Krooninen sairaus

tiivistelmä

androgeenireseptorin (AR) on ilmaistu osajoukko eturauhasen stroomasoluissa ja toiminnalliset stroomasolujen AR tarvitaan normaaliin eturauhasen kehitys- ja vaikuttaa kasvua eturauhasen kasvaimia. Vaikka olemme yleisesti tietoisia erityispiirteiden genomisen toimia AR eturauhassyöpäsoluissa, tiedetään suhteellisen vähän koskien geenikohteet toiminnallisten AR eturauhasen stroomasoluissa. Tässä kuvaamme uuden ihmisen eturauhasen stroomasolujen malli, joka meille mahdollisuuden tutkia vaikutuksia AR-geenin ilmentymisen näissä soluissa. Malli sisältää geneettisesti manipuloitu variantti ikuisti ihmisen WPMY-1 eturauhasen stromasoluja että yli-ilmentää villityypin AR (WPMY-AR) tasolle verrattavissa LNCaP ja reagoi dihydrotestosteroni (DHT) stimulaatio. Käyttö WPMY-AR-solujen geeniekspressioprofilointi osoitti, että läsnä oli AR, jopa ilman DHT, muutti merkittävästi geeniekspressiomalli solujen verrattuna kontrolliin (WPMY-Vec) soluja. Hoito WPMY-AR-soluissa, mutta ei WPMY-Vec ohjaus soluja, joissa DHT aiheutti lisämuutoksia, jotka vaikuttivat ilmentymistä 141 geenien 2-kertainen tai suurempi verrattuna vehikkelillä hoidettuihin WPMY-AR soluissa. Merkillistä, DHT merkittävästi vaimentua enemmän geenejä kuin oli voimistunut, mutta monet näistä muutoksista päinvastainen alkuperäisen vaikutuksia AR yli-ilmentymisen yksin yksittäisiä geenejä. Geenit eniten aikaan DHT hoito luokiteltiin perustuen niiden rooli syövän reittejä tai solujen signalointipolkujen (transformoiva kasvutekijä-β, Wnt, Hedgehog ja MAP Kinase) ajatellaan olevan mukana strooman-epiteelin ylikuulumisen aikana eturauhasen tai eturauhasen syöpä kehittäminen. DHT hoidossa WPMY-AR-soluissa oli myös riittävä muuttamaan paracrine mahdollisuuksia syöpäsolujen kuten väliaine DHT-käsiteltyjen WPMY-AR lisäsi merkittävästi kasvua LNCaP verrattuna DHT-käsitellyn WPMY-Vec solujen väliaine.

Citation: Tanner MJ, Welliver RC Jr, Chen M, Shtutman M, Godoy A, Smith G, et al. (2011) vaikutukset androgeenireseptorin ja androgeenin eturauhasessa stroomakasvaimet fibroblasteja ja parakriinisten signaloinnin syöpäsolujen. PLoS ONE 6 (1): e16027. doi: 10,1371 /journal.pone.0016027

Editor: Paraskevi Giannakakou, Weill Cornell Medical College of Cornell University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 12 lokakuu 2010; Hyväksytty: 02 joulukuu 2010; Julkaistu: 18 tammikuu 2011

Copyright: © 2011 Tanner et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoitti Equinox Foundation ja Medical Research Foundation of Albany, New York. MT oli yhdysvaltalainen Urological Association (URA) Foundation tutkija. MC ja AG vastaanottavat puolustusministeriön (DoD) Eturauhassyöpä Research Program (PCRP) Postdoctoral Research Yhteisöt (W81XWH-10-100125 [MC] ja W81XWH-09-1-0330 [AG]). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

eturauhanen edellyttää androgeeniset steroidit kehittämiseen, aikuisten ylläpito ja toiminta. Miehillä inaktivoivat mutaatiot keskeisten geenien tarvitaan androgen aineenvaihduntaan kehittää vain alkeellisia eturauhanen [1] ja miehillä inaktivoivat mutaatiot androgeenireseptorin (AR) geeni, joka välittää vaikutukset Androgeenit, eivät kehity prostates [2]. Androgeenit ja AR toiminta on myös tärkeä rooli eturauhasen syövän synnyn. Lääkkeet, jotka estävät androgeenin biosynteesin on kemopreventatiivisille vaikutuksia, jotka vähentävät merkittävästi riskiä kehittää eturauhasen syöpä miehillä [3] ja androgeeniablaatio hoitojen tarjota mahdollisimman kliinisesti käyttökelpoinen keino lievittävää tautien torjuntaan, kun eturauhasen syöpä havaitaan pitkälle [4]. Nämä kliiniset tosiasiat tunnistaa merkitystä androgeenireseptorin signaloinnin eturauhasen biologian ja syövän synnyn ja ajaa tutkimustyötä luonnehtia seurauksia androgen signaloinnin eturauhasen soluissa.

Koska AR-proteiini on laajennettu jäsen tumatranskriptiotekijä että ehdollisena säätelee geenien ilmentymistä, [5], on kohtuullista odottaa, että saatavuus on kattava luettelo androgeenin geenien eturauhasen soluissa merkittävästi myötävaikuttaa tietomme androgeenitoiminnan eturauhasen. Tätä varten käyttämään nykyaikaista massan geeniekspressioprofilointi teknologia, etenkin kun on kyse geeni mikrosiruja on Chips, on jo huomattavasti laajennettu luettelo tunnettujen androgeenireseptorin geenien eturauhassyöpäsoluissa [6] – [9]. Tutkimukset käyttäen tätä lähestymistapaa on tuettu lopulta tunnistaminen uusia geneettisiä poikkeavuuksia (ETS geenin uudelleenjärjestäytymistä) [10] – [12] ja ovat auttaneet tunnistamaan epätavallisen aktiivinen signalointireitteihin eturauhassyöpäsoluissa [13], [14], jotka ovat translaation potentiaalia parantaa eturauhassyövän diagnostiikkaan tai hoitostrategioita. Tämäntyyppinen tekniikka, ei ole kuitenkaan vielä käytetty kuvaamaan androgen /AR vaikutuksia eturauhasessa stroomasolujen huolimatta laajaa näyttöä, että soluja eturauhasen strooman osallistua aktiivisesti prosesseihin, joiden kautta androgeenien säätelevät normaalia tai pahanlaatuinen eturauhas- kehitykseen [15] – [19]. Pääasiallinen syy tähän vaje on puute sopivan viljellyissä ihmisen eturauhasen stroomasolulinja malleja, jotka voimakkaasti ilmentävät AR proteiinia ja ovat todistettavasti reagoivat androgeenien läsnäolon kuten muutokset geenien ilmentyminen, kun viljellään androgeenin sisältävässä alustassa. Tässä kuvaamme kokemuksemme kokeilee käytettävissä (hyvänlaatuinen) ihmisen eturauhasen stroomasolulinja malleja niiden reagointikykyä androgeenien

in vitro

ja kehittämään tietyn androgen reagoiva ihmisen eturauhasen stroomasolulinja malli (WPMY-AR-solut) joka oli profiloitu AR- ja androgeenin aiheuttamat muutokset geenien ilmentyminen käyttämällä ihmisen geeniä Chip mikrosiruja. Lisäksi käytimme tätä mallia solusysteemi testata ajatusta, että androgeenien muuttavat parakriinisen signalointi ympäristön eturauhaskasvainnäytteen vaikuttamalla tuotoksen erittyvän tekijöiden eturauhasen strooman fibroblasteista.

Tulokset

Androgeenireseptorin ilmaisun ja aktiivisuus viljellyissä ihmisen eturauhasen stromasoluja

Kaksi käytettävissä ikuisti ihmisen eturauhasen strooman solulinjoissa, PS-30 ja WPMY-1, ja ei-ikuisti ensisijainen ihmisen eturauhasen stroomasolulinja myofibroblasteja arvioitiin AR ilmaisun ja vastata androgeenit. Yksikään näistä soluista vaativat androgeenin

in vitro

kasvua, kuitenkin, WPMY-1-soluja on aiemmin raportoitu kasvavan hieman nopeammin, kun läsnä on synteettisen androgeenin, R1881: n [20]. AR ilmentyminen arvioitiin näissä soluissa kvantitatiivisen RT-PCR (qPCR) ja Western blot menettelyjä ja verrattiin viljeltyjen ihmisen primaaristen eturauhasen strooman fibroblasteissa (kyseistä luottoa) ja LNCaP eturauhassyövän solut, jotka ovat malleja AR toimia eturauhassyövässä (kuvio 1A ). Tutkituista solut, LNCaP-solut ilmaisivat korkeimman AR-mRNA. AR-mRNA ilmentyi vain 3,4% tästä tasosta PS30 soluissa, 1,1% kyseistä luottoa ja hieman yli 0,1% tästä tasosta WPMY-1-soluissa. Tämä malli oli yhdenmukainen meidän Western blot data jossa emme pystyneet havaitsemaan nauha vastasi AR uutteissa jommankumman ikuistettu soluissa tai kyseistä luottoa, vaikka se oli helposti havaittavissa otteessa LNCaP (Fig. 1 B). Samoin, kun vanhempien WPMY-1-solut transfektoitiin androgeenin reagoiva toimittaja vektori, ne eivät osoittaneet todisteita lisääntyneen ekspression toimittaja (lusiferaasi), vasteena yhä enemmän DHT (Fig. 1 C). Kuitenkin, kun WPMY-1-solut kotransfektoitiin androgeenireseptorin reportteri yhdessä AR ekspressiovektoriin, ilmentämiseen toimittaja oli merkittävästi lisääntynyt läsnäolo DHT (Fig. 1 C). Yhteenvetona, alhaisen endogeenisen AR ilmentymistä näissä ihmisen eturauhasen strooman solulinjoja ja niiden reagoimattomuus androgeenin stimulaation viittaa siihen, että he ovat köyhiä malleja tutkimuksen androgeenin toiminnan stroomasolujen, mutta eksogeeninen ekspressio AR, ainakin WPMY-1 solut, uskottu nämä solut androgen reagoiva fenotyyppi, joka voisi olla paremmin edistävät tutkimuksen androgeenitoiminnan.

(A) AR mRNA tasot PS30, ensisijainen eturauhasen strooman (kyseistä luottoa), WPMY-1 (W ), WPMY-Vec (W-Vec), WPMY-AR (W-AR) tai LNCaP-solujen havaitaan reaaliaikaisesti qPCR RNA: uutettu soluista. Ekspressiotasot on sidottu ilmentymistä GAPDH kussakin solulinjassa. (B) AR proteiinin (ylempi kaistat) in PS30, kyseistä luottoa, W, W-Vec, W-AR tai LNCaP havaittiin Western blot. Blotti uudelleen tutkittiin GAPDH-proteiinin (alempi kaistat) kontrollina. (C) lusiferaasireporttiterilla ilmentyminen WPMY-1-solut ko-transfektoitiin ARE-luc-reportterivektoria ja ohjaus (tyhjä) vektori (vektori) tai pLenti6.2-Har-vektoriin (AR). Luciferase tasot normalisoidaan GFP-fluoresenssin samaa uutetta kuin transfektiolla rastilipulla. (D) immunofluoresenssivärjäyksellä AR W-AR soluja kasvatettiin 72 tunnin ajan ilman (vasemmalla) tai läsnä ollessa (oikealla) 10 nM DHT. Solut yhteistyössä värjättiin DAPI tunnistaa ytimiä. (E) Lusiferaasiaktiivisuutta W-AR: llä transfektoitujen solujen ARE-Luc ja GFP puuttuessa tai läsnä on 10 nM DHT. Lusiferaasiaktiivisuudeksi normalisoitui verrattuna GFP tasoilla samaa uutetta. (F). Kasvu W-Vec tai W-AR-solujen puuttuessa tai läsnä 10 nM DHT mitattuna WST-1-määritystä.

Jotta WPMY-1-soluissa sopivampi tutkimukseen androgen vaikutukset geeni-ilmentymisen, me transdusoitujen solujen ihmisen villityypin AR ilmaisun lentivirus ja sitten käytetään antibiootti valinnan, jotta saadaan stabiili populaatio AR yli-ilmentävät WPMY-1-soluja (WPMY-AR). Muut WPMY-1-soluja transdusoitiin tyhjä lentiviruksen ja valitaan samoin edellytyksin saada ohjaus solupopulaation (WPMY-Vec). WPMY-AR-solut ilmentävät AR-mRNA ja proteiini tasolle verrattavissa androgen-herkkien LNCaP eturauhassyövän solut (kuviot. 1A, B). Immunofluoresenssivärjäyksen käyttäen anti-AR-vasta-aine osoitti, että AR oli enimmäkseen sytoplasmassa, kun näitä soluja kasvatettiin ilman DHT, vaikka oli kevyt ydin- immunofluoresenssivärjäyksellä useimmissa soluissa (Fig. 1 D). Sen sijaan, kun WPMY-AR-soluja kasvatettiin DHT-sisältävässä väliaineessa, AR immunovärjäytyminen oli yksinomaan ydin. AR ilmaistu vakaa WPMY-AR-soluissa oli toimiva genominen geeniekspression aktivaation. Kun nämä solut transfektoitiin androgen-reportteri, lusiferaasiaktiivisuus lisääntyi merkittävästi käsittelemällä DHT ottaa huomioon, että DHT ei vaikuta lusiferaasin ilmentymistä reportteri-transfektoiduissa WPMY-Vec kontrollisoluja (Fig. 1 E). Muuten, WPMY-AR-solut eivät osoittaneet mitään muuta ilmeistä fenotyyppisiä eroja verrattuna WPMY-Vec kontrollisolut; he olivat erottamattomat morfologian mikroskoopin avulla seuraten (ei esitetty) ja on samanlainen kasvu sekä androgeeni-vapaa ja androgeenin sisältävää väliainetta (Fig. 1 F).

Comparative geeniekspressioprofilointi eturauhasen stroomakasvaimet Cell Variantit, Kasvatettu läsnäolo tai poissaolo DHT

WPMY-Vec ja WPMY1-AR-solut maljattiin yhtä paljon androgeeni-väliaineessa kiinnittämistä varten siirrettiin sitten tuoreeseen elatusaineeseen tai ilman täydentävää 10 nM DHT 72 tuntia. RNA: t uutetaan biologisesta kaksoiskappaleet näiden viljelmien leimattiin sitten profiloitu Affymetrix Human Gene ST 1.0 Array Gene Chips. Microarray ilmaisun analysoitiin tunnistaa ne geenit, jotka ilmentyvät differentiaalisesti välillä tietyn solun eri ehdoin (- /+ DHT) tai kahden solutyyppien (WPMY-Vec vs WPMY-AR) vastaavissa olosuhteissa. Käyttäen cutoff 1,5-kertainen muutoksia RNA ilmaisu, WPMY-Vec ohjaus soluilla oli vain 8 geenejä, jotka ilmentyvät differentiaalisesti läsnä ollessa DHT ja kuvaaja, joka esittää erilaisia ​​nämä muuttuneet geenien tuottamat GeneSpring ohjelmaa ja se on esitetty Kuvio 2A. Yritimme vahvistaa ero ilmaisuaan 8 geenien WPMY-Vec DHT-käsiteltyjen /-untreated soluista käyttämällä reaaliaikaisia ​​qPCR arvioida jokaisen näistä geenin levitetään uusille biologisten rinnakkaisnäytteitä mutta tuloksineen, analyysi osoitti, mitään merkittäviä eroja ilmentymisessä tahansa niistä tällä menetelmällä (ei esitetty). Vertailu geeniekspressioprofiilien DHT-käsiteltyjen /-untreated WPMY-AR solut kuitenkin se osoitti paljon silmiinpistävää ja vankka muutoksia geenien ilmentyminen liittyy DHT hoidossa. DHT vaikuttaa ilmaus 172 yksittäisiä geenejä 1,5-kertaisen tai sitä suuremman (Fig. 2B). Kuitenkin, suurin osa näistä muutoksista (141 tai 81,9%) oli tasolla 2-kertainen tai suurempi. Tässä jälkimmäisessä luokassa, lisää geenit vaimentua DHT (85 geenit) kuin oli voimistunut (56 geenejä). Geenit, jotka muuttivat 2-kertainen tai suurempi, tunnistetaan taulukossa S2 ja taulukossa S3. Sitten Valitsimme 10 eri geenit näiden listojen, kuten 6 ilmen- tymisen lisääntymisen ja 4 vaimentua geenejä, sillä lisävalidointia reaaliaikaisella qPCR levitetään uusille RNA: iden uutetaan biologisista kaksoisnäytteillä. Kukin näistä valitun geenin varmistettiin olevan merkittävästi ylös- tai alas-säädellä läsnäolo DHT samalla tavalla kuin tulokset microarray ilmentymisen analyysi (Fig. 3A). Lopuksi luettelo geenien (ylös- ja alas-säännelty), joka muutettiin 2-kertainen tai suurempi, kun läsnä on DHT oli toiminnallisesti arvioitiin käyttämällä

Pathway Express

ohjelma (http: //pyörre. cs.wayne.edu/projects.htm) [21], joka antaa geenit erityisiksi Kegg toiminnallisten reittejä ja sitten eri Kegg reittejä liittyy näiden geenien kvantitatiivisesti priorisoidaan voidaan käyttää kahta eri parametrien: 1) syötettyjen geenejä, jotka ovat määrätty tietylle Kegg koulutusjakson tai 2) prosenttia yksittäisten Kegg reitin geenit, jotka olivat läsnä tulo geeniperimä (taulukko 1). Top 10 Kegg koulutusjakson rankingissa käyttämällä kahta eri parametreja jaettu luokkiin, Pathways in Cancer, Sytokiini-sytokiinireseptorin Vuorovaikutus, TGF-β Pathway, Wnt Pathway, ja Hedgehog signalointireitin mutta muita näkyviä soluviestitykseen reittejä edustivat yhdessä sijoitusta tai muut.

(A) GeneSpring luoman viivadiagrammina merkittävien (P 0,05) geenien ilmentyminen erot yli 1,5-kertaisesti WPMY-Vec soluja käsitellään 72 tunnin ajan 10 nM DHT. (B) GeneSpring syntyvän viivadiagrammina merkittävien (P 0,05) geenien ilmentyminen erot yli 1,5-kertaisesti WPMY-AR soluja käsitellään 72 tunnin ajan 10 nM DHT. (C) GeneSpring syntyvän viivadiagrammina merkittävien (P 0,05) geenien ilmentyminen erot yli 1,5-kertainen välillä WPMY-Vec ja WPMY-AR soluja kasvatettu ilman DHT. (D) GeneSpring syntyvän line käyrä, joka esittää vaikutusta DHT hoidon geenejä, jotka eri tavoin voimistuvan 2-kertainen tai suurempi AR ilmaisu yksinään (ei DHT). (E) GeneSpring generated viiva käyrä, joka esittää vaikutusta DHT hoidon geenit, jotka olivat eri tavoin alas-säädellä 2-kertainen tai suurempi AR ilmaisu yksinään (ei DHT) ja sittemmin up-säännellään 2-kertaiseksi, kun läsnä on DHT. (F) GeneSpring generated viiva käyrä, joka esittää vaikutusta DHT hoidon geenit, jotka olivat eri tavoin alas-säädellä 2-kertainen tai suurempi AR ilmaisu yksinään (ei DHT) ja sittemmin edelleen alas-säädellä 2-kertainen tai suurempi, kun läsnä DHT.

(A). Arviointi yksittäisen geenin ilmentymisen muutoksia, jotka liittyvät DHT hoidossa WPMY-AR solujen qPCR. Kuusi geenien tässä paneelissa (SFRP-5, IGF-1, Wnt-16, AQP3, FKBP5 ja RERG) tunnistettiin DHT-up-geenien in microarray geenien ilmentymisen analyysi ja neljästä geenistä (BMP-4, FST , IL7R ja FGF5) tunnistettiin DHT-alassäädetty geenien microarray geenien ilmentymisen analyysi ja nämä muutokset vahvistettiin qPCR määrityksessä. Kaikki muutokset havaitaan qPCR oli merkittäviä muutoksia (P 0,05). (B) arviointi yksittäisen geenin ilmentymisen muutoksia, jotka liittyvät DHT hoidossa PS30 soluja transfektoitiin väliaikaisesti pLenti6.2-Har by qPCR. Muutosten mittaamiseksi SRBP5, IGF1, Wnt-16, AQP3, FKBP5, RERG ja FGF5 olivat merkitseviä (P 0,05), kun taas muutokset BMP-4, FST ja IL7R eivät olleet merkittäviä (P 0,05).

paremmin ovatko nämä geeni muutokset liittyvät DHT hoidossa olivat spesifisiä WPMY-AR soluja tai ne saattavat esiintyä myös muissa ihmisen eturauhasen stromasoluja riittävän AR ilme, me transfektoitiin ohimenevästi PS30 solujen kanssa AR ekspressiovektori tai tyhjän kontrollivektorille käsitellään sitten näitä soluja ilman tai 10 nM DHT 72 tuntia. RNA: t uutetaan näistä soluista testattiin reaaliaikaisella qPCR analyysi ilmentymisen AR ja ekspressiota varten on sama 10-geenit, jotka on selektiivisesti analysoitiin WPMY-AR-soluja. Tuloksia osoitti, että AR ekspressoitui 923-kertaisesti enemmän AR-transfektoiduissa kuin verrokeilla-transfektoiduissa PS30 soluissa. Kuten on esitetty kuviossa 3B, ilmentyminen 6 muut 10 geeniä muutetaan samalla tavalla kuin WPMY-AR-solut, joita käsiteltiin DHT, kun taas 4 10-geenit eivät muuttuneet merkitsevästi välillä untreated- tai DHT-käsitellyt solut . Lopuksi, primaaristen ihmisen eturauhasen solu- fibroblastit olivat myös viljeltiin väliaineessa tai ilman DHT 72 tuntia ja RNA: t uutettiin reaaliaikaista qPCR analyysi. CDNA: Näistä soluista analysoitiin sitten DHT vaikutuksia ekspressioon 5 eri geenien meidän paneelista. Tuloksia osoitti, että SFRP5 ja IGF1 olivat voimistuvan 1.67- ja 1.73- kertaisesti DHT (p 0,05) ja FGF5 säädeltiin vähentävästi 1,5-kertaisesti (p 0,05) verrattuna ei-DHT valvontaa taas ilmaus FST ja Wnt16 ollut merkittävästi muuttunut DHT hoidossa näiden solujen.

Gene Expression liittyviä muutoksia yliekspressio AR WPMY-1 solut

Voit selvittää AR lauseke (puuttuessa ligandin) vaikuttaa geenin ilmentyminen WPMY solut, myös verrattuna geeniekspressioprofiilien välillä WPMY-Vec ja WPMY-AR-soluja kasvatettiin ilman DHT hoitoa. Huomattavan 443 geenejä havaittiin ilmentyvät differentiaalisesti näiden solujen tasolla 1,5-kertainen tai suurempi (Fig. 2C) ja 374 näiden geenien ilmentyvät differentiaalisesti 2-kertainen tai suurempi näiden solujen. Tässä jälkimmäisessä alaryhmässä, 55-geenit ilmentymistä selektiivi- sesti ja 319 geenit selektiivisesti vaimentua AR-ilmentäviä soluja. Se oli edelleen kiinnostusta määrittää, miten nämä kaksi ryhmää geenejä sittemmin vaikuttanut DHT hoidossa. Ensin valitaan nämä geenit (55), jotka voimistuvan yliekspressio AR (vähintään 2-kertainen) ilman DHT. Kuusikymmentä prosenttia näistä geeneistä (33 geenit) myöhemmin vaimentua (2-kertainen tai suurempi) uudelleen, kun läsnä on DHT (Fig. 2D), kun taas muut 40% oli joko muuttumattomana tai muuttaa vähemmän kuin 2-kertaisesti DHT ja, siis kuulu analyysimme. Niille 319 geeniä, jotka ovat vaimentua 2-kertainen tai suurempi AR yli-ilmentyminen yksin, 21-geenien (6,58%) myöhemmin voimistuvan 2-kertainen tai suurempi lisäämällä DHT (kuvio 2E), kun taas 21-geenien (6,58%) oli lisäksi vaimentua 2-kertainen tai suurempi lisäämällä DHT (kuvio 2F). Loput geenit tähän luokkaan (277 eli 86,8%) olivat joko ennallaan lisäämällä DHT tai muutettu alle 2-kertainen ja jätetty analyysimme. Ei geenit voimistuvan AR ilmaisu sitten edelleen voimistuvan DHT jopa ne, jotka kärsivät DHT 2- 1,5-kertaiseksi. Yhteenvetona, AR yli-ilmentyminen yksin ligandin poissa ollessa voi indusoida, mutta pääasiassa tukahduttaa ilmaisun geenejä WPMY-1-soluissa, mutta vaikutukset olivat joskus päinvastaiseksi ligandin läsnäolon. Kuitenkin jotkut geeniekspression aiheuttamien muutosten AR yli-ilmentyminen (geeni downregulations) on edelleen täydennetty käsittely androgeenin ligandin näissä soluissa.

suoraan tai välillisesti asetukseen Genes DHT

on kuvattu tässä muuttunut malleja geenin ilmentymisen eturauhasen stroomasoluissa aiheuttama AR yli-ilmentyminen, kanssa tai ilman ligandia, jotka mittausten perusteella mRNA-tasojen. Olemme pyrkineet edelleen arvioimaan pienen osan näistä DHT-geenien onko vaikutuksia DHT tarvitaan välittäjän proteiinisynteesiä. Tätä varten, trypsiinillä WPMY-AR Solujen annettiin kiinnittyä yön yli ja sitten käsiteltiin lyhyesti (30 min), joilla on korkea annos sykloheksimidillä (40 μgs /ml) estää proteiinisynteesiä ja sen jälkeen kytketään väliaineen kanssa tai ilman DHT (10 nM) läsnäolon pienemmällä annoksella sykloheksimidiä (10 μgs /ml) 24 tunnin ajan. Kontrollisoluja käsiteltiin samalla tavalla, paitsi että ei ole cyclohexmide sisällytettiin milloin tahansa. RNA: t uutetaan näitä soluja sitten arvioitiin ilmentämiseen valitun DHT-voimistunut (RERG, Wnt16 ja SFRP5) tai DHT-alassäädetty (FST, FGF5 ja BMP4) geenejä. Tuloksemme (kuva 4) osoitti, että DHT vaikutus ilmaisu muuttuu neljä näistä geeneistä (RERG, WNT16, SFRP5, ja FST) eivät muuttuneet sykloheksimidikäsittelylle, kun taas DHT vaikutukset BMP4 ja FGF5 ilmaisuja blokattiin sykloheksimi-.

WPMY-AR-soluja esikäsiteltiin käsiteltiin sitten sykloheksimidillä puuttuessa tai läsnä oli 10 nM DHT 24 tuntia. RNA: t analysoitiin qPCR: n ekspressiota varten RERG, FST tai FGF5, kuten on osoitettu ja ekspressiotasot normalisoitiin GAPDH-ilmentymisen tasoja.

Effects of DHT-stimuloidun WPMY1-AR Pakattu Media LNCaP Cell Growth

Lopuksi pyrittiin selvittämään DHT toimia WPMY-AR-malliin solut voivat vaikuttaa erittyvien tekijöiden tällaisia ​​soluja, jotka vaikuttavat eturauhasen syöpäsolujen kasvua. Kolmen päivän väliaine 10 nM DHT-käsitellyn WPMY-Vec tai WPMY-AR-solut laimennettiin 1:01 tuoreella väliaineella (10 nM DHT), ja lisättiin sitten tuoreisiin LNCaP-solujen monokerrokset ja soluja seurattiin 9päivä kanssa keskipitkän vaihto 3 päivän välein. Kasvu tämän ajanjakson aikana mitattiin käyttämällä WST-1-määritys ja tulokset on esitetty kuviossa 5. Käsittely väliaine DHT-käsitellyn WPMY-AR-solujen havaittiin olevan huomattavasti kasvua stimuloivien ja LNCaP verrattuna hoitoon conditioned väliaine DHT-käsiteltyjen WPMY-Vec soluissa.

Suhteellinen solujen määrä eri päivinä arvioitiin WST-1 määrityksessä. Käyttö kunnostettua alustaa DHT-käsiteltyjen WPMY-AR-soluissa merkittävästi lisänneet kasvua (P 0,01, kaksisuuntainen ANOVA) ja LNCaP-soluja verrattuna kunnostettua alustaa DHT-käsiteltyjen WPMY-Vec soluja. Rinteillä kaksi kasvukäyrät olivat myös merkitsevästi erilainen (P = 0,0181, lineaarinen regressio Analysis).

Keskustelu

Kuten muissa kudoksissa, eturauhasen koostuu johon on lisätty erilaisia solutyyppejä, jotka laajasti erotella epiteelin tai strooman osastoon perustuu niiden lokalisointi suhteen tyvikalvon. Eturauhasen syöpäsoluja, jotka ovat peräisin eturauhasen epiteeli ovat perinteisesti toimittaneet mallit tutkia, miten androgeenitoiminnan vaikuttaa eturauhasen solujen geenin ilmentymistä. Kuitenkin useat solutyypit sisällä eturauhasen strooman tiedetään myös ilmaista AR

in vivo

[22] – [24] ja edistää prosessi (e), jonka kautta androgeenien säätelevät eturauhasen kehittämiseen ja sairaus kuitenkin tiedämme hyvin vähän, vaikutukset androgeenista geenien ilmentymistä tällaisia ​​soluja. Pyrkimykset tätä varten haittasivat puute sopivan viljeltyjen stroomasolulinja malleja, erityisesti ne, jotka ilmentävät AR riittävän korkeana, jotta voidaan käyttää nykyaikaista massan geeniekspressioprofilointi tekniikoita. Täällä, yritimme luonnehtia AR ilmaisun ja androgeenin signalointiaktiivisuuteen kahdessa käytettävissä kuolemattomaksi eturauhasen stroomasolulinja linjat, PS30 ja WPMY-1, jotka raportoitiin aiemmin ilmaisemaan AR [20], [25] arvioida, ne voisivat tarjota malleja tutkia androgeenireseptorin säännelty geenien ilmentyminen. Nämä solut ovat molemmat luokitellaan myofibroblasteja perustuu niiden morfologiaa viljelmässä ja niiden koekspressio vimentiinista ja sileän lihaksen aktiini. Huomasimme, että molemmat solut ilmentävät erittäin alhainen AR-mRNA ja proteiini ja kumpikaan solutyyppi reagoinut DHT hoidon jälkeen transfektion androgen reagoiva lusiferaasireportteri vektori joten kumpikaan ei todennäköisesti hyvä malli tutkimiseen androgen säädellä geeniekspressiota. Kuitenkin, kun androgeeni toimittaja vektori kotransfektoitiin villityypin AR ekspressiovektori, WPMY-1-solut pystyivät reagoimaan DHT hoitoon säätelemällä androgen-reagoiva toimittaja ilmentymistä. Tämä tulos osoitti, että WPMY-1-solut voidaan tehdä myöntyväinen tutkimiseksi androgeenin säännellään geeniekspression kun tarjotaan eksogeenista AR. Transduktio antibiootilla valittavissa AR-ilmentymisen lentivirus pystyimme sitten johtamiseksi stabiili solulinja, WPMY-AR, joka ilmaistaan ​​AR-mRNA ja proteiini tasolle verrattavissa LNCaP, joita käytetään usein mallintaa syöpäsolujen reagointia androgeenit. WPMY-AR-solut siirrettiin AR proteiinin ytimen läsnä ollessa DHT ja asianmukaisesti ylössäätää lusiferaasin ilmentyminen androgeeni-säännelty toimittaja vektori jälkeen DHT hoidon tunnistamiseksi, että ne on toiminnallinen androgen signalointi, joka on yhdenmukainen niiden käyttö geeniekspressioprofilointi kokeissa. Se oli huomattava, että WPMY-AR-solut olivat morfologisesti erottaa vanhempien tai valvontaa transdusoidaan (WPMY-Vec-solut), ja että niiden suhteellinen kasvu (läsnä tai poissa androgeenien) ei merkittävästi vaikuta AR yli-ilmentyminen, erityisesti koska AR on tiedetään vaikuttavan eturauhasen syöpäsolujen kasvua, joko silloin, kun se on ilmaistu endogeenisesti tai eksogeenisesti [26], [27].

WPMY-Vec ja WPMY-AR sitten soluja profiloitu yleisen geeniekspressiomalleja ja muutokset näissä kuvioita liittyy DHT hoitoa käyttämällä geeniä Chip microarray lähestymistapaa. Alustavien vaivalla pitempi hoidon DHT (72 h) kuin käytetään yleisesti tutkimuksissa eturauhassyöpäsolujen, mutta toivotaan pidemmän hoitojakson aikana mahdollistaisi myös havaita mahdollinen sekundaarinen geeniekspression muutoksia, jotka saattavat olla merkityksellisiä näkökohtia cross-talk välillä eturauhasen stroo- ja epiteelisolujen, jotka vaikuttavat eturauhasen kehitykseen tai eturauhasen syöpäsolujen kasvua. Jotta WPMY-Vec kontrollisoluja, DHT hoitoon merkittävästi muuttunut ilmentyminen vain 8 geenien (pois 28712-geenin koetinsarjojen on Chip), ja nämä muutokset olivat suhteellisen alhaiset, vaihtelevat 1.62- 1,74-kertainen muutos verrattuna käsittelemättömiin WPMY -Vec soluja. Mitään näistä geenin muutokset vahvistivat myöhemmin käyttäen reaaliaikaista qPCR lähestymistapaa. Mielestämme niin, että nämä pienet muutokset hallinnassamme soluissa (+/- DHT) havaittiin käyttämällä geeniä Chip mikrosirulla lähestymistapa edustaa ”kohina” järjestelmän ja että tämä melu on erittäin alhainen ja helposti suodatettu käyttäen toissijaisena qPCR lähestymistapaa. Silmiinpistävä vastakohta, hoito WPMY-AR solujen DHT muuttunut ilmentyminen 141 eri geenien 2-kertainen tai suurempi. Suurin osa näistä muutoksista (60,2%) mukana geeniekspressiota alas-asetukset liittyvät DHT hoidossa. Ottaen huomioon, että kopioinnin suhteen aktiivisia (ligandoidun) AR on useimmiten ajatellaan indusoi geenin ilmentymisen, tämä on huomattavan suuri määrä mahdollisesti androgeenin tukahdutettu geenejä. Kuitenkin AR /androgeeni tukahdutettu geenejä on aiemmin kuvattu eturauhassyövän soluissa [8] ja yksi raportin, jossa kuvataan vaikutuksia androgen geenien ilmentymisen LNCaP saatiin näyttöä, että androgeenireseptorin hoito tukahdutti lähes yhtä monta geenien aiheutettiin näissä soluissa [9 ] joten havaintomme tukevat havainnot muiden eturauhasen soluja. Oli myös mielenkiintoista, että vertailu meidän DHT-muuttunut stroomasolulinja geeni luettelot jo tunnettujen androgeenireseptorin geenien koottu verkkosivuilla resurssi (https://argdb.fudan.edu.cn/index_info.php, [28] osoitti, että noin 21%: n geenien läsnä meidän luetteloissa (taulukot S1 ja S2) on aiemmin kuvattu olevan ”androgeenireseptorin säännellä”, joka perustuu kartoitettiin kirjallisuudesta pääasiassa sekä tutkimuksia eturauhasen syöpäsoluja. läsnäolo tämän merkittävän prosenttiosuuden aiemmin kuvattu ”androgeenireseptorin säännelty ”geenit meidän luetteloissa tukee ajatusta, että me tunnistaa monia geenejä, jotka voidaan yleisesti säädellä ligandoidun AR monenlaisissa eturauhasen solujen sekä geenejä, jotka voidaan valikoivasti vaikuttaa AR /androgeenien eturauhasen stroomasolujen.

Mitä tulee luonne DHT-säänneltyjen stroomasolulinja geenejä, oli vähän, jos lainkaan geenejä, jotka toiminnallisesti luokiteltu säätelijöinä soluproliferatiivisen prosessien tai apoptoosin ja tämä on sopusoinnussa havaintomme että androgen hoito ei vaikuttanut merkitsevästi WPMY AR kasvua. Arviointi geenin toiminnon säädelty /alas geenien meidän luetteloihin perustuvat Kegg polku nimitys oli merkittävä, koska se tunnistaa vallitsevana geenejä, jotka osallistuvat yleinen ”syöpä väyliä”, jotka saattavat olla merkityksellisiä havaintomme että ilmastoitu väliaine DHT-stimuloitujen WPMY-AR vahingoittuneiden solujen LNCaP solujen kasvua. Samoin läsnäolo useiden geenien listallamme luokiteltu efektorien sytokiinin-sytokiinireseptorien signalointi, TGF-β, WNT, Hedgehog tai MAP Kinase signalointipolkujen tukisi aiemmin julkaistun tutkimusten mukaan nämä tietyt signalointireitteihin osallistuvat rajat talk että tapahtuu eturauhasen strooman ja eturauhasen epiteelisolujen /syöpäsolujen kehitykseen tai sairauden [29] – [31]. Luokittelu geenien luettelossa perustuvat Gene ontologia (GO) toimeksiantoja tehtiin myös käyttämällä DAVID ohjelmaa ja tuloksista osoittivat samanlaisia ​​ryhmiin määrättyjä tehtäviä alle Kegg Pathway (ei kuvassa). Lopuksi, meidän rajalliset kysely varten sykloheksimidin vaikutusta DHT aiheuttamaa geenin muutosten ei tue ajatusta, että monet geenin muutokset havaitsimme yhdistetään lähinnä AR toiminnallinen aktiivisuus. Silti kykymme tunnistaa joitakin DHT-vaikutti geenien WPMY AR soluja, jotka eivät muuttuneet, kun sykloheksimi- oli mukana DHT hoito osoittaa myös, että on olemassa geenit meidän luetteloista sekundaarisesti säädellään muulla proteiini vaikuttaa DHT kuin me epäillään. Käyttö WPMY-AR solujen lyhyemmässä DHT hoito voi auttaa meitä selvittämään ensisijaisesti vaikuttaa vs toissijainen vaikuttaa geenien ja yritämme näin tulevaisuudessa.

validointitarkoituksiin, meillä oli valinnut paneelin