Krooninen sairaus

tiivistelmä

DNA yhteensopimattomuuden korjausjärjestelmän (MMR) ylläpitää genomin vakautta tunnustamista ja korjaus yhden emäsyhteensopimattomuuksia ja pieni lisäys-poisto silmukoita. Inaktivointi MMR reitin aiheuttaa mikrosatelliittien epävakautta ja kertymistä genomista mutaatioita, jotka voivat aiheuttaa tai edistää syövän. Itse asiassa 10-20% tiettyjen kiinteiden ja hematologisia syöpiä ovat MMR-puutteellisia. MMR-puutteellinen syövät eivät reagoi joihinkin tavanomaista hoitoa kemoterapeuttisten koska oletetaan lisääntynyt toleranssi DNA-vaurioita, mikä korostaa tarvetta uusille lääkeaineet. Tämän päämäärän tuottamaamme isogeenisiin syöpäsolulinjoja suoraa vertailua MMR-taitavia ja MMR-vajaiden solujen. Olemme suunniteltu NCI-H23-keuhkoadenokarsinooma solut sisältävät doksisykliini-indusoituva shRNA suunniteltu tukahduttaa ilmentymisen virhepariutumista korjaava geeni MLH1, ja kun yksittäinen solu alaklooneja, jotka indusoimattomia (MLH1-taitavia) verrattuna indusoi varten MLH1 shRNA (MLH1-puutteellisia ). Tässä esitämme luonnehdinta näiden MMR-indusoituva solulinjojen ja vahvistaa uuden luokan rodium metalloinsertor yhdisteitä, jotka eri tavoin inhiboimaan MMR-vajaiden syöpäsoluja.

Citation: Bailis JM, Gordon ML, Gurgel JL, Komor AC, Barton JK, Kirsch IR (2013) indusoituvan, isogeenisiin Cancer Cell Line System kohdistaminen osavaltion Mismatch korjaus puutos. PLoS ONE 8 (10): e78726. doi: 10,1371 /journal.pone.0078726

Editor: Klaus Roemer, University of Saarland Medical School, Saksa

vastaanotettu: 24 kesäkuu 2013; Hyväksytty: 17 syyskuu 2013; Julkaistu: 29 lokakuu 2013

Copyright: © 2013 Bailis et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat kiitos NIH (GM33309 on JKB) ja NSF (fellowship ACK) taloudellista tukea. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Julie Bailis, Marcia Gordon, Jesse Gurgel, ja Ilan Kirsch ovat tai olivat työntekijöitä Amgen, Inc. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Genome epävakaus on tunnusmerkki syöpäsolujen ja voi johtaa numeerinen tai rakenteellisia muutoksia kromosomeissa (kromosomi epävakautta, tai CIN) tai Nukleotidiyhteensopimattomuuden korjaus (MMR) puutos (MIN) [1]. Vaikka CIN voi johtua lakkaa toimimasta useita solureiteillä, MIN johtuu nimenomaan ilmene MMR järjestelmään ja on tunnistettavissa voitto tai tappio mono-, di- tai tri-nukleotidin toistosekvenssit, kutsutaan microsatellite epävakautta (MSI) (tarkistetaan 2). Replikointi virheitä, kuten polymeraasi liukuminen tuottaa pienen lisäyksen-poisto silmukoita (IDLs) tai yhden emäsyhteensopimattomuuksia DNA. DNA-vaurioita voi myös muokata emäkset aiheuttaa epäsuhta. Ihmisen solut, jotka ovat MMR-taitavia, heterodimeerejä, jotka sisältävät bakteeri- MutS- homologi MSH2 sitoa epäsuhta, ja sitten heterodimeerejä, jotka sisältävät bakteeri- MutL homologi MLH1 liittävät proteiini: DNA-kompleksi välittävän rekrytointiin korjaus tekijöitä Leikataan epäsuhta ja palauttaa oikeat DNA-sekvenssin. MMR-puutteelliset solut eivät pysty korjaamaan epäsuhta, jolloin sisällyttäminen virheiden osaksi DNA-templaattina ja mutaattori- fenotyypin.

MMR puute on vahvasti yhteydessä syövän. Ituradan mutaatio MMR geenien, erityisesti MLH1 tai MSH2, on perusta perinnöllinen ei-polypoosin peräsuolen syöpä (HNPCC), tai Lynch oireyhtymä, joka antaa paksunsuolen syöpään altistava vaan myös muiden erityisten syöpätyyppeihin mukaan lukien kohdun limakalvon ja munasarjasyövän (tarkistetaan in 3,4). Mutaation tai hypermetylaatiota MMR-geenien somaattisten solujen liittyy noin 15%: satunnaista paksusuolen ja peräsuolen syöpiä, samoin kuin 10-15% munasarjojen, kohdun limakalvon ja mahalaukun syövistä (tarkistetaan 5). MMR puutos ja MSI on myös havaittu jopa 20% leukemioiden potilailla, jotka relapsi tai että sairastuminen seurauksena ennen kemoterapiaa [6].

MMR puute ja MSI esiintyy myös ensisijainen keuhkosyöpä liittyy tupakointi tai altistuminen kromia [7-9]. Syövät MSI on raportoitu olevan vastustuskykyisiä useille standardi-of-care kemoterapeuttisten aineiden, kuten antimetaboliittina 5-fluorourasiilin (5-FU), platinan yhdisteet sisplatiinin ja karboplatiinin, alkyloiva lääke temotsolomidia ja topoisomeraasiestäjä etoposidi [ ,,,0],10]. Inaktivointi MMR reitti voi sallia solujen sietämään tietyntyyppisiä DNA-vaurioita aloittamatta polun ohjelmoidun solukuoleman [11].

Yksi haaste tunnistaa hoitomuotoja MMR-puutteellinen syöpiä on, että molekyyli tavoitteet ja kliinisen fenotyypit johtuvat inaktivoitumisen MMR geenien ovat vaihtelevia. MMR puutos voi johtaa lukukehysmutaatioita geeneissä, jotka sisältävät toistuvia sekvenssejä DNA, ja vähintään 30 geenit on tunnistettu mahdollisina kohteina MSI, kuten onkogeenien BRAF ja KRAS, ja DNA-vaurioita muuniresponssigeeneinä MRE11, BRCA1 ja ATR [ ,,,0],12,13]. Pyrkimykset tunnistaa uusia hoitotavoitteet, näytteille synteettinen kuolleisuutta kanssa MMR-puutosta syöpäsolut ovat paljastaneet vaihtelua geneettisen tavoitteita lakkaa toimimasta MLH1 tai MSH2 [14]. Yhdessä nämä havainnot tukevat ajatusta, että syöpiä MSI edustavat monitahoista, heterogeeninen joukko sairauksia. Kun otetaan huomioon monimutkaisuus MSI kasvainten, olemme aiemmin ehdottanut kohdistaminen loppuun fenotyypin tai ”tila” epäsuhta korjaus puutos itsessään [15,16].

Nykyisessä vaivaa tässä kuvatut, tavoitteenamme oli kehittää välineet, joiden avulla tutkimusten aiheuttamaa yhteensopimattomuuden korjauksen puute. Kuvaamme täysin isogeenisiin solulinja järjestelmä, jossa ilmentyminen MMR geenin MLH1 voidaan kytkeä päälle tai pois päältä shRNA. Kuten mallijärjestelmä käytimme keuhkoadenokarsinooma NCI-H23, solulinja valitaan perustuen suhteellisen korkea MLH1, joita voidaan palautuvasti inaktivoitu shRNA. Tässä tutkimuksessa olemme aiheuttaa MMR puutos NCI-H23 solulinjassa järjestelmä ja osoittaa, että tämä johtaa MSI ja lisääntynyt vastustuskyky DNA: ta vaurioittavat aineet. Mahdollisena askeleena kohti kehittää terapeuttinen että tavoitteet loppuun ”tila” MMR puutos, me myös käyttää tätä solulinjaa järjestelmä edelleen vahvistaa uuden luokan metallikompleksien että tavoite DNA epäsuhta.

Materiaalit ja menetelmät

Short hiusneula-RNA (shRNA) B

Jaksot ennustettu kaataa ilmaus MLH1 tai MSH2 geenit suunniteltu käyttäen BLOCK-IT RNAi Designer (Life Technologies). Neljä itsenäistä sekvenssit kutakin geeniä valittiin ehdokkaaksi shRNA laukaisee kuten alla (numerointi osoittaa kannan cDNA).

MLH1.

362 GCCTGAAGTTGATTCAGATCC

740 GCAGGTATTCAGTACACAATG

928 GGTTACATATCCAATGCAAAC

2237 GCGCTATGTTCTATTCCATCC

MSH2.

399 GCATCCAAGGAGAATGATTGG

1102 GGATTAAGCAGCCTCTCATGG

1260 GCAGCAAACTTACAAGATTGT

2359 GGGCTATATCAGAATACATTG

käytetty menetelmä rakentamista shRNA kasetteja on kuvattu yksityiskohtaisesti muualla [17]. Lyhyesti, shRNA sense-loop-antisense konstruktioita Näiden sekvenssit muodostettiin PCR käyttäen TTCATGAGA kuin silmukka järjestyksessä. Lopullinen PCR-tuote, joka sisälsi mielessä silmukan-antisense shRNA sekvenssit reunustavat

attB1

päällä ja TH1 promoottorin 5′, ja irtisanominen signaali ja

attB2

sivusto 3′-päähän, kloonattiin sitten Gateway vektoriin pDONR (Life Technologies). Gateway rekombinaatiotekniikoita käytettiin sitten siirtää shRNA kasetit Gateway-yhteensopivat lentiviral kohde vektorit pLV736G tai pLV739G.

Lentivirusvektorikonstruktit varastot valmistettiin, kuten on kuvattu [17]. 293-METR soluihin [18] transfektoitiin pLV736G tai pLV739G vektori, joka sisälsi yksittäisen shRNA kasetti yhdessä plasmidien, jotka sisältävät Gag /Pol, Rev, ja Env-geenit. Yön yli inkuboinnin jälkeen, supernatantti otettiin talteen, suodatettiin, konsentroitiin ultrasentrifugoimalla ja säilytettiin -80 ° C: ssa.

solulinja sukupolven

NCI-H23-soluja saatiin American Type Culture Collection (ATCC ) kasvatettiin RPMI-elatusaineessa, jossa oli 10% naudan sikiön seerumia. Lentivirus transduktion, NCI-H23-soluja, ympättiin 2 x 10

4 solua per ml 12-kuoppalevyille ja inkuboitiin yön yli. Imettiin pois soluista ja korvattiin Opti-MEM media (Life Technologies), joka sisälsi 10 ug /ml dietyyliaminoetyyli-dekstraani (GE Healthcare Life Sciences) ja 1-5 x 10

6 transduktio yksikköä millilitraa kohti (TU /ml ) of lentiviruksen. Solut transdusoitiin lentiviruksen sisältävien MLH1 shRNA tai MSH2 shRNA. Levyjä inkuboitiin yön yli, ja sitten jotka sisälsivät lentivirukselle imettiin pois ja korvattiin tuoreella RPMI media. Jälkeen 1-3 päivää (d), soluja lisättiin 6-kuoppaisille levyille ja niitä kasvatettiin läsnä valinta-aineen (250 ug /ml G418: aa ja MLH1 ja 2,5 ug /ml puromysiiniä ja MSH2). 500 ng /ml doksisykliiniä (Sigma-Aldrich) lisättiin solujen ilmentymisen indusoimiseksi shRNA.

Soluja kasvatettiin valinta ja shRNA indusoi vähintään 2 kuukautta maljattiin 96-kuoppaisille levyille tiheydellä 0,3 solua per kuoppa valita yhden solun alakloonit. Yhden solun jatkokloonit laajennettiin ja ylläpidetään valinnan olosuhteissa. Indusoimatonta käytetyt solut verrattuna indusoidun subklooneja saatiin viljelemällä Subkloonien ilman doksisykliiniä vähintään yhden viikon ajan.

Vasta-aineet ja Western blot

Protein lysaatit valmistettiin lyysipuskurissa ( 50 mM HEPES, 1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA, 10% glyseroli, 1 mM ditiotreitoli), johon fosfataasi ja proteaasi-inhibiittoreita (20 mM glyserofosfaatti, 100 mM natriumfluoridi, 0,5 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, 0,1 mM natriumortovanadaattia, 10 ug /ml leupeptiiniä) lisättiin. Lysaatit kirkastettiin sentrifugoimalla ja analysoitiin sitten SDS-PAGE 4-12% Bis-Tris geeleillä (Life Technologies), jota seuraa immunoblottaus. Ensisijainen vasta käytettiin vastaan ​​MLH1 (Becton Dickinson # 551091), MSH2 (Becton Dickinson # 556349), GAPDH (Abcam # ab9484), fosforyloitu histoni H2AX (Millipore # 05-636) tai tubuliinin (Cell Signaling # 2148). Ensisijainen vasta-aineet havaittiin toissijaisen vasta-aineilla konjugoituna IRDye700 tai IRDye800 (Licor) ja visualisoidaan kanssa licoria Odyssey. Jokainen western blot Koe toteutettiin vähintään kahdesti, riippumattomia päivinä. Edustavat tiedot yhdestä kokeesta on esitetty.

DNA-fragmentti analyysi

Genominen DNA NCI-H23-alakloonit valmistettiin käyttäen DNeasy (Qiagen). Multiplex PCR-reaktiot suoritettiin MSI Analysis System, versio 2.1 (Promega). PCR-tuotteet analysoitiin ABI 3130 sekvensseri, ja sitten analysoitiin käyttämällä GeneMapper ohjelmistoa (Life Technologies). Alakloonien että näytteillä MSI vähintään yksi merkki ensimmäisessä kokeessa testattiin uudelleen erillisellä kokeella tulosten varmistamiseksi.

Solun luelinkykymäärityksillä

Solut kasvatettiin ilman tai läsnä doksisykliini levytettiin at 2000-5000 solua kuoppaa kohti 96-kuoppaisille levyille ja annettiin inkuboitua yön yli. Soluja käsiteltiin sitten yhdisteiden annos-vaste-4d. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin käyttämällä Cell Titer-Glo määritystä (Promega) ja ATP aineenvaihduntaa. Solujen elinkelpoisuus määritykset suoritettiin kahtena kappaleena vähintään 3 toisistaan ​​riippumattoman kokeen. Edustavat tiedot yhdestä sellaisesta kokeesta on esitetty.

Faasikontrasti- kuvantaminen soluihin leviämisen kokeet suoritettiin käyttäen IncuCyte kanssa 20X objektiivin (Essen BioScience).

Colony muodostavat määrityksiä käytettiin myös testaamaan solujen elinkelpoisuuden seuraava yhdiste hoitoon. Kasvatettujen solujen läsnä ollessa tai ilman doksisykliiniä maljattiin 500-2000 solua per kuoppa 6-kuoppaiselle levylle ja annettiin inkuboitua yön yli. Soluja käsiteltiin yhdisteillä on annos-vaste 24 tuntia (h), ja sitten imettiin pois ja korvattiin tuoreella väliaineella, joka ei sisältänyt yhdistettä. Pesäkkeet visualisoitiin kristalliviolettivärjäys on 10-12d.

Vanheneminen liittyy beeta-galaktosidaasi (SA – gal) tuotantoa arvioitiin käyttäen histokemiallista väriä-galaktosidaasin aktiivisuus pH 6,0 (Sigma-Aldrich) . Solut olivat käsittelemättömiä tai niitä käsiteltiin yhdisteillä kuten 3D, ja sen jälkeen solut kiinnitettiin, värjättiin SA – gal ja kuvattiin käyttäen Zeiss Axio -käänteismikroskoopissa varustettu värikamera.

Tilastollinen analyysi

solujen elinkelpoisuuden määritykset, pariksi t testejä käytettiin verrata puoleen maksimaalisesta estävä (IC

50) tai mediaani tappava annos (LD

50) arvot useista kokeista ja määrittää p-arvot. P-arvot yhtä suuri tai pienempi kuin 0,05 katsottiin tilastollisesti merkittäviksi. Tilastollinen analyysi tehtiin Graph Pad Prism ohjelmistoa.

Microarray-analyysi

Kokonais-RNA valmistettiin rinnakkaisnäytteitä solujen kasvun log-faasissa, käyttäen RNeasy mini (Qiagen). Ehjinä oli arvioitava Bioanalyzer. Cy3- ja Cy5-leimattua RNA: ta valmistettiin 200 ng kokonais-RNA: näytettä kohti, ja hybridisoidaan sitten Human Whole Genome Arrays (Agilent Technologies) mukainen Agilent Two-Color Microarray-Based Gene Expression Analysis Protocol. Tiedot analysoitiin Rosetta Resolver.

Kemialliset yhdisteet

synteesi [Rh (HDPA)

2chrysi]

3 + ja [Rh (DIP)

2chrysi]

3 + on kuvattu [19,20]. Synteesi [Rh (DPE) (phen) (Chrysi)]

3 + äskettäin raportoitu [21]. Sisplatiini, doksorubisiini, etoposidi, 6-tioguaniini ja temotsolomidi saatiin Sigma-Aldrich ja liuotettiin DMSO: hon tai veteen. CDK4 /6-inhibiittori PD-0332991 [22], käytettiin positiivisena kontrollina vanhenemista määrityksiin, syntetisoitiin julkaistujen menetelmien mukaisesti.

Tulokset

inhibitio MLH1 mukaan shRNA alentaa MLH1-proteiinin tasot

NCI-H23 keuhkon adenokarsinoomasolulinja on taitavia epäsuhta korjaus- ja sisältää suhteellisen suuria MMR proteiinien MLH1 ja MSH2 [23]. Jonka tavoitteena on tuottaa sovitetun järjestelmän, joka indusoi MMR puute ja mahdollistaa suoran vertailun MMR-taitavia soluissa, me testasimme ovatko ilmentymistä näiden MMR proteiineja voitiin vaimentua mukaan shRNA. NCI-H23-soluja transdusoitiin lentiviruksen sisältävien indusoitavissa shRNA on MLH1 tai MSH2, ja solut, jotka stabiilisti integroitu konstrukti genomiin valittiin ja laajennettiin. Normaaleissa kasvuolosuhteet, integroidun shRNA ei ollut aktiivinen, ja MMR-proteiinien edelleen ilmaista. Ilmentymisen shRNA säädeltiin käsittelemällä soluja doksisykliini. Kun shRNA indusoitiin, proteiini lysaatit soluista, jotka sisälsivät tahansa neljästä shRNA rakentaa vastaan ​​MLH1 osoitettu kohteen täydellinen ( 90%) inhibition MLH1-proteiinin (kuvio S1). Sen sijaan MSH2 proteiini vain osittain vähentynyt induktion jälkeen kaikki neljä MSH2 shRNA rakentaa NCI-H23-soluja (kuvio S1) ja näitä soluja ei ole vielä tunnettu.

Koska mahdollisten vaihtelevuutta shRNA ilmentymisen solun sisällä populaation, me eristetty ja karakterisoitu yhden solun subkloonin NCI-H23-soluja, transdusoitu jonkin shRNA-konstruktit, MLH1 928. Soluja kasvatettiin läsnäollessa doksisykliini indusoivan MLH1 shRNA vähintään yhden kuukauden ajan, ja sitten päällystetty yhden soluja, jotka laajennettiin pesäkkeet, jotka pidettiin asiakkuutta olosuhteissa. MMR-proteiinin tasot olivat sitten uudelleen arvioida immunoblottauksella. NCI-H23-alakloonit, jotka ilmensivät MLH1 shRNA jatkuvasti vähensivät MLH1-proteiinin 90%, vaikuttamatta tasot MSH2 proteiinia (kuvio 1).

MLH1 proteiinin tasot NCI-H23 alakloonit indusoi varten MLH1 928 shRNA verrattiin MLH1 proteiinin tasot NCI-H23 vanhempien soluja (H23). Proteiini lysaatit analysoitiin SDS-PAGE ja immunoblottaus varten MLH1 ja MSH2 proteiinin tasot. GAPDH: ta käytettiin kontrollina proteiinimäärän.

alassäätely MLH1 indusoi mikrosatelliittimerkkien epävakaus

Valitsimme vähintään 20 subkloonin NCI-H23-soluja, jotka ilmaisivat MLH1 shRNA testata MSI. Genominen DNA valmistettiin vanhempien NCI-H23-soluista ja kustakin subklooni, ja sitten multiplex PCR suoritettiin monistaa standardia paneeli mikrosatelliittimarkkerin (BAT-26, BAT-25, MONO-27, NR-21 ja NR-24 ). Fragmentti koot Sitten PCR-tuotteet analysoitiin DNA-sekvensserin. Kaikki NCI-H23 alakloonit osoitti MSI klo mononukleotidi toista BAT-26 [24], osoitetaan siirtymä 1-3 nukleotidin lokuksessa (kuva S2). MLH1 puutos riittää siten aiheuttaa MSI. Useat Subkloonien näytetään myös mahdollista MSI on toinen merkki, jolla on itsenäinen subklooneja, jotka osoittavat muutoksen eri merkkiaineiden (kuva S2). Alakloonien 4-10 ja 4-13, joista saatiin transduktion NCI-H23-solujen kanssa MLH1 928 shRNA konstruktio, valittiin ylimääräisiä fenotyyppianalyysillä.

alassäätely MMR geenien shRNA on palautuva

NCI-H23 yksisoluisia jatkokloonit ylläpidettiin kasvuolosuhteissa että jatkuvasti aiheuttama shRNA ilme. Sen testaamiseksi, shRNA-välitteisen downregulation MLH1 oli palautuva, solut kustakin subkloonista jaettiin kahteen erilliseen viljelmiä, yksi kulttuurin yllä, kun läsnä on doksisykliini säilyttää MLH1 puute, ja muut kulttuurin kasvatettiin ilman doksisykliiniä, jotta MLH1 ilme. Viikon kuluttua proteiini lysaatit valmistettiin soluista, ja MLH1-proteiinin taso määritettiin immunoblottauksella. Koska doksisykliini, soluja 4-10 ja 4-13 subklooneja pystyivät uudelleen ilmaista villityypin tasot MLH1-proteiinin (kuvio 2). Ei kaikki Subkloonien testattu pystyivät uudelleen ilmaista MLH1 proteiinin kasvatuksen jälkeen ilman doksisykliiniä (tietoja ei ole esitetty), mikä viittaa siihen, että shRNA näiden alaklooneja voidaan ekspressoidaan konstitutiivisesti.

NCI-H23-alakloonit 4 -10 ja 4-13, jotka oli indusoitu MLH1 shRNA jaettiin kahteen viljelmiä, yksi yllä indusoivat olosuhteet (+ doksisykliini) ja toinen kasvatettiin ilman doksisykliiniä (-), jotta uudelleen ilmentymisen MLH1. Proteiini lysaatit valmistettiin ja analysoitiin SDS-PAGE ja sen jälkeen immunoblottauksella, ekspressiota varten MLH1-proteiinin. Tubuliinia käytettiin verrokkina yhtäläistä Proteiinilisäyksen poikki näytteitä.

MLH1-puutosta NCI-H23 alakloonit eivät näy maailmanlaajuisia muutoksia geenien ilmentyminen

mikrosiruanalyysi suoritettiin NCI-H23 yksittäinen solu subklooneja testata, downregulation MLH1 by shRNA vaikuttaa ilmentymisen muita geenejä. Solut alakloonien 4-10 ja 4-13 olivat joko yllä, kun läsnä on doksisykliini aiheuttaa MLH1 shRNA tai kasvatettiin ilman doksisykliiniä vähintään viikon, jotta uudelleen ilmentymisen MLH1. Emosolulinjassa NCI-H23, joko käsittelemättömiä tai niitä käsiteltiin doksisykliini, sisällytettiin kontrollina. Kokonais-RNA eristettiin rinnakkaisnäytteitä solujen, fluoresoivasti leimattuja, ja hybridisoitiin Agilent koko genomin taulukot. Geeniekspressiomalleja indusoimattomassa subklooneja olivat samanlaisia ​​kuin emo-NCI-H23-soluja, joko käsittelemättömien tai doksisykliinillä (tuloksia ei ole esitetty). Tasoilla MLH1 geenitranskriptin pieneni noin kolminkertaiseksi että 4-10 ja 4-13 subkloonit jossa MLH1 shRNA oli indusoitu (kuva S3). Laajempi geenin ilmentymisen allekirjoitus liittyy MLH1 shRNA induktio ei ilmene data (kuva S3).

MLH1-puutosta NCI-H23 alakloonit näytteille lisääntynyt vastustuskyky kemoterapeuttisia lääkkeitä

Seuraavaksi testasimme ovatko aiheuttama MMR puutos aiheuttaa resistenssiä DNA: ta vaurioittavat aineet. Olemme suoraan verrata MMR-puutteellinen NCI-H23 subklooneja MMR-taitavia solujen samasta subkloonista, jotka saatiin antamalla solujen uudelleen ilmaista MLH1. MMR-puutteellinen ja MMR-asiantunteva alakloonit käsiteltiin topoisomeraasin inhibiittori etoposidi tai alkyloivan aineen temotsolomidia ja solujen elinkelpoisuus arvioitiin sen jälkeen, kun 4d (kuvio 3A, D). MMR-taitavia alakloonit, jossa shRNA oli indusoimattomia, eivät osoittaneet merkittävää eroa herkkyydessä yhdisteiden verrattuna vanhempien NCI-H23-soluja, jotka olivat joko käsittelemättömiä tai niitä käsiteltiin doksisykliinihoidon (p = 0,34) (kuva S4). Kullekin Hyväksytty soluparille (esimerkiksi aliklooni 4-10 indusoimattoman verrattuna 4-10 aiheuttama), The MLH1-vajaiden solujen olivat jatkuvasti vähintään kaksi kertaa enemmän vastustuskykyisiä näitä yhdisteitä kuin isogeenisissä MLH1-taitavia solujen toteaminen että on tilastollisesti merkitsevä (p = 0,04 käsiteltyjä soluja etoposidi ja p = 0,01 soluja käsiteltiin temotsolomidia) (kuvio 3A, D). MLH1-puutteellinen alakloonit olivat myös resistenttejä silloitusaineen sisplatiini (p = 0,02), puriini-analogi 6-tioguaniini (p = 0,05), ja toisen topoisomeraasin inhibiittori, doksorubisiini (p = 0,04) (kuvio S5). Noin kaksi-kertainen ero elinkelpoisuus MMR-vajaiden solujen versus MMR-taitavia soluissa in vitro reaktiona kemoterapia-aineiden on raportoitu aikaisemmin ja osoitettu kääntää lääkeresistenssin in vivo (tarkistetaan 4,10). Sen varmistamiseksi, että ero vaikutus elinkelpoisuuden johtuu läsnäolo tai puuttuminen MLH1, käytimme eri shRNA sekvenssit, 362 ja 2239, estävän MLH1 ilmaisun ja sitten ominaista solujen herkkyyttä kemoterapeuttisten. Havaitsimme, että MLH1-puutos johtuvat induktion näiden riippumattomien shRNA laukaisee johti vastaavasti lisääntynyt vastustuskyky kemoterapeuttisten suhteessa NCI-H23-soluja, jotka ilmaisivat MLH1 (p = 0,01) (kuva S6).

NCI-H23 alakloonit, jotka indusoimattomia tai indusoitiin MLH1 shRNA käsiteltiin etoposidi (A-C) tai temotsolomidi (D-F). (A, D) Soluja käsiteltiin yhdisteen annettuina pitoisuuksina, ja solujen elinkelpoisuus arvioitiin 4d käyttäen Cell Titer-Glo määrityksessä. Käyrät osoittavat suhteellisen selviytymisen kaksoisnäytteillä yhdestä kokeen. T testit verrata IC

50-arvot useille kokeissa määritettiin p-arvot p = 0,04 käsiteltyjä soluja etoposidi ja p = 0,01 soluja käsiteltiin temotsolomidi. (B, E) Faasikontrasti- kuvia solujen 0h ja 96h ajankohtina aikana solujen elinkelpoisuuden koe on esitetty. Soluja käsiteltiin 390 uM etoposidi (B) tai 500 uM temotsolomidia (E). (C, F) Soluja käsiteltiin yhdisteen 24 annettuina pitoisuuksina, ja pesäkkeenmuodostuskyvyn jälkeen yhdiste huuhtoutumiskauden arvioitiin. Käyrät näyttää eloonjäämisprosentteina at 10d for kaksoisnäytteillä käsiteltyjen solujen etoposidia (C) tai temotsolomidille (F). Vertailu LD

50-arvot useiden kokeiden t-testillä määritetään p-arvot p = 0,03 käsiteltyjä soluja etoposidi ja p = 0,04 soluille käsitelty temotsolomidia.

Tutkitaan ero herkkyys yhdisteitä yksityiskohtaisemmin, olemme kuvaamisen solujen yli 4d hoitojakson aikana solun elinkyvyn ja tutkittiin solujen määrä ja morfologia. Tällä 0h aikapisteessä solut ovat kasvuvaiheessa ja näyttävät terve faasikontrastimikro- kuvantaminen. Kuitenkin mukaan 96h väliset erot indusoimattomassa ja indusoitiin subkloonit ovat ilmeisiä: useimmat MLH1-taitavia solut oli tehty solukuolemaa käsittelyn jälkeen DNA: ta vaurioittavat aineet, kun taas MLH1-vajaiden solujen edelleen lisääntyä (kuvio 3B, E). Hoito DNA: ta vaurioittavat aineet eivät vaikuttaneet MLH1 ilmentymistä indusoimattomassa Subkloonien mutta aiheuttaa lisääntyneen ilmentymisen fosforyloitua histoni H2AX, merkkiaine DNA-fragmentaation [25], mikä viittaa siihen, että MLH1-ilmentävät solut oli tehty apoptoosia (kuvio S7).

Tutkimme lisäksi solujen selviytymistä seuraava yhdiste hoitoon käytetään klonogeeniset määrityksiä. Soluja käsiteltiin etoposidin tai temotsolomidihappona 24 h, ja toipuminen yhdistehoito arvioitiin pesäkemuodostusta jälkeen 10d. MLH1-puutteellinen NCI-H23 alakloonit olivat vastustuskykyisempiä yhdiste kohtelun kuin isogeenisissä solujen taitavia MLH1 (kuvio 3C, F), osoittaa merkittävää eroa LD

50-arvot (p = 0,03 etoposidin, ja p = 0,04 temotsolomidi). Yhdessä nämä tulokset osoittavat ero vasteena DNA-vauriolle, joka perustuu yksinomaan läsnäolo tai puuttuminen MLH1.

MLH1-puutosta NCI-H23 alakloonit näyttö lisääntynyt herkkyys rodiumia metalloinsertor yhdisteitä

aiemmin kuvattu metallikompleksit että kovalenttisesti sitovat DNA epäsuhta kanssa kohtalainen affiniteetti ja korkea spesifisyys, koska termodynaaminen epävakautta yhteensopimattomien emäsparien (tarkistetaan 26). Alussa osoittaneet, että tämä luokka yhdisteitä valikoivasti estää leviämisen MMR-vajaiden solujen käyttäen sovitetun HCT-116 peräsuolen syövän solulinja järjestelmä ja geneettinen Knockout järjestelmä [16,19,21]. Tämä aikaisempi työ oli perusta ja motivaation luomiseksi isogeenisissä solulinjojen kuvattu nykyisessä tutkimuksessa ja sai meidät testata onko rodiumia metalloinsertor yhdisteet myös estävät valikoivasti elinkelpoisuuden näiden solujen kun MPR puute indusoitiin.

meidän indusoituva solulinjan järjestelmä, rodiumin metalloinsertor yhdistettä [Rh (Chrysi) (phen) (DPE)]

3 + inhiboi etusijassa elinkelpoisuutta aiheuttama MLH1-puutosta NCI-H23 alakloonit, vähintään kolminkertaiseksi muutos solun IC

50 on 4d Cell Titer-Glo määritys suhteessa MLH1-taitavia alakloonit (p = 0,01) (kuvio 4A, B). Toinen rodium metalloinsertor yhdiste, [Rh (HDPA)

2chrysi]

3+ myös ensisijaisesti esti leviämisen MLH1-vajaiden solujen (kuvio S8), jossa kaksi- ja kolminkertaiseksi muutos solun IC

50 -arvot (p = 0,02). Vahvista, että ero johtui MLH1 puute pikemminkin kuin off-tavoite vaikutus shRNA, käytimme ylimääräisiä, riippumattomia MLH1 shRNA rakenteista sitoutuminen downregulate MLH1 NCI-H23-soluista ja varmisti, että MLH1-vajaiden solujen olivat ensisijaisesti herkkiä rodium metalloinsertor yhdisteet (p = 0,01) (kuvio S9). Sitä vastoin liittyvä yhdiste, jolla on vain heikko sitoutuminen paritonta DNA, [Rh (DIP)

2chrysi]

3 + [21] ei näy ero vaikutus solujen elinkelpoisuuteen indusoimattomien ja indusoitiin NCI-H23 kloonia (p = 0,90) (kuvio S9). Yhdessä meidän tiedot tukevat hypoteesia, että downregulation MLH1 lisää solun herkkyyttä rodium metalloinsertor yhdisteitä.

NCI-H23 alakloonit, jotka indusoimattomia tai indusoitiin MLH1 shRNA hoidettiin rodiumin metalloinsertor yhdistettä [Rh (Chrysi) (phen) (DPE)]

3+. (A) Soluja käsiteltiin pitoisuuksina, ja solujen elinkyky arvioitiin sen jälkeen, kun 4d käyttäen Cell Titer-Glo määrityksessä. Prosenttia elinkelpoisuus kaksoisnäytteillä yhdestä koe on esitetty. P-arvo määritettiin p = 0,01, jonka t-testillä. (B) Faasikontrasti- kuvia käsiteltyjen solujen 5 uM [Rh (Chrysi) (phen) (DPE)]

3+ 0h ja 96h aikana solunelinkykyisyysmääritys näkyvät. (C) Soluja käsiteltiin [Rh (Chrysi) (phen) (DPE)]

3 + 24 tuntia, ja sitten määritettiin pesäkemuodostusta jälkeen 10d. Käyrät osoittavat prosenttia selviytymisen rinnakkaisnäytteitä yhdisteillä käsiteltyjen solujen. P-arvo määritettiin p = 0,01, jonka t-testillä.

tarkasteltiin solun morfologiaa NCI-H23 alakloonit käsitelty [Rh (Chrysi) (phen) (DPE)]

3+ aikana kuluessa proliferaatiomäärityksillä käyttäen vaihe kontrasti kuvantaminen. Soluja MLH1-taitavia ja MLH1 puutteesta alaklooneja ilmestyi terveenä ja kasvuvaiheessa tällä 0h ajankohtana. Vuoteen 96h, indusoimattomassa MLH1 taitava solut olivat edelleen lisääntyä, mutta vähemmän soluja näytti olevan käynnissä mitoosia, mikä viittaa solusyklin viivästyminen tai pidätys (kuvio 4C). Solut eivät näytä olevan senescent, mistä on osoituksena ei tuoteta SA – gal [26] (tuloksia ei ole esitetty). Sen sijaan, suurin osa MLH1-vajaiden solujen ei joko lisääntyä tai oli tehty solukuoleman 96t (kuvio 4C). Olemme varmistaneet, että tämä ero vaikutus johtui läsnä ollessa tai poissa MMR soluissa arvioimalla MLH1-proteiinin tasot soluissa, joita käsiteltiin rodium metalloinsertor yhdisteiden (kuvio S10). Aiemmin osoitti vaikutus shRNA induktio MLH1 proteiinin ilmentyminen ei muuttunut hoidon jälkeen rodiumin yhdisteet (kuva S10).

vahvisti myös lisääntynyt herkkyys MLH1 puutosta NCI-H23 subklooneja rodiumiin metalloinsertor yhdisteitä käyttäen klonogeeniset määrityksiä. 24 tunnin kuluttua hoidon [Rh (Chrysi) (phen) (DPE)]

3 + The MLH1 puutosta NCI-H23 alakloonit muodostivat vähemmän pesäkkeitä kuin isogeenisissä MLH1-taitavia alakloonit, osoittaen merkittävää eroa LD

50-arvot (p = 0,01) (kuvio 4D). Ero herkkyys MLH1-puutteellinen subklooneja rodiumiin metalloinsertor yhdisteet on yhdenmukainen sen hypoteesin kanssa, että nämä yhdisteet saavat aikaan vaikutuksia sitoutumalla DNA yhteensopimattomuuksia, jotka ovat läsnä MMR-vajaiden solujen.

Keskustelu

MMR koulutusjakson ylläpitää genomin vakautta edistämällä tunnustamista ja korjaus yhden emäksen yhteensopimattomuuksia ja pieni lisäys-poisto silmukoita DNA jotka johtuvat replikointi virheitä tai DNA-vaurioita. Lakkaa toimimasta MMR reitin kasvattaa esiintyvyys solun mutaatioita ja voivat aiheuttaa tai edistää syövän. Mekanismi syövän johtuvat perinnöllinen MMR puute on hyvin tutkittu, erityisesti kolorektaalisyöpä [4,27], ja on mallinnettu solulinjassa, kuten HCT-116 O-solut, jotka ovat MLH1 puutteesta vaan sisältävät ylimääräisen kopion Kromosomin 2, ja HCT-116 N soluihin, joissa MLH1 puute täydentää ylimääräinen kopio kromosomi 3, joka sisältää villityypin MLH1 [28]. Muissa syöpätyyppeihin, kuten keuhkosyöpä, MMR puutos voidaan edistää karsinogeeni altistus [7-9]. Kemoterapiaa voi myös edistää MMR puute johtaa toissijaiseen leukemia [6]. Solun line-kuvaamme on ensimmäinen esimerkki isogeenisen mallin aiheuttama MMR puutos, joka voi olla palautuvasti kytkeä päälle tai pois päältä tasolla valvonnan proteiinin ilmentymisen. Se tarjoaa mallin tutkia kysymyksiä aiheuttamaa MMR puute ja joista voidaan todeta molekyylejä, jotka saattavat tarjota terapeuttista hyötyä MMR-puutosta syöpiä.

NCI-H23 täsmäsi solulinjaa kuvattua tässä sallii yksityiskohtainen luonnehdinta ajoituksen ja tapahtumasarjaa, joka johtaa kun MPR puute aiheuttama. Havaitsimme samanlaisia ​​vaikutuksia kolme eri shRNA sekvenssit suunnattu MLH1, ja kahdessa eri yhdessä solussa Alakloonien eristettiin soluista transdusoitu yksi MLH1 shRNA konstrukteja.