Krooninen sairaus

tiivistelmä

konstitutiivisen aktivaation pro-eloonjäämisen kinaasien on tullut lupaava kohde pienten molekyylien kanssa lisääntyvää kiinnostusta kehittää multi -targeted aineita. Mekanismit kykyä vastata kaikkein tekijöille suunnattu syöpä erityisiä eloonjäämisreittejä tunnetaan edelleen huonosti, mutta kriittinen niiden kliinistä soveltamista. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että sunitinibi, pieni molekyyli estäjä useita tyrosiinikinaasien lukien VEGFRs ja PDGFRs indusoi apoptoosia ja estää solukasvua koolonkarsinoomasoluissa soluviljelmässä ja ksenograftimalleja kautta BH3 vain proteiinia PUMA. Sunitinibihoito indusoi

PUMA

transkription kautta AKT /FoxO3a akselilla. PUMA, BH3 mimeettejä, tai 5-Flurourical herkistyneet koolonsyöpäsoluihin sunitinibille: n indusoiman apoptoosin. Lisäksi PUMA aiheutettiin sunitinibihoito ksenograftikasvaimissa, ja puute

PUMA

merkittävästi tukahdutti antituumorivaikutuksia Sunitinibin. Tutkimuksemme osoittaa, että PUMA-välitteinen apoptoosi on tärkeää terapeuttisen vaikutuksen sunitinibille, ja aktivointi mitokondrioiden-reitin BH3 jäljittelijät tai PUMA manipulointi voi olla käyttökelpoinen parantamiseksi antituumorivaikutuksen sunitinibin. Modulaatio PUMA ja selektiivinen Bcl-2-perheen jäsenet saattaisivat olla mahdollisia biomarkkereita ennustamiseen sunitinibia vastauksia.

Citation: Sun J, Sun Q, Brown MF, Dudgeon C, Chandler J, Xu X, et al. (2012) Multi-Kohdennettu Kinase Inhibitor Sunitinibi indusoi apoptoosia koolonkarsinoomasoluissa kautta PUMA. PLoS ONE 7 (8): e43158. doi: 10,1371 /journal.pone.0043158

Editor: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 02 maaliskuu 2012; Hyväksytty: 17 heinäkuu 2012; Julkaistu: 17 elokuu 2012

Copyright: © Sun et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukevat National Institutes of Health (NIH) avustus CA129829, American Cancer Society apurahan RGS-10-124-01-CCE ja FAMRI (J. Yu), ja NIH avustukset CA106348, CA121105 ja American Cancer Society apurahan RSG-07- 156-01-CNE (L. Zhang). Tämä projekti käytti UPCI yhteiset tilat, joita tukee osittain palkinnon P30CA047904. J. Sun ja Y. Shu tukee osittain National Natural Science Foundation of China Apurahat 30772549. Rahoittajat ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on kolmanneksi suurin syy syöpään liittyvät kuolemat Yhdysvalloissa ja esiintyvyys on nousu kehitysmaissa [1]. Vaikka yhdistelmä parantaa kemoterapiaa ja säteily menneinä vuosikymmeninä, 5 vuoden pysyvyys CRC joilla on pitkälle edennyt sairaus edelleen liian alhainen. Poikkeava aktivaatio eri kinaasin reittejä on yleinen useimmissa kiinteiden kasvainten, mikä voi johtaa lisääntyneeseen lisääntymistä, eloonjääntiä, angiogeneesiä tai invaasio [2], [3]. Viime vuosina huomattavasti toivoa on saatettu aineita kehitetty kohdistaa onkogeeniset kinaasien, joiden käyttö yhdessä kemoterapiaa tai sädehoitoa saattaa parantaa selviytymistä ja tulos CRC potilaista [4]. Tavoiteltu lähestymistavan odotetaan lopulta antaa turvallisempaa ja tehokkaampaa syöpähoitojen [5]. Yksi suuri haaste kliinisessä näiden lääkkeiden käytön on yleisyys luontainen ja hankitun resistenssin, jonka taustalla mekanismeja edelleen suureksi osaksi tuntemattomia ja kiivasta tutkimuksen [4], [5].

Sunitinibi (tunnetaan myös nimellä SU11248) kehitettiin usean kohdistetun reseptorityrosiinikinaasin (RTK) estäjä, ja hyväksytty FDA vuonna 2006 hoitoon munuaissolukarsinooma (RCC) ja imatinibille resistenttejä ruuansulatuskanavan stroomakasvain (GIST) [6], [7] . Käynnissä kliinisissä tutkimuksissa käydään arvioida sen tehoa muissa elimissä kuten metastaattinen paksusuolen syövän [7], [8] (https://clinicaltrials.gov/). Sunitinibi estää erilaisia ​​reseptorityrosiinikinaasien (RTK: t), jotka on joko mutatoitu tai aktivoitu syöpä. Näitä ovat reseptoreita verihiutaleperäinen kasvutekijä (PDGF-R α ja β) ja verisuonten endoteelin kasvutekijä reseptorit (VEGFR1, 2 ja 3), sekä KIT (CD117), RET, CSF-1R, ja flt3 [6] [7]. Sunitinibi on suositeltu toisen linjan hoito GIST, joka kehitti Imatinibiresistenteiksi vuoksi toissijainen mutaatioista

c-KIT

. Angiogeneesin inhibitio, immuunijärjestelmän modulaatio ja apoptoosin induktio on ehdotettu välittävän antituumorivaikutuksia Sunitinibin [7]. Mekanismit solun itsenäinen vaikutus Sunitinibin kuten solujen tappaminen ei ole hyvin ymmärretty.

Mitochondria-välitteisen apoptoosin tärkeä rooli tuumorin vastaisen toiminnan monenlaisia ​​tavanomaisia ​​kemoterapia-aineiden sekä kohdennettuja hoitomuotojen [9], [10]. Bcl-2 perheen proteiinit ovat keskeinen sääntelyviranomaisten mitokondrioiden-välitteisen apoptoosin, joka tarttuu selektiivinen aktivaatio tai induktion proksimaalisen BH3-vasta jäseniä vastauksena erillisiä sekä päällekkäiset signaalit [11], [12]. BH3: een vain proteiinia PUMA on keskeinen rooli p53-riippuvaista ja riippumattaman apoptoosin ihmisen syöpäsoluja ja hiirillä [13], ja aktivoi mitokondrioiden reitin kautta Bcl-2-perheen jäsen Bax /Bak seuraavat neutraloivat kaikkien jäsenten antiapoptoottisten Bcl -2 kaltaisia ​​molekyylejä [14], [15], [16], [17]. DNA-vaurion aiheuttama gamma-säteilytystä tai yleisesti käytettyjen kemoterapeuttisten aineiden, kuten 5-fluorourasiili (5-FU), adriamysiini ja etoposidi, aiheuttaa p53-riippuvainen induktio PUMA ja apoptoosin [15], [18]. Nongenotoxic korostaa, kuten kasvutekijä puutetta, endoplasmakalvostossa myrkkyjä ja useita estäjät indusoivat PUMA läpi useita muita transkriptiotekijöitä, mukaan lukien p73, NF-KB: n ja FoxO3a [13], [19], [20], [21], [22], [23].

nykyisessä tutkimuksessa osoitimme, että sunitinibi indusoi PUMA ilmaus riippumaton p53 koolonkarsinoomasoluissa. Induktio PUMA välitti transkriptiotekijän FoxO3a kun esto AKT.

PUMA

puute johti vastustuskyky sunitinibille aiheuttaman apoptoosin soluissa sekä ksenografteissa. Tutkimuksemme tarjoaa molekyylitason mekanismi indusoiman apoptoosin tämä ei-selektiivinen estäjä paksusuolen syöpäsoluissa, ja sillä on merkittäviä vaikutuksia biomarkkereiden löytö ja mahdollisia strategioita vastustus.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture and Drug Treatment

Colon syövän solulinjat saatiin ATCC: stä. Kaikkia solulinjoja pidettiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2 ja viljeltiin Mycoy 5A-alustassa (Invitrogen, Carlsbad, CA), johon oli lisätty 10% FBS: ää (HyClone, Logan, UT), 100 yksikköä /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä (Invitrogen, Carlsbad, CA). Somaattiset tyrmäys solulinjoja HCT 116

p53

KO [24], HCT 116

PUMA

KO [15], DLD1

PUMA

KO [18], HCT 116

FoxO3a

vakaa pudotus (KD) soluja ja pieniä häiritseviä RNA (siRNA) [19] on kuvattu aiemmin. Syöpälääkkeiden tai kemikaaleja tutkimuksessa käytetyt kuuluu sunitinibimaleaatti (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI), 5-fluorourasiilin (5-FU), Gossypolin (Sigma, St. Louis, MO), HA14-1 (Axxora LLC, San Diego , CA), ABT-737 (Selleck Chemicals LLC, Houston, TX). Kantaliuoksia kaikki yhdisteet valmistettiin DMSO: hon ja laimennettiin elatusaineeseen työskennellä pitoisuudet ennen käyttöä. Solut infektoitiin adenoviruksella ilmentävien PUMA, Ad-PUMA [15] (20 MOI) yksin tai lisäämällä sunitinibin. Transfektio ekspressiokonstruktien Flag-Mcl-1 [16], Bcl-2 ja konstitutiivisen AKT (Millipore) suoritettiin, kuten on kuvattu [20].

Western-blottaus ja Solunosafraktiointi

käytetyt vasta-aineet Western blotting mukana ne vastaan ​​kaspaasi-3, Myc (9B11), FoxO3a (yhteensä), p-FoxO3a, AKT (yhteensä), p-AKT (S473) (Cell Signaling Technology, Beverly, MA), sytokromi-c-, α- tubuliinia, Bcl-x L, Mcl-1 (BD Biosciences), kaspaasi-9 (Stressgen Bioreagents, Ann Arbor, MI), sytokromi-oksidaasi-alayksikön IV (Cox IV, Invitrogen), Bcl-2 (Dako, Carpinteria, CA, USA) , Flag (Sigma), PUMA [15], p53, p21, Bim, Bid, Noxa, Smac ja β-aktiini (EMD Biosciences, Gibbstown, NJ). Western-blottaus suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [25].

vapautuminen cytochorme c ja smac havaittiin sytosoliin seuraavat subcelluar fraktiointi, kuten on kuvattu [20], [26]. Lyhyesti, solut käsiteltiin T75- pulloissa merkitty kertaa ja jollei differentiaalisentrifugointia saada soluliman ja mitokondrioiden jakeet. Pitoisuudet solulimafraktiot Saadut normalisoitiin käyttäen proteiinimääritys värireagenssia (Bio-Rad, Hercules, CA). Fraktiot, sekoitettiin yhtä suurilla tilavuuksilla 2 x Laemmli-näytepuskuriin ja sille suoritettiin Western blotting -analyysi.

Kromatiini immunosaostus

Kromatiini immunosaostuksella (ChIP) tehtiin käyttämällä Kromatiini Immunosaostusmääritys kit (Millipore, Billerica , MA), jossa FoxO3a vasta-aineen kromatiinin saostamalla kuten on kuvattu [18]. Sakat analysoitiin PCR: llä käyttämällä alukkeita 5-GCGCACAGGTGCCTCGGC-3 ja 5-TGGGTGTGGCCGCCCCT-3, kuten on kuvattu [22].

Lusiferaasimäärityksiä

Solut transfektoitiin PUMA toimittajille, jotka sisältävät joko WT tai mutantti FoxO3a sitoutumiskohdat [19], jossa transfektion ohjaus β-galaktosidaasi toimittaja pCMVβ (Promega), ja sitä käsiteltiin 12 uM sunitinibilla 24 tuntia. Solulysaatit otettiin talteen ja lusiferaasiaktiivisuudet mitattiin, kuten aiemmin on kuvattu [23]. Kaikki reportteri kokeet tehtiin kolmena kappaleena ja toistettiin kolme kertaa.

(A) Ilmoitettu koolonsyöpäsolulinjoissa käsiteltiin 15 uM sunitinibilla 24 tuntia. Tasot PUMA analysoitiin Western-blottauksella. (B) Vanhempien HCT 116 (WT) tai

p53

KO soluja käsiteltiin kuten (A) kasvavia annoksia sunitinibin ja analysoitiin PUMA, p53 ja p21 ilme. (C) ja (D) HCT 116-soluja käsiteltiin 15 uM sunitinibilla varten ilmoitettu kertaa.

PUM

mRNA ja proteiini tasot analysoitiin reaaliaikaisella RT-PCR ja Western blottauksella, vastaavasti.

GAPDH

mRNA käytettiin kontrollina normalisointia RT-PCR, ja β-aktiini käytettiin kontrollina lastausta Western-blottauksella.

Reaaliaikainen Käänteinen Transcription- PCR

Kokonais-RNA eristettiin soluista käyttämällä Mini RNA: n eristäminen II -kittiä (Zymo Research, Irvine, CA) valmistajan protokollan. Kokonais-RNA (1 ug) käytettiin cDNA-käyttäen SuperScript II käänteistranskriptaasia (Invitrogen). Reaaliaikainen PCR suoritettiin PUMA ja GAPDH kuvatulla [22].

(A) HCT 116 WT ja

PUMA

KO soluja käsiteltiin kasvavia annoksia sunitinibin 48 tuntia. Apoptoosi analysoitiin ydin- pirstoutuminen määrityksessä. Tiedot saatiin 3 erilliselle kokeelle. **,

P

0,01, KO

vs.

WT. (B) HCT 116-solujen genotyypin ollessa esitetyn olivat käsittelemällä 15 uM sunitinibilla 48 tuntia.

Upper

, pilkkoutumistuotteet kaspaasi-3 ja -9 analysoitiin Western-blottauksella.

Ala

, vapauttaa sytokromi c: ja Smac sytosoliin analysoitiin Western blottauksella. β-aktiini ja CoxIV ovat säätimet lastaus, ja soluliman ja mitokondrioiden fraktiointeja, vastaavasti. (C) Pesäkkeenmuodostusta HCT 116 WT ja

PUMA

KO soluja käsitellään sunitinibilla. Soluja käsiteltiin 12 uM sunitinibihoito 48 tunnin ajan, sitten maljattiin 1:200 tai 1:400 laimentaminen (~600 tai 300 solua per kuoppa) 12-kuoppaisille levyille ja niiden annettiin muodostaa pesäkkeitä 14 päivää.

Upper

edustaja kuvia pesäkkeiden.

Ala

yhdyskunnat sisältävä 50 solut laskettiin ja suhteellinen eloonjääminen laskettiin käsittelemättömät solut asetettu 100%. Tiedot saatiin 3 erilliselle kokeelle. **,

P

0,005, KO

vs.

WT. (D) DLD1 WT ja

PUMA

KO soluja hoidon 30pM sunitinibilla 48 tuntia.

Vasen

, PUMA ja pilkkoutumistuotteet kaspaasi-3 analysoitiin Western-blottauksella.

Oikea

, apoptoosin analysoitiin ydin- pirstoutuminen määrityksessä. **,

P

0,01, KO

vs.

WT.

Apoptosis Analyysit

Adherentit ja kelluvat solut kerättiin, värjättiin Hoechstin 33258 (Invitrogen), ja analysoitiin apoptoosi tumavärjäystä määrityksessä. Vähintään 300 solua kussakin käsittelyssä analysoidun [25], [27]. Pesäkkeiden muodostumista määrityksiä, yhtä suuri määrä soluja käsiteltiin eri ja maljataan 12-kuoppaisille levyille eri laimennoksilla. Pesäkkeet näkyviksi kristallivioletilla värjäys 11-14 päivä jälkeen pinnoituksen kuten aikaisemmin on kuvattu [25], [28]. Kukin koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja toistettiin ainakin kahdesti.

(A) HCT 116 ja HT 29-soluja käsiteltiin 15 uM sunitinibilla varten osoitettu kertaa. Tasot yhteensä FoxO3a, fosforyloidun (p) – FoxO3a yhteensä-AKT ja fosforyloidun (p) -AKT (S473) analysoitiin Western-blottauksella. (B) HCT 116

p53

KO-soluja ja HT 29-solut transfektoitiin joko tyhjällä vektorilla tai konstitutiivisesti aktiivinen AKT-ilmentämiskonstrukteja 16 tuntia, sitten käsiteltiin 15 uM sunitinibilla 24 tuntia. Tasot p-AKT ja PUMA analysoitiin Western-blottauksella. (C) HCT 116

p53

KO-solut transfektoitiin joko salattu siRNA tai

FoxO3a

erityisiä siRNA: ssa 24 tuntia, ja sitten sitä käsiteltiin 15 uM sunitinibilla 24 tuntia. Tasot ilmoitetaan proteiinit analysoitiin Western-blottauksella. (D)

FoxO3a

vakaa pudotus (KD) Soluja käsiteltiin 15 uM sunitinibilla 24 tuntia. Tasot ilmoitetaan proteiinit analysoitiin Western-blottauksella. Erityinen bändi koko-FoxO3a on merkitty nuolella. p-aktiini käytettiin verrokkina lastaukseen.

ksenograftikasvaimissa

Kaikki eläinkokeet hyväksyttiin Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC) yliopiston Pittsburgh. HCT 116 WT ja

PUMA

KO -ksenografteja perustettiin ja mitattiin osassa [25]. Lyhyesti 5-6 viikkoa vanhoja naaraspuolisia kateenkorvattomia nude-hiiriä (Harlan, Indianapolis, IN) ympättiin 5 x 10

6 solua päällä molemmissa kyljissä. Kasvainten annettiin ottamaan käyttöön 7 päivää. Hiirten oraalinen letkulla 10 peräkkäisenä päivänä 80 mg /kg /päivä sunitinibille laimennettu natriumsitraattia (pH 4,7, kantaja-aine), tai ajoneuvon [29]. Kasvainten tilavuuden mitattiin kahdessa ulottuvuudessa käyttäen työntömitalla. Hiiret satunnaistettiin ryhmiin, niin että keskimääräinen kasvaimen tilavuus poikki ryhmien oli sama ennen käsittelyä. Kaikille

in vivo

kokeissa kasvainten mitattiin joka toinen päivä 2 mitat ja tilavuudet määritettiin mm

3 kaavalla l × b

2 × 0,52 (jossa l on suurempi halkaisija ja b on pienempi halkaisija kasvaimen). -Hiiriin ruiskutettiin i.p. 2 h ennen tappamista yhdellä annoksella bromideoksiuridiinin (BrdU) 150 mg /kg merkitä soluja S-vaiheessa. BrdU liuotettiin PBS: ään siten, että lopullinen pitoisuus on 30 mg /ml. Histologiset ja immunofluoresenssianalyysillä apoptoosin ja leviämisen suoritettiin 5-uM jääleikkeitä, kuten on kuvattu [25]. Hiiret lopetettiin 21 päivää hoidon jälkeen, tai 24 tuntia kolmannen käsittelyn jälkeen (päivä 4). Kasvaimet leikeltiin ja pakastettiin nopeasti Länsi tai taudille kiinnitettiin 10% formaliinilla ennen parafiiniupotusta.

(A) Kromatiini immunosaostuksella (chip) suoritettiin HCT 116

p53

KO soluissa 15 uM sunitinibihoito 8 ja 12 tuntia. IgG: tä käytettiin kontrollina varten FoxO3a-spesifistä vasta-ainetta. (B) HCT 116 -solut transfektoitiin PUMA reportteri, joka sisältää WT tai mutantti FoxO3a sitoutumiskohdat 16 tuntia, ja sitten sitä käsiteltiin 15 uM sunitinibilla 24 tuntia. Reportteri toimintaa mitattiin lusiferaasianalyysissä menetelmissä kuvatulla tavalla. (C)

FoxO3a

vakaa taintumisen (KD) soluja käsiteltiin kasvavia annoksia sunitinibin 48 tuntia. Apoptoosi analysoitiin ydin- pirstoutuminen määrityksessä. Tiedot saatiin 3 erilliselle kokeelle. **,

P

0,01, KD

vs.

WT. (D) Expression of Mcl-1 tukahdutetaan sunitinibia aiheuttaman apoptoosin HCT 116-soluissa. Solut transfektoitiin Flag-merkityn Mcl-1 16 tuntia, sitten käsiteltiin 15 uM sunitinibilla 48 tuntia. Apoptoosi analysoitiin ydin- pirstoutuminen määrityksessä. Tiedot saatiin 3 erilliselle kokeelle. **,

P

0,01, KO

vs.

WT.

Oikea

, Mcl-1 ilmentyminen vahvistettiin Western-blottauksella. β-aktiini käytettiin verrokkina lastaukseen.

TUNEL ja Immunovärjäys

Histologinen analyysi tehtiin hematoksyliinillä ja eosiinilla värjäystä. Terminal deoxyribonucleotidyl transferaasi -välitteisen dUTP nick end merkinnät (TUNEL) värjäys jääleikkeillä tehtiin rekombinantilla terminaalitransferaasientsyymiä (Roche) ja uUTP-Alexa 594 (Invitrogen) mukaan valmistaa ohjeita, ja vastavärjättiin 4 ’, 6-diamidino- 2-fenyyli (DAPI) pienin muutoksin tehdään parafiini näytteet [25], [30], [31]. Apoptoottisia soluja laskettiin fluoresenssimikroskoopilla in satunnaisesti valittu aloilla, ja apoptoosin indeksi laskettiin prosentteina TUNEL-positiivisten solujen vähintään 1,000 sijoitettiin soluja. BrdU visualisoitiin anti-BrdU- Alexa 594-vasta-aine (Invitrogen) ja tumat näkyviksi DAPI. Lisääntyminen indeksi laskettiin laskemalla soluja fluoresenssimikroskoopissa useilla satunnaisesti valittu aloilla. BrdU-indeksi laskettiin prosentteina BrdU-positiivisten solujen vähintään 1,000 sijoitettiin soluja. Fosfo-AKT, fosfo-FoxO3a ja aktiivinen kaspaasi-3 immunohistokemia suoritettiin, kuten on kuvattu [19].

Apoptoosi määritettiin ydin- pirstoutuminen määrityksessä ja kaspaasien aktivaatio. Kaikki tiedot apoptoosiin saatiin 3 erilliselle kokeelle samalla tyypillinen Western blot on esitetty. (A) HCT 116-soluja käsiteltiin 10 uM sunitinibilla, 5 uM HA14-1, 5 uM Gossypolin, 1 uM ABT-737, 20 MOI Ad-PUMA (0,2 ul /ml) yksinään tai niiden yhdistelmä 48 tuntia. *,

P

0,05, yhdistelmä

vs.

Monoterapiana.

Oikea

, käsitellään kaspaasi-3 havaittiin Western-blottauksella. (B) HCT 116

PUMA

KO-soluja käsiteltiin 12 uM sunitinibilla, 5 uM HA14-1, 5 uM Gossypolin, 1 uM ABT-737, 20 MOI Ad-PUMA (0,2 ul /ml) yksinään, tai niiden yhdistelmä 48 tuntia. *,

P

0,05, yhdistelmä

vs.

Monoterapiana.

Oikea

, käsitellään kaspaasi-3 havaittiin Western-blottauksella. (C) HCT 116 WT ja

PUMA

KO-soluja käsiteltiin 10 uM sunitinibilla, 30 ug /ml 5-FU joko yksinään tai yhdessä 48 tuntia. *,

P

0,05, KO

vs.

WT.

Oikea

, jalostettu kaspaasi-3 havaittiin Western blotting -tekniikalla.

Tilastollinen analyysi

Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttämällä GraphPad Prism IV ohjelmisto. Kaikki P-arvot laskettiin opiskelijan t-testissä, ja P 0,05 pidettiin merkittävänä. Keinot ± yksi keskihajonta (SD) oli esillä numeroin tarvittaessa.

Tulokset

PUMA aiheutetaan Sunitinibi vuonna koolonkarsinoomasoluissa

Ilmaisu PUMA on alhainen useimmissa jännittämättömässä soluja, ja aiheutetaan erilaisia ​​genotoksinen ja genotoksinen korostaa [23]. Määrittämään mahdollinen rooli PUMA in sunitinibin aiheuttama vaste, olemme analysoineet tasot PUMA, p21 ja p53 ennen käsittelyä ja sen jälkeen viiden koolonsyöpäsolulinjoissa. Kolme näistä linjat, HCT 116, RKO ja SW 48 sisältävät WT

p53

taas kaksi riviä HT 29 ja SW 480 sisältävät mutantti

p53

. PUMA aiheutettiin sunitinibille kaikissa viidessä solulinjoissa (Fig. 1A). PUMA induktio oli annoksesta riippuvaa ja esiintyi molemmissa HCT 116 WT ja

p53

Knockout (KO) solut (Fig. 1 B). Pohjapinta tasoilla PUMA olivat alhaisempia

p53

Knockout soluja verrattuna WT soluihin, kuten aiemmin on raportoitu (Fig. 1 B) [15]. p53 ja p21 myös aiheuttama sunitinibihoito.

PUMA

mRNA nopeasti aiheuttama sunitinibi, edeltävän proteiinin induktio (Fig. 1 C ja 1 D). Nämä tiedot viittaavat siihen, että puma on transkriptionaalisesti indusoi sunitinibille riippumaton p53 paksusuolen syöpäsoluissa.

(A)

Vasen

, kasvukäyrä HCT 116 WT ja

PUMA

KO käsitellyt kasvaimet sunitinibilla (Suni, suun kautta letkulla, 80 mg /kg /hiiri, päivittäin 10 päivää) tai vehikkeliä (ve, sitraattipuskuria pH4.7) ja 21 päivää. Kasvaimen tilavuus mitattiin joka toinen päivä. N = 7 ryhmää kohden. **,

P

0,01, WT + Ve

vs.

WT + Suni: *,

P

0,05, WT + Suni

vs. PUMA

KO + Suni.

Righ

t, edustavan kuvan WT ja

PUMA

KO käsitellyt kasvaimet kuten päivänä 21 (B) Sunitinibi aiheuttama PUMA ksenograftikasvaimissa. Tasot ilmoitetaan proteiinien neljän satunnaisesti valitun WT KO kasvainten havaittiin Western-blottauksella. (C) tasot p-AKT ja p-FoxO3a WT kasvaimia 24 tunnin kuluttua kolmannesta annoksesta analysoitiin IHC. Edustavia kuvia näytetään. (D)

PUMA

puute esti sunitinibilla indusoiman apoptoosin ja kasvun hidastuminen ksenograftikasvaimissa. Parafiinileikkeitä HCT 116 kasvaimia 24 tuntia kolmannen injektion jälkeen altistettiin TUNEL ja BrdU-värjäys kvantitoimiseksi apoptoosin ja proliferaatiota, vastaavasti. Indeksi TUNEL-positiivisia tai BrdU-leimattujen solujen laskettiin. **,

P

0,01, WT + Ve

vs.

WT + Suni: *,

P

0,05, WT + Suni

vs. PUMA

KO + Suni.

PUMA sovittelee Sunitinibi aiheuttama apoptoosi

Jotta voidaan tutkia mahdollisen roolin PUMA in sunitinibin: n indusoiman apoptoosin, vertasimme vastaukset HCT 116-solujen kanssa, isogeenisiin

PUMA

knockout (KO) soluihin [15].

PUMA

KO-solut olivat erittäin resistenttejä sunibinib indusoiman apoptoosin (Fig. 2A). Kuten odotettua, kaspaasi-3 ja -9, tai sytosolista vapautuminen sytokromi c tai smac on heikentynyt

PUMA

KO-solut, mutta ei

p53

KO solut (Fig. 2B) . Pitkäaikaisessa pesäkkeiden muodostumisen määritykset,

PUMA

KO soluja tuotetaan yli 4 kertaa enemmän pesäkkeitä kuin WT-solut (Fig. 2C). PUMA oli myös merkitsevästi aiheuttama sunitinibille in

p53

mutantti DLD 1-soluissa, kun taas

PUMA

puutos merkittävästi estänyt sunitinibilla indusoiman apoptoosin ja kaspaasin aktivaatio näissä soluissa (kuvio. 2D). Tutkimme myös tasoja useita BH3 vain proteiineja ja antiapoptoottisten Bcl-2-perheen jäsentä jälkeen sunitinibihoito. Mitään johdonmukaista havaittu muutosta useimmat lukuunottamatta nopeaa Mcl-1 downregulation ja viivästetyn induktio Bim 24 tunnin kuluttua, in HCT 116-soluissa (kuvio. S1A). Kuitenkin vähän tai ei lainkaan Mcl-1 downregulation tai Bim induktio havaittiin DLD1 soluissa (kuvio. S1B). Mielenkiintoista, tasot useita Bcl-2-perheen jäsentä lisääntynyt

PUMA

KO soluja verrattuna WT soluihin, mikä saattaa heijastaa niiden proteaasidegradaatio aktivoitu hoidon aikana ja apoptoosi (kuvio. S1B). Nämä tulokset viittaavat siihen, että PUMA on keskeinen rooli apoptoottisen vastausten sunitinibille paksusuolen syöpäsoluissa.

Mekanismi PUMA indusointi Sunitinibi

PI3K /AKT-reitin on yleinen efektori myötävirtaan useiden kinaasien kohteena sunitinibia. Siksi tutkittiin AKT aktivoinnin aikana kurssin kokeen seuraavan sunitinibihoito, ja löysi AKT de-fosforylaatio muutamassa minuutissa (Fig. 3A). FoxO3a on transkriptiotekijä ja vakiintunut tavoite AKT, ja sen fosforylaatio AKT johtaa inaktivaation ja ydinvoiman syrjäytymistä. Sunitinibihoito johtanut nopeaan de-fosforylaation FoxO3a, mutta ei ollut selvää vaikutusta koko FoxO3a tasossa (Fig. 3A). On huomattava, että muutokset FoxO3a ja AKT-fosforylaation tai

PUMA

mRNA ovat dynaamisia ja ohimeneviä; kun induktio PUMA proteiini on jatkuva ja yhtenäinen eri solulinjoissa (kuviot. 1 ja 3A). Eksogeeninen ilmaus aktiivisen AKT tukahdutti PUMA induktion sunitinibipitoisuutta (Fig. 3B). Induktioon PUMA merkittävästi inhiboitui

FoxO3a

pudotus joko ohimenevä ilmentyminen siRNA tai stabiilin ilmentymisen shRNA sekä WT ja

p53

KO HCT 116-soluissa (kuvio. 3C ja 3D).

p53

KO soluja käytetään vähentämään p53-depedent PUMA induktio transfektiolla.

Seuraava ratkaistava, onko FoxO3a suoraan aktivoi

PUMA

transkriptio kromatiinin Immunosaostaminen (chip) määritys. Kaksi FoxO3a sitoutumiskohdat sijaitsevat ensimmäisessä intronin

PUMA

[19]. Rekrytointi FoxO3a että

PUMA

promoottori sisältää nämä sivustot kasvoi jo 8 tunnin kuluessa sunitinibihoito (Fig. 4A). Käyttäen toimittaja määrityksiä, olemme huomanneet, että mutaatiot FoxO3a sitoutumiskohdat vähentää merkittävästi PUMA toimittaja aktiivisuudesta sunitinibihoito (Fig. 4B). Lisäksi

FoxO3a

stabiileja pudotus solujen havaittiin olevan resistenttejä sunitinibille indusoiman apoptoosin (Fig. 4C). MCL-1 tasot palauttaa

FoxO3a

siRNA sunitinibi-käsitellyissä soluissa (kuviot. 1D ja 3C, S1), mikä viittaa sen hajoaminen saattaa olla ylimääräinen mekanismi sunitinibin aiheuttaman apoptoosin HCT 116-soluissa. Sunitinibi aiheuttama apoptoosin tapahtui muilla CRC alueisiin, mukaan lukien HT29, ja vaimeni yliekspressio Mcl-1 tai Bcl-2 (kuviot. 4D ja S2). Nämä tiedot osoittavat, että FoxO3a säätelee PUMA induktio ja mitokondrioiden väylän sunitinibin aiheuttaman apoptoosin.

BH3 mimetiikka tai Kohonnut PUMA tasot Kiinnitetään koolonkarsinoomasoluissa sunitinibille

Edellä havainnot ennustaa korkeita PUMA , BH3 vain proteiineja, tai pienimolekyylinen BH3 jäljittelijät herkistää syöpäsolut sunitinibille indusoiman apoptoosin. Useat BH3 jäljittelijät kuten HA14-1, gossypol ja ABT-737, ja PUMA adenovirus (Ad-PUMA [15]), kykenivät herkistää HCT 116 solua sunitinibille. Nämä aineet yksinään indusoi vähän tai rajoitetusti apoptoosin (Kuva. 5A). Mielenkiintoista on, BH3 jäljittelijät indusoi merkittävän apoptoosin ja kaspaasin aktivaatio

PUMA

KO soluja yhdistettynä sunitinibilla (Fig. 5A ja 5B). DNA: ta vaurioittavat aineet, kuten 5-FU indusoi PUMA ja Noxa p53 WT-soluissa [14], [32], [33], [34]. 5-FU myös synergized sunitinibilla apoptoosin indusoimiseksi HCT 116-soluissa (kuvio. 5C), joka liittyy parannetun PUMA induktion (kuvio. S3). Tämä synergia heikennetty, mutta ei estetty

PUMA

KO soluja (Kuva. 5C) johtuu ehkä modulaatioina muiden Bcl-2-perheen jäsenten kautta sekä p53-riippuvaisten ja riippumattomien mekanismien. Nämä tiedot osoittavat, että kohonneet PUMA tai BH3 jäljittelijät voivat parantaa apoptoottisia vastauksia sunitinibille jopa apoptoosin-resistentit solut.

PUMA välittää terapeuttinen Vastaukset Sunitinibi ksenograftimalleissa

Sen arvioimiseksi PUMA säätelee terapeuttisen vaikutuksen

in vivo

, WT ja

PUMA

KO HCT 116 solua ihonalaisesti kyljissä BALB /c (nu /nu) nude-hiirten perustaa ksenograftit. Verrattuna ajoneuvoon, sunitinibia hoito johti 62% ja 38% kasvun eston in HCT 116 WT ja

PUMA

KO kasvaimia, vastaavasti (kuvio. 6A). Erot

PUMA

genotyypit olivat tilastollisesti merkitsevä sunitinibi-ryhmässä (P 0,01), mutta ei autossa käsivarteen koskien tehokkuutta tai kasvu kasvaimen laitoksessa (Fig. 6A).

PUMA oli indusoituu merkittävästi WT kasvainten sunitinibilla-käsitellyistä hiiristä (Fig. 6B). Modulaatiot MCL-1, fosforyloidun FoxO3a ja AKT havaittiin myös (Fig. 6B ja 6C). Analysoidaan tuumorisektioiden hiiristä yhden päivän kuluttua kolmannesta sunitinibia hallinto (päivä 4), löysimme huomattavasti matalampi apoptoosin ja korkeampi soluproliferaation

PUMA

KO kasvaimissa verrattuna WT kasvaimia (kuviot. 6D ja S4A). Aktiivinen kaspaasi-3 värjäys vahvisti vähensi apoptoosin

PUMA

KO kasvaimia (-80%), verrattuna WT kasvaimia käsitellä samalla tavoin (kuvio. S4b). Nämä tulokset osoittavat, että hoitovasteen sunitinibille

in vivo

välittyy PUMA-riippuvaista apoptoosia.

Keskustelu

Kehittyvät todisteet osoittavat, että apoptoosin induktio on tärkeä mekanismi erilaisia ​​syöpälääkkeiden [2], [10], [35]. Evasion solukuoleman on tunnusmerkki syövän ja tärkeä tekijä terapeuttisia vastus [2], [3]. Lisäksi hyvin dokumentoituja vaikutuksia Sunitinibin estossa kasvaimen angiogeneesissä [6], [7], [36], [37], työmme osoittaa, että sunitinibi on voimakas pro-apoptoottisen aktiivisuuden koolonkarsinoomasoluissa kautta PUMA induktion kautta transkription tekijä FoxO3a, mutta ei p53, NF-KB p65 tai p53 homologin p73 ja p63. Sunitinibin indusoiman apoptoosin liittyy induktio Bim tai säätelyä alaspäin Mcl-l joissakin koolonsyöpäsolulinjoissa testasimme. Aiemmin työ osoitti osallistuminen Bim ja STAT3 aikana sunitinibilla aiheuttaman apoptoosin muissa solutyypeissä [38], [39], [40]. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että induktio BH3-vasta proteiineista saattaa olla yhteinen mekanismi taustalla sunitinibilla aiheuttama syöpäsolujen tappaminen, jotka saattavat vaikuttaa tilan eri kinaasien, ja eri BH3-vasta proteiinit saattavat olla tärkeitä erilaisissa solutyypeissä.

useita valikoivia VEGFR-estäjien havaittiin myös aiheuttavan PUMA ja apoptoosin koolonkarsinoomasoluissa (tietoja ei ole esitetty), joka tukee ei-angiogeeninen rooli anti-VEGFR hoitoja. On tärkeää määrittää, onko sunitinibia aiheuttama apoptoosin välittyy PUMA tai muiden BH3 vain proteiineja muita kiinteitä kasvaimia, kuten munuaisten syöpään ja GIST, ja niiden mahdollinen rooli apoptoottisen vastauksia muihin VEGFR ja PDGFR estäjiä. Vähentynyt herkkyys sunitinibille ehdotettiin linkitetään mutaatioiden

KIT

tai

VEGFR /FDGFR

tai muissa RTK sekä vähentynyt ilmentyminen liukoisen VEGF-reseptorien (sVEGFs) [6], [7], joka voi estää solukuoleman tai edistää eloonjäämistä [2], [5]. Lisäksi, tuumorin angiogeneesin tai muita komponentteja mikroympäristössä voivat epäsuorasti aktivoida solukuolemareittejä [2]. Käyttö isogeenisten solulinjojen kuten teimme tässä voisi olla erityisen hyödyllinen ymmärtämisessä huumeiden tavoitteet ja mekanismit [41].

Huolimatta jännitystä kehittämisessä aineiden kohdistaminen onkogeenisten kinaasien, kliiniset tiedot osoittavat, että suurin osa näiden aineiden ovat yleensä tehokkaita ainoastaan ​​vähäinen osa potilaista [4], [5]. Yksi merkittävä muutos on tunnistaa biomarkkerit auttaa potilasta valintaan ja kerrostumista. Tuloksemme osoittivat, että PUMA jatkuu 24-48 tunnin kuluttua sunitinibihoito. Sen sijaan, inhibitio AKT /FoxO3a on ohimenevä ja palauttaa tunteina, johtui todennäköisesti toisen ja selviytymistä yrittää kasvaimen aktivaation jälkeen apoptoottisten signalointia. Nämä havainnot mahdollisesti selittävät, miksi ylävirran molekyylejä ovat vähemmän sopivia biomarkkereina, ja ehdottaa modulaatio mitokondrion kuoleman polku saattaa olla hyödyllisempi lukema yleisestä terapeuttista aktiivisuutta syöpälääkkeiden.