Krooninen sairaus

tiivistelmä

varhainen havaitseminen kasvaimia voi merkittävästi parantaa tulos kasvaimen hoitoon. Yksi useimmin kysyttyihin kysymyksiin syöpä kuvantaminen kuinka monta solut voidaan havaita ei-invasiivisesti on elävä eläin. Vaikka monet tekijät rajoittavat tällaisten havaitseminen, lisäämällä valon emission soluista on yksi tehokkaimmista tavoista voittaa nämä rajoitukset. Tässä kuvaamme kehittäminen ja hyödyntäminen lentivirusvektoria sisältää laajennetut tulikärpäsen lusiferaasi (

luc2

) geeni. Saatu yhden solun klooneja hiiren maitorauhasen kasvain (4T1-luc2) osoitti stabiili valon emission välillä 10000 fotonien /s /solu. Joissakin tapauksissa yksittäiset 4T1-luc2 solut asetetaan ihon alle

nu /nu

hiiri voitiin havaita ei-invasiivisesti käyttäen jäähdytettyä CCD-kameraa joissakin tapauksissa. Lisäksi osoitimme, että vain harvat solut kehittämiseen tarvitaan kasvaimia hiirissä ja syövän etenemistä voidaan seurata heti solut istutetaan. Merkittävästi suurempia lusiferaasiaktiivisuus näissä soluissa antoi meille mahdollisuuden havaita mikrometastaasien molemmissa syngeeniset Balb /c- ja

nu /nu

hiirillä.

Citation: Kim JB, Urban K, Cochran E, Lee S , Ang A, Rice B, et al. (2010) Ei-invasiivinen Detection of a Pieni määrä Bioluminescent Syöpäsolut

In Vivo

. PLoS ONE 5 (2): e9364. doi: 10,1371 /journal.pone.0009364

Editor: Alexander Swarbrick, Garvan Institute of Medical Research, Australia

vastaanotettu: toukokuu 12, 2009; Hyväksytty: 02 tammikuu 2010; Julkaistu: 23 helmikuu 2010

Copyright: © 2010 Kim et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat sisäisesti Caliper Life Sciences ja Momenta Pharmaceuticals. Rahoittajat edellyttäen reagenssit, tutkimus tilaa, ja resursseja tähän tutkimukseen. Kuitenkin kirjoittajat yksinomaan mukana tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysit, tai valmisteen käsikirjoituksen. Jarrusatula Life Sciences ja Momenta Biopharma suostui julkaisemaan nämä tiedot tieteellisessä julkaisussa. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Jae-Beom Kim, Konnie Urban, Steve Lee, Bradley Rice, Adam Bata, Kenneth Campbell, Richard Coffee, Alex Gorodinsky, Zhan Lu ja Peter Lassota ovat työntekijöitä Caliper Life Sciences. Hän Zhou, Edward Cochran ja Takashi Kei Kishimoto ovat työntekijöitä Momenta Pharmaceuticals Inc. Kirjoittajat sopivat PLoS One valiokunnalle tiedonjakokäytännöistä. Ei ole papatenttihakemukseen avulla saadut tiedot tämän tutkimuksen.

Johdanto

havaitseminen kasvaimia alkuvaiheessa on kriittinen tehokkaan kasvaimen hoitoon ja tutkimiseen tuumorigeneesin [1], [2] , [3]. Perinteisesti kasvaimen kasvua arvioitiin käyttäen mekaanista tai elektronista jarrusatulat ottaa fyysiset mitat ihonalaisen ihmisen kasvaimista kasvaa immuunipuutteisilla hiirillä [4]. Tämä menetelmä soveltuu kuitenkin vain palpoitavissa kasvaimia kasvaa ihon alle eläinten. Syvempi kasvain massat, kuten osteosarcomas kapseloitu luun, eivät ole vastaanottavaisia ​​suoraan fyysiset mitat. Jopa ihonalainen malleissa kasvaintaakat ei voida tarkasti kvantifioidaan fyysiset mitat, koska turvotus ja nekroottista keskuksia edistää kasvaimen kokoa [5]. Orthotopic kiinteä kasvain malleja kiertää näitä esteitä ja mahdollistaa melko tarkan arvion kasvaintaakat punnitsemalla leikataan, ”puhdistettu” kasvaimia jälkeen eläimet tapetaan. Klassinen potilaalle tehdä mallit ovat epäkäytännöllisiä arviointia yhdisteiden tehosta, koska ne vaativat suuria määriä eläimiä uhrattavaksi kunakin ajankohtana. Samoin tunnistaminen kasvaimia ja kvantifiointi tuumoritaakka malleissa etäpesäkkeiden kysynnän tyhjentävä ja työläs histologiset analyysit [6], [7], [8].

Noninvasiiviset koko kehon bioluminenssina kuvantamisen (BLI) sallii toistuvan , reaaliaikainen

in vivo

seurantaan kasvaimen kasvua koe-eläimillä, riippumatta kasvaimen paikoissa. Toisin kuin fluoresenssi, BLI, osoittaa erittäin vähän tausta signaalit eläinten kudoksista [9]. Siksi BLI voidaan havaita suhteellisen heikkoja signaaleja, joilla on korkea signaali taustan suhteen. Koska sen monipuolisuus, BLI on hyväksytty opiskelemaan prekliinistä tehoa lääkeaihiota [10], [11], [12], [13] sekä eri osa nisäkkäiden biologian kautta toimittaja analyysit [14], [15].

Äskettäin Firefly (

Photinus pyralis

) lusiferaasia uudelleen suunniteltu edelleen optimoida sen nisäkässoluissa. Verrattuna edellisten sukupolvien lusiferaasin, uusi versio (

luc2

) tarjoaa yli neljän-kertainen valon emission johon päästiin kodonioptimointi ja poistamalla mahdollisia transkriptiotekijän sitoutumiskohtia [16]. Me olettaisi, että yksittäiset syöpäsolut voidaan havaita

in vivo

hyödyntämällä lisääntynyt bioluminenssi

luc2

. Tätä varten me valmistimme lentivirusvektoria jossa

luc2

ekspressiota ohjaa kautta ihmisen ubikitiinipromoottori C-promoottori [17]. Sitten rakenne transfektoitiin stabiilisti osaksi 4T1 hiiren maitorauhasen kasvainsolulinjaa [18], [19]. Useita vakaa, yksisoluiset klooneja (4T1-luc2) myöhemmin eristetty valon emission välillä 10.000 fotonien /sec /solu. Täällä, me raportoimme että ainakin joissakin tapauksissa havaita yksittäinen syöpäsolu

in vivo

jollakin näistä luc-2 leimattu kloonien saavutettiin. Olemme myös osoittaa kasvaimia peräisin vain harvat solut istutettiin

nu /nu

hiirillä ja havaitseminen metastaasien syngeenisiin Balb /c-hiirissä. Parhaan tietomme, tämä on ensimmäinen raportti havaita yksittäisen bioluminoivan solun

in vivo

käyttäen noninvasiivinen kuvantaminen menetelmä. Sellaiset kirkas soluja voidaan tehokkaasti käyttää valvomaan tehoa lääkekandidaatteja malleissa etäpesäkkeiden ja potilaalle tehdä kasvainmuodosta, seurata metastaattisen migraation syöpäsolujen, ja voidaan myös käyttää tarkasti onko jäljellä taudin esiintyminen hoidon jälkeen.

tulokset

Generation of lentivirusvektoria järjestelmä ja Vakaa 4T1-luc2 Cell Lines

lentivirusvektoria sisältävä tulikärpäsen

luc2

geeni konjugoitu ihmisen ubikitiinipromoottori C promoottori rakennettiin tuottamaan vakaa bioluminesoiviin syöpäsolulinjoissa [16], [17], [18]. Hiiren maitorauhasen kasvain 4T1-solut transfektoidaan sitten lentivirusvektorin ja vakaa kloonit valittiin käyttäen puromysiinin (4T1-luc2). Kahdeksan kloonia valittiin jatkotutkimuksiin ja niiden lusiferaasiaktiivisuudet seurattiin neljän viikon ajan ilman selektiomarkkeri. Vaikka oli vaihtelua kloonien joukossa, joista suurin osa klooneista vapautuu enemmän kuin 3000 fotoneja /sec /solu valoa. Ottaen huomioon, että useimmat solulinjat merkitty aikaisempien sukupolvien lusiferaasin päästävät alle 250 fotonit /sec /solu, meidän luc2 kloonia huomattavasti korkeampi valon emission [20]. Yllättäen yksi klooni (C26) aluksi vapautuu niin paljon kuin 52000 fotoneja /sec /solu mutta sen valon emission laski 6400 fotoneja /sec /solu neljän viikon kuluttua (kuvio S1A). Sen vahvistamiseksi, että mitään muutoksia solun fysiologian tapahtui merkintöjä /kloonaus prosessi, vertasimme kloonit alkuperäiseen vanhempien 4T1 soluja useilla eri tasoilla. Ensiksi, tutkimme kasvutavat. Kahdeksan alussa valittu kloonien, valitsimme kaksi riviä (C27 ja C38) ja verrattiin kasvutapaan parentaalikantaan 4T1 soluja. Molemmat linjat oli samanlainen kaksinkertaistaminen kertaa emosoluista (12,6 tuntia kaksinkertaistaa aika niin kloonit, vs. 12,0 tuntia alkuperäisestä 4T1-solut).

tutki myös muita kriittisiä parametreja solujen fysiologiaa, mukaan luettuna vaikutukset ATP kulutuksen . Koska lusiferaasi käyttää yhden molekyylin ATP tuottaa kullekin fotoni valon, korkea valon emission voisi vahingoittaa solun aineenvaihduntaa johtuen ehtyminen sen ATP-allas. Sen testaamiseksi, korkean valon tuotanto vaikuttaa solujen fysiologiaan, havaitsimme solujen kasvua neljän päivän ajan, kun läsnä on korkeita pitoisuuksia lusiferaasisubstraattia, D-lusiferiinin (150 ja 300 ug /ml /päivä). Tulokset osoittivat, että, kun läsnä on D-lusiferiini, 4T1-luc2 klooneista osoitti samanlaista kasvua kuvioita kuin viljeltyjen solujen ilman D-lusiferiini ja vanhempien 4T1-solut (kuvio S1B, C, D). Tämä viittaa siihen, että 4T1-luc2 solut voivat kestää kulutusta ATP tarvitaan nopean valoemission ilman merkittävää vaikutusta solun ATP-allas.

Koska klooni C26 osoitti laskussa lusiferaasivaikutusta ajan yritimme toisella kierroksella rajoitettu laimennus yksittäisen solun kloonaus alkuperäisestä sekoitettu väestöstä. Neljä kirkas kloonit valittiin ja niiden lusiferaasiaktiivisuudet (valon emission) seurattiin kuuden viikon ajan ilman selektiopainetta (kuvio 1A, B). Kaikki kloonit perin tuotettu yli 40000 fotoneja /sec /solu; Sitten valoemission laski 10000 fotoneja /sec /solu, ja vakiintui tällä tasolla. Se pysyi stabiilina neljä viikkoa ilman puromysiiniä (kuvio 1 B). Näiden kloonien 1A4 klooni (4T1-luc2-1A4) valittiin jatkotutkimuksiin. Kasvu kuvio 4T1-luc2-1A4 oli verrattavissa vanhempien 4T1 solujen läsnä ollessa, tai puuttuminen D-lusiferiinin (kuvio 1 C, D, E). Voit osoite syy alkuperäisen lasku valon emission 4T1-luc2-1A4 klooni, suoritimme rajoitettu laimennus kulttuuri 96-kuoppalevyillä. Kun solut kasvoivat noin 25% konfluenssiin, tutkimme lusiferaasin ilmentymisen bioluminescent kuvantaminen. Jokainen hyvin sisältäviä solut osoittivat lusiferaasiaktiivisuus. Nämä tulokset osoittavat, että alkuperäinen lasku lusiferaasiaktiivisuuden ei johtunut menetys lusiferaasin ilmentymistä tietyissä soluissa kloonin (kuva S2).

(A) Generation of 4T1-luc2-1A4 soluja. Hiiren maitorauhasen kasvain 4T1-soluja transfektoitiin sisältävän lentivirusvektorin parantaa lusiferaasia 2 kurissa ihmisen ubikitiinipromoottori C-promoottori [16], [18]. Puromysiiniresistenttiä kloonit eristettiin ja niiden lusiferaasin ilmaisuja seulottiin bioluminenssina. Kaksi kierrosta kloonauksen syntyy 4 yhden solun klooneja 4T1-luc2. Lusiferaasiaktiivisuudet mitattiin käyttämällä IVIS Spectrum (Binning: med, f stop: 1, valotusaikaa: 1 sek). Tyypillinen bioluminesenssi kuva testausta vakauden lusiferaasiekspression näkyy. Yhteensä flux (fotonit /s) kvantifioitiin käyttäen Living Image ohjelmisto 3.0. Klooni 4T1-luc2-1A4 valittiin ja käytettiin lisätutkimuksiin. (B) Stability Lusiferaasiaktiivisuuden neljästä 4T1-luc2 klooneja. Soluja kasvatettiin 6 viikkoa säännöllisesti median ilman puromysiinissä ja valon emissio seurattiin viikoittain. Kaikki kloonit osoittivat yli 7000 fotoneja /sec /kenno valon emission koko testin ajan. (C) kasvukäyrät 4T1-luc2-1A4 klooni ja vanhempien 4T1 soluja. Soluja kasvatettiin 4 päivää säännöllisesti kasvualustaa puromysiini. Yhteensä määrä soluja ajan piirrettiin sisään logaritmisella asteikolla. Molemmat solulinjat osoittivat samanlaisia ​​kasvuvauhtiin ja kaksinkertaistaa kertaa. (D, E) Kasvu 4T1-luc2-1A4 klooni ja vanhempien 4T1 solujen läsnäollessa D-lusiferiini. Solut syötettiin D-lusiferiini kerran päivässä (150 ug /ml /päivä, D), tai kaksi kertaa päivässä (300 ug /ml /päivä, E), vastaavasti, kerättiin kunakin ajankohtana ja laskettiin. Läsnäolo ylimäärä D-lusiferiini ei vaikuttanut yleiseen kasvuun kuviot 4T1-luc2 soluissa.

Noninvasiiviset havaitseminen Pieni solumääristä

nu /nu

Hiiret

Koska 4T1-luc2 solut osoittivat erittäin korkea valon emission, seuraavan kerran yrittänyt havaita pieniä määriä näitä soluja

in vivo

. Aluksi 4T1-luc2-1A4 solut valmistettiin laimennossarjaa käyttämällä menetelmää ja istutettiin molempiin kylkiin naaraspuolisen nu /nu-hiirissä (kuvio 2). Eri määrä soluja istutettiin jokaisen implantaatiokohtien. Kuusi implantaatioiden suoritetaan jokaiselle solujen lukumäärä (3, 5, 10, ja 50 solua). Bioluminesenssi kuvat otettiin heti implantations. Käyttämällä erittäin herkkä jäähdytetty CCD-kamera, pystyimme havaitsemaan niinkin vähän kuin 3 soluja tässä kokeessa (kuva 2A-D, punainen pilkullinen ympyrät). Joissakin tapauksissa kuitenkin, emme havaitse mitään merkityksellisiä signaaleja sivustoja istutusta (Kuva 2A-D, keltainen pilkullinen ympyrät). Tämä voi johtua solukuolemaan heti istutuksen tai luonnostaan ​​vaihtelevaa Sarjalaimennosten tapaa, kun aiottu solujen määrä on hyvin pieni (kuvio 2A-D, keltainen ympyrä). Erikseen, otimme PC3M-luc-C6, joka oli yksi kirkkaimmista solulinjojen (~250 fotoneja /sec /solu) tuottama meille tähän asti (käyttäen useita kierroksia transfektioista mukaan pGL3) ja sitä verrattiin 4T1-luc2-1A4 soluissa , istuttamalla molemmat SCID-bg hiirillä (kuva S3). Tulokset osoittavat, että bioluminescent signaalit 10

2 4T1-luc2-1A4 solujen pörröinen hiirillä oli helposti havaittavissa, kun taas mitään signaalia ei havaittu samasta määrä PC3M-luc-C6-soluissa.

( AD) Määritelty määrä soluja istutettiin ihon alle selän kylkeen alueilla naisten nu /nu -hiirten [1]. Kukin hiiri sai kaksi implantations. Sisäkkeet osoittavat solujen lukumäärä implantoitu. D-lusiferiini injektoidaan hiiriin heti istutuksen ja bioluminescent kuvat on otettu (t = 0) käyttäen IVIS spektri (FOV, A, binning, pienet, f pisteellä; 1, valotusaika, 5 min). (E-H) 6 tunnin kuluttua implantaatiosta, kaikki hiiret uudelleen kuvattiin käyttäen samoja asetuksia IVIS spektri (t = 6 h). Punainen ympyrät edustavat implantaatiokohtien joka oli bioluminesoiviin signaaleja yli autoluminescence. Keltainen ympyrät osoittavat implantaatiokohtien jotka eivät tuottaneet mitään merkityksellisiä signaaleja johtuen mahdollisesti välittömästi solukuolemaan. (I) välinen korrelaatio määrä istutettujen solujen ja koko vuon implantaatiokohtien. Bioluminescent signaalit kvantitoitiin käyttäen Living Image-ohjelmiston 3,0 ja funktiona määrän soluja. Mitattu intensiteetti bioluminenssin oli suoraan verrannollinen istutettujen solujen. Tähdellä (*) osoittaa kudoksen autoluminescence.

Kuusi tuntia sen jälkeen, kun implantations, me uudelleen kuvaamisen samoja eläimiä (Kuva 2E-H). Kuten odotettua, joka perustuu vihamielinen implantaation jälkeisiä ympäristö, 4 sivustoja 10- ja 50 soluistutusryhmä sivustojen menettäneet alkuperäisen bioluminesoiviin signaalit (kuvio 2G, H). Yllättäen kuitenkin pystyimme havaitsemaan signaaleja 3- ja 5 soluistutusryhmä sivustoja (kuvio 2E, F). Meidän analyysit kuvat otetaan välittömästi implantoinnin jälkeen (t = 0) ilmoittaa, että koko vuon implantaatio on suoraan verrannollinen solujen lukumäärä istutettiin (kuvio 2I). Tämä on yhdenmukainen muiden tietojen (ei esitetty), mikä osoittaa lineaarisen suhteen valon emission ja solujen lukumäärä päällystetty

in vitro

. Näiden tulosten perusteella, osoitimme, että bioluminenssina mittaus on uskottava tapa saavuttaa ei-invasiivisia seuranta varhaisen kasvaimen kasvua

in vivo

.

Detection of a Yhden Bioluminescent 4T1-luc2 Cell

in vivo

Kun olet vahvistanut noninvasiivinen havaitseminen kolme solua

in vivo

, me haastoi itse havaitsemaan yhden 4T1-luc2-1A4 solun jälkeen ihonalaisen istutuksen. Poistamiseksi kokeellisen virheen ja lisätä tarkkuuden määrittämiseen määrä istutettujen solujen, käytimme mikropipetin istuttaa yhden 4T1-luc-2-1A4 solu. Ensinnäkin, 4T1-luc2-1A4 solut trypsinoitiin ja maljattiin Soluviljelymaljassa. Seuraavaksi yksittäiset solut kyytiin ja istutettiin käyttäen mikropipettoria subkutaaniseen aukkoihin tehty kylkeen alueilla hiirillä. Hiiret jaettiin kahteen ryhmään: neljä hiirtä istutettiin yksittäisiä soluja, ja neljä muuta hiiriin istutettiin 10 solua kullekin (kuvio S4C, D). Eläimet alistettiin sitten bioluminenssi kuvantamisen välittömästi implantaation jälkeen. Joissakin tapauksissa, pystyimme havaitsemaan yhden 4T1-luc2-1A4 solu (kuvio 3A-C ja kuvion S4A, B). Kustakin kolmesta itsenäisestä, peräkkäisiä kuvia saman yksittäisen solun olemme rekisteröity yhteensä vuon vaihtelee 460-528 fotonit /sek. Line profilointianalyysejä rekisteröidyn vuon yhdestä solusta paljasti signaalin suhde taustaan ​​6-1, jossa signaali selvästi peräisin implantaatiokohdasta (kuvio 3D, E). Siksi, päättelimme, että bioluminesoiviin signaali todellakin saaneet alkunsa yhdestä 4T1-luc2-1A4 solu. Puute signaalin kolme muuta sivustoja kussakin ryhmässä voi johtua nopea solukuolema.

(A-C) Bioluminescent signaali yhden 4T1-luc2-1A4 cell

in vivo

. Yksittäinen solu istutettiin takana

nu /nu

hiiri. D-lusiferiini ruiskutettiin hiiren vatsaonteloon ja bioluminescent kuvat otettiin käyttäen IVIS spektri (FOV; C, binning, pienet, f pysäytys, 1, valotusaika, 5 min). Kuvia ennen ja jälkeen lusiferiini injektion osoitettiin paneeleissa (A) ja (B), tässä järjestyksessä. Suurennettu kuva pilkullinen alue paneeli (B) näkyy paneelissa (C). Pilkullinen ympyrän edustaa yksittäisen solun signaalin. Tähti (*) tarkoittaa taustan signaali suolistosta. (D, E) Line profilointi analyysi yhden solun signaalin. Valon emissio piirrettiin pitkin linjaa näkyy paneelissa (D). Peak signaalin paneelin (E) edustaa valon emission yhdestä 4T1-luc2-1A4 solu. (F) Kasvaimen kehitykseen viidestä 4T1-luc2-1A4 soluissa. Solut istutettiin ihon alle (mikropipetin avulla) osaksi selkäpuoli kylkeen alueelle

nu /nu

hiiri. Bioluminescent kuvat oli ensin otettu ennen D-lusiferiini injektio (Pre-lusiferiini). Sitten eläin kuvattiin päivänä 0 päivään 42. (G) Seuranta kasvaimen kasvua 5 soluista 4T1-luc2-1A4. Bioluminescent signaalit kvantitoitiin käyttäen Living Image ohjelmistoja ja pidon fyysinen kasvaimen mittauksia paksuus. Kasvain ei ollut käsin kosketeltava till päivä 27 implantaation jälkeen, kun bioluminesoiviin signaaleja havaittiin päivästä 0. Huomaa, että koko vuon oli piirrettynä logaritmisella asteikolla. (H) Kasvaimen kehittämiseen 10 soluista 4T1-luc2-1A4. Solut istutettiin ihon alle (mikropipetin avulla) takaosaan

nu /nu

hiiri. Taustalla signaali näkyy valmiiksi D-lusiferiini injektio kuva (Pre-lusiferiini). Kasvaimen kasvua seurattiin 40 päivän ajan käyttämällä IVIS Spectrum ja paksuus. (I) Seuranta kasvaimen kasvua 10 solujen 4T1-luc2-1A4. Kasvaintilavuudet mitattiin paksuus ja pidon bioluminescent signaaleja, jotka kvantitoitiin käyttäen Living Image ohjelmistoa. Kasvain ei ollut käsin kosketeltava till päivä 29 istutuksen jälkeen. Päinvastoin, bioluminoiva signaaleja erosivat päivästä 0 kiinnittymisprosessi.

kasvainten kehittymiseen Small populaatiot 4T1-luc2 Cells

Havaittuaan yhden solun

in vivo

, hiiret istutettiin 1-50 soluja seurattiin pidemmän aikaa voidaan havaita mahdolliset kasvaimen kasvua. Oletimme, että istuttaminen suurempi määrä soluja voisi kiertää tämän ongelman, että vihamielinen kiinnittyneen munasolun ympäristöissä läsnä pienempi määrä soluja. Koska rutiininomainen kasvaimen istutuksen menettelyjä käyttää 0,5-10 miljoonia solujen ihonalainen kasvain malleja, emme odota kasvainten syntyä niin pieniä määriä soluja. Yllätykseksemme, kaksi hiirtä, jotka istutettiin 5 ja 10 solut kehitettiin kiinteitä tuumoreita. Jatkoimme kuva näissä hiirissä, ja kun kasvaimet tuli kouraantuntuva olemme myös fyysisesti mitataan mitoiltaan tavallisilla satulat. Kasvaimet, jotka johtuvat 5-solu- ja 10-solu implantations ei voitu havaita jarrusatulat ennen päivä 27 ja päivä 29, vastaavasti (kuvio 3G, I). Kuitenkin ei-invasiivisia näkyvän valon kuvantaminen, pystyimme havaitsemaan ja määrällisesti kasvaintaakat jatkuvasti aika istutusta (Kuva 3F, H). Nämä tiedot osoittavat selvästi, että kasvaimen kasvua voidaan seurata käyttämällä ei-invasiivisia bioluminenssin kuvantamiseen niin pian kuin solut istutetaan eläimen, jopa silloin, kun vain viisi solut istutetaan.

etäpesäkkeitä of 4T1-luc2-1A4 Cells in syngeenisiin Balb /c-hiiret päässä Orthotopic istuttamisesta utarerasvaa Pad

testaamiseksi metastaattisen ominaisuudet 4T1-luc2-1A4 soluissa, me ortotooppisesti istutettiin nämä solut utarerasvaa tyynyt naisten nu /nu-hiiriä ( 5 x 10

5 solua per hiiri, n = 9). Primäärikasvaimissa kasvoi nopeasti ja kehitti etäpesäkeleesioita, jotka voidaan havaita käyttäen bioluminenssin kuvantamiseen päivään 27 (kuvio 4). Vahvista etäpesäke kasvainsoluja keuhkoihin, me eristetty keuhkokudokset päivänä 27 implantaation jälkeen ja otti

ex vivo

kuvia (kuva 4B). Lisäksi teimme histologiset analyysit formaliinilla säilynyt, parafiinia leikattiin kudoksiin. Tulokset osoittivat, että keuhkopussin ja subpleural alueiden keuhkot soluttautunut arkkia huonosti eriytetty neoplastiset solut, jotka osoittavat bioluminesoiviin kuvantaminen voidaan tehokkaasti havaita mikrometastaasien hiiri (kuvio 4C, D). On kuitenkin vaikea arvioida tarkasti, kuinka monta solua oleskellut metastasized kasvain massat perustuu valon säteily rekisteröidään

in vivo

koska lähetetyn valon vaimennetaan ja hajallaan riippuen tiellä kestää läpi kudoksiin, ja tarkka sijainti näiden kasvainten ei ole selvitetty.

(A) Female nu /nu -hiirten ympättiin 5 x 10

5 4T1-luc2-1A4 solujen ortotooppisesti vatsan utarerasvaa tyynyt [1] . Bioluminescent Kuvat on otettu pituussuunnassa. At implantaation jälkeen päivän 27 mikroetäpesäkkeet havaittiin keuhkoissa (nuolet) (B) Keuhkot eristettiin implantaation jälkeen päivän 27 ja

ex vivo

kuva otettiin. (C, D) Lung kudokset fiksoitiin formaliiniin ja upotettiin parafiiniin. H Xba I ja ligoitiin pUB6-V5-HisB vektoriin (Invitrogen, CA). Fragmentti syntyy Bgl II: lla ja BstB I pilkkomalla pUB6-luc2 ligatoitiin modifioituun pLPCX-vektoriin (Clontech, CA). Lentivirusvektoria joka kuljettaa ihmisen ubikitiinipromoottori C promoottorin ja luc2 cDNA muodostettiin liittämällä BglII EcoRI-fragmentti ylhäältä rakentaa osaksi Bcl I EcoRI modifioidun pLKO.1 vektorin (Sigma-Aldrich, MO) [18], [19].

Cell Culture

Hiiren maitorauhasen kasvainsolulinja 4T1 saatiin ATCC (Manassas, VA). Soluja kasvatettiin runsaasti glukoosia RPMI 1640 väliaine (ATCC). PC-3M-luc-C6-soluja kasvatettiin minimal essential medium (ATCC) (For täydentävä data) [30]. Kaikki media on täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (Hyclone, UT) ilman antibiootteja. Kasvukäyrät kertyi kylvämällä 50000 solua T25-pulloihin.