaan taso UGCG lisättiin D-PDMP syötetään hiirissä (kuvio 4A). Biomarkkereita solujen lisääntymisen ja angiogeneesin esim p44MAPK ja p-AKT-1 olivat kaikki väheni munuaisten hiirien syötetty D-PDMP verrattuna lumelääkkeeseen munuaisten (kuvio 4B). Nämä havainnot viittaavat siihen, että D-PDMP vaikuttaa soluproliferaatioon ja angiogeneesiä inhiboimalla LCS ja LacCer tuotantoa. Samanaikaisesti

in vitro

tutkimuksissa olemme havainneet, että D-PDMP mutta ei L-PDMP annoksesta riippuvaa laskua RENCA-solujen, johtuen mahdollisesti pidätykseen solujen G2-M-vaiheessa solun sykli, kun hoito D-PDMP [20] (kuvio S1).

edustaja immunobloteista kudosuutteissa BALB /c-hiirten syötetään ajoneuvon (plasebo + RENCA-solua /kasvain) ja 3 ja 10 MPK D- PDMP 26 päivää ja ohjaus munuaisten ja vastaavat densitometristen skannaa näkyvät. V: D-PDMP annosriippuvaisesti vähensi proteiinin ilmentymistä LacCer syntaasi (β-1,4-GalT-V) (N = 3-6), hiiren munuaissyövän, mutta jonkin verran lisääntynyt proteiinin ilmentymistä UGCG (N = 2) hiiren munuaisten syöpään. B: Western immunobloteista merkkiaineita solujen lisääntymistä (p44MAPK, N = 3), angiogeneesin (Pakt-1, N = 3, mTOR, N = 3 lumelääkettä ja 10 MPK) ja talon pitäminen proteiinia GAPDH. D-PDMP hoito vähensi markkereita solujen lisääntymisen ja angiogeneesiä. Tiedot arvioitiin yksisuuntaisella ANOVA.

histologinen arviointi munuaisten paljasti laajan kasvu aggressiivinen RENCA, on merkitty kuolion. Kuolion, prosentteina tuumorimäärä kvantifioitiin käyttämällä digitaalista analyysityökaluja [21] ja sen havaittiin olevan 38,8%, 28,4% ja 33,2% vastaavasti lumelääkettä, 10 MPK, ja 25 MPK käsiteltyihin hiiriin (Kuva S4A-H). Olemme aiemmin osoittaneet, että D-PDMP voidaan tehokkaasti estää VEGF-indusoitua angiogeneesiä

in vitro

ihmisen napalaskimon endoteelisolut ja ihmisen valtimon endoteelisolujen [4], [5]. Myös aiemmassa tutkimuksessa, VEGF + β-FGF angiogeneesiä lievensi D-PDMP hiirillä [4]. Tämä mitattiin heikkenee huomattavasti ilmaus CD31 ja angiogeneesiä. Määrittämään, onko lasku munuaisen kasvain tilavuus oli myös laskun vuoksi tarjonnan veren pienenemisenä angiogeneesin, suoritimme immunovärjäyty- CD31 (kuva S4i, J). Oli vähentyneen merkittävästi CD31 positiivinen verisuonten alueella elinkelpoinen alueilla kasvain (0,3% vs. 0,05% plasebo vs. 25 MPK hoidetut hiiret) määritettynä käyttäen digitaalista analyysityökaluja [21]. Aiemmin mTOR on perustettu markkerina angiogeneesin ja on ollut validoitu tavoite lieventää useiden syöpätyyppien. Havaitsimme, että D-PDMP merkittävästi vähentynyt mTOR-proteiinin ilmentyminen (kuvio 4B), mikä viittaa siihen, että estämällä angiogeneesiä, D-PDMP riistää kasvain verenkierron ja siten vähentäneet kasvaimen tilavuuden. Odottamaton tulos oli, että D-PDMP merkittävästi vähensi apoptoottisten solujen mitattuna kaspaasi-3 immunovärjäyksellä. Prosentuaalinen kaspaasi positiiviset solut olivat 0,09%, 0,04% ja 0,03% plasebolla, 10 MPK, ja 25 MPK käsiteltyjen hiirten, määritettynä digitaalinen analyysi (kuva S4K-N) [21]. Niinpä meidän

in vivo

tutkimukset viittaavat siihen, että D-PDMP ei pienennä kasvaimen tilavuuden indusoimalla apoptoosin hiirillä munuaisissa.

Keskustelu

seuraavat havainnot voidaan tehdä tämänhetkisiin tutkimuksessa syyllistämättä rooli glykosfingolipidien munuaisten tuumoribiologiassa. Ensinnäkin on vahva ja tilastollisesti merkitsevä korrelaatio kasvua hiiren munuaisten kasvaimen tilavuuden ja samalla lisääntynyt massa LacCer. Toiseksi inhibitio glykosfingolipidin glykosyylitransferaasivaikutus, ja erityisesti aktiivisuus vähenee ja massa LacCer syntaasin korreloi pieneneminen kasvaimen tilavuuden. Kolmanneksi, vaikka D-PDMP tiedetään olevan estäjä UGCG, se ei esittänyt munuaisten seramiditasot. Koska keramidiin on sekaantunut apoptoosin, meidän tutkimusten mukaan D-PDMP ei pienennä kasvaimen tilavuuden indusoimalla apoptoosin kautta Keramidin reitin hiirillä munuaisissa. Pikemminkin, D-PDMP inhiboi signalointireitin-aiheuttama LacCer, mikä tukee soluproliferaation inhibointi ja kasvaimen angiogeneesissä. Yhdessä nämä tutkimukset viittaavat siihen, että esto Glykolipidin glykosyylitransferaasi- voi estää proliferaatiota /angiogeneesiä kudosten kautta mekanismien riippumaton apoptoosin.

Tässä tutkimuksessa, joka on -30-kertainen kasvaimen tilavuuden lumelääkettä hiiren munuaisen (verrattuna kuin kontrolli) rinnastettiin yhtä kertaiseen kasvuun LacCer massa. Ruokinta D-PDMP merkittävästi vähentää kasvaimen tapa vähentää entsyymiaktiivisuuden LCS, LCS massa, ja näin ollen LacCer massa, ja angiogeenisen proteiinit, kuten p-AKT-1 ja mTOR. Aiemmissa tutkimuksissa havaitsimme, että käyttö siRNA LCS

in vitro ihmisen endoteelisolujen

[5] ja

in vivo hiiren glioblastooma

[22] ja käyttää D- PDMP tässä tutkimuksessa voi vähentää kasvaimen lieventämällä angiogeneesiä. Näin ollen, glykolipidiä synteesi yleensä ja LacCer syntaasia erityisesti [5], [22] on uusi lähestymistapa lieventämiseksi munuaissyövän hiirillä. Olemme myös aiemmin raportoitu, että L-PDMP, joka aktivoi LacCer syntaasin endoteelisolut voivat myös aiheuttaa angiogenensis annoksesta riippuvalla tavalla [7] ja myös RENCA-solujen lisääntymisen tässä tutkimuksessa (katso liite). Siten aktivointi /inaktivointi LacCer taasin agonistit /antagonistit voivat hyvinkin säädellä angiogeneesiä

in vitro

ja

in vivo

.

tutkimuksia ja toisten [13] ovat osoittaneet että D-PDMP on myrkytön, kun sitä annetaan annoksina kymmenen kertaa käytetty pitoisuus esillä olevassa tutkimuksessa. Kehon paino Tässä tutkimuksessa ei eroa lumelääkkeeseen verrattuna D-PDMP hoidetuissa hiirissä. Kasvain painonlasku noin 50% 3 MPK ja 10 MPK syötettiin hiirille lumelääkkeeseen verrattuna. Kuitenkin, kun hiiriä syötettiin suurempia määriä D-PDMP; 25 ja 50 MPK, se ei vähentää kasvaimen tilavuus (tuloksia ei ole esitetty). Aikaisemmassa tutkimuksessa on osoitettu, että t

1/2 D-PDMP hiirillä veressä on -50 min [13]. Näin ollen on mahdollista, että enemmän kuin kynnysarvo 10 MPK, suurin osa tästä yhdisteestä on nopeasti poistetaan erittymistä ja siten edelleen vähentämään kasvaimen ei havaittu. Aiemmin D-PDMP on käytetty laajasti tutkia roolia glykosfingolipidin ja niihin liittyvien glycosytransferases valtimoiden sileän lihaksen solujen proliferaatiota [1], [23], [24], haavan paranemisessa [1], [23], [24],