Krooninen sairaus

tiivistelmä

Hiiri on kehitetty tutkimaan peräsuolen syövän etiologiasta ja arvioida uusien syöpälääkkeiden. Vaikka geneettisesti ja karsinogeeni aiheuttama hiirimalleihin ovat antaneet tärkeää tietoa osalta mekanismeista onkogeenisel- prosessi, -tuumoriksenografti mallit pysyvät standardin arviointia varten uuden kemoterapiaa ja kohdennettuja lääkehoitoja kliiniseen käyttöön. On kuitenkin epäselvää, missä määrin irrotetut peräsuolen kasvain kudosten säilyttää luontainen patologisia piirteitä ajan. Tässä tutkimuksessa olemme tuottaneet paneeli 27 potilaasta peräisin kolorektaalisyöpä eksplanttien (PDCCEs) suoralla Ihmiskudosten kolorektaalisyövän kudosten osaksi NOD-SCID-hiirissä. Käyttämällä tätä paneeli, teimme vertailun histologian, geenien ilmentyminen ja mutaatiostatus välillä PDCCEs ja alkuperäinen ihmisen kudoksia, josta ne on johdettu. Meidän havainnot osoittavat, että PDCCEs säilyttää keskeiset histologisia piirteitä, perus geeniekspressiomalleja ja

KRAS Twitter /

BRAF

mutaatiostatus läpi useita kohtia. Kaiken kaikkiaan nämä havainnot viittaavat siihen, että PDCCEs säilyttää samankaltaisuus potilaalle kasvain, josta ne on johdettu, ja ne voivat olla mahdollisesti ollakseen luotettava prekliininen malli, joka voidaan sisällyttää tulevia strategioita optimoida yksittäisille potilaille, joilla peräsuolen syöpä.

Citation: Uronis JM, Osada T, McCall S, Yang XY, Mantyh C, Morse MA, et al. (2012) Histologinen ja Molecular arviointi potilaasta peräisin peräsuolen syövän Eksplan-. PLoS ONE 7 (6): e38422. doi: 10,1371 /journal.pone.0038422

Editor: Alana L. Welm, Huntsman Cancer Institute, University of Utah, Yhdysvallat

vastaanotettu: 08 maaliskuu 2012; Hyväksytty: 09 toukokuu 2012; Julkaistu 4. kesäkuuta 2012

Copyright: © 2012 Uronis et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta ohjasivat Research Scholars Grant (119824-MRSG-10-195-01-TBG) American Cancer Society (www.cancer.org). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on kolmanneksi yleisin syöpä ja toiseksi yleisin syy syövän kuolemaan Yhdysvalloissa. Vuonna 2010 noin 142000 ihmistä oli diagnosoitu CRC, ja noin 40% näistä potilaista oli edennyt sairaus [1]. Hoito kehittynyt CRC kemoterapiaan on tyypillisesti tarkoitettu tautien torjunnan ja palliaation oireita vain, ja sen seurauksena, leikkaushoitoon CRC edelleen parantumaton sairaus. Parantaakseen hoitotuloksia ja kehittää uusia hoitomenetelmiä, kehittämällä luotettavan prekliinisen malli tutkia CRC biologian ja lääkeherkkyyksiä tarvitaan.

Hiiri malleja CRC edelleen yksi eniten hyödyllisiä työkaluja tulkita biologiseen mekanismit onkogeenisel- prosessi. Tähän mennessä erilaisia ​​geenitekniikalla, karsinogeeni aiheuttama ja ksenografti hiiri malleja on perustettu [2], [3] ja se on yleensä sovittu, että kukaan mallia riittää valaista kaikilla CRC verestä.

geneettisesti hiiri (GEM) mallit ovat olleet korvaamattomia perustamisessa roolia monien eri geneettisten mutaatioiden ja signaalitransduktioreaktioteiden edistää onkogeenisel- prosessia ja mahdollistavat tutkimuksen yhteydessä aktiivisen immuunijärjestelmän [2], [3]. Kuitenkin monet näistä GEM malleja, ensisijaisesti ne, joihin liittyy mutaatio

APC

kasvainsuppressorigeenin, kehittää kasvaimia, ohutsuolessa sijaan paksusuolen. Tämä tekee pitkittäinen taudin etenemistä tutkimukset vaikea lisäksi puuttuu geneettisen monimutkaisuuden havaittu ihmisen syövissä [2], [3].

Toinen laajalti käytetty hiiri malleja CRC nojautuu käyttöä syöpää aiheuttavan peräsuolen kasvainten kehittymiseen . Ehkä yleisimmin käytetty karsinogeeni perustuva malli on azoxymethane (AOM) malli. Tässä, paksusuolen ja peräsuolen kasvainten kehittymiseen aloitetaan AOM, joka on voimakas, paksusuoli-spesifinen syöpää aiheuttavaksi muodostamalla DNA-additiotuotteiden [4]. Kolorektaalituumorien johdettu käyttämällä tätä mallia kerrata keskeiset ihmisen patologisia piirteitä saaneilla ihmisillä ja mahdollistavat tutkinnan alkuvaiheessa CRC. Kuitenkin kasvaimen aloittaminen ja kehittäminen on aikaa vievä prosessi, usein ottaen jopa 6 kuukauden kasvainten lukumäärää ja penetrance riippuen voimakkaasti hiirikannasta [2], [5], [6].

Vaikka GEM ja karsinogeeni -pohjainen mallit ovat huomattavasti korkeampia tietomme genetiikan ja etiologia CRC, nämä mallit eivät salli tarkkaa testaus syöpähoitojen käytettäväksi kliinisessä [7]. Laajimmin käytetty

in vivo

malli testaukseen syövän huumeiden tehoa ja yhdistelmiä on ksenograftimallissa. Historiallisesti, ksenografteissa on perustettu läpi ihon alle geneettisesti määritelty ihmisen solulinjat osaksi heikentyneisiin nude-hiirissä [8]. Tähän mennessä suurin osa näistä cell line-pohjainen ksenograftimalleissa ovat epäonnistuneet tuottamaan lääkkeen arkaluonteisuuden data, joka näkyy kliinisesti merkityksellisiä tietoja, [7]. Lisäksi tuoreet raportit viittaavat siihen, että kasvaimeen stroomavuorovaikutuksiin ole läsnä solulinjassa-pohjainen ksenografteissa voi olla erottamaton osa onkogeeninen ja kasvaimen lääkevaste [9], [10]. Näin ollen viime aikoina, koko-kudosviljelyistä peräisin ihmisen syövissä, mukaan lukien rinta- [11], keuhkosyöpä [12], eturauhassyöpä [13] ja peräsuolen syövän [14] – [16] on perustettu yritetään tuottaa enemmän kliinisesti tarkka ja luotettava ksenograftimalleissa. Kuitenkin nämä tutkimukset tutki pääasiassa varhain passage eksplanttien ( 5 sukupolvet) alkaen pääasiassa ensisijainen kasvaimia ja näin ollen on edelleen tarvetta luonnehtia näitä malleja ja arvioida, miten hyvin ne säilyttävät tärkeitä ominaisuuksia alkuperäisen ihmisen kasvain erityisesti etäpesäkkeitä.

H 10 korkea powered kentät per jakso. Kasvaimen tumat arvioitiin CDX-2 värjäyksen käyttämällä tavanomaista määrällinen asteikolla 0, 1+, 2+ ja 3+. Värjäys kasvain ytimien klo 2+ ja 3+ pidettiin positiivisena ja kaikissa tapauksissa pitää positiivisena näytteillä vähintään 20% kasvaimen ytimien kanssa värjäystä.

Oncogene Mutaatioanalyysi

Perimän DNA eristettiin snap jäädytetty PDCCE kudoksia käyttäen Qiagen genomista DNA eristyspakkausta. Näytteet laimennettiin 10 ng /ul, ja PCR suoritettiin käyttäen seuraavia alukkeita

KRAS

: eteenpäin 5 ’GTGTGACATGTTCTAATATAGTCA 3’; reverse 5 ’GAATGGTCCTGCACCAGTAA 3’ ja

BRAF

: eteenpäin 5 ’TCATAATGCTTGCTCTGATAGGA 3’; reverse 5 ’GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA 3’. Amplikonit sekvensoitiin tavanomaisilla menetelmillä käyttämällä eteenpäin-alukkeita.

Microarray Analysis

RNA eristettiin snap-jäädytetty PDCCE kudoksia käyttäen Qiagen RNA /DNA Allprep kit, muunnetaan cDNA: n ja leimatun yksi sykli IVT. IVT leimattua cDNA valmistettiin valmistajan ohjeiden ja tavoitteet hybridisoitiin ihmisen U133A 2.0 GeneChip- ja lukea koskevasta Affymetrix array skanneri. Raakadataa muutettiin. CEL-tiedostot ja RMA normalisoida. CEL-tiedostot (GSE35144) ovat saatavilla Gene Expression Omnibus (GEO) tietovarasto (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Voit tarkistaa näytteen vieraita havaintoja ja erän vaikutukset, 3D pääkomponenttianalyysi maailmanlaajuista geenin ilmentyminen suoritettiin. Erä vaikutuksia normalisoitiin käyttämällä Combat algoritmia (https://jlab.byu.edu/ComBat/) [18]. Valvomaton hierarkkinen klusterointi ihmisen kasvaimia ja vastaavat PDCCEs suoritettiin 20% geenien kaikella variaatiokerroin. Agglomerative klustereita luotiin käyttäen Pearsonin korrelaatiokerroin ja täydellinen sidos käyttäen R-ohjelman (R Foundation for Statistical Computing).

Ohjelmisto Käytetään Analysis

R tilastollinen ohjelmistopaketti on saatavilla osoitteessa www .r-project.org. Bioconductor R paketti on saatavilla osoitteessa www.bioconductor.org. Combat on saatavana R käsikirjoituksen https://jlab.byu.edu/ComBat/. Graphpad Prism on tuote GraphPad Software (La Jolla, CA, USA) ja se on saatavilla osoitteessa www.graphpad.com/prism/prism.htm.

Tulokset

histologinen arviointi PDCCEs

paneeli 27 potilaasta peräisin kolorektaalisyöpä eksplanttien (PDCCEs) suoralla Ihmiskudosten peräsuolen syöpä (CRC) kudosten osaksi NOD-SCID luotiin tässä tutkimuksessa. Taulukko 1 esittää alkuperä potilaan kasvaimen ja yhteensä 5 ensisijaisen PDCCEs ja 22 metastaattinen PDCCEs luotiin. Sen arvioimiseksi, missä määrin

in vivo

malleja potilaasta johdettujen kolorektaalisyöpä eksplanttien (PDCEEs) tarkasti kerrata ja voi näin ollen toimia mallina ihmisen kunnossa, me tutkimme, PDCCEs säilyttävät keskeiset biologiset ominaisuudet luonnostaan ​​yksittäisille ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syöpiä (CRC) ajan. Ensinnäkin, arvioida, missä määrin histologinen parametrit säilyvät jälkeen ksenotransplantaatiolla, kaksi riippumatonta PDCCEs siirrostettiin kautta 10 sukupolvea ja arvioitiin histologisesti. Molemmat PDCCEs tutkittujen näytteillä patologisia piirteitä huomattavan yhdenmukainen alkuperäisen potilaan kasvain kautta 11 sukupolvea (kuva 1). Seuraavaksi kattava histologinen arviointi suoritettiin alapaneelin 15 sovitetun PDCCEs ja alkuperäinen kallisteta kudoksissa paljasti, että 15/15 PDCCEs säilyttänyt patologisia piirteitä samanlaisia ​​kuin sovitetussa ihmisen kasvainten ja luonnehdittiin histologisesti identtinen yhteensopivien alkuperäiseen varastoitujen näyte (Taulukko 2). Senkin jälkeen, kun 11 sukupolvea, PDCCEs säilyi kyky muodostaa rauhaset ja sisälsi CDX-2 positiivisia ytimet verrattavissa ensimmäisen sukupolven PDCCEs (kuvio 2). Nämä tiedot osoittavat, että histologisia piirteitä läsnä peräsuolen syöpä, mukaan lukien muodostuminen rauhaset ja läsnäolo peruskudoskomponentit säilyvät myös myöhään passage eksplantaateissa, mikä viittaa siihen, että toisin kuin CRC solulinja johdettu ksenografteissa, The PDCCE malli antaa meille tutkimus työkalu, esitetään yhteenveto ihmisen kunnossa yleensä ole havaittu muissa malleissa.

PDCCEs Säilytä Basic Global geeniekspressioprofiilien Luonnostaan ​​Human kolorektaalisyövissä

Seuraavaksi edelleen arvioida, missä määrin PDCCEs edustaa niiden ensisijainen ihmisen kollegansa kartoitettiin 27 Hyväksytty potilaan kasvaimia ja PDCCEs microarray analyysi. Potilaan kasvain ja PDCCE geenien ilmentyminen tietoja ensin normalisoitiin käyttämällä torjumiseksi minimoimiseksi erän vaikutuksia. Valvomatta hierarkkinen klusterointi analyysi suoritettiin sitten normalisoitu datasarjan ja paljasti kolme erillistä klustereita (kuva 3). 27 Hyväksytty potilaan kasvain ja PDCCEs, 22 paria (81%) laski saman klusterin perustuu dendrogrammissa 18 PDCCEs (66%) ryhmittyneet suoraan alkuperäisestä kasvaimesta näyte. Kaiken kaikkiaan nämä tiedot viittaavat siihen, että perus globaali geeni-ilmentymisen kuviot säilyvät välillä PDCCEs ja alkuperäiseen ihmisen kollegansa.

onkogeenimutaatiota tila säilyy PDCCEs

Jos potilaalla on kehittynyt peräsuolen syövän, testaus mutaatio aseman onkogeenien kuten

KRAS

tarvitaan ohjaamiseen hoitoa. Erityisesti potilaat, joilla on

KRAS

mutaatioita osoita mitään hyötyä hoidon EGFR: n estäjien kuten setuksimabi tai panitumumabi, kun taas potilaat, joiden kasvaimet ovat

KRAS

WT hyötyvät EGFR hoitomuodot [19] , [20]. Sen määrittämiseksi, ovatko nämä kliinisesti merkittäviä genomista parametrit säilyvät PDCCEs, 27 Hyväksytty PDCCEs ja alkuperäinen potilaan analysoitiin

KRAS

ja

BRAF

mutaatiostatus. 27 pareittain arvioitiin 13 esittelyyn aktivoimalla

KRAS

mutaatioita (kodoni 12 = 11; Kodonissa 13 = 2) (taulukko 3). Näistä 27 pareittain, 26/27 PDCCEs (96%) sovitetun alkuperäisessä ihmisen vastine viittaa siihen, että paksu- ja peräsuolisyövän kudoksiin ylläpidetään hiiri PDCCEs ovat geneettisesti vakaita ja säilyttää onkogeenisten mutaatio aseman kriittinen CRC patofysiologiaan. Kaikki näytteet olivat kielteisiä

BRAF

mutaatioita. Kaiken kaikkiaan nämä tiedot viittaavat siihen, että PDCCEs säilyttää biologisesti monimutkainen histologinen, geenien ilmentyminen ja mutaatio-pohjainen ominaisuuksien havaittu ihmisen CRC.

Keskustelu

Tähän mennessä useita hiiren ksenograftimalleissa on perustettu tutkia CRC etiologian ja hoidon. Suurelta osin, nämä mallit on luotu käyttämällä myöhään passage solulinjoja peräisin ihmisen CRC ja vaikka merkittävää hoidon aiheuttamaa tuumorivasteita havaittu näissä malleissa, ne ovat harvoin ennakoivan kasvaimen vasteen ihmispotilaille [7]. Tämä johtuu todennäköisesti siitä, näissä malleissa, ainakin osittain, luontaisesta puutteesta strooman in kasvain- epiteelisolujen linjat. Asennus todisteet osoittavat, että paracrine signalointi ja soluväliainekomponenteista toimittamat naapurina stromasoluja on merkittävä rooli kasvaimia synnyttävän potentiaalin kolorektaalisyöpää ja että modulaatio näiden strooman vuorovaikutusten vaikuttavat suoraan tehoon kemoterapiaa kasvaimen vasteen [9], [10].

Viimeaikaiset on yritetty tuottaa hiiren ksenograftimalleja CRC suoraan transplantaation ihmisen paksusuolen tuumorien heikentyneisiin hiirissä [14] – [16], [21]. Poupon ja työtovereille raportoitu, että kulkua ihmisen paksusuolen syövän kudosten läpi ksenograftin vaiheessa parantaa huomattavasti onnistumisprosentti solulinjan derivointi ihmisen CRC etäpesäkkeitä [15]. Viime aikoina, Hohenadl ja työtoverit raportoitu, että histologisia ominaisuudet ja onkogeenin ilmentymisen tasot säilyvät alussa passage CRC-ksenografteja [21], kun taas Fichtnerin et al., Ja Messersmith et ai, käytetään paneelit 15 ja 10 ihmisen CRC eksplantaatteja vastaavasti arvioida lääkeaineen herkkyys [14], [16]. Lisäksi nämä tutkimukset käytetty potilaasta johdettujen eksplanttien lähinnä ensisijainen päällä ja kun etäpesäkkeitä yleensä aggressiivisempia ja ovat todennäköisesti erottaa, jää epäselväksi, jos PDCCEs syntyvät metastaasien säilyttäisi samankaltaisuus alkuperäisestä kasvaimesta. Vaikka nämä tutkimukset ovat alkaneet korostaa arvoa explant malleja CRC tutkimukseen, kattavampi histologista ja molekyylitason analyysi suuremmassa paneelissa ihmisen CRC kudosviljelmiä tarvitaan perustella käytettäväksi prekliinisessä mallissa suorittaa tarkka lääkkeen tehon analyysi ja ennakoivan biologisten merkkiaineiden tunnistamiseen.

tässä tutkimuksessa osoitamme, että PDCCEs oli tuotettu ihmisen adenokarsinoomia vaihtelevalla histologinen tarjolla säilyttävät kukin parametrit kasvaimen, josta ne on johdettu on histologinen, maailmanlaajuinen RNA ilmaisun ja onkogeenimutaatiota tasolla. Huolimatta eroista prosenttiosuuden kasvain strooman välissä alkuperäisen ihmisen kudoksissa ja ne ksenosiirrettyjä hiiriin, tutkimuksemme keskittyy pahanlaatuisia epiteelisolujen. Ensimmäinen, histologinen arkkitehtuuri ominaista peräsuolen adenokarsinooma, ensisijaisesti kyky muodostaa dysplastic rauhasia sekä läsnäolo CDX-2 positiivisia ytimien ylläpidetään PDCCEs koko useita kohtia ( 10). Seuraavaksi verrataan geeniekspressioprofiilien välillä täsmäsi PDCCEs ja sen vastaavat potilaan kasvaimen ja havaittu, että 18/27 (66%) näytteistä ryhmitelty suoraan yhteen ja 22/27 (81%) ryhmittyneet sisällä suuria klusterin määritelty dendro- .

spekuloida, että 9 PDCCE näytteet, jotka eivät klusterin suoraan niiden vastaavien alkuperäisestä kasvaimesta on saattanut johtua luontaisesta epäyhtenäisyys CRC. On todennäköistä, että alkuperäisen CRC kasvain näytteet Vastaavista 9 PDCCEs kanna pieni osapopulaatiosta käytetään täydentäviä onkogeenisia tapahtumia. Tämä puolestaan ​​antaa kasvun etu, että nämä populaatiot jälkeen istutetaan hiiren aiheuttaen PDCCE olevan erilainen geneettinen koostumus kuin alkuperäinen kudokseen, josta se on peräisin. Tämän tukemiseksi käsitystä, näyttää siltä, ​​että suurin osa vaihtelua primaarikasvaimen ja sen PDCCE esiintyä alussa PDCCE kohtia ja että vähemmän vaihtelua tapahtuu prosessin kautta johtamisella. Esimerkiksi PDCCE CRC105 ryhmittyneet alkuperäisen potilaan näytettä PDCCE kanavat 1 ja 11, kun taas PDCCE CRC149 ei klusterin sen alkuperäisen näytteen joko passage 1 tai 5 viittaa siihen, että geneettisiin muutoksiin pääasiassa alussa käytäviä ja ylläpidetään myöhemmin kohtia. On myös mahdollista, että nämä 9 näytettä, voi olla suurempi strooman saastuminen johtaa ero niiden klusterointi kuvio. Nämä tulokset viittaavat siihen, että on todellakin olemassa luontaisia ​​eroja Hyväksytty potilaan kasvain ja PDCCE ja ekstrapoloinnit vetää näitä malleja on tehtävä niin huolellisesti. Kuitenkin yleinen meidän havaintojen mukaan PDCCE mallissa on potentiaalia käytettäväksi tutkimuksessa uusien terapeuttisten aineiden, jotka kohdistuvat sekä pahanlaatuinen epiteelituumori arkkitehtuuria ja /tai strooman komponentti ja että PDCCEs voidaan säilyttää 10 tai useamman sukupolven säilyttäen avaimen histologisia parametreja.

Lopuksi arvioitiin

KRAS

ja

BRAF

mutaatio aseman PDCCEs ja osoitti, että tilan kaikki yhtä lukuun ottamatta onkogeenimutaatiot säilytettiin. Havaitsimme yhdessä tapauksessa (CRC020), jossa

KRAS

aktivoiva mutaatio oli läsnä PDCCE, mutta ei havaittu alkuperäisessä potilaan näytteet huolimatta siitä, että nämä näytteet ryhmittyivät yhteen ilman valvontaa klusterianalyysillä. On erittäin todennäköistä, että pieni, huomaamaton väestö

KRAS

mutanttisoluihin oli läsnä potilailla kasvain aikaan kirurgisen resektion ja että kasvu etu mukaan

KRAS

aktivointi sallittu myöhempää laajentaminen

KRAS

mutanttisoluista alkupuolella PDCCE kohtia.

Vaikka mikään yksittäinen hiirimallissa koskaan täysin kerrattava todellinen havainnot potilailla, käyttö nonkliinisissä on tarpeen ja käytännöllistä kehittämiselle terapeuttisten aineet ja biomarkkereita ja ratkaiseva ensimmäinen askel tavoitteessa näiden aineiden klinikalle. Emme ymmärrä rajoituksista mallimme ja että toteamus on tehtävä tiukat testit arvioida tarkkuutta, luotettavuutta ja toistettavuutta ja on myös jälkikäteen validoitu monipotilasharjoitusta näytteissä. Kuitenkin mielestämme meidän prekliinisissä hiirimallissa on potentiaalia voidaan tunnistaa ja testata uusia yhdistelmiä terapeuttisten aineiden sekä myös kehittää sekä ennakoivaa ja prognostisia biomarkkereita, jotka sitten voidaan systemaattisesti synnytti osaksi kliinisessä ympäristössä.

Kiitokset

kirjoittajat haluavat kiittää Duke mikrosirulla ydin laitokseen keräämiseen microarray data.