Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Haimasyöpä on yksi tappavimmista syövistä on 5 vuoden pysyvyys on 6%. Hoitovaihtoehdot ovat hyvin rajalliset ja on lääketieteellinen tarve turvallinen ja tehokas hoitoja. Syöpä solujen aineenvaihduntaa ja mitokondriot tarjoavat tutkimaton tavoitteita tähän tautiin. Olemme äskettäin tunnistaneet uuden luokan Trifenyylifosfoniumsuolat, TP yhdisteitä, joissa laaja-taajuuksien syövän vastaisia ​​ominaisuuksia. Tutkimme kykyä meidän prototyyppi- yhdistettä TP421- valittu sen fluoresoivien ominaisuuksien – kasvun estämiseksi haimasyövän soluja ja tutki tarkemmin molekyylitason mekanismeja, joilla se kykenee sen syöpää ehkäisevistä vaikutuksista.

Menetelmät /Principal Havainnot

TP421 näytteillä Saharan mikromolaaria IC

50-arvot kaikissa haimasyövän solulinjoissa testattu käyttämällä MTT ja pesäkkeiden muodostumisen määritykset. TP421 lokalisoitu pääasiassa mitokondrioita ja indusoi G

0 /G

1 pidätys, ROS kertymistä ja aktivointia useiden stressiin säännelty kinaasien. Kaspaasi ja PARP-1 pilkkominen havaittiin osoittaa apoptoottisen vasteen, kun LC3B-II ja p62 kerättiin ilmaisee esto autophagy. Lisäksi TP421 indusoi de-fosforylaation avaimen signalointimolekyylien mukana FAK välittämä adheesio, joka korreloi inhibitio solumigraation.

Johtopäätökset /merkitys

TP421 on edustava yhdiste uusi lupaava luokan mitokondrioiden kohdistetut käyttökelpoiset aineet haimasyövän hoitoon. Koska niiden ainutlaatuinen vaikutusmekanismi ja tehokkuuden edelleen kehittäminen on perusteltua.

Citation: Shabaik YH, Millard M, Neamati N (2013) Mekanistiset arviointi Novel pienimolekyylisiä kohdistaminen Mitokondriot haimasyöpäsoluissa. PLoS ONE 8 (1): e54346. doi: 10,1371 /journal.pone.0054346

Editor: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 12 heinäkuu 2012; Hyväksytty: 12 joulukuu 2012; Julkaistu: 21. 2013

Copyright: © 2013 Shabaik et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tuettiin osittain varoja congressionally Suunnatun Medical Research Program Rintasyöpä Concept Award ja Sharon ja William Cockrell Endaumentin Cancer Research Fund. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä on neljänneksi suurin syy syöpään liittyvät kuolemat Yhdysvalloissa yleinen 5 vuoden pysyvyys on 6% [1]. Vuodesta 2005 standardi kemoterapeuttisen hoito on hallinnon gemsitabiinin, nukleosidianalogi yhdistettynä erlotinibin, kinaasi-inhibiittori [2], [3]. Gemsitabiini tavoitteet ribonukleotidireduktaasia aiheuttaa ehtyminen dNTP ja edelleen pääsee liittymään DNA aiheuttaa pilttuu synteesi [4]. Toisaalta erlotinibin, alun perin ajateltiin kohdistaa epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR), on viime aikoina todettu olevan monen estäjä [5]. Koulutusjakson gemsitabiini toiminta on riittävän monimutkainen, mukaan lukien otto kuljettajat ja solunsisäisen fosforylaation johtavat sytotoksisuuteen, joka osaltaan alhainen alhainen vaste potilailla ja lisääntyvän kehittämisen chemoresistance [6]. Äskettäin on ehdotettu, että PDAC kerrostuminen useisiin alatyyppeihin perustuen molekyylien ero voidaan määrittää vastauksena kemoterapia [7]. Kaksi kolmesta määriteltyä alatyyppiä on edustettuina yleisesti käytetty haimasyövän solulinjoissa, mukaan lukien MIA PaCa-2, PANC-1 ja LVI jota käytetään tutkimukseen.

Yksi varhaisimmista molekyylitason muutosten taustalla haimasyöpä on konstitutiivisesti aktivoivan K-ras-mutaatio, joka esiintyy lähes 100% tapauksista [8], [9]. Aikana muutos, K-ras signalointi asemien solujen liiallista lisääntymistä ja edistää selviytymistä. On ehdotettu, että mitokondrioiden energiantuotanto on olennaista tuettaessa Ras-transformoidut solut, jotka tulevat erittäin riippuvainen autophagy, valtion kutsutaan ”autophagy riippuvuus”, ylläpitämään tervettä altaan mitokondrioiden ja riittävän TCA cycle välituotteita tukemaan oksidatiivinen fosforylaatio ( OXPHOS) [10], [11]. Erityisesti, haimasyövän solulinjoissa ja potilaan näytteitä, pohjapinta taso autophagy on kohonnut verrattuna normaaleihin soluihin tai solut muista kasvainsolulinjoja ja korreloi huonompi kliinisiä tuloksia [10], [12]. Tämä fenotyyppi ominainen Ras-transformoitujen solujen, tekee niistä ainutlaatuisen alttiita Mitokondrioiden hengitys ja autophagy. Itse asiassa, farmakologinen esto sekä hiljentäminen avaimen autophagy geenien on menestyksekkäästi johtanut vähentäminen mitokondrioiden hapen kulutusta ja solunsisäisiä ATP-tasot johtavat syvällinen inhibitio haimasyövän kasvua sekä in vitro että in vivo [10]. Siksi esto autophagy ja mitokondrioiden kohdentaminen voisi tarjota uuden lähestymistavan hoitoon PDACs jotka ovat yleensä hyvin tehonnut käytettävissä chemotherapies. Itse asiassa on ollut viime aikoina nousuun edun kohdistamiseen syöpäsolu mitokondrioissa jälkeen tunnustus niiden muuttuneen bioenergetic asema myötävaikuttamassa syövän synnyssä [13]. Niinpä kohdistaminen mitokondriot on tullut uusi ihanteellinen syöpähoidolla tuetun osittain tieto saavuttaa tarkka toimitus huumeiden organelle. Käyttö mitokondrioiden kohdennettujen aineita syöpähoitoihin esittelee lisäetuna suoraan vaikuttamalla tärkein säätelijä ohjelmoidun solukuoleman solussa ja täysin ohittaa ylävirran signalointikaskadien jotka ovat usein heikentää [14]. On hyvin dokumentoitu, että mitokondriot pahanlaatuisten solujen näytteille korkeampi transmembraaninen potentiaali verrattuna ei-pahanlaatuisia soluja eroihin entsyymin toimintaan, elektroni harjoittajien ja kalvo lipidirakenteeseen kuin mahdolliset syyt [15]. Hyödyntäville ainutlaatuinen määrite on johtanut suunnittelun uusille lipofiilisten kationien, jotka voivat valikoivasti kerääntyä kasvainsolun mitokondrioissa yli normaalin kudoksen vetämänä lisääntynyt transmembraaninen potentiaali [15]. Konjugointi trifenyylifosfonium (TPP) kationeja erilaisia ​​kemiallisia antureista ja huumeita käytetään laajalti saavuttaa erityisiä kohdistamista mitokondriot [16], [17], [18], [19], [20]. TPP-merkitty E-vitamiinin analogi (MitoVES) on tutkittu laajasti sen apoptoottisen ja antiangiogeenisiä ominaisuuksia, jotka ovat huomattavasti parannettu yli kuin vanhempien un-merkitty yhdiste, tukemalla mitokondrio kohdistaminen elinkelpoinen lähestymistapa parantaa tehokkuutta kohtalaisen aktiivinen lääkekandidaatteja [20], [21], [22]. Vaihtoehtoisesti lääkeaineen kantajia kuten -dendrimeerit ja lipososmes on modifioitu TPP kationien ja hyödynnetään toimittaa lasti mitokondriot [17], [23], [24], [25]. Kun nämä kantajia kuormitettiin malli kemoterapeuttisten lääkkeiden kuten paklitakselin tai doksorubisiinin, teho parannettu yli kohdentamattomaan kantajia osoittaa, että toimitus mitokondriot voivat parantaa apoptoosin ja sytotoksisuutta.

Olemme aiemmin raportoitu löytö uutta luokkaa TPP suoloja, jotka ovat laaja-alaista syövän vastaista aktiivisuutta [26]. Nämä yhdisteet voivat kerääntyä mitokondrioita nojalla niiden positiivisesti varautuneita TPP ryhmät ja negatiivinen potentiaali poikki mitokondrioiden kalvot [27]. Sen jälkeen, olemme osoittaneet, että nämä yhdisteet kykenevät kumotaan mitokondrion hengitystä ja lisäämällä mitokondrion superoksidi tasoilla. Tärkeintä on, että olemme osoittaneet, että tämän luokan yhdisteet voivat tehokkaasti inhiboida kasvaimen kasvua nude-hiiren rintasyövän ksenograftimallissa ilman ilmeistä toksisuutta [26]. Koska niiden ainutlaatuinen vaikutusmekanismi kohdistaminen mitokondrioita ja hieno riippuvuus Ras-ajettu kasvaimia mitokondrioiden toimintaan, pyrimme kehittämään tämän luokan yhdisteiden uusina aineina haimasyövän. Kun lisäksi otetaan huomioon, että on tärkeää autophagy säilyttää terveen uima mitokondrioita tukemiseksi selviytymistä ja proliferaatiota Ras transformoitujen solujen, me arveltu, että TP421 aiheuttaisivat solukuoleman haimasyövän soluja tavalla, johon autophagy sääntelyä mitokondrioita.

Materiaalit ja menetelmät

solulinjat ja Culture reagenssit

MIA PaCa-2, PANC-1, BxPC-3 ja LVI haimasyövän solulinjoissa ostettiin American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA). MEF atg3 + /+ ja atg3 – /- hiiren solulinjat olivat lahja Masaaki Komatsu (Juntendo University School of Medicine, Bunkyo-ku, Tokyo) [28]. HFF-1 normaali fibroblastisolulinjassa saatiin tohtori Carla Grandori (Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA). Kaikkia solulinjoja käytetään tutkimukseen pidettiin viljelmässä alle 35 kohtia ja testataan säännöllisesti mykoplasmakontaminaation käyttämällä PlasmoTest ™ (InvivoGen, San Diego, CA). MIA PaCa-2 ja PANC-1-solut ylläpidettiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS; Gemini-Bioproducts, West Sacramento, CA). BxPC-3, MEF atg3 + /+ ja atg3 – /- soluja ylläpidettiin RPMI, jota oli täydennetty 10% FBS: ää. HPAC-solut ylläpidettiin 1:01 DMEM: ää ja Ham F12 elatusaineessa, johon 5% FBS: ää. Soluja kasvatettiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO2: ta. Kaikissa kokeissa, solut eksponentiaalisen kasvun vaiheessa huuhdeltiin DPBS: llä ilman kalsiumia ja magnesiumia, lyhyesti trypsiinillä pieneen tilavuuteen 0,25% trypsiini-EDTA-liuosta (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), suspendoitiin uudelleen täydelliseen viljelyalustaan manuaalisesti laskettiin ja ympättiin steriiliin levyille ja annetaan kiinnittyä yön yli, ennen kuin hoidossa.

yhdisteet

Kaikki yhdisteet tallennetaan konsentroitiin DMSO- kantaliuosta, jäädytettiin -20 ° C: ssa. Laimennokset valmistettiin DPBS, ilman kalsiumia ja magnesiumia, ja käytetään uudelleen enintään 3 jäädytys-sulatus sykliä. Yhdisteet ostettiin LKT Laboratories Inc. (St. Paul, MN), Sigma-Aldrich Corp. (Saint Louis, MO) ja Asinex Ltd (Moskova, Venäjä).

Sytotoksisuusmääritys

Sytotoksisuus mitattiin 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidin (MTT) kolorimetristä määritystä kuten aiemmin on kuvattu [26].

Colony muodostumisen määritys

solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille (500-1000 solua kuoppaa kohden riippuen solulinjasta) ja annettiin yön yli tarttua. Seuraavana päivänä, lääkkeet lisättiin kuoppiin 24 h, minkä jälkeen elatusaine korvattiin lääkkeettömän media. Soluja inkuboitiin vielä 7-14 päivää, jotta pesäkkeiden muodostamiseksi. Pesäkkeet värjättiin kristalliviolettiliuoksella (0,05% kristalliviolettia, 0,74% formaldehydiä ja 36% metanolia), huuhdellaan ja sitten kuvattiin.

trypaanisiniekskluusiolla Pitoisuus

Käsitellyt solut kerättiin lyhyt trypsinaatiolla ja värjätään trypaanisininen 0,4% liuos (Lonza Ltd) mukaan valmistajan ohjeiden. Solut laskettiin käyttämällä hemasytometriä.

Alamar Blue solunelinkykyisyysmääritys

soluja käsitellään identtinen MTT-analyysi edellä kuvatulla tavalla. Lopussa hoidon alamarBlue (ABD Serotec

©) lisättiin kuoppiin mukaan valmistajan suositusten. Fluoresenssi havaittiin 560/590 ex /em aallonpituuksilla.

Cell Cycle määritys

Drug käsitellyt solut kerättiin kautta lyhyt trypsinaation, ja kiinnitettiin 70% etanolilla -20 ° C: ssa vähintään 4 h. Määrittämiseksi DNA-sisältöä, näytteet sentrifugoitiin ja suspendoitiin uudelleen DPBS: ssä, joka sisälsi propidiumjodidilla (50 ug /ml lopullinen konsentraatio) ja RNaasi A: ta (100 ug /ml lopullinen konsentraatio) ja analysoitiin virtaussytometrialla.

Cell lysaatit ja Western-blottaus-analyysi

Käsitelty cellswere huuhdeltiin DPBS: llä ja hajotettiin jäällä lisäämällä pieni tilavuus SDS-sisältävien solujen hajotuspuskuria 15 min. Lysaatit kerättiin Eppendorf-putkiin, sonikoitiin jäillä leikkausvoimien DNA, ja kvantitoitiin käyttäen RC DC-proteiinin määritys (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Kolmekymmentä mikrogrammaa solulysaattia ladattiin kuhunkin kaistaan, ja alistettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin sen jälkeen Immun-blot polyvinylideenifluoridia kalvoja (PVDF; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Lyhyesti, kalvot estettiin 5% maito TBST, jota seurasi inkubointi primääristä vasta-ainetta laimennettuna tarvittaessa esto-puskurissa 4 ° C: ssa overnight.After, kalvot pestiin, sopivan sekundäärisen vasta-ainetta lisättiin 1 h huoneen lämpötilassa ja lopuksi pestään pois ennen kuvantaminen. Kaikki vasta-aineet hankittiin joko Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA), tai Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA). Proteiini havaitseminen suoritettiin käyttäen Super Signal West Dura kemiluminesenssisubstraatilla (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) ja kuvatuksi ChemiDoc ™ XRS + -järjestelmä (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Kaikkien western blot tiedot, kuvat ovat edustavia blotteja valitaan vähintään kaksi erillistä koetta.

vetyperoksidin mittaamiseen Levels

sukupolvi vetyperoksidi mitattiin käyttämällä Amplex Red entsyymimääritystä. Solut ympättiin 96-kuoppaisille kirkas pohja mustille levyille käsiteltiin 4 tuntia, jolla on haluttu lääkkeen pitoisuus fenolipunaista DMEM-alustassa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää. Lopussa hoidon, solut pestiin ja hajotettiin DPBS-puskuriin, joka sisälsi 50 uM Amplex Red (Molecular Probes) ja 0,1 yksikköä /ml piparjuuriperoksidaasi (HRP; Sigma, St. Louis, MO) ja inkuboitiin 30 min 37 ° C: ssa valolta suojattuna. Inkuboinnin jälkeen fluoresenssin voimakkuus kussakin kuopassa havaittiin 540/590 ex /em aallonpituuksilla.

mittaus superoksidianionin tasot

Drug käsiteltiin MIA PaCa-2 ja BxPC-3-solut lyhyesti värjättiin jossa MitoSOX Red mitokondrio Superoxide Indicator (Invitrogen, Carlsbad, CA) ja noudattamalla valmistajan recommendations.Fluorescence voimakkuus mitattiin käyttäen virtaussytometriaa, kuten aiemmin on kuvattu [26].

fluoresoiva mikroskopia TP421 solunosasijaintia

MIA PaCa-2 ja PANC-1 solulinjoja istutettiin kaksinkertainen Chambered suojalasi (Nalge Nunc International, Rochester, NY) tiheydellä 50000 solua /kammio ja annettiin yön yli tarttua. Seuraavana päivänä solut käsiteltiin 2 uM TP421 ajanjaksojen jopa 72 tuntia. Ennen kuvausta, solut värjättiin 15 minuutin ajan 37 ° C: ssa käyttäen joko 200 nM Mitotracker Red CMXRos tai 50 nM Lysotracker Red DND 99 elävien solujen organelliin tahrat (Life Technologies, Grand Island, NY) seuraavasti valmistajan suositusten mukaisesti. Elävät solut visualisoitiin käyttäen Nikon DAIPHOT 300 käännettyä mikroskooppia (Nikon Instruments, Melville, NY) varustettu DAPI ja Cy3 suodatin estää, 10x silmäkappale ja 100x /1,3 Nikon öljyssä objektiivi ja Super High elohopealamppu. Estämään fotobleknande, näyte altistuminen valolle minimoitiin kuvan ottamisen harjoittamalla harmaasuodinta (ND2 ja ND4) suodattimia rajoittaa valon voimakkuutta päästä näytteen. Kuvat otettiin käyttäen Photometrics CoolSNAP 9 CCD-kamera (Roper Scientific, Ottobrun, Saksa) ja käsitellään käyttäen Q-capture Pro v 5.1.1.14 kuvankäsittelyohjelma (Q kuvantaminen Corporation, Surrey, BC, Kanada).

Immunofluoresoivat värjäys LC3B

MIA PaCa-2-solut ympättiin lasipeitinlevyille tiheydellä 50000 solua ja annettiin yön yli tarttua. Seuraavana päivänä soluja käsiteltiin 2 uM TP421: n läsnä tai poissa ollessa 5 uM rapamysiinin tai 10 uM klorokiinin 18 tuntia. Lopussa hoito, väliaine poistettiin ja solut pestiin 500 ui DPBS ennen kiinnittämistä 3,7% formaldehydiä 15 m huoneenlämpötilassa. Kiinnitetyt solut pestiin 500 ui DPBS: llä ennen ja jälkeen permeablization jääkylmällä asetonilla 5 minuutin ajan -20 ° C. Peitinlasit blokattiin 30 min ajan 1% naudan seerumin albumiinia (BSA) DPBS: ssä ennen inkubointia yön yli 4 ° C: ssa LC3B vasta-aineen 1% BSA: ta. Vasta-aine poistettiin ja peitinlasit pestiin DPBS: llä varovasti sekoittaen. Cy5 ja Cy3-konjugoitu vasta-aineita (GE Healthcare Lifesciences, Pittsburgh, PA), laimennettu 1% BSA inkuboitiin peitelasit 2 tuntia. Peitelaseja pestiin uudelleen DPBS varovasti sekoittaen, ilmakuivattua ja asennettu valmiiksi puhdistettu lasi slidesusing Prolong Gold antihäipyminen kiinnitysväliaineet (Life Technologies, Grand Island, NY). Kuvat saatiin käyttäen Lieca SP2 skannaus -konfokaalimikroskoopilla (Leica, Heidelberg, Saksa) varustettu 488 nm argon ja 633 nM krypton laser (laser valta minimiin 50% kokonaismäärästä) ja Leica konfokaali ohjelmisto v 2,61 ( Leica Microsystems, Heidelberg, Saksa).

In vitro migraatiokokeessa

solun muuttoliikettä analysoinnissa käytettiin 24-kuoppaisen levyn soluviljelmässä insertit varustettu läpinäkyvä PET kalvoja, joissa on 8 um kokoinen huokosiin (BD Biosciences, San Jose, CA). 7.5 x 10

4 seerumia MIA PaCa-2 solut levytettiin yläkammiossa seerumittomassa median ja annettiin kevyesti tarttua yhdessä yössä. Seuraavana päivänä, muuttoliike stimuloitiin 10% FBS: ia lisätään alempaan kammioon. Negatiivisena kontrollina kuoppia sai 1% seerumiväliaineessa sijaan. TP421 Käsitellyt näytteet, sai 10% FBS: ia alemmassa kammiossa ja yhdiste seerumivapaassa väliaineessa yläkammiossa. 24 tunnin kuluttua solut tarttuu alkuun membraanin olivat kevyesti romutettiin pois käyttäen Q-tip. Solut pohjassa membraanin värjättiin Giemsa tumaväriä 30 minuuttia huoneenlämpötilassa ja pestiin deionisoidulla vedellä. Kuvia värjättyä kalvot kiinni edustavien kenttiin Nikon käännettyä mikroskooppia käyttäen 10X tavoite.

haavan paraneminen Pitoisuus

Kudosviljelytutkimusten käsiteltiin 96-kuoppaisia ​​levyjä päällystettiin kollageeni I liuotetaan 0,2 N etikkahappoa (steriilisuodatettu) lopulliseen konsentraatioon 45 ug /ml, yön yli 4 ° C: ssa yön yli. Seuraavana päivänä ylimäärä kollageeni poistettiin, kaivot pestiin kahdesti DPBS: llä ja estettiin 2 mg /ml BSA: ta DPBS: ssä 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Blokkauksen jälkeen kuopat pestiin uudelleen DPBS: llä. PANC-1-solut ympättiin sitten tiheydellä 35000 solua /kuoppa koko seerumivähennysväliainetta ja annettiin kiinnittyä yön yli. Media vaihdettiin seerumittomassa alustassa ja soluja inkuboitiin edelleen yön yli. Seuraavana päivänä, naarmut tehtiin käyttämällä reunan 200 ui kärkeä ja kuopat pestiin DPBS: llä. Käsitellyt ja un käsitellyn kontrollisyvennyksissä saivat 10% FBS sisältäviä aineita ja huumeiden lisättiin. Negatiivisena kontrollina kuoppia sai seerumittomassa alustassa. Haavat annettiin 24 h sulkea lopussa, jonka kuopat huuhdeltiin DPBS: llä, solut kiinnitettiin 100% metanolissa 10 minuutin ajan ja värjättiin Giemsa tumaväriä 30 min. Lopuksi kuopat pestiin deionisoidulla vedellä ja kieritteli kuivua. Haavat olivat kuvattiin kanssa käyttämällä 4X tavoite.

Tilastollinen analyysi

Milloin on osoitettu, p-arvot laskettiin käyttäen kaksisuuntaisia ​​parittomia Studentin t-testi epätasainen varianssit. P-arvot alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

TP421 Näyttää nopea ja sytotoksisiksi on paneeli haimasyövän solulinjojen

Meidän alustava selvitys on syövän vastaista aktiivisuutta tämän luokan yhdisteitä kuvasimme niiden voimakas sytotoksisuus syöpäsolulinjoja vaihtelevia suvusta [26]. Täällä, testasimme kykyä yhden johtoyhdisteillä tunnistettu muodossa meidän aloitusnäyttö, TP421, indusoida ja estävät solujen lisääntymistä paneelissa haimasyövän solulinjoissa. Käyttäen MTT-määritystä, arvioimme vaikutus 72 tunnin jatkuvan altistuksen nousevia annoksia TP421, TP187 ja TP197 kasvuun MIA PaCa-2, BxPC-3, PANC-1 ja LVI-solulinjat. Tulokset (taulukko 1) paljasti voimakas sytotoksisuus, jossa TP421 IC

50-arvot osa-mikromolaarisella alueella kaikissa testattujen solulinjojen riippumatta eroista erilaistumisen tilassa tai geneettinen mutaatiostatuksesta tausta. Yhdisteiden rakenteet testattiin on esitetty tukea kuvassa (Kuva S1). TPP-osa on tämä yhdiste on olennaista aktiivisuutta 7-dietyyliamino-4-metyylikumariinia, rakenteellisesti samanlaisia ​​analogi TP421 puuttuu TPP osan, ei aiheuttanut sytotoksisuutta testatuissa solulinjoissa. Olemme edelleen tutkittiin, mikä vaikutus 24 tunnin altistuminen TP421 on pesäkkeitä muodostava kyky MIA PaCa-2-soluissa verrattuna gemsitabiini ja erlotinibin (kuvio 1). Tulokset vahvistivat kykyä TP421 estää soluproliferaatiota

in vitro

tasolle verrattavissa gemsitabiinin ja huomattavasti voimakkaammin kuin erlotinibi. Edelleen karakterisoimiseksi sytotoksista toimintaa TP421, inkuboimme soluja läsnä tai poissa ollessa konsentraatioalueella TP421 0,25, 0,5, 1 tai 5 h, mitä seurasi inkubointi huumeiden alustassa 24, 48 ja 72 tuntia. Samanaikaisesti, käsittelimme solut jatkuva altistuminen TP421 24, 48 ja 72 tuntia. Lopussa inkubointien arvioimme solujen elinkykyä kautta MTT. Kuten odotettua, IC

50 TP421 oli käänteinen korrelaatio hoitoaika sekä kokonaiskesto inkubaatioajan, kuten on esitetty taulukossa 2. Yllättäen kuitenkin havaitsimme, että hyvin lyhyt valotusaika, niin lyhyt kuin 15 min, TP421 kykeni saavuttamaan 50% sytotoksisuuden joskin korkeammilla konsentraatioilla (20 uM), joka osoittaa aluksi erittäin nopeasti lääkkeen vaikutuksen. Kiinnostavaa kyllä, havaitsimme, että PANC-1 solut, joita käsiteltiin tällä tavalla, lyhyempi lääkealtistuksen kertaa vähentää huomattavasti sytotoksisuuden TP421. Eloonjäämiskäyrät vertaamalla jatkuvasti ja 0,25 h altistuksen kertaa kolmen solulinjoissa on esitetty kuviossa 2.

Effect of 24 h lääkkeen altistumisen pesäkkeenmuodostuskyvyn (A) MIA PaCa-2, ja (B) BxPC -3. Kuvat edustavat kolmen erillisen kokeen.

Annosvastetutkimukset eloonjäämiskäyriä solulinjoja käsiteltiin TP421 vertaamalla jatkuva altistuminen (suljetut neliöt) 0,25 h lääkeainealtistukseen seurasi media huuhdo (avoimet neliöt) ja inkuboida edelleen. Yhteensä inkubaatioaika on sulkeissa. Tiedot ovat keskiarvo ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. TP421 pitoisuudet piirrettiin Log kantaluku 10 mittakaavassa.

TP421 Sytotoksisuus on Selective Kohti Syöpäsolut

jälkeen olettaen, että TP421 voisi kerääntyä valikoidusti syöpäsoluissa ohjaa korkeamman transmembraaninen potentiaali, vertasimme vaikutus TP421 on kasvuominaisuudet normaalin fibroblastisolulinjaa HFF-1 vastaan ​​kolme haimasyövän solulinjoissa. Hoitoon MIA PaCa-2 ja HFF-1 solujen erilaisia ​​annoksia TP421 72 h paljasti selvästi suurempi herkkyys haimasyövän solulinjaa kohti lääke (kuvio 3A). Tämä vahvistettiin mittaamalla prosentuaalinen kuolleiden solujen kertynyt TP421 hoito, joka oli huomattavasti korkeampi haiman syöpäsoluissa verrattuna HFF-1 (kuvio 3B). Lisäksi, käyttäen Alamar Blue indikaattoriväriä, havaitsimme 4-kertainen ero inhibitio MIA PaCa-2-solujen lisääntymisen verrattuna HFF-1-soluissa 72 tunnin inkuboinnin ajan ja TP421 osoitetussa annoksilla. (Kuvio 3C).

(A) kasvu normaalista HFF-1-soluissa ei vaikuta samalla haimasyövän MIA PaCa-2 solut näyttävät laaja kuolemaa seuraavan 72 tunnin altistuminen nousevia annoksia TP421. (B) TP421 indusoi suuremman solukuoleman kolme haimasyövän solulinjoissa verrattuna HFF-1-soluja mitattuna trypaanisiniekskluusiolla. (C) leviämisen MIA PaCa-2, mutta ei HFF-1 suuresti estyy TP421 alamarBlue määrityksessä. Kolme riippumatonta koetta suoritettiin edustavat kuvat on esitetty (A), keskiarvo ± SD on merkitty (B) ja (C). *, **, *** Ja **** osoittavat p-arvo 0,05, p 0,01, p 0,001 ja p 0,00005 vastaavasti.

TP421 Pidätykset Haimasyöpä Cell Lines G

0 /G

1 vaiheen Cell Cycle in Time ja annosriippuvaisesti

jotta selvittämiseksi mekanismi, jonka TP421 estää soluproliferaatiota, arvioimme sen vaikutus solusyklin kinetiikka. MIA PaCa-2 (kuvio 4), PANC-1, BxPC-3, ja HPAC (taulukko 3) soluja käsiteltiin kahden pitoisuuksilla TP421 lisäämiseksi kestot ajan ja DNA-pitoisuus analysoitiin käyttämällä virtaussytometriaa. Laaja G

0 /G

1 pidätys havaittiin kaikissa solulinjoissa pienistä eroista huolimatta niiden herkkyyttä TP421. Mielenkiintoista, solusyklin jakelu MIA PaCa-2-soluja käsiteltiin kahden muun analogit, TP187 ja TP197, myös muistutti TP421 merkittäviä ja varhaisen pidätys G

0 /G

1 (taulukko 3). Tämä tulos poikkeaa G

2 /M ja S-vaiheen pysähtymisen aiheuttama näiden yhdisteiden ei-haimasyövän solulinjoissa [26], mikä viittaa mahdolliseen kasvain-tyyppinen erityinen vaikutus.

Vaikutus TP421 käsittely solusyklin jakautumista MIA PaCa-2-soluissa tutkittiin annoksesta ja ajasta riippuvalla tavalla. Solut olivat käsittelemättömiä tai käsiteltiin 0,1 ja 1 uM TP421 24, 48 ja 72 tuntia. Histogrammit kuvattu edustavat kolmen erillisen kokeen.

TP421 paikantuu Mitokondrioiden Rakenteet, joissa jatkuva säilyttäminen ajan mittaan

TP421 kuuluu luokkaan yhdisteitä, jotka sisältävät TPP kationin tiedossa kerääntyä mitokondriot [27]. Jotta voitaisiin vahvistaa mitokondrioiden lokalisointi, PANC-1-soluja käsiteltiin 2 uM TP421 eri aikoja. Välittömästi ennen kuvantamisen, solut yhteistyössä värjättiin 200 nM MitoTracker Red väriaine merkitä mitokondrioita. Havaitsimme merkittävän kolokalisaation kestäen jopa 72 tuntia (kuvio 5A), joka ilmaisee, että TP421 todellakin kertynyt mitokondrioita ja säilyi pitkäksi aikaa. Toissijaisena todentaminen mitokondrioiden lokalisointi pyrimme määrittämään roolia mitokondrion transmembraanisen potentiaalin kertymistä TP421 soluissa. Käyttämällä ionofori karbonyyli syanidi-4- (trifluorimetoksi) fenyy- (FCCP), jota käytetään yleisesti haihduttaa mitokondrion transmembraanisen potentiaalin tutkimme rakenteessa TP421 fluoresenssin. Esikäsittelimme PANC-1-soluja 30 minuutin ajan 10 uM FCCP jota seurasi 15 min inkubaatio TP421. Ohjaus solut saanut FCCP ja altistettiin 15 min TP421 vain. Läsnä ollessa FCCP, havaitsimme selvästi diffuusi TP421 fluoresenssi (kuvio 5B), joka ei muistuta, että mitokondrioiden lokalisointi vahvistetaan, että tavanomaisissa TP421 kertynyt mitokondriot ohjaa transmembraaninen potentiaali. Koska meillä oli havaittu, että 7-dietyyliamino-4-metyylikumariini ei ollut sytotoksinen soluille, olemme edelleen tutkia suhdetta mitokondrioiden lokalisointi ja TP421 sytotoksisuutta. Esikäsittelimme MIA PaCa-2-soluissa 30 minuutin ajan 10 uM FCCP jälkeen lisättiin TP421 vielä 30 min. Lopussa hoidon kesto, pesimme solut ja korvattiin väliaineen liika lääkeaineen ja inkuboitiin soluja 24, 48 ja 72 tuntia ja mitatun solujen elinkykyä. Läsnä ollessa FCCP solut merkittävästi suojattu TP421 sytotoksisuus (kuvio 5C) osoittaen, että lokalisointi mitokondriot oli suoraan vastuussa toiminnan lääkeaineisiin.

(A) PANC-1-soluja käsiteltiin TP421 ja värjättiin kanssa MitoTracker Red (MTR) paljastaisi moninaisia ​​kolokalisaation TP421 ja mitokondrioiden merkki väriainetta. (B) PANC-1-soluja esikäsitellään FCCP ilmi, ettei mitokondrioiden TP421 lokalisointi. (C) Alennettu sytotoksisuus TP421 in MIA PaCa-2-solut esikäsitellään FCCP nähdään 24, 48 ja 72 tuntia. Tiedot ovat keskiarvo ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. * Osoittaa p 0,01.

TP421 hoito indusoi Mitokondrioiden ja Sytosoliset Kertyminen reaktiivisia happiradikaaleja

TP421 pienenee mitokondrioiden hengityskapasiteetti ja lisää superoksidi (O

2

– ) kertyminen [26]. Kuitenkin verrattuna O

2

-, vetyperoksidi (H

2O

2) on suhteellisen vakaa ja kalvon läpäisevä ROS, joka voi aiheuttaa lipidi-, proteiini- ja DNA-vaurioita sekä osallistuu signaalitransduktion [29]. Siksi tutkimme taso H

2O

2 haiman syöpäsoluissa seuraavat TP421 hoitoa. MIA PaCa-2 ja BxPC-3-soluja käsiteltiin kasvavia annoksia TP421 4 tuntia ja sen jälkeen lyhyt inkuboimalla 50 uM Amplex Red, kun läsnä oli 0,1 yksikköä /ml HRP. Läsnäollessa HRP, Amplex Red reagenssi reagoi H ​​

2O

2 on 1:01 stoikiometria tuottaa erittäin loisteputki resorufiini. Saatu fluoresenssi-intensiteetti mitattiin viritys- ja emissioaallonpituuksia 540 nm ja 590 nm, vastaavasti. Kuten odotettua, hoito johti 2,5-kertainen H

2O

2 tasoa BxPC-3 on korkein pitoisuus TP421 hyvän korrelaatio H

2O

2 tasoa ja annos TP421 käyttää (kuva 6A). Toisaalta, samanlainen Fluoresenssin kasvua ei voitu havaita MIA PaCa-2-soluissa (tietoja ei ole esitetty). Sen määrittämiseksi, ettei H

2O

2 kerääntyminen näissä soluissa johtui puuttumisen O

2

– sukupolvi, käytimme MitoSOX punainen määritys [26] mittaamaan tasoa mitokondrioiden O

2

– in MIA PaCa-2 ja verrattiin sitä BxPC-3. Molemmat solulinjat käsiteltiin kasvavia annoksia TP421 4 h näytteille 3-5 kertainen lisäys O

2

– taso (kuvio 6B) ja ne pysyivät korkealla 24 h (tuloksia ei ole esitetty). Tämä viittaa siihen, että puute H

2O

2 kertymistä havaittu MIA PaCa-2-soluissa ei johtunut puutteellinen O

2

Ravinnon tuotanto näissä soluissa.

Vaikutus of TP421 hoidon tasoa (A) H

2O

2 ja (B) mitokondrion O

2

– in BxPC-3 ja MIA PaCa-2-soluissa mitattiin käyttämällä fluoresoivia koettimia Amplex punainen ja MitoSOX punainen, vastaavasti. (C) vaikutus antioksidantti esikäsittely sytotoksisuuteen TP421 in PANC-1-soluissa. *, ** Ja *** osoittaa p 0,05, p 0,005 ja p 0,001 vastaavasti.

Koska liiallinen ROS tiedetään johtavan solukuolemaan, me tutki vielä potentiaalia suojaava rooli antioksidanttina. PANC-1-soluja esikäsiteltiin 15 mM

N

-asetyyli-L- kysteiinin (NAC), 2 tuntia ennen kuin lisättiin TP421. Sen jälkeen kun oli inkuboitu 24 tuntia, missä määrin sytotoksisuus määritettiin MTT. Antioksidantti esikäsittely voisi suojata soluja TP421 indusoi sytotoksisuuden jopa 35% (kuvio 6C) ja samanlaiset tulokset havaittiin MIA PaCa-2 ja BxPC-3-soluja (tietoja ei esitetty).

TP421 hoito Aktivoi stressiin indusoi Pathways

Koska voimakas kertyminen ROS seuraavista TP421 hoidon, me arveltu, että solustressiä sellaisia ​​keinoja JNK, p-38 ja ERK, aktivoidaan [30], [31], [32]. MIA PaCa-2 ja BxPC-3-soluja käsiteltiin nousevia annoksia TP421 4 h tai 5 uM 1-8 h ja kinaasin aktivaatio määritettiin Western-blottauksella.