Krooninen sairaus

tiivistelmä

tutkittiin miten kasvain kopioluvun (CN) -altered genomin (CN-AG) on karsinogeneesi kohdunkaulan syövän (CC), erityisesti sen vaikutus geenien ilmentyminen, biologisia prosesseja, ja potilaan selviytymistä. Viisikymmentäyhdeksän ihmisen papilloomavirus 16 (HPV16) -positiivinen SERTiä tutkittiin kanssa mikrosiruja-31 kartoittamiseen CN-AG ja 55 maailmanlaajuisen geenin ilmentymisen, jolla on 27 sertiä yhteistä. Viiden vuoden eloonjääminen tutkittiin 55 potilaalla. Poistot ja monistukset 2,5 Mb määriteltiin CN muutoksia. Että% CN-AG vaihteli 0-32,2% (keskiarvo = 8,1 ± 8,9). Kasvaimet luokiteltiin alhainen (keskiarvo = 0,5 ± 0,6, n = 11), keskipitkän (keskiarvo = 5,4 ± 2,4, n = 10), tai korkea (keskiarvo = 19,2 ± 6,6, n = 10) CN. Korkeimmat% CN-AG löytyi 3Q, mikä osaltaan keskimäärin 55% kaikista CN muutoksia. Genome-leveä, vain 5,3% CN-muuttunut geenejä vapautui suoraan geeni annostus. Sen sijaan korko täysin kahdennettu 3q oli kaksinkertainen. Monistaminen 3q selitti 23,2% of vapautettiin geenien koko kasvaimissa (r

2 = 0,232, p = 0,006; varianssianalyysi), mukaan lukien geenit sijaitsevat 3Q ja muiden kromosomien. Kaikkiaan 862 geenien vapautui yksinomaan korkean CN kasvaimia, mutta vain 22,9% oli CN muuttunut. Tämä viittaa siihen, että jäljellä olevat geenit eivät ole vapautettu suoraan geeniannoksen, mutta mekanismit indusoi

trans

CN-muuttunut geenejä. Anaphase edistäviä monimutkainen /cyclosome (APC /C) -riippuvaista proteasomin proteolyysin, Glykolyysivaiheen, ja apoptoosin oli voimistunut, kun taas soluadheesiota ja angiogeneesi oli vaimentua yksinomaan korkean CN kasvaimia. Korkean% CN-AG ja voimistuvan geeniekspressioprofiili APC /C-riippuvaisen proteasomin proteolyysiä olivat yhteydessä huonoon elossaololuku (p 0,05, log-rank-testi). Yhdessä Glykolyysivaiheen, he olivat lineaarisesti liittyy FIGO vaiheessa (r 0,38, p 0,01, Spearman testi). Siksi esto APC /C-riippuvaisen proteasomin proteolyysiä ja glykolyysiin voisivat olla hyödyllisiä CC hoitoon. Kuitenkin ne ovat välttämättömiä kasvaimen kasvua vielä osoitettava.

Citation: Medina-Martinez I, Barron V, Roman-Bassaure E, Juárez-Torres E, Guardadon-Estrada M, Espinosa AM, et al . (2014) vaikutus Gene Annostus Gene Expression, biologisia prosesseja ja Survival in kohdunkaulan syövän A genominlaajuisten seurantatutkimus. PLoS ONE 9 (5): e97842. doi: 10,1371 /journal.pone.0097842

Editor: Robert D. Burk, Albert Einstein College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 06 joulukuu 2013; Hyväksytty: 25 huhtikuu 2014; Julkaistu: 30 toukokuu 2014

Copyright: © 2014 Medina-Martínez et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Council of Science and Technology (CONACYT, www.conacyt.mx), myöntävät numerot 8135 /A1, 24341 (JB), 80680 (SK) ja 133273 (FF) ja National University of Mexico ( www.unam.mx), myöntää numero SDI.PTID.05.2 (JB). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kohdunkaulan syöpä (CC) on toiseksi yleisin syöpä naisilla maailmanlaajuisesti, vaikuttavat 500000 yksilöitä vuosittain; se on johtava syy syövän kuolemaan naisten kehitysmaissa [1]. Viruksen onkoproteiineja E6 ja E7 korkean riskin ihmisen papilloomaviruksen (HPV) on tärkeä rooli syövän synnyssä. Ne estävät solujen eri tavoitteita, mukaan lukien kasvaimeen vaimennin proteiinien p53 ja pRb häiritä avain cellular prosessien, kuten apoptoosin ja solusyklikontrollin, ja johtaa genomin epästabiilisuuden ja neoplastisia kehittämiseen [2]. Huolimatta aiheuttamat vahingot näiden oncoviral proteiinit, CC on harvinainen komplikaatio virusinfektio; useimmat infektiot ovat ohimeneviä eivätkä kehittyä neoplastisia vaurioita. Keskimäärin 12-15 vuosi voi kulkea ennen pysyviä HPV-infektio johtaa CC kautta syöpää edeltävä vaiheissa kohdunkaulan intraepiteliaalisia uudisvaurioiden [3]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että HPV-infektio ei yksin aiheuta tautia ja myös muut tekijät, kuten epänormaali isäntägeenejä, liittyvät kehittämiseen kohdunkaulan syöpä.

Perimän epätasapaino voi edistää vapautuneilla ilmentyminen onkogeenien ja tuumorisuppressorin geenejä syöpäsoluissa, ja kokoamisen muuttaa geenien on osoitettu korreloivan kasvaimen etenemiseen [4]. Useat kopioluku (CN) -altered alueilla (CNAs) on havaittu CC avulla kasvaimen genomianalyysi käyttämällä menetelmiä, kuten vertaileva genominen hybridisaatio, fluoresenssi in situ hybridisaatio, ja microarray (MAS). Voitot 3q [5] – [11] ja 5p [5], [12] – [15] ovat yleisimpiä kromosomaalisia muutoksia sertiä, ja niitä on myös kuvattu muita kiinteitä kasvaimia [16] – [18]. Pienin konsensus alue 3q vahvistus CC karttoja kromosomi cytobands 3q26-27 [6] – [10], [19], mikä viittaa siihen, että geenit, kuten

kiksi tert

[20], [21],

PIK3CA

[22], ja

ECT2

[23], joita pidetään ehdokas onkogeenien CC, saattavat osallistua kohdunkaulan syövän synnyn. Se, missä määrin nämä toistuvat kromosomaalisen muutokset ovat merkityksellisiä kasvainten kehittymiseen ei vielä juurikaan tunneta. Toisaalta, kokonaisuudessaan monistus 5p on hyvin dokumentoitu tuumorinäytteissä ja solulinjat [12], [23] – [25]. Jotkin geenit monistetaan tällä alueella ja ehdotti olla mukana CC, kuten

SKP2

,

TERT

,

TRIO

,

RNASEN

, ja

PRKAA1

, yliekspressoituvat tuumorinäytteissä [15] ja solulinjat [12], [24].

panos CN muutokset kohdunkaulan syövän synnyn on ratkaisematta mikä johtuu genominlaajuisten puute korrelaatio CNAs ja geenien ilmentymisen [23], vaikka täysin monistettiin kromosomi käsivarret kuten 3q tai 5p [23] – [24], [26] – [27]. Aikaisemmassa tutkimuksessa, tutkimme onko CNAs solulinjoissa calo, CaSki, HeLa, ja SiHa liittyvät muutokset geenien ilmentyminen [23]. Genome-leveä, vain pieni osa geenien sijaitsee CNAs (15,6%) tai minimaalinen toistuvia alueita (18,8%) vapautui. Nämä osuudet olivat enimmillään 4% korkeampi kuin ryhmä geenejä ilman CN muutoksia (14,8%). Nämä tiedot viittaavat siihen, että vain noin 4% CN-muuttunut geenejä yleinen sääntely on purettu suoraan geeni annostus CC solulinjat. Myös genomisia segmenttejä on todettu täysin monistettiin, kuten 3q ja 5p, prosenttiosuus vapautettu geenien ei aina lisääntynyt. Kun kyseessä on 5p, prosenttiosuus vapautettu geenien kasvoi jopa 33% 4 solulinjoissa. Vaikka 3q lähes kokonaan monistettiin Calo (93,5%) ja HeLa (87,2%), osuus vapautetuilla geenien kasvoi vain noin 2-kertaisesti HeLa (23,4%), mutta ei Calo (12,7%) verrattuna, että CaSki ( 13,9%) ja SiHa (9,4%), joka osoitti vain osittaista monistamisen 3q [23]. Mielenkiintoista, ei kaikki vapautettu geenit kahdennettu 5p ja 3q oli yli-ilmentynyt. Sen sijaan noin 20% geeneistä vapautettiin 5p ja yli 50% geeneistä vapautettiin 3q oli vaimentua. Siksi muut tekijät kuin geeni annostus, kuten epigeneettiset mekanismit voivat vaikuttaa geenin ilmentymisen sisällä täysin monistettiin genomista segmenttiä. Ei ole tutkimuksia, jotka tutkivat globaali korrelaatio CN muutokset ja geeniekspressio CC.

Tässä tutkimuksessa selvitimme 59 HPV16-positiivisia sertit kanssa mikrosiruja-31 kartoittamiseen CN-AG ja 55 maailmanlaajuisen geeni ilme, 27 sertiä yhteistä. Olemme tutkineet genomin laajuinen, on geeni-by-geeni tason osuus CN-muuttunut geenejä, jotka vapautettu ja laajuus koko muuttuneen transcriptome CC, joka on vapautettu suoraan tai välillisesti geeni annostus. Tutkimme myös biologisia prosesseja kohdunkaulan syövän synnyn, jotka liittyvät geenien vapautettu geeni annostus ja vaikutuksen geeniannoksen yleiseen elossaololuku.

Tulokset

Kaiken Kasvain Genome Analysis: tunnistaminen Kromosomit , alueiden ja Geenit muuttunut CN

yhteensä 673 CNAs suurempi kuin 2,5 Mb tunnistettiin perustuu analyysiin kanssa GeneChip- Human Mapping 500 K (500 K) microarray: 446 monistukset ja 227 poistot. Nämä alueet olivat validoitu toisella tiheäksi mikrosiru (CytoScan HD2.7) in 15 31 kasvainten kanssa tarkastellaan 500 K mikrosirulla. Keskimääräinen yhteensattuma välillä 2 paneelit oli 79,3%, mutta se nousi lineaarisesti 70%: CNAs 2,5-3 Mb 93,4% vuonna CNAs yli 10 Mb (r = 0,93, p 0,001, Spearmanin korrelaatio; Kuva S1) . Itse asiassa, kun täydellinen kromosomaalisen varret verrattiin, korrelaatio 2 mikrosiruja oli lähes 100% (kuvio 1). Keskimäärin, kasvaimia oli 22 ± 19 CNAs (vaihteluväli 0-65). Koosta haploidista genomia (3000 Mb), laskimme prosenttiosuus CN-muutettu genomi (CN-AG) jokaista kasvain. Prosenttiosuudet vaihtelivat suuresti kasvainten 0%: sta 32,2% (keskiarvo = 8,1 ± 8,9%) ja seurasi nonparametric jakauma (kuvio 2A, taulukko 1). Kasvaimet jaettiin 3 ryhmään mukaan% CN-AG: alhainen (keskiarvo = 0,5 ± 0,6, n = 11), keskipitkän (keskiarvo = 5,4 ± 2,4, n = 10), ja korkea (keskiarvo = 19,2 ± 6,6, n = 10; kuvio 2B, harmaat laatikot). Vain 5 kromosomi käsivarret oli keskimäärin% CN-AG suurempi kuin genomin keskimääräistä ja oli tilastollisesti merkitsevä (p 0,05, chi-neliö; merkitty tähdellä kuviossa 3A). Neljä näistä aseiden osoitti pääasiassa saavuttanut genomin (3q, 5p, Xp, Xq), ja vain 3p osoitti pääosin poistettu genomin. Prosentuaalisesti eniten löydettiin 3q (44,3%), jonka jälkeen selvästi alla Xq (26,8%), Xp (22,4%), ja 5p (21,2%; katso kuvio 3A). Vain CN-muutoksia kromosomeissa 3Q, Xp ja 5p osoitti lineaarinen korrelaatio maailmanlaajuisen muutoksia genomissa (r = 0,88, p 0,0001, varianssianalyysi). Nämä 3 kromosomit voivat selittää 76%: n vaihtelua CN (oikaistu r2 = 0,76), jossa 3Q sijoitusta yläosassa ja osuus 55% kaikista CN muutoksia kasvaimen genomissa [moninkertaisen lineaarisen regression (MLR)].

intensiteetti signaaleja yhden nukleotidin polymorfismien (SNP: t) tai ei-polymorfisen koettimet ilmaistaan ​​log

2 suhdeluvut kromosomeista 3, 4, ja 5 kasvaimen R496 tutkitaan käyttämällä 500 K mikrosiru (yläpaneeli) ja HD 2.7 mikrosiru (alempi kuva). Molemmissa paneelit, y-akseli kuvaa log

2-suhde asteikolla -1,5-1,5, ja x-akseli esittää ideogrammi on tutkittu kromosomeja, joissa genomiin paikkoihin. Vaakasuora viiva rajan pisteen y = 0 vastaa 2 kappaletta. Keskimääräinen tiheys tutkitaan kantoja on yli 5 kertaa suurempi HD 2.7 microarray kuin että 500 K mikrosiru (katso materiaalit ja menetelmät).

A-kuvassa rasiakuvaajien jaon kanssa kasvainten (n = 31) mukaisesti prosenttiosuus kaikista, poistettu tai ulkoiset CN-muuttunut genomin (CN-AG). Paneeli B esittää jakautuminen kasvainten, jotka on ryhmitelty niin alhainen (n = 11), keskipitkän (n = 10), ja korkea (n = 10) mukaisesti prosenttiosuus maailman ja 3Q CN-AG. Vaakasuorat viivat sisällä laatikot edustavat mediaani (kiinteä) ja keskimääräinen (pisteviiva), ja viikset ovat minimi- ja maksimiarvot alueella 1,56 kvartiiliväli lopusta ruutuun. Rajat ylittävät arvot edustaa musta piireissä. Lasku kertynyt liittyvän toistuvan CN-muuttunut geenejä, koska määrä kasvaa kasvaimia, jotka oli sama muunneltu geeni, esitetään koko genomin (paneeli C) tai kromosomeja, joissa on merkittävä korkean% CN-AG (paneeli D) . Yhdistetty geenejä ovat ne, jotka poistettiin joissakin ja laajennettu muissa kasvaimissa.

Vasen puoli näyttää tutkitaan genomi (Mb) kussakin kromosomissa varsi tutkittiin kanssa 500 K microarray 31 kasvaimissa. Oikealla puolella näkyy joukko geenejä kuhunkin varteen tutkittava yhdessä Human Gene 1.0 ST microarray 27 kasvainten jossa CN tutkittiin. Kukin pylväs prosenttiosuutta CN-AG (vasemmalla) tai vapautuneilla geenejä (oikealla) kromosomin varren ilmoitettu keskellä. Punainen palkit osoittavat voitot tai yliekspressio ja siniset palkit osoittavat tappioita tai lauseketta. Pisteviiva edustaa keskimääräistä prosenttiosuutta globaalin CN-AG (8,1%; vasen) tai prosenttiosuus vapautettu geenien (9,5%, oikealla) kasvaimen genomissa. Varret merkitty tähdellä oli keskimäärin osuus CN-AG tai prosenttiosuus vapautettu geenien ylivoimainen ja tilastollisesti merkitsevä verrattuna numerot löytyy täydellinen kasvaimen genomin (p 0,05, chi-neliö).

geenien tunnistamiseen CN muutoksiin, olemme linjassa CNAs ihmisen geenien mukaan sijoitukseen genomissa. Määrä muuttunut geenejä vaihtelivat 0 10666 (keskiarvo = 2,754 geenit; katso taulukko 1) joukossa kasvaimia ja korreloi positiivisesti% CN-AG (r = 0,99, p 0,0001, Pearsonin korrelaatio). Useimmat CN-muuttunut geenejä ei jaettava kasvaimia. Kertynyt liittyvän toistuvan CN-muuttanut geenien merkittävästi vähentynyt, kun määrä kasvaimia, jotka oli sama muuttunut geeni kasvoi (kuvio 2C). Mitään geeni muuttaa kaikissa 31 kasvaimet tutkitaan, ja vain 3 geenit (

RPL21P39

,

NLGN1

,

GM2AP1

) muutettiin 20 kasvaimissa. 3Q geenit olivat räikeimpiä up 10 kasvainten näkyvissä muutos on lähes 100%: n tutkitaan genes-, ja 3Q käyrä siirtyi oikealle 6 kasvaimia lähimmästä käyrä muiden kromosomien (katso kuva 2D). Kaikkiaan 264 geenien oli toistuvia muutoksia, kaikkea 3Q, 16 (51,6%) tai enemmän kasvaimia.

Valitsimme 7 räikeimpiä geenit sijaitsevat 3q (

CLDN1

,

ECT2

,

NAALADL2

,

NLGN1

,

PLOD2

,

PLSCR1

, ja

PLSCR4

) on varmennettava reaaliaikainen kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio (qPCR) tekniikka kaikissa 31 kasvaimia ja 17 ohjaa. Kaikki geenit näkyy merkittävä positiivinen korrelaatio (r 0,6, p 0,0001, Pearsonin korrelaatio) välillä keskimääräinen intensiteetti (log2 suhde) SNP tunnistettu kanssa mikrosirun on CNAs, jossa geenit sijaitsevat molemmissa kasvain, ja numero kopioiden laskettuna qPCR (tuloksia ei ole esitetty). Kun kopioiden määrä lasketaan qPCR verrattiin ryhmien välillä, keskiarvon CN 7 tutkitaan geenien oli merkitsevästi suurempi kasvaimia, jotka olivat muutokset kuin ne, ilman muutoksia näihin 3q geeneistä (p 0,05, t-testillä, kuvio 4A) .

yläpaneelissa osoittaa keskimääräisen kopioluvun 7 geenejä (

CLDN1

,

ECT2

,

NAALADL2

,

NLGN1

PLOD2

,

PLSCR1

, ja

PLSCR4

) sijaitsee 3q pohditiin qPCR kontrolleissa (lymfosyytit) ja kasvainten 2 tai 3-4 kappaletta tunnistetaan 500 K mikrosirun. Whiskers kunkin pylvään edustaa standardin keskivirhe. Katkoviivoja punainen viiva osoittaa arvo 2,5 kopioita lasketaan qPCR (ks materiaali ja menetelmät). Pohja paneeli esittää korrelaatio geenien ilmentymisen 8 geenien (

MCM2

,

PLOD2

,

PLSCR1

,

SMC4

,

ECT2

,

NLGN1

,

RFC4

, ja

CLDN1

) sijaitsee 3q tutkittava 27 kasvaimia ja 6 säätimet sekä HG 1.0 ST microarray ja qRT-PCR-tekniikoita . Log

2 arvot normalisoitu voimakkuus signaalit saadaan mikrosirulla (vankka multichip keskiarvot) ja qRT-PCR piirrettiin. Trend linja (musta viiva), korrelaatiokerroin (r), ja p-arvo laskettiin Pearsonin korrelaatio testi.

analyysi Global Gene Expression

määrä lähetti-RNA (mRNA ) transkriboitu 21034 geeneistä tutkittiin käyttäen microarray HG 1.0ST vuonna 27 31 kasvainten tutkittiin 500 K microarray ja 17 normaalin kohdunkaulan epiteelin valvonta (kuvio 5, taulukko 1 ja taulukko 2). Havaitsimme 2006 muuttaa geenejä (9,5%), 57,6% vaimentua ja 42,4% voimistunut (taulukko S1). Kun 2 adenokarsinoomat (ACC, R075 ja R189 taulukossa 1) ja adenosquamous cell carcinoma (ASCC; R298 taulukossa 1) jätettiin pois analyyseistä, löysimme sama määrä geenejä yksimielisiksi ja 95%: n luettelon muuttunut geenejä. Siksi säilyttää otoskoko me kaikki 27 sertiä.

Kuva esittää analyysin työnkulun 59 CC tapauksia tarkastellaan tässä tutkimuksessa. Kaikki CC näytteet olivat HPV16 positiivisia ja tutkittiin kanssa mikrosiruja-31 kartoittamiseen CN-AG ja 55 maailmanlaajuisen geenin ilmentymisen, jolla on 27 sertiä yhteistä. Nämä 27 sertiä käytettiin analyyseihin globaalin geenien ilmentyminen ja korrelaatio CN-AG ja geenin ilmentymisen. Sillä hierarkkinen klusterointi analyysin ilmaus profiilit 55 CC näytteet mukana. Viiden vuoden eloonjääminen tutkittiin 55 potilaalla, 51 tutkitaan geenien ilmentymisen ja 28 CN muutoksiin, 24 sertiä yhteistä. Katso materiaali ja menetelmät yksityiskohdat osasta menettelyistä.

taajuus vapautettu geenien laskettiin kromosomi. 42 tutkitaan varret, vain 5 (3q, 4q, 6p, 15q, ja Xq) oli suurempi ja tilastollisesti merkittävä prosenttiosuus vapautettu geenien verrattuna kokonaisosuuden (9,5%; merkitty tähdellä kuviossa 3B). Kromosomit joka osoitti suurimman prosenttiosuuden olivat 6p (16,0%, p 0,001) ja 3q (15,9%, p 0,001), jota seurasi 4Q (15,6%, p 0,001), Xq (13,0%, p 0,02), ja 15q (12,9%, p 0,04); chi-neliö testi kaikille vertailuissa. Yliaktiivista geenit dominoivat 3Q ja 6p, kun taas vaimentua geenit olivat yleisintä 4q, 15q, ja Xq (katso kuvio 3B).

arvioitiin ilmentymisen 28 geenien valittu validointi kanssa qRT-PCR tekniikka 27 CC näytteet ja 6 valvonta (taulukko S2). Löysimme merkittävä positiivinen korrelaatio (keskimäärin r = 0,74, p 0,05; Pearsonin korrelaatio) välillä logaritmiarvot (log2) saatujen tietojen kanssa qRT-PCR ja microarray vuonna 27 28 geenit tutkitaan (96,4%). Kuvio 4B esittää korrelaation intensiteetin arvot (log2), jotka on saatu 2 menetelmiä 8-geenit sijaitsevat 3q. Nämä tulokset osoittivat, että ilmaisu arvot lasketaan mikrosirulla olivat melko luotettava, koska jopa 96,4% validoituja geenien oli merkittävä korrelaatio.

tunnistamiseksi biologisia prosesseja, jotka liittyvät 2006 eri ilmaistuna geenejä, käytimme Database for Annotation, visualisointi, ja Integrated Discovery väline (DAVID; https://david.abcc.ncifcrf.gov/). Verrattuna ihmisen genomin tietokannasta, 5 eniten rikastettu klusterit alin p arvot keskimääräisen ankarissa olivat solusyklin kuten mitoosia, DNA metabolisia prosesseja mukaan lukien DNA korjaus, kromosomi erottelu, solun tukirangan organisaatioon, ja kehitysprosesseja (taulukko 3). Mielenkiintoista, korkeimmalla ankarissa, jossa liittää tiukemmin geenejä kussakin ryhmässä odotetaan, klustereiden lukien mitoosin rankattiin ensimmäisen, kolmannen ja viidennen (biologiset prosessit kursiivilla taulukossa 3).

yhteensä ryhmä vapautettiin geenien analysoitiin myös kekseliäisyyttä Pathway Analysis (IPA) ohjelmisto, ja kokonaistulokset olivat hyvin samanlaisia ​​kuin saavutetut DAVID työkalun (tuloksia ei ole esitetty). Niistä 89 kanoninen polkuja, jotka IPA tunnistettu muuttunut (p 0,05, Fisherin eksakti testi), jotka osallistuvat solusyklin ja DNA: n korjaukseen sijoittui yläosassa luettelon (kuvio 6A).

A-kuvassa top 25 kanoninen reittejä tunnistettu joukko 2006 vapautettiin geenien koko joukko kasvaimia. Paneeli B esittää alkuun 25 kanoninen reittejä tunnistettu joukko 862 geenien vapautettiin yksinomaan korkean CN kasvaimia. Kanoninen reittejä tunnistettiin nerokkuus Pathway Analyysiohjelmisto. -log (P-arvo) ja suhde laskettiin vertaamalla määrä kuuluvien geenien polku läsnä tietuekokonaisuudet ihmisen genomin tietokannasta. P-arvo laskettiin käyttäen chi-neliö tai Fisherin testiä, tarvittaessa ja arvot -log (p-arvo) on suurempi kuin 1,3 (punainen viiva) vastaavat arvoa p 0,05. Kanoninen polun hypoksian indusoima tekijä (HIF1α) signalointi olivat tilastollisesti merkitseviä vapailla geenien kokonaisuus (43 paikkaa) ja korkean CN joukko kasvaimia (26. sija).

Korrelaatio välillä muutokset CN ja Gene Expression

yksinkertainen analyysi Kuva 3 osoittaa, että ei ole selkeää korrelaatiota välillä geeniekspressiota ja CNAs. Esimerkiksi on 5 kromosomien kanssa prosentuaalisesti eniten CN-AG, vain 2 (3q, Xq) kasvoi merkittävästi prosenttiosuuden vapautettu geenejä. Lisäksi muut 3 kromosomien osoittavat merkittävää kasvua vapautuneilla geenejä (4q, 6p, 15q) puuttui suuri osa CN-AG, jopa 6p ja 15q oli prosentteina selvästi alle yleinen keskiarvo. Vaikka yli-ilmentynyt geenit vallitsevia useimmissa kromosomeja, joissa on suuri osuus voittoja, nämä kromosomit on myös suuri osa vaimentua geenien, ja joissakin, kuten Xq osuus vaimentua geenien hallitseva (kuva 3). Toisaalta, kromosomien, että näytetään pääasiassa deleetioita (3p, 4p) oli myös prosentteina ilmen- tymisen lisääntymisen geenien, vaikka prosenttiosuus vaimentua geenien vallitsevana.

ymmärtää perusteellisemmin suhdetta CN muutoksiin ja geenin ilmentymisen, analysoimme näitä muuttujia geenin geeni kussakin kasvain. Ilmaus tila (vaimentua, voimistunut, tai ilman muuta) kullekin tutkittu geeni (n = 21034) tunnistettiin kuhunkin kasvaimeen käyttäen cutoff-arvot (katso materiaalit ja menetelmät). CN tilan kunkin näiden geenien tunnistettiin myös kunkin kasvaimen. Määrä geenejä ja ilman muutoksia CN ja geenien ilmentyminen näkyy kunkin kasvaimen taulukossa 1. Keskimääräinen määrä CN-muuttunut geenejä oli 1673, ja keskimäärin 2 kopion geenejä oli 19362 (katso taulukko 1). Keskimäärin 2010 (9,6%) geenit vapautui kasvaimissa, joista 241 oli CN muuttunut ja 1769 oli 2 kopiota. Nämä tiedot tarkoittaa, että keskimäärin vain 14,4% (241/1673) CN-muuttunut geenejä ja 9,1% (1769/19362) 2 kopion geenejä vapautettu. Ero 2 alaryhmään oli vain 5,3% (p 0,00001, chi-neliö) ja vastaa keskimääräistä osa geenien CN muutoksia, jotka voivat vapautettu suoraan geeni annostus. Erityisesti vain 69% monistettujen ja vapautuneilla geenejä yli-ilmentyy; loput vaimentua. Lisäksi vain 82% poistetun ja vapautuneilla geenejä vaimentua; loput yli-ilmentyy (tuloksia ei ole esitetty). Nämä tulokset yhtyä havaintoja kromosomin tasolla.

Sen tutkimiseksi, lineaarisen trendin välillä geenien ilmentyminen ja määrän CN muutos (CN-AG), analysoimme korrelaation 2 muuttujien, mukaan lukien yksittäiset tiedot kaikista kasvaimista tutkittu. Kuten odotettua, kokonaismäärä vapautettu geenien kasvoi% CN-AG: n (laskettuna taulukossa 1, r = 0,5, p = 0,007, Pearsonin korrelaatiota; kuvio 7). Yhtälön mukaisesti kuviossa 7 (y = 32x + 1,734), joka kasvain 0% CN-AG (x = 0), lukumäärä vapautettu geenejä on noin 1734 ja olisi vapautettu muilla mekanismeilla kuin geeni annostus. Sitä vastoin kasvain, jolla on korkein% CN-AG (R365 = 32,2%, katso taulukko 1), on lisäksi 1034 vapautettu geenejä (yhteensä = 2768). Tämä määrä on hyvin lähellä todettu määrä vapautui geenien (katso taulukko 1) ja jotka sisältyvät osa vapautettu geenejä, jotka voidaan vapautettu suoraan geeniannosta. Tässä äärimmäisessä tapauksessa määrä vastaa 37,4% kaikista vapautettu geenien (1034/2768). Koko joukko kasvaimia, vain 12% (241/2010) on vapautettu geenien olivat keskimäärin CN muuttunut (laskettuna taulukko 1). Vain CN-muutoksia 3q näkyi selvä lineaarinen regressio globaalien geenien ilmentyminen (r = 0,51, p = 0,006, varianssianalyysi), ja se selitti 23,2% (oikaistu r

2 = 0,232, MLR) kaikista muutoksista geenien ilmentyminen.

trendi määrän vapautettu geenien lisääntynyt% CN-AG: n koko joukko 21034 tutkitaan geenien näkyvät. Viiva edustaa lineaarinen korrelaatio suuntaus tietojen käyttöä. Kuvassa myös ovat yhtälön linjan, korrelaatiokerroin, ja p-arvo lasketaan Pearsonin korrelaatio testi.

tunnistaminen vapautettiin Geenit ja biologiset prosessit liittyy muutoksia Gene Annostus

a) vapautettiin geenien matalan ja korkean CN kasvaimia.

tunnistamiseksi differentiaalisesti ilmentyvien geenien kasvaimissa matalan ja korkean prosenttiosuuksia CN muutoksia (katso kuvio 2B, harmaat laatikot), vertasimme kunkin ryhmän kasvaimen kontrolliryhmään (n = 17) käyttäen SAM menetelmää. Niistä 21034 tutkitaan geenejä, 1757 (8,4%) vapautui kasvaimissa korkea CN, mutta vain 1104 geenit (5,2%) vapautui kasvaimissa alhainen CN. Mielenkiintoista, 895 (81,1%) ja vapailla geenien matalan CN ryhmä myös vapautui korkean CN ryhmä. Ero määrä vapautetuilla geenien välisen korkean CN ryhmä ja yhteisen geenit (n = 862) vastasi osa geenien vapautettu geenin annos korkean CN ryhmässä (49,1%).

Huomattavaa on, vain 9,2%: n geenien vapautettiin ainoastaan ​​korkean CN kasvaimet (79 862) amplifioitiin (n = 76) tai poistetaan (n = 3), 6 tai enemmän kasvaimia. Loput geenit CN muuttunut 4-5 (n = 118), 1-3 (n = 370) tai ei (n = 295) kasvaimia (taulukko S3). Näiden laskelmien perusteella, me konservatiivisesti oletettu, että tässä ryhmässä geenien yksinomaan liittyy korkea-CN kasvain (n = 862), geeni annostus on suora vaikutus geenien ilmentymiseen enimmillään 22,9% näistä geeneistä (CN muuttunut ≥4 kasvaimet). Loput geenit (CN muuttunut ≤3 kasvaimissa, n = 665) eivät vapautettu suoraan geeni annostus mutta muilla mekanismeilla, ehkä vaikuttaa

trans

noin CN-muuttunut geenejä.

b) tunnistaminen biologisten prosessien liittyy kasvainten korkea ja matala CN.

DAVID työkalua käytettiin tunnistamaan biologisia prosesseja rikastettu osajoukko yhteisten geenien (n = 895) ja ne vapautettiin yksinomaan korkealla -CN (n = 862) ja matala-CN (n = 209) kasvaimia. Klustereiden biologisia prosesseja löytyy yhteisiä geenejä olivat hyvin samanlaisia ​​kuin rikastettu koko joukko kasvaimia (taulukko 3 vs. Taulukko S4). Kuitenkin joitakin tärkeitä biologisia prosesseja rikastettu koko joukko kasvaimia, kuten angiogeneesin, säätely soluadheesiota, ja anafaasia edistävän kompleksin /cyclosome (APC /C) -riippuva proteasomaalisten ubikitiinistä riippuvainen proteiini catabolic prosessin (katso taulukko 3) ei ole rikastettu osajoukko geenien yhteinen molemmille ryhmille. Mielenkiintoista, nämä 3 prosesseja rikastettu korkean CN kasvaimet; Lisäksi, ne ensimmäisellä sijalla joukossa biologisia prosesseja (taulukko 4). Muita klustereita rikastettu yksinomaan korkean CN ryhmässä, mutta ei havaittu alaryhmässä yhteisten geenien mukana Glykolyysivaiheen, joka sijoittui toiseksi, apoptoosin, ja mRNA liikenne (katso taulukko 4). Nämä tiedot viittaavat siihen, että nämä prosessit liittyvät läheisesti geeni annostus. Prosessit solun tukirangan organisaatioon, solusyklin ja DNA pakkaus, mutta ei yksinomaan, myös rikastettu ryhmän geenejä, jotka liittyvät korkean CN kasvaimia, mikä viittaa siihen, että jotkut osallistuvat geenit näitä prosesseja voidaan vapautettu geenin annostuksen. Kaikki nämä biologiset prosessit, paitsi soluadheesiota ja angiogeneesiä, liittyi yli-ilmentynyt geenejä. Mielenkiintoista, korkeimmalla tiukkuus, prosessit APC /C-riippuvaisen proteasomaalisten ubikitiinistä riippuvainen proteiini catabolic prosessin ensimmäistä sijaa, seuraa Glykolyysivaiheen ja DNA pakkaus (biologiset prosessit kursiivilla taulukossa 4). Tunnetusti, suurin osa geeneistä, jotka liittyvät biologisiin prosesseihin, jotka liittyvät korkean CN kasvaimia ei CN muuttunut (kuvio 8). Toisaalta, vain 2 klustereita rikastuneet alaryhmässä geenien yksinomaan vapautettiin alhaisen CN kasvaimia: solujen erilaistumista ja käsittely ja esittäminen peptidiantigeenia kautta major histocompatibility complex luokan I (tuloksia ei ole esitetty). Tämä viittaa siihen, että suurin osa geenien mukana näissä 2 prosessit vapautettu muiden mekanismien kuin geeniannosta.

Näkyy ovat numerot 2-copy tai CN-muutettu geenien ≤3 kasvaimet (vihreitä palkkeja) ja CN- -altered geenien ≥4 kasvaimissa (sininen pylväät) joukossa biologisia prosesseja rikastettu osajoukko geenien vapautettiin yksinomaan korkean CN kasvaimia.

Sen tutkimiseksi, onko geeni-ilmentymisen profiilit biologiset prosessit liittyvät korkean CN kasvaimia mahdollistavat erottelun kasvaimia joko CN tai biologisten prosessien itse teimme valvomatta hierarkkinen klusterointi luokitella 55 kasvainten tutkittava yhdessä HG 1.0 ST mikrosiru (taulukko 2), mukaan lukien 27 kasvaimet tutkitaan varten CN-analyysi, ja 17 tervettä kohdunkaulan valvontaa. Vain ilmaus profiilit Glykolyysivaiheen ja APC-riippuvainen proteasomaalisten proteiini catabolic prosessin selvästi erillisiä kasvaimet ryhmissä erityisiä ekspressioprofiileja (kuva 9). Analyysissä Glykolyysivaiheen, dendro- osoitti 3 päähaaraan: 1 vahvalla ilmen- tymisen lisääntymisen profiilin, toinen yhdistelmä heikko ylä- ja vaimentua signaaleja, ja kolmas vahva profiilia downregulation. Nämä tulokset osoittavat heterogeenisyys geenissä allekirjoittamista biologisen prosessin koko joukko näytteitä. Useimmat kasvaimet (81,8%) ryhmittyneet tasaisesti ensimmäiseen 2 oksat, ja vähemmistö ryhmitelty kolmas osa (18,2%). Sitä vastoin kaikki vaan 3 verrokkia ryhmittyneet kolmas osa. Varsinkin korkean CN kasvaimia ryhmiteltiin voimakkaasti (60%) ja yhdistetty (40%) voimistunut profiilit, kun taas matalan CN kasvaimia ryhmitelty lähinnä vaimentua (50%) ja yhdistetty (30%) profiilit (p = 0,028 , Fisherin eksakti testi, kuvio 9A).

valvomaton hierarkkinen klusterin analyysi 55 sertiä ja 17 tervettä kohdunkaulan epiteelinäytteistä käyttämällä ilmaisua arvoja geenien vapautettu alkaen Glykolyysivaiheen (paneeli A) ja anafaasia edistävän kompleksin /cyclosome (APC /C) -riippuva proteasomaalisten proteiini catabolic prosessin (paneeli B), jotka on saatu HG 1.0 ST mikrosirun. Kukin rivi edustaa geeniä ja kukin sarake edustaa näytettä. Näytteitä nimi alkaa ”R” ovat sertiä ja ”C” ovat valvontaa; Sertit päättyy 1, 2 tai 3 kuuluvat laitteista matalissa, keskisuuren tai suuren CN-ryhmässä, kun taas päättyy ilman määrä ei tutkittu CN. Pituus ja osastoimisesta oksat edustavat välisiä suhteita näytteiden perusteella intensiteetti geenien ilmentymisen. a. b. a. b. a.