Krooninen sairaus

tiivistelmä

Sarka adjuvantti kemoterapian virtsarakon siirtymä- solukarsinoomat (TCC: t) voivat aiheuttaa voimakasta systeemistä toksisuutta ja paikallista ärsytys. Myrkytön resveratroli inhiboi TCC solujen kasvua, mutta sen toteutettavuus kliinisissä hallintaan TCC: t edelleen epäselvä. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli arvioida turvallisuutta ja anti-TCC tehoa resveratrol käyttäen kokeellisissa malleissa lähemmäksi kliinisen hoidon edellytys. Ihmisen TCC EJ solut altistettiin 100 uM, 150 uM ja 200 uM resveratrolin vastaavasti 1 tunti ja 2 tuntia matkia rakonsisäistä lääkkeen tiputusta ja soluvasteita analysoitiin useita kokeellisia lähestymistapoja. Ortotrooppinen TCC nude-hiirimallissa määritettiin ruiskuttamalla EJ solut osa-urothelial kerrosta ja käytetään lyhyen aikavälin rakkoon resveratrolin tiputuksen. Turvallisuutta resveratrolin tiputusta arvioitiin ja verrattiin MCC. Tulokset paljastivat, että 2 tuntia 150 uM tai 200 uM resveratrolin hoidon lyijyä merkittäviin S vaiheen pysähtymisen ja apoptoosin 72 tunnin ajan pisteen, johon liittyy heikennettyjen fosforylaatio, tumaansiirtymiseen ja transkription STAT3, alas-säätely STAT3 alavirran geenien (surviviinista, cyclinD1, c-Myc ja VEGF) ja ydinvoiman translokaatiot sekä SIRT1 ja p53. Tärkeys STST3 signaloinnin solujen kasvua vahvistettiin käsittelemällä EJ soluja JAK2 estäjän tyrfostiinin AG490. Tehoa ja turvallisuutta resveratrolin tiputtamisen oli näytetty toteen havaintojen nude mouse potilaalle tehdä ksenograftimalleja, koska tämä hoito aiheutti kasvun hidastuminen, erottuva apoptoosin ja STAT3 inaktivoitumisen siirrettyjen kasvainten vaikuttamatta normaaliin uroteeliin. Tuloksemme viittaavat siten siihen ensimmäistä kertaa käytännön arvoja resveratrol kuin turvallinen ja tehokas agentti postoperatiivisen hoitoon TCC: t.

Citation: Wu ML, Li H, Yu LJ, Chen XY, Kong QY Song X, et al. (2014) Lyhyen aikavälin resveratrolin altistuminen aiheuttaa

In vitro

ja

In vivo

kasvunestomenetelmää ja apoptoosi virtsarakon syövän solut. PLoS ONE 9 (2): e89806. doi: 10,1371 /journal.pone.0089806

Editor: Irina V. Lebedeva, Columbia University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 26 elokuu 2013; Hyväksytty: 24 tammikuu 2014; Julkaistu: 25 helmikuu 2014

Copyright: © 2014 Wu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukee avustuksia National Natural Science Foundation of China (nro. 81272786, 30971038, 81071971 ja 81072063) ja Research Fund for PhD valvojien National opetusviraston of China (20122105110005). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Virtsarakon syöpä on yleisin maligniteetti virtsateiden, joista 90% on siirtymäkauden cell carcinoma (TCC). Höyläysleikkaus seurasi rakkoon kemoterapia standardi hoito TCC potilaista [1]. Toistuminen on johtava riski TCC potilaille, koska on vaikea radikaalisti poistaa aggressiivinen kasvaimia [2]. Näin ollen adjuvantti rakkoon solunsalpaajahoitojen tullut merkittävä lähestymistapoja estämään TCC uusiutumisen. Bacillus Calmette-Guerin, interferoni-α, sisplatiini, mitomysiini C (MMC) ja niiden yhdistelmiä käytetään tavanomaisesti kliinisessä käytännössä, kun taas niiden tehot vaihtelevat [3], [4] ja yleensä aiheuttaa voimakasta systeemistä toksisuutta ja paikallista komplikaatioiden, kuten aivoverenvuotoon kystiitti [2]. Siksi on kiireesti tutkia vähemmän myrkyllisiä ja tehokkaampi lähestymistapa parempaan hallintaan TCC: t.

resveratrolin on pidetty myrkytön polyfenoliyhdistepitoisuus että löydetty viinirypäleitä, marjoja, pähkinöitä ja punaviiniä [5 ]. Elin on näyttöä siitä, että resveratroli kykenee estämään kasvua moniin syöpiin, kuten leukemia, rintasyöpä ja ensisijainen aivokasvaimet [6] – [8]. Siinä tapauksessa, virtsarakon syöpien, resveratroli tehokkaasti vähentää solujen elinkelpoisuuden ja indusoi apoptoosia ihmisen ja hiiren virtsarakon syövän soluissa [9] – [12]. Kuitenkin käytännön arvo resveratrolin anti-TCC-hoitoa ei ole käsitelty käyttämällä enemmän kliinisesti merkitsevää kokeellinen malli (t) ja sillä tavalla paikallisen lääkkeen annostelun. Nykyisessä tutkimuksessa ihmisen TCC solulinja, EJ [13], käsiteltiin lyhyellä aikavälillä resveratrolin matkimaan kliinisessä tiputtamisen [14]. Solu- ja molekyylitason vasteet EJ solujen käsittelyä analysoitiin useita lähestymistapoja. Samaan aikaan, joka on potilaalle tehdä TCC nude-hiirimallissa määritettiin ruiskuttamalla EJ solut osa-urothelial kerroksen ja hoitaa resveratrol tavalla samanlainen rakonsisäistä lääkkeen tiputusta [15]. Solu- ja molekyylitason vastauksia näihin hoitoihin arvioitiin sen jälkeen.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja Hoidot

Ihmisen TCC EJ soluihin [13] viljeltiin Dulbeccon muokatussa Eaglen essential medium (DMEM), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (Gibco Life Science, Grand Island, NY, USA) mukaisesti 37 ° C: ssa ja 5% CO

2 olosuhteissa. Solut (5 x 10

4 /ml) maljattiin viljelymaljoihin (NUNC, Tanska) ja inkuboitiin 24 tuntia ennen kokeita.

resveratrolin (Res; Sigma Chemical, Inc., St. Louis , MO) liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO, Sigma) ja laimennettiin elatusaineeseen työ- pitoisuudet juuri ennen käyttöä. Solut normaaleissa viljelyolosuhteissa, käsiteltiin 0,2% DMSO ja altistettiin 100 uM Res 48 h käytettiin normaalia, tausta ja tehoa valvontaa, vastaavasti. Kuten on esitetty kaaviossa (kuvio 1A), EJ-soluja käsiteltiin 100 uM, 150 uM tai 200 uM Res 1 h, 1,5 h ja 2 h 24 tunnin välein. 1 tunnin kuluttua ja 2 h hoitoja, Res sisältävä media korvattiin normaali väliaineen päälle 3 pesua. Näin ollen, EJ solut altistettiin eri pitoisuuksia Res 3 kertaa (kerran päivässä) aikana 72 tunnin kokeessa (kuvio 1A). Solujen lukumäärät ja elinkykyisyyksiä tarkastettiin 12 tunnin välein. Solu-laakeri peitelaseja fiksoitiin kylmässä asetonissa tai 4% paraformaldehydillä (pH 7,4) morfologiset ja immunosytokemiallisia tutkimukset. Koeryhmiin asetettiin kolmena kappaleena ja kokeet toistettiin kolme kertaa perustaa luottamuksellisten johtopäätökseen.

. Kaavakuva lyhyen aikavälin in vitro resveratrol hoidossa. B. MTT-määritys suoritettiin 72 tunnin kuluttua hoitojen osoitti, että lyhytaikainen resveratrolin altistuminen väheni solujen elinkelpoisuuden ja tukahdutti EJ solukasvua ja ajasta riippuvaisella tavalla. * Verrattuna N-ryhmän,

P

0,01; ** Verrattuna keskuudessa 100pM, 150 uM ja 200 uM Res saaneissa ryhmissä 1,5 h ja 2,0 h,

P

0,01; # Verrattuna 1 h 150 uM Res hoito,

P

0,05; $ Verrattuna 1 h 200 uM Res hoito,

P

0,05; ##, Verrattuna 1 h 100 uM Res hoito,

P

0,05.

∧ verrattuna keskuudessa 1,0 h, 1,5 h tai 2,0 h 100 uM Res-hoidetuilla ryhmillä,

P

0,01; , verrattuna keskuudessa 1,0 h, 1,5 h tai 2,0 h 150 uM Res-hoidetuilla ryhmillä,

P

0,01;

∧∧ verrattuna keskuudessa 1,0 h, 1,5 h tai 2,0 h 200 uM Res-hoidetuilla ryhmillä,

P

0,01. C. H ++), kun merkinnöistä oli vahvempi tai selvästi vahvempi kuin (++). Immunofluoresenssivärjäystä (IF), solun joissa peitinlasit huuhdottiin fosfaattipuskuroidulla liuoksella (PBS; pH 7,4) ja 3 kertaa, blokattiin 10% vuohen seerumilla PBS: ssä (pH 7,4) 20 minuutin ajan, inkuboitiin yön yli primaarisen vasta-aineen vastaan kohdeproteiinin ja lopuksi yhteistyössä inkuboitiin fluoresenssi-leimattua vuohen anti-kani tai kanin anti-hiiri-IgG (1:200; Santa Cruz Biotechnology, Inc) 37 ° C: ssa 60 minuutin ajan pimeässä. Tumat leimattiin DAPI (sininen fluoresenssi). Peitinlasit havaittiin ja valokuvattiin fluoresenssimikroskoopilla (BX53F, Olympus, Japani).

Protein valmistelu ja Western blotting

Yhteensä solun proteiinien valmistettiin soluista erilaisissa viljelyolosuhteissa [20] . Näytteen proteiinit (50 ug /kuoppa) erotettiin 10%: natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi ja siirrettiin polyvinylideenidifluoridi kalvo (Amersham, Buckinghamshire, UK). Membraani blokattiin 5% rasvatonta maitoa TBS-T: n (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl: a ja 0,5% Tween 20: tä) 4 ° C: ssa, huuhdottiin 10 minuuttia kolme kertaa TBS-T, minkä jälkeen 3 h huoneenlämpötilassa inkuboinnin ensimmäisen vasta-aineen ja sitten 1 tunnin inkuboinnin HRP-konjugoidun anti-hiiri- tai anti-kani IgG: tä (Zymed Lab, Inc.). Sitoutunut vasta-aine havaittiin käyttäen parannetun kemiluminesenssi-järjestelmä (Roche GmbH, Mannheim, Saksa). Poistamisen jälkeen merkintöjä signaalin inkuboimalla strippaamalla puskurilla [8], kalvo uudelleenseulottiin muiden vasta-aineiden yksi kerrallaan, kunnes kaikki parametrit tutkittiin.

inhibitio STAT3 Aktivointi AG490

JAK2-spesifinen estäjä AG490 (Sigma) [21], liuotettiin DMSO: hon ja laimennettiin lopulliset pitoisuudet 50 uM ja 80 uM kasvualustalla. Neljä koeryhmään vahvistettiin seuraavasti: Ryhmä 1, normaali kulttuuri; Ryhmä 2, käsittelemällä 1,2 ‰ DMSO tausta valvonta; Ryhmät 3 ja 4, käsittely 50 uM tai 80 uM AG490. Vaikutukset AG490 soluproliferaatioon määritettiin MTT, virtaussytometrialla ja peitelasi perustuvia morfologiset ja ICC värjäytyminen STAT3, p-STAT3, cyclinD1 surviviiniperäiset, c-Myc ja VEGF. RNA ja proteiini näytteet valmistettiin kaikista ryhmistä RT-PCR ja Western blot -analyysit.

Ethics lausunto

Ennen Eläinkokeissa tutkimussuunnitelmissa tarkistettiin ja hyväksyttiin Animal Care ja käyttö komitean Dalian Medical University. Kaikki työ, johon koe-eläimistä tehtiin noudattaen täysin NIH (National Institutes of Health) suuntaviivat hoito ja käyttö Laboratory Animals. Kaikki kokeet suoritettiin kloraalihydraatin anestesiassa ja yritettiin minimoida kärsimyksen.

Orthotopic TCC Malli ja Virtsarakonsisäinen hoito

BALB /c-nude-hiiriin (4 viikkoa, 14-16 g kehon paino) nostettiin erityisissä taudinaiheuttajista vapaa (SPF) olosuhteissa. Sillä vahvistetaan potilaalle tehdä virtsarakon syöpä malli [22], hiiret nukutettiin vatsaontelon sisäisesti 3,5% kloraalihydraatilla (0,1 ml /10 g hiirten kehon paino) [23]. Tila anestesian arvioitiin oikaisu- refleksin häviäminen (LORR), ja aika aiheuttaa LORR oli tavallisesti välillä 5-10 minuuttia. Vuonna germfree eristin, hiiret virtsarakot altistettiin läpi alhaisella keskilinjaviilto; 20 ui EJ solususpensiota (1 x 10

6 solua) injektoitiin sen osa-epiteelin kerros ja ulkonäkö ”puoliläpinäkyvän kuplien” merkitty onnistunut rokotus. Kolme päivää myöhemmin hiiret jaettiin satunnaisesti kahteen ryhmään (10 hiirtä /ryhmä) ja käsiteltiin 50 ui 200 uM resveratroli tai 50 ui 0,9% NaCl kahden päivän välein. Sen jälkeen, kun virtsan evakuointi, 24-gaugen teflonpäällysteinen katetri vietiin onteloon virtsarakon. Välttämiseksi neste vuotaa, katetri kiinnitetään ruiskun pidettiin paikallaan 40 minuuttia. Kaikki hiiret nukutettiin ja turvallisesti yleensä talteen anestesian jälkeen 2 tuntia. Loppuun mennessä 28 päivää kokeen koko rakot kerättiin, punnittiin ja sen jälkeen niille histologisia ja immunohistokemiallinen (IHC) tutkimukset. Apoptoosi havaittiin TUNEL määrityksen ja sen indeksit saatiin laskemalla TUNEL-positiivisia soluja vastaan ​​yli 1000 havaittiin solujen kasvainleikkeissä [24].

arviointi paikallista ärsytystä ja systeeminen myrkyllisyys

5 viikon ikäisiä ICR-naarashiiriä (5 hiirtä /ryhmä) annettiin intravesikaalisesti, käsiteltiin 50 ui 200 uM resveratrol. Hoito suoritettiin 6 kertaa 2 päivän välein. Hiiret käsiteltiin 50 ui 2 mg /ml MMC (Sigma-Aldrich, liuotettu 0,9% NaCl) [25] kanssa samalla hallinnon tavalla mainittiin kontrollina. Loppuun mennessä hoitojen, kehon painoja laskettiin ja vastaus (t) virtsarakon kudosten hoitoja tutkittiin kannalta limakalvon eheyden, kapillaarinen ruuhkia ja verenvuoto.

Tilastollinen analyysi

erot jatkuvia muuttujia arvioitiin Student

t

testiä tai yksisuuntaista ANOVA. Tilastollinen merkittävyys määritettiin

P

0,05.

Tulokset

Lyhytaikaiset resveratrolin hoito Tukahdetut TCC Cell Growth

MTT-analyysi paljasti, että EJ solu kasvua tukahdutti lyhytaikaiset resveratrolin hoitoja annoksesta ja aikaan liittyviä muodista (kuvio 1 B). H /E värjäystä ja TUNEL testi osoitti usein apoptoottista kuolemaa 2 tuntia 150 uM ja 200 uM Res-käsiteltyjen ryhmien (kuvio 1 C). Virtaussytometria osoitti, että 2 tuntia 150 uM ja 200 uM Res hoitoja aiheutti S-vaiheen pysähtymisen ja apoptoosin EJ solupopulaatioiden. Kuten kuviossa 1D, G1 ja S jakeet EJ solut olivat 62,6% ja 33% normaalisti viljellyissä soluissa, jotka muutettiin 23,9% ja 76,1% 2 tuntia 150 uM Res käsiteltiin ja 17,7% ja 82,3% 2 tuntia 200 uM Res käsitelty populaatiot, vastaavasti. Prosenttiosuudet apoptoosin normaalisti viljellyissä, 2 h 150 uM ravintolavaunuissa ja 200 uM Res hoidetuissa ryhmissä olivat 0,394%, 4,98% ja 11,4% 72 h ajankohtana (kuvio 1 D). Kasvua EJ-solut estettiin tehokkaasti jatkuva hoito 100 uM resveratrol.

resveratrolin Inhibioitu STAT3 Transcription and Activation

Koska kriittisen roolin aktivoitu STAT3 signaloinnin virtsarakon TCC soluihin [26 ], vaikutus resveratrolin STAT3 signalointi EJ-solut analysoitiin RT-PCR: llä käyttäen RNA-näytteet uutettiin EJ-solujen kanssa ja ilman Res hoitoon. Kuten kuviossa 2A, STST3 ilmaistiin normaalisti viljellyissä EJ soluja ja alassäädetty kuluttua 2 h 200 uM Res hoitoa 72 tuntia. ICC värjäys suoritettiin samalla koeryhmään paljasti vahvan STAT3 värjäytymistä ( ++) joko sytosolin tilaan tai ytimet tavallisesti viljeltyjä EJ soluja, mikä ilmeisesti heikentynyt (+) 72 tunnin jälkeen 2 h 200 uM Res käsittely (kuvio 2B; Taulukko 2). Todettiin myös, että p-STAT3 pääasiassa lokalisoitu ytimet EJ-soluja ja väheni 2 tunnin jälkeen 200 uM Res hoitoa 72 tuntia (kuvio 2B, taulukko 2). Mukaisesti tulosten RT-PCR ja ICC, Western blotting osoitti, että 2 tuntia 200 uM Res hoito aiheutti erillisiä STST3 ja p-STAT3 vähennys (kuvio 2C). Edelleen selvittämiseksi vaikutuksia 2 h Res hoidon STAT3 signaloinnin tasojen STAT3 alavirran geenien (c-Myc, surviviini, cyclinD1 ja VEGF) normaalisti viljeltiin ja 2 h 200 uM Res käsiteltiin EJ-soluja tutkittiin edellä kuvatuilla menetelmillä . Kuten on esitetty kuviossa 2, ilmaisu c-Myc, surviviini, cyclinD1 ja VEGF tukahdutettiin 2 h 200 uM Res käsiteltyjen EJ-soluja (taulukko 2). Samanlaisia ​​havaintoja voidaan myös havaita EJ soluissa käsitellään jatkuvasti 100 uM resveratroli 48 tuntia.

estovaikutus AG490 on EJ Cells

Voit selvittää merkitys resveratrolin -caused STAT3 esto, AG490, selektiivinen estäjä STAT3 fosforylaatio, on käytetty hoitamaan EJ-soluja [21]. Immunosytokemiallinen värjäys osoitti, että STST3 fosforylaatio estyi AG490-käsitellyissä soluissa mitattuna vähentäminen STAT3 ja p-STAT3 ydinaseiden merkinnät (kuva 3, taulukko 2). Leviämisen EJ solujen tukahdutettiin AG490 on annoksesta ja aikaan liittyviä muoti (kuvio 4A). Virtaussytometria analyysi osoitti, että 48 tunnin 50 uM ja 80 uM AG490 hoitoja aiheutti S-vaiheen pysähtymisen aiheuttamatta selvä apoptoosin. G1 ja S jakeet olivat 62,6% ja 33% normaalisti viljellään, 50,4% ja 49,6% 50 uM AG490 käsitelty ja 17,9% ja 75,7% 80 uM AG490 käsiteltyjen EJ soluja (kuvio 4B). Nämä tulokset ovat täysin samansuuntainen kuin lyhyen aikavälin resveratrolin hoitoja. Prosenttiosuudet apoptoosin normaalisti viljeltiin 50 uM AG490- ja 80 uM AG490-hoidetuissa ryhmissä 48 tunnin aikapisteessä oli 0,394%, 0,194% ja 1,77%, vastaavasti (kuvio 4B). Verrattuna tavallisesti viljeltyjä EJ soluja, c-Myc, cyclinD1 surviviiniperäiset ja VEGF ilmaisut olivat säädellä vähentävästi AG490-käsitellyissä soluissa (kuvio 3, kuvio 4C ja D; taulukko 2).

. MTT soluproleferaatiomäärityksessä suoritetaan normaalisti viljeltiin EJ-soluja ja soluja, joilla AG490 (50 uM ja 80 uM) ja vakio 100 uM resveratrol hoitoja. *,

P

0,01; **,

P

0,05. B. Virtaussytometriaa määrittämistä solusyklin jakelun ja apoptoosin AG490 käsitelty EJ solupopulaation. C ja D. Evaluation of p-STAT3, cyclinD1, surviviini, c-Myc: llä ja VEGF-tasot EJ-soluja ilman ja yhdessä 50 uM tai 80 uM AG490 hoitoja RT-PCR: llä ja Western blot -analyysit.

Rakonsisäinen Resveratrol Treatment Inhibioitu Orthotopic Tumor Growth

H /E värjäys suoritettiin ympätty sivustoja ja vahvisti, että onnistunut korko potilaalle tehdä kasvaimen istutuksen oli 100% (20/20). Kaavakuvan rakkoon resveratrol käsittelyn ja annostelun aikataulua kuviossa 5A on esitetty. Kasvain rasitteita määritettiin punnitsemalla kokonaiset rakkojen korjattu kaikista ryhmistä [27], joka paljasti enemmän keskimääräinen virtsarakon paino NaCl-käsitellyn kontrolliryhmän kuin että resveratroli-hoidetussa ryhmässä (0,03362 g vs 0,01625 g,

P

0,01, kuvio 5B ja C). TUNEL määritys suoritettiin potilaalle tehdä kasvainnäytteestä ja ilman lyhytaikaisia ​​resveratrolin tiputtamisen osoittanut huomattavaa apoptoottisen kuoleman (apoptoottisten indeksi = 23,2%) entisessä tapauksissa (kuvio 5D ja E). Immunohistokemiallinen värjäys osoitti, että STAT3, p-STAT3 ja sen alavirran geenien c-Myc, cyclinD1, surviviini ja VEGF voitiin havaita joko solulimassa tai ytimet kasvaimen kudosten NaCl kontrolliryhmässä, mutta tuli ilmeisesti pienentää resveratrol-käsitellyt tuumorit (kuvio 6 ; taulukko 2).

. Kaaviokuva tutkimuksen suunnittelun ja annostelun aikataulusta. Hoidot aloitettiin 3 vuorokauden kuluttua implantaatiosta (tähdellä). B. Ylempi: Virtsaputken katetrointi nude-hiirten; Alempi: koot parin kasvain virtsarakot ilman ja 2 h 200 uM resveratroli rakkoon tiputtamisen 13 kertaa. C. Vertailu kasvaintaakat välillä resveratrolin tiputuksen ryhmän ja käsittelemättömän verrokin 28. päivänä kasvaimen istutuksen jälkeen. Normaali nude-hiiriin (sama viikkoa) rakot vapaa kasvaimen implantaation kontrollina. * Verrattuna N-ryhmän tai Res ryhmää,

P

0,01; # Verrattuna N-ryhmän,

P

0,05. D. H Ohjaus: virtsarakon laakeri potilaalle tehdä istutetut kasvain ilman resveratrolin hoitoa (0,9% NaCl hoitoa); Res: virtsarakon laakeri ortotooppisten siirrettyjen kasvainten 200 uM resveratrolin hoitoon 2 h ja 13 kertaa. E. arviointi apoptoottisten indeksien joukkoon normaali, Control and Res ryhmiä.

H

P

0,01, kuvio 8B ja 8C).

NaCl, ICR hoitaa rakkoon tiputtamisen 0,9% NaCl; Res, 200 uM resveratroli; MMC, 2 mg /ml mitomycine C. Nämä hoidot suoritettiin 6 kertaa 2 päivän välein. Vakava epiteelin vaurio, kapillaarinen ruuhkia ja verenvuoto voitiin havaita MMC-käsiteltyjen muttei NaCl ja Res käsiteltyä rakot. Sisäkkeet, korkea suurennus kuvia nuolen-aiheista urothelial alueilla. *

P

0,01.

Keskustelu

Siirtymäkauden cell carcinoma virtsarakon /TCC on vastuussa yli 130 000 vuotuisen kuolemantapausta maailmanlaajuisesti [30] paljolti toistumisen ja etäpesäkkeitä [2]. Virtsarakonsisäinen annon syöpälääkkeiden on hyväksytty hävittämiseksi jäljellä kasvainsoluihin [3], [4]. Kuitenkin ne hoitomuotojen ei voi kestää kauan, koska systeemisen toksisuuden ja paikallista ärsytystä [2]. Koska resveratroli on myrkytön [5] ja kohdistaa estovaikutusta TCC soluihin [9] – [12], se olisi vaihtoehto ehdokas hallinnan TCC: t, jos sen anti-TCC kapasiteettia voidaan edelleen todistaa koeolosuhteissa lähemmäksi kliinisen statukset. Matkia rakkoon lääkkeen tiputusta, viljellyt EJ TCC-soluja käsiteltiin 100 uM, 150 uM tai 200 uM resveratrol tilapäisesti eikä jatkuvasti. Tulokset osoittivat selvästi, että 150 uM ja 200 uM resveratrolin hoitoja 1,5 tunnin tai 2 tunnin riittivät tukahduttaa kasvua ja aiheuttaa apoptoosin EJ soluja, mikä viittaa siihen, että lyhyen aikavälin resveratrolin hoito voisi saavuttaa samanlainen anti-TCC vaikutuksia kuin tavanomaisten huumeet [14]. Tämä käsite on edelleen tukee downregulation STAT3 ja STAT3 kohdegeenin ilmentymisen ja vähentäminen p-STAT3 tumaansiirtymiseen resveratrol saaneilla EJ soluissa, koska aktivoitu STST3 signalointi liittyi TCC solujen kasvua ja selviytymistä [26]. Nämä lupaavia in vitro tulokset kannustavat meitä todistamaan, ovatko lyhytaikaisen resveratroli tiputtamisen voi myös johtaa samanlaisiin terapeuttista seuraus asianmukaisella potilaalle tehdä ksenograftimallissa.

Vaikka syöpälääkkeen vaikutuksia resveratrol on osoituksena, tämä aine ei ole vielä sovellettu kliiniseen käytäntöön paljolti alhaisesta solunsisäisen hyötyosuus systeemisesti ylläpitäjä resveratrolin [31], [32]. Toisin kiinteitä kasvaimia useimmissa elimissä, TCC: t kasvaa ulospäin virtsarakon onteloon. Lisäksi juurrutti lääke voidaan helposti rakossa ja sitä kykenee sen vaikutukset kasvainkudoksen /soluihin. Siksi potilaalle tehdä ksenograftimallia perustettiin nude hiiren virtsarakossa, jota käsiteltiin sitten resveratrolin samassa annoksina kuin in vitro kokeessa ja tavalla samanlainen kliinisen käytännön [14]. Todettiin, että kasvaimen kasvu oli merkittävästi tukahdutti ja kasvainsolujen tehtiin laaja apoptoosin. Koska koe suoritettiin kasvaimia sisällä virtsarakon, saadut tulokset olivat lähempänä potilaan todellisuutta, ja siksi olisivat translaation arvoja.

Yksi vakavia sivuvaikutuksia intravesikaalisen kemoterapian kanssa tavanomaisten syöpälääkkeiden on hemorraginen kystiitti [33]. Vaikka ei-toksisuutta resveratrolin normaaleihin soluihin on kuvattu joissakin elimissä [32], vaikutus (t) resveratrolin normaalin virtsarakkokudoksen on edelleen tuntematon. Näin ollen, tehokas anti-TCC annos resveratrolin (200 uM) tiputettiin rakkojen syövän-hiiriin, ja verrattuna käsitelty 2 mg /ml mitomysiini C. Samalla, vaste (t) siirrettyjen kasvainten ja niiden ympäristössä limakalvon resveratrol verrattiin. Huomasimme, että sekä syöpä vapaa ja kasvain-ympäröivä limakalvo näytti lähes ennallaan siirtymäkauden epiteeli ilman erillistä kapillaarisen ruuhkia ja tulehduksellinen lymfosyyttien infiltraatio, kun taas vakavaa ärsytystä ja epiteelin vaurioita tapahtui mitomysiini C-käsitelty limakalvoa. Tuloksemme tarjoavat siten osoittaa in vivo syöpää kohdistaminen ominaisuus resveratrolin virtsarakossa ja edelleen ehdottaa soveltuvuutta resveratrolin kliinisessä hoidossa ihmisen TCC: t.

Resveratrol hallussaan monimuotoinen molekyylitason vaikutuksia myös estämällä STAT3 signalointi [20 ] ja aktivointi SIRT1 deasetyloinnin [28]. STAT3 aktivointi on yleistä TCC: t ja sen estäminen voi johtaa kasvuun pidätys ja apoptoosin [26]. Huomasimme, että STST3 signalointi myös aktivoituu EJ TCC soluissa ja lyhyen aikavälin in vitro ja in vivo resveratroli hoidot voivat estää STAT3 aktivointia ja alas-säätelemään STAT3 ja sen loppupään syöpään liittyvien geenien. Nämä tulokset yhdessä samanlaisia ​​havaintoja muista syöpien [20], [32], [34] viittaavat siihen, että STST3 on merkittävä molekyylikohteena resveratrolin. Tukahdutetaan kasvu AG490 käsiteltyjen EJ solujen edelleen tukee kriittistä roolia aktivoitujen STST3 signalointi edistämisessä TCC solujen lisääntymisen. Puute apoptoottista kuolemaa AG490 saaneilla EJ väestö osoittaa, että resveratroli voi muuttaa muiden solujen selviytymistä koneistoja yli STST3 signalointi. Toistaiseksi rooli SIRT1 on TCC muodostumista ja etenemistä on edelleen epäselvä. Tässä tutkimuksessa SIRT1 tumaansiirtymiseen on osoituksena resveratrol saaneilla EJ soluja, rinnastettavissa p53 tumaansiirtymiseen. On raportoitu, että SIRT1 nucleocytoplasmic shuttling on kriittinen rooli säätelyssä SIRT1 toimintaa [35]. Lisäksi aktivoitu SIRT1-p53-reitin voi aiheuttaa vanhenemista kaltainen kasvun pysähtymisen syöpäsolujen [36]. Tuloksemme siis tarjota ohjeena tutkimaan ylimääräisiä anti-TCC mekanismi resveratrolin ja valottaa biologisten vaikutusten ydinvoiman yhteistyössä translokaatiota SIRT1 ja p53-proteiineja.

Johtopäätöksissään turvallisuutta ja tehoa resveratrol kliinisessä hoidossa virtsarakon TCC: t on validoitu tässä piakkoin altistamalla viljeltyjä ihmisen TCC EJ soluja ja potilaalle tehdä siirrettyjen kasvainten resveratrol. Kaksi tuntia 200 uM resveratrol käsittely on riittävä tukahduttaa in vitro ja in vivo kasvun ja aiheuttaa erillisiä apoptoosin EJ-soluja, oletettavasti estämällä STAT3 aktivaation ja induktio SIRT1 ja p53 tumaansiirtymiseen. Lisäksi resveratrolin kumpikaan kiinnostavuus haitallisia vaikutuksia normaaleihin urothelial soluissa eikä aiheuta virtsarakon hemorraginen kystiitti ja painon menetys.