Krooninen sairaus

tiivistelmä

Src ja nisäkkäiden rapamysiinin kohde (mTOR) signalointi yleisesti aktivoidaan ei- pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) ja siten potentiaalisia kemoterapiaa. Vaikka yhdistetty käyttö Src-estäjällä Dasatinibia muiden kemoterapia-aineiden on osoittanut teholtaan syövän hoitoon, mekanismeja, jotka johtavat herkempiä Dasatinibi ei täysin ymmärretä. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että Rapamysiini paranee dramaattisesti Dasatinibia aiheuttama solujen kasvun esto ja solukierron G1 pysähtymisen ihmisen keuhkojen A549-soluissa vaikuttamatta apoptoosin. Synergiavaikutuksen olivat johdonmukaisesti korreloi säätely ylöspäin sykliiniriippuvaisten kinaasien -estäjä proteiineja, kuten p16, p19, p21, ja p27, sekä tukahduttaminen Cdk4 ilmaisun ja tumaansiirtymiseen. Mekanistinen tutkimukset osoittivat, että FoxO1 /FoxO3a ja p70S6K /4E-BP1, molekyylit alavirtaan Src-PI3K-Akt ja mTOR signalointi, merkittävästi tukahdutti käyttö yhdessä Dasatinibi ja Rapamysiinin. Lähestymiskielto Src ja mTOR pieniä häiritseviä RNA A549 vahvistivat lisäksi, että Src /PI3K /mTOR Pathway ollut keskeinen rooli vahvistettaessa syövänvastainen vaikutus Dasatinibia. Lisäksi tämä havainto oli myös vahvistanut joukon määrityksiä käyttäen toista kahdesta NSCLC solulinjoista, NCI-H1706 ja NCI-H460. Lopullisesti, tuloksemme ehdotti, että kombinatoorista soveltaminen Src ja mTOR-estäjät saattavat olla lupaava terapeuttinen strategia NSCLC hoitoon.

Citation: Chen B, Xu X, Luo J, Wang H, Zhou S (2015) Rapamysiinin parantaa syövän vaikutusta dasatinibin estämällä Src /PI3K /mTOR Pathway in NSCLC solut. PLoS ONE 10 (6): e0129663. doi: 10,1371 /journal.pone.0129663

Academic Editor: Shi-Yong Sun, Emory University, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 27 helmikuu 2015; Hyväksytty: 11. toukokuuta 2015 Julkaistu: 10 kesäkuu 2015

Copyright: © 2015 Chen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat avustuksia Shanghai Municipal Natural Science Foundation (Grant N0.13ZR1434700) ja National Natural Science Foundation of China (Grant N0.81301994). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) on merkittävä patologinen alatyypin keuhkosyöpä, joka on yleisin kuolinsyy syöpään maailmanlaajuisesti [1]. Niistä NSCLC potilaat, Src-ryhmän kinaasien (SFKs) ovat konstitutiivisesti ilmentynyt tai aktivoitu [2,3]. Mahdollisena terapeuttinen kohde NSCLC, Src voisi olla tärkeä rooli etenemistä keuhkojen adenokarsinoomien kautta säädellään signaaleja useilta solun pinnan molekyylejä, mukaan lukien integriinin, kasvutekijät, ja G-proteiiniin kytkettyjen reseptorien [4,5]. Prekliiniset tutkimukset ovat osoittaneet, että SFKs esto voi estää leviäminen, angiogeneesi, invaasio, ja selviytyminen syöpäsolujen [6-9]. Koska spesifinen inhibiittori Src, Dasatinibi on hyväksytty kroonisen myelooisen leukemian (KML), ja se on nyt arvioitu, että kliiniseen käyttöön keuhkosyövän [10,11]. Kuitenkin Dasatinibi monoterapiana osoittivat vaatimatonta kliininen aktiivisuus, joka oli alhaisempi kuin yleisesti havaittu NSCLC potilailla, jotka saivat kemoterapiaa [11]. Sen sijaan yhdistelmä Dasatinibia kanssa solunsalpaajahoito ilmestyi lupaavampi kuin käyttämällä yksittäisenä aineena. Koska Src voi välittää kasvaimen vastustuskyky solunsalpaajille, Src esto Dasatinibia on osoitettu parantaa vastetta paksusuolen ja keuhkojen syöpäsolujen sisplatiini in vitro [12,13]. Lisäksi äskettäin kliinisessä tutkimuksessa Dasatinibin yhdistettynä erlotinibin saavutettu parannettu hyödyllinen vaikutus potilailla, joilla on aiemmin hoidettu NSCLC [14]. Lisäksi Dasatinibi voisi myös helpottaa syöpää ehkäisevistä vaikutuksista sädehoidon [15]. Vaikka ylivoimainen teho on erittäin suositeltavaa, että yhdessä Dasatinibi on ratkaisevan tärkeää NSCLC hoitoja, mekanismeja, jotka johtavat herkempiä kemoterapian vielä monimutkaisia ​​ja ei täysin tunneta. Koska Src moduloi signaalia transductions säätelevät lisääntymistä, invaasiota, apoptoosin,

jne

. syöpäsolujen tutkimukset selvittämisessä sääntelyn Src aktivointi ja sen vuorovaikutusta muiden signalointi molekyylien syövän hoidossa ovat erityisen perusteltua.

Lisäksi Src, nisäkkään rapamysiinin kohde (mTOR) on myös erittäin aktivoitu monissa keuhkosyövän potilaiden ja edustaa toisena kohteena terapiassa. MTOR signalointireitin ajaa monia tärkeitä solun prosesseja ja on sekaantunut yhä useammat patologisia tiloja, mukaan lukien syöpä [16]. Äskettäin alustavat kliiniset tiedot ovat osoittaneet tiettyä antituumoriaktiivisuus on mTOR-estäjän Rapamysiinin ja sen analogit joidenkin syöpien mukaan lukien NSCLC [17,18]. Erityisesti, Rapamysiini on myös tutkitaan sen kyky palauttaa herkkyys syöpäsolujen ylävirran signalointi kohdennettuja aineet [19]. Akt /mTOR inhibition Rapamysiini tai sen johdannaiset ovat osoittautuneet se tehostaa sytotoksisuutta säteilyn ja kemoterapeuttisten aineiden, edistää solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin [20,21]. Toisaalta, on osoitettu, että mTOR voitaisiin aktivoida Src-signalointia fosfatidyyli-3-kinaasi (PI3K) /Akt-reitillä [22-24]. Tämä johti hypoteesiin, että yhdistelmä Rapamysiinin kanssa Src-inhibiittorit, kuten Dasatinibia, voisivat helpottaa syövän vastaista aktiivisuutta ja olla tehokkaampia kemoterapiaa. Tuore tutkimus osoitti, että kahden estäminen Src ja mTOR oli erittäin tehokas kasvaimen pienenemisestä hiirimalleissa rintasyövän [25]. Kuitenkin Prekliinistä tiedot ovat nykyisin saatavilla niiden kombinatoorista käyttöä hoitoon keuhkosyöpään. Myös mahdollinen vaikutus mTOR säätelyssä Src signalointi edelleen suurelta osin epäselvä.

Täällä pyrimme tutkimaan kombinatoorista terapeuttista vaikutusta Rapamysiinin ja Dasatinibia keuhkosyöpään käyttäen ihmisen keuhkon adenokarsinooma (A549), keuhkojen levyepiteelikarsinooma karsinoomasolut (NCI-H1703), ja iso-keuhkosyövän soluja (NCI-H460), kuten in vitro solujen malleissa. Tässä tutkimuksessa Dasatinibia aiheuttama solujen kasvun esto ja solukierron pysähtymisen dramaattisesti tehostaa yhteistyössä hoidon Rapamysiini, rinnalle kanssa sitten ylös-säätely sykliiniriippuvaisen kinaasien (CDK) estäjä proteiineja. Analyysi molekyylejä osoitti, että Src deaktivointi on tehokkaasti helpotti mTOR eston kautta PI3K-Akt-reitin. Käyttämällä pieniä häiritseviä RNA: ita vastaan ​​Src ja mTOR, havaitsimme samanlainen tukahduttaminen kuin siitä inhibiittorit soluproliferaatioon, solusyklin etenemistä, invaasio, ja muuttoliikkeen A549-soluja. Lisäksi meidän tulokset osoittivat synergistisen vuorovaikutuksen Src ja mTOR signaloinneista NSCLC soluissa, joka ehdotti lupaava terapeuttinen hyöty mTOR /Src dual eston NSCLC hoitoon.

Materiaalit ja menetelmät

Reagenssit ja vasta

Dasatinibi ja Rapamysiini ostettiin Selleck Chemical (Shanghai, Kiina). Ensisijainen vasta-aineita fosfo-Src (Tyr416), Src, fosfo-mTOR (Ser2448), mTOR, fosfo-PI3K (Tyr458), PI3K p85, fosfo-Akt (Thr308), Akt, fosfo-FoxO1 (Ser256), fosfori-FoxO3a (Ser253), fosfori-4E-BP1 (Thr37 /46), 4E-BP1, Cdk2, Cdk4, Cdk6, ja Alexa Fluor 555 konjugoitu vasta-aine saatiin Cell Signal Technologies (Shanghai, Kiina). Ensisijainen vasta-aineita CDK-estäjä proteiineja kuten p16, p19, p21, P27, ja β-tubuliinin ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Shanghai, Kiina). Vasta-aineita fosfo-p70S6K (Thr389 /412), p70S6K, ostettiin SAB Signalway (College Park, MD, USA). Toissijaisessa HRP- tai FITC- konjugoiduilla vasta-aineilla, si-mTOR, si-Src, ja transfektioreagenssit ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Shanghai, Kiina).

Soluviljely ja käsittely

ihmisen adenokarsinoomasolulinja A549 ihmisen keuhko- levyepiteelikarsinoomasolu line NCI-H1703, ihmisen suuri keuhkosyöpä solulinja NCI-H460 ja normaali keuhkoputken epiteelisolujen BEAS-2B hankittiin ATCC: ltä (Peking, Kiina), ja niitä viljeltiin Dulbeccon modifioidussa eagle väliainetta (Life tekniikkaa, Shanghai, Kiina), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 5% CO

2. Solujen lukumäärä ja elinkelpoisuus määritettiin trypaanisiniekskluusiolla, jossa vähintään 90% eläviä soluja ennen hoitoa altistusta. A549-soluja käsiteltiin Dasatinibia (5, 10, 25, tai 50 nM) yksin tai yhdessä Rapamysiini (20, 50, tai 100 nM) ja 24-96 tuntia. Solut, jotka käsitelty 0,1%: iin dimetyylisulfoksidia (DMSO) käytettiin vehikkelikontrollina.

Solun proliferaation ja solusyklin määritykset

soluproleferaatiomäärityksessä, 10

4 solua kuoppaa kohti ympättiin 24 kuoppaiset levyt ja niitä inkuboitiin 24 h. Soluja käsiteltiin 5, 10, 15, tai 20 nM Dasatinibia läsnä ollessa tai poissa ollessa Rapamysiini (20, 50, tai 100 nM), ja kerättiin 24, 48, 72, ja 96 h. Trypaanisiniekskluusiolla määritykset, jotka on suoritettu solujen määrä käyttämällä Cellometer Auto T4 (Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA, USA).

solusyklin määrityksessä solut 6-kuoppaisilla levyillä otettiin talteen, huuhdeltiin ja kiinteä yön yli 75%: n kylmään etanoliin -20 ° C: ssa. Sitten soluja käsiteltiin Tris-HCl-puskuria (pH 7,4), 100 ug /ml RNaasi A: ta ja värjättiin 25 ug /ml propidiumjodidia (PI) (Life tekniikka, Shanghai, Kiina). Kymmenen tuhansia solut hankittiin ja analysoitiin virtaussytometrillä (BD FACSCalibur, CA, USA), joka perustuu DNA-pitoisuus.

apoptoosimäärityksessä

1 x 10

6 soluja käsiteltiin DMSO ( 0,1%), Dasatinibia (10 nM), yksin tai yhdessä Rapamysiini (100 nM) 96 tuntia. Solujen apoptoosi korko määritettiin anneksiini V-FITC Apoptosis Detection Kit I (BD Biosciences, Shanghai, Kiina) mukaan valmistajan ohjeiden. Fluoresoiva intensiteetti kaikkien koettimien määritettiin virtaussytometrialla (BD FACSCalibur, CA, USA).

Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR

Kokonais-RNA eristettiin käyttämällä Trizol-reagenssia ja käsiteltiin DNaasi mukaisesti valmistajan ohjeiden. Ensimmäisen juosteen cDNA syntetisoitiin käyttämällä M-MLV käänteistranskriptaasia ja oligo-dT-aluketta (Invitrogen, Shanghai, Kiina). Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR määritykset suoritettiin 96 kuopan optinen levyt ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Lifetechnology, Shanghai, Kiina) kanssa SYBR Green qPCR Master Mix (Qiagen, Shanghai, Kiina). Expression of P16, P19, P21, P27, sykliini A /D1 /E ja CDC25A mRNA normalisoitui vastaan ​​kuin 18s RNA. Alukesekvenssit reaaliaikainen PCR-määritykset on lueteltu S1 taulukossa.

Western blotting

Homogenaattia proteiineja (20 ug) kustakin käsitellyistä soluista erotettiin SDS-polyakryyliamidigeeleillä, ja siirrettiin elektroforeettisesti päälle Immobilon-P polyvinylidenedifluoride kalvoja. Sen jälkeen kalvoja inkuboitiin erityisten vasta-aineiden CDK-estäjä proteiineja (p16, p19, p21 ja p27), cdk2 /4/6 Forkhead laatikko proteiinit (FoxO1 ja FoxO3a), fosforyloitu tai koko Src, PI3K, Akt, mTOR, p70S6K ja 4E-BP1, vastaavasti. Beta-tubuliinia käytettiin normalisointia Proteiinilisäyksen. Inkuboinnin jälkeen piparjuuriperoksidaasiin (HRP) konjugoitua IgG-vasta, kalvot kehitettiin käyttämällä ECL Western blotting detektointireagenssia (Thermo, Peking, Kiina). Densitometristä mittaukset bändit tehtiin käyttämällä Määrä Yksi ohjelma (Bio-Rad, Peking, Kiina).

Cell immunofluoresenssivärjäyksen

Kun ympätään 12-kuoppalevyllä 24 tunnin, A549-soluja käsiteltiin DMSO: ta (0,1%), Dasatinibia (10 nM), yksin tai yhdessä Rapamysiini (100 nM) 48 tuntia. Solut pestiin ja kiinnitettiin 0,4% paraformaldehydillä 15 minuuttia huoneen lämpötilassa, sitten niitä inkuboitiin primääristen vasta-aineita fosforyloidun Src tai Cdk4 yön yli 4 ° C: ssa. Pesun jälkeen soluja inkuboitiin FITC-leimatun tai Alexa Fluor 555-konjugoitu sekundaarinen vasta-aine. Sen jälkeen, solun tumassa värjättiin PI ja sitten havaittiin käyttämällä Cytation 3 useita kuvantamisjärjestelmä (BioTek, VT, USA).

Sirna (siRNA) transfektion

A549-soluja ympättiin on kuusi hyvin kudosviljelylevylle 2 x 10

5 solua per kuoppa 2 ml antibioottia-väliaineessa ja inkuboitiin 24 tuntia. Mukaan valmistajan ohjeen, soluja inkuboitiin transfektioväliainetta sisältävien si-Src, si-mTOR, tai kontrolloida siRNA 8 tuntia. Sitten transfektion väliaine korvattiin normaali tuoretta täydellistä kasvualustaa, ja sen jälkeen ylimääräinen inkubaation 24-72 tuntia. Tämän jälkeen solut kerättiin määrityksiä soluproliferaatioon, solusyklin ja western-blottauksella, vastaavasti.

Cell invaasiomääritys

Solun invaasiomääritys suoritettiin käyttäen trans-hyvin kammiot (Matrigel päällystetty kalvo for invaasio, BD Biosciences, Shanghai, Kiina). Yhteensä 5 x 10

5 solua maljattiin ylemmässä kammiossa seerumittomalla alustalla ja käsiteltiin 0,1% DMSO: ta, Dasatinibia (10 nM), yksin tai yhdessä Rapamysiini (100 nM). Sitten solujen annettiin tunkeutua kohti 10% FBS: ää, kuten kemoattraktantti alemmassa kammiossa 24 tuntia. Solut ylemmässä kammiossa poistettiin huolellisesti käyttäen pumpulipuikolla, ja soluja pohjassa kalvo kiinnitettiin ja värjättiin ydin- nopea punainen. Lukumäärät tunkeutuneet solut laskettiin mikroskoopilla ja prosentuaalinen hyökkäys laskettiin solut tunkeutuvat läpi matrigeelin matriisin ja kalvo suhteessa hyökkäystä solujen kontrolliryhmässä.

Haavan paranemista määritys

solut ympättiin 24-kuoppaisiin kudosviljelylevyihin ja saavutti 70-80% konfluenssiin yhtenä kerroksena 24 tunnin kuluttua kasvun. Yksikerroksiset varovasti ja hitaasti naarmuuntunut uudella 1 ml pipetin kärki poikki keskellä hyvin. Sitten hyvin oli pese kahdesti väliaineen poistamiseksi irrallaan soluihin. Lisäämisen jälkeen hyvin tuoreella elatusaineella, soluja käsiteltiin ja kasvatettiin vielä 18 tuntia. Yksikerroksiset Solut valokuvattiin käänteisen faasikontrastimikroskooppia.

Tilastollinen

Kaikki tiedot edustavat vähintään kolmen erillisen kokeen ja ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskihajonta (SD) Tilastolliset vertailut tehtiin käyttämällä ohjelmistopaketin SPSS 16.0 ja analysoitiin yksisuuntaisella varianssianalyysillä (ANOVA) seurasi post hoc Dunnettin testi tarvittaessa. Tilastollinen merkitsevyys asetettiin p-arvot 0,05 (*), tai 0,01 (**).

Tulokset

Rapamysiinin tehosti estävä vaikutus Dasatinibia soluproliferaatioon ja solusyklin etenemisen A549

Kuten kuviossa 1A, Dasatinibia at farmakologisesti asiaankuuluvat tasot merkittävästi vähensi solujen määrä A549 solujen pitoisuudesta riippuvalla tavalla. Merkillistä, co-hoidon Rapamysiinin (50 ja 100 nM) paransi merkittävästi Dasatinibia-välitteistä kasvun inhibitio A549-soluja, että 10 nM Dasatinibia plus 100 nM Rapamysiinin voisi saavuttaa yhtä suuri suuruudet syövän vastaista aktiivisuutta kuin Dasatinibia yksin pitoisuus 50 nM. Tulokset noin ajallisia vaikutuksia Dasatinibia kanssa Rapamysiini osoitti, että A549-solujen lisääntymisen merkittävästi inhiboi Dasatinibia (10 nM) kautta 96 h hoidon (kuvio 1 B). Tärkeää on, että yhtäaikainen käsittely Rapamysiini (100 nM) laskivat edelleen solun numerot jo 48 h, minkä perusteella merkityt synergistinen tehokkuus kohteluun Dasatinibia itse. Kuitenkin Rapamysiini yksin osoitti vähäinen vaimennus on kasvukäyrä syöpäsolujen.

(A) pitoisuus riippuvainen vaikutus Rapamysiinin on syövän vastaista aktiivisuutta dasatinibin A549-solut. Kuten yksityiskohtaisesti esitetty ”

Methods

”, A549-soluja käsiteltiin ajoneuvon ohjaus (0,1% DMSO) tai Dasatinibia (5, 10, 25, ja 50 nM) läsnä ollessa ja puuttuessa Rapamysiini (20, 50 , ja 100 nM). Elävien solujen määrä analysoitiin 72 tunnin kuluttua co-hoitoa. (B) Vaikutukset Rapamysiinin ajallista muutokset Dasatinibia aiheuttama kasvun esto in A549-soluja. Soluja käsiteltiin ajoneuvon ohjaus (0,1% DMSO), Dasatinibia (10 nM) kanssa tai ilman Rapamysiini (100 nM). Solumäärät mitattiin 0, 24, 48, 72, ja 96 h käsittelyn jälkeen. (C) vaikutukset Dasatinibia ja Rapamysiini on solusyklin jakautumisen. A549-soluja käsiteltiin Dasatinibia (10 nM) tai Rapamysiini (100 nM) 96 tuntia ja analysoitiin virtaussytometrialla jälkeen PI-värjäyksellä. Tulokset on esitetty keskimääräinen prosenttiosuus solujen G0 /G1, S ja G2 /M-vaiheen kolmesta itsenäisestä kokeesta. (D) vaikutukset Dasatinibi ja Rapamysiini on apoptoosin A549-soluja. Soluja käsiteltiin Dasatinibia (10 nM) tai Rapamysiini (100 nM) 96 tuntia ja apoptoottisten hinnat määritettiin virtaussytometrialla anneksiini-V: n ja PI-värjäyksellä. Pylväät, kolmen määrityksen keskiarvo; baareja, SD. * P 0,05, ** p 0.01.

Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että sekä Src ja mTOR usein konstitutiivisesti aktivoitua akuutti myelooinen leukemia (AML) solut ja siten muodostavat mahdollisia terapeuttisia kohteita. Esimerkiksi epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR) estäjä erlotinibin voi aiheuttaa solusyklin pysähtymisen G1-vaiheessa estämällä onkogeenisten signaloinnin kautta Src ja mTOR [26]. Yhteisymmärryksessä, meidän tulokset solusyklin määritys A549-solut osoittivat, että Dasatinibia (10 nM) lisäsi merkittävästi solujen osuus G1-vaiheeseen verrattuna kontrolliryhmään (kuvio 1C), mikä viittaa suoraan pidätykseen solusyklin etenemisen Src-inhibition syöpäsoluissa. Sen sijaan, Rapamysiini (100 nM) yksinään osoitti vain vähän vaikutusta solujen jakauma eri solusyklin vaiheissa. Kuitenkin läsnäolo Rapamysiinin in yhteistyössä dasatinibihoitoon merkittävästi lisääntynyt solun prosenttiosuus G1 vaiheessa, mikä johti merkittävään lukkiutuvat G1 /S siirtyminen ja solujen mitoosin. Tuloksena oli yhdenmukainen synergized solujen kasvun esto, jonka Dasatinibia ja Rapamysiini yhdistelmänä. Samaan aikaan vaikutus Dasatinibi ja Rapamysiini solujen apoptoosiin arvioitiin myös A549-soluja, mutta ei merkittävää eroa solujen apoptoosin oli havaittu keskuudessa hoitoja ohjaus, Dasatinibia tai Rapamysiini (kuvio 1 D), mikä viittaa siihen, että Rapamysiinin ja Dasatinibi on vähäinen vaikutus apoptoosin A549-soluja.

Rapamysiini voimistua Dasatinibia jopa säännellä CDK-estäjä proteiineja ja alas-säädellä Cdk4

G1 solukierron pysähtymisen ohjaa useita tekijöitä kuten sykliinejä, solunjakautumisen sykli proteiinia ( CDC), CDK ja CDK-estäjä proteiineja. Alustavien tutkimus osoitti, että ilmaukset sykliini A /D1 /E ja Cdc25A eivät muuttuneet merkittävästi muuttunut Dasatinibi ja Rapamysiini mRNA ja proteiini tasoilla (S1 Kuva). Kuten CDK-inhibiittorit, Dasatinibia lisäsi ilmentymistä p16, p19 ja p21 sekä mRNA (kuvio 2A) ja proteiini (kuvio 2B) tasoilla, tilastollista eroa verrokkiryhmässä. On mielenkiintoista, että yhtäaikainen käsittely Rapamysiini selvästi edistänyt Dasatinibia aiheuttama ylössäätöä p16, p19, p21 ja p27, mutta Rapamysiini yksin näytti olevan vähän vaikutusta ilmaisun näiden CDK estäjän proteiineja. Koska seurauksena ilmentyminen Cdk4 dramaattisesti tukahdutettiin yhdistelmä Dasatinibia ja Rapamysiini, mutta ei Cdk2 eikä Cdk6 näytti selvästi vasteena hoitoja (kuvio 2B).

A549-soluja käsiteltiin ajoneuvon ohjaus (0,1 % DMSO) tai Dasatinibia (10 nM) läsnä ollessa ja puuttuessa Rapamysiini (100 nM) 24 tuntia. (A) Suhteellinen ilmentyminen CDK estäjän proteiinien (p16, p19, p21 ja p27) mRNA tasolla. Pylväät, kolmen määrityksen keskiarvo; baareja, SD. * P 0,05, ** p 0,01. (B) ilmentäminen CDK-estäjä proteiineja, CDK ja FoxOs määritettiin western blottauksella. (D) lokalisaatio Cdk4 määräytyy immunofluoresenssivärjäyksen. Edustavia kuvia osoitti värjäytymisen Cdk4 (punainen), nucleus (sininen), ja siihen sulautunut kuvia.

edelleen varmistamiseksi vaikutuksia Dasatinibi ja Rapamysiini on CDK-estäjä proteiineja, ilmaisun ja jakelu CDK4 A549-solut analysoitiin edelleen immunofluoresenssivärjäyksen. Normaalisti Cdk4 sitoutuu sykliini-D muodostavat kompleksin sytoplasmassa, niin kerääntyy tumakalvon ja translokoituvat tumaan, kun solut etenevät G1 /S-vaiheen. Tuloksemme osoittivat, että Cdk4 pääasiallisesti tumassa A549-soluissa; he kuitenkin osittain erottautuvat sytoplasmassa alla dasatinibihoitoon (kuvio 2C). Lisäksi translokaatiota Cdk4 osaksi tumaan merkittävästi estänyt dasatinibihoitoon ja Rapamysiini yhdistelmänä. Yhdessä nämä tulokset johdonmukaisesti ehdottanut, että esto solusyklin etenemisen Dasatinibia ja Rapamysiini välittyi läpi ylössäätöä CDK-estäjä proteiineja sekä alas-säätely Cdk4 A549-soluissa.

Aiemmat raportit ovat osoittaneet, että p19 p21 ja p27 olivat transkriptionaalisesti säätelevät FOXOs, joka on myöhemmin osoittautunut niin loppupään kohteina PI3K /AKT [25,27]. Se raportoi äskettäin, että p16 voi myös säädellä Src-AKT väylän solujen vanhenemista ihmisen eturauhasen syöpäsolujen [28]. Tässä tutkimuksessa tuloksemme osoittivat, että fosforylaatiota tasot FOXO1 ja FOXO3a myös merkittävästi nostaa antamalla samanaikaisesti hoitoa verrattuna indusoitu joko Src tai mTOR inhibiittorin (kuvio 2B). Lisäksi, tuloksena oli samanaikaisesti ilmentymisen CDK-inhibiittorit. Siksi me arveltu, että säätely ylöspäin CDK-inhibiittorit mukaan Dasatinibia ja Rapamysiini oli todennäköisesti johtuvan Src ja PI3K /AKT-reitin.

Rapamysiini synergized dasatinibihoidon tukahduttamaan PI3K-Akt-mTOR signalointia A549-soluja

Uusin tutkimus osoittaa, että Src fosforylaatio voivat helpottaa aktivointi Akt-mTOR signalointireitistä AML soluissa [29]. Tutkia mahdollisuuksia vuorovaikutusta Src ja mTOR polkuja, olemme analysoineet aktivointi Src, PI3K, AKT, ja mTOR järjestyksessä. Ensinnäkin immunofluoresenssivärjäyksen fosfo-Src osoitti, että Src aktivaatio estyi Dasatinibi ja lisää merkittävästi tukahdutettu yhteistyössä hoidon Rapamysiini (kuvio 3A), mikä viittaa siihen, että mTOR esto Rapamysiini voisi synergoida Dasatinibia tukahduttamaan Src aktivaation A549-soluja . Ja tämä tulos vahvistettiin lisäksi western-blottauksella (kuvio 3B). Lisäksi tuloksemme osoittivat, että inhibitio Src Dasatinibia voisi myös tukahduttaa aktivointi PI3K-Akt signaloinnin A549-soluja, jotka oli yhteisymmärryksessä aiempien raporttien kanssa [29]. Vielä tärkeämpää on, estoja Src, PI3K, ja AKT yksimielisesti läsnäolo lisää Rapamysiinin verrattuna Dasatinibia yksinään, kuten on esitetty kuviossa 3B ja 3C. Oli huomattava, että tulos oli hyvin korreloi huomioita ilmaus CDK-estäjä ja Forkhead laatikko proteiineja (kuvio 2B), joka yhtyi meidän keinottelun välinen yhteys solusyklin pysähtymiseen ja Src-PI3K-AKT deaktivointi. Toisaalta, Immunovärjäyksen ja Western blot tulokset osoittivat, että Src aktivaatio inhiboi Rapamysiini, vähemmässä määrin kuin Dasatinibia. Nämä tiedot ymmärtää, että mTOR joka perinteisesti tunnustettu reagoiva tavoite PI3K /AKT signalointi, voi olla tärkeä rooli sääntelyn Src aktivointi.

A549-soluja käsiteltiin ajoneuvon ohjaus (0,1% DMSO) , Dasatinibia (10 nM) kanssa tai ilman Rapamysiini (100 nM) 24 tuntia. Homogenaatti proteiineja (20 ug) peräisin kokosolulysaatissa kerättiin ja käytettiin western blottauksella. (A) aktivointi Src määräytyy immunofluoresenssivärjäyksen. Edustavia kuvia osoitti värjäytymisen Src (punainen), nucleus (sininen), ja siihen sulautunut kuvia. (B) aktivointi Src, PI3K, ja Akt määritettiin western blottauksella. (C) Densitometria määrällistä Src, PI3K ja Akt-fosforylaation A549-soluja. (D) aktivointi mTOR signalointi määritettiin western blottauksella. (E) Densitometria määrällistä mTOR, p70S6K ja 4E-BP1 fosforylaatiota A549-soluja. Esitetyt tiedot keskimääräinen suhteellinen fosforylaation suhteet kuin käsittelemätön kontrolli kolmesta itsenäisestä kokeesta. Pylväät, kolmen määrityksen keskiarvo; baareja, SD. * P 0,05, ** p 0,01.

Sen jälkeen, aktivointi mTOR määritettiin käyttäen western blotting on fosforyloitu tasoilla mTOR. Kuten odotettua, aktivointi mTOR inhiboitui merkittävästi inhibiittorilla Rapamysiinin. Vaikka Dasatinibi kohtalainen vaikutus tukahduta mTOR Aktivoinnin yhdessä Rapamysiinin huomattavasti edennyt esto, joka indusoi Dasatinibia yksinään (kuvio 3D ja 3E). Lisäksi fosforylaatiota p70S6K ja 4E-BP1, tunnetut tavoitteita alavirtaan mTOR koulutusjakson, molemmat merkittävästi tukahdutti Rapamysiinin ja ne olivat myös edelleen väheni yhdistelmän kanssa Dasatinibia. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että Rapamysiini synergized dasatinibihoidon tukahduttamisessa PI3K-Akt-mTOR signalointireitistä A549-soluissa.

Dual tukahduttaminen mTOR ja Src by siRNA aiheuttama solusyklin pysähtymiseen ja kasvun eston A549-soluja

vahvistaa mahdollisia vuorovaikutusta Src ja mTOR signalointi, me tutki tarkemmin muuttaminen fosforylaation tasojen PI3K /AKT ja ekspressiotasot CDK estäjän proteiinien A549 solujen keinotekoinen knock-down Src tai mTOR . Kuten kuviossa 4A lähestymiskielto ilmaus Src tai mTOR jonka siRNA merkittävästi tukahdutettu fosforylaation tasoja PI3K /AKT ja p70S6K /4E-BP1, vastaavasti. Toisaalta, ilmentymistasojen CDK-inhibiittori-proteiinit, mukaan lukien p16, p19, p21, ja p27, olivat kaikki ilmeisesti koholla, jonka si-mTOR tai si-Src (kuvio 4B). Yhteisymmärryksessä, ilmentyminen FoxO1 kasvattivat myös taas Cdk4 merkittävästi vähentynyt. Vielä tärkeämpää on, dual knock-down mTOR ja Src merkittävästi edistänyt esto PI3K /AKT, p70S6K /4E-BP1 ja johti ylössäätöä CDK-estäjä proteiineja, verrattuna joko si-mTOR tai si-Src yksin. Tulokset olivat yhdenmukaisia ​​meidän havaintojen A549-soluja käsiteltiin Rapamysiinin ja Dasatinibia.

(A) aktivointi tasot PI3K, AKT, ja mTOR määritettiin western blottauksella. A549-soluja transfektoitiin si-Src, si-mTOR, tai ohjaus siRNA: ssa 8 tuntia, minkä jälkeen pitkittynyt inkubointi 24 tuntia. Homogenaatti proteiineja (20 ug) peräisin kokosolulysaatissa kerättiin ja käytettiin western blottauksella. (B) Ilmaisulla CDK estäjän proteiinien (p16, p19, p21, ja P27), FoxO1, ja Cdk4 määritettiin western blottauksella. (C) Effects of si-mTOR ja si-Src on solusyklin etenemisen. A549-soluja transfektoitiin si-Src, si-mTOR, tai ohjaus siRNA: ssa 8 tuntia, minkä jälkeen pitkittynyt inkubointi 24 tuntia. Sitten solut kerättiin ja analysoitiin virtaussytometrialla PI-värjäyksellä. Tulokset on esitetty keskimääräinen prosenttiosuus solujen G0 /G1, S ja G2 /M-vaiheen kolmesta itsenäisestä kokeesta. Tulokset ilmaistiin keskimääräinen prosenttiosuus solujen G0 /G1, S ja G2 /M vaiheessa kolmesta itsenäisestä kokeesta. (D) vaikutukset si-mTOR ja si-Src ajallista muutoksia solujen lisääntymisen. A549 ells transfektoitiin si-Src, si-mTOR, tai ohjaus siRNA: ssa 8 tuntia, ja sitten inkuboitiin normaalissa väliaineessa 72 tuntia. Solumäärät mitattiin 0, 24, 48, ja 72 h transfektion jälkeen. Aineisto esitetään keskiarvona ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. * P 0,05, ** p 0.01.

Lisäksi knock-down mTOR ja Src johti samanlainen solusyklin pysähtymiseen ja että aiheuttama erityinen inhibiittorit Rapamysiinin ja Dasatinibia. Kuten on esitetty kuviossa 4C, dual mTOR ja Src siRNA indusoi suurempia tukahduttaminen solusyklin etenemisen G1-vaiheeseen A549-soluja verrattuna joko si-mTOR tai si-Src yksin. Lisäksi soluproliferaatiota vaikutti myös vertailukelpoisen tavalla, joka indusoi kemiallista inhibiittorit (kuvio 4D). Oli merkittävää, että si-mTOR yksin indusoi myös maltillinen G1 pidätyksen ja kasvun esto A549-soluissa, johtuen mahdollisesti korkeammasta tehosta masentavaa mTOR kuin sakko, jonka Rapamysiinin. Yhdessä si-mTOR paransi merkittävästi solusyklin pysähtymiseen ja kasvun esto, joka indusoi si-Src A549-soluissa, jotka tukivat meidän toteamus tehostettua kemoterapeuttisen vaikutuksen Dasatinibin yhdistettynä Rapamysiini.

Rapamysiinin tehosti estäviä dasatinibin vaikutusta solujen invaasiota ja muuttoliike A549

varmistamiseksi edelleen tehostajavaikutuksen Rapamysiinin on syövän vastaista aktiivisuutta dasatinibin, tarkastelimme hyökkäyksen ja migraatio A549 soluja erilaisia ​​hoitoja. Kuten kuviossa 5A, invasiivinen kyky kautta Matrigel-päällystetyt suodattimet solujen käsiteltiin Dasatinibia oli merkittävästi vähentynyt verrattuna kontrollisoluihin. Yhteistyössä hoito Dasatinibi kanssa Rapamysiini laskivat edelleen hyökkäyksen prosenttia A549-solut lähes 50%, kun taas Rapamysiini yksinään eivät osoittaneet selkeää tukahduttaminen solujen invaasio verrattuna kontrolliin.

(A) Kuvat ovat ( ylempi paneeli) ja kvantifiointi (alempi paneeli) hyökkäävän soluja. Kuten kerrotaan ”solu invaasiomääritys” in ”

Methods

”, A549-soluja käsiteltiin DMSO (0,1%), Dasatinibia (10 nM) yksin tai yhdessä Rapamysiini (100 nM) 24 tuntia. Numerot tunkeutuvat solut laskettiin mikroskoopin alla ja tulokset esitetään keskiarvona ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta, * p 0,05, ** p 0,01. (B) edustavat kuvat haavojen määritykset A549-soluja, joita oli käsitelty DMSO: ta (0,1%), Dasatinibia (10 nM) tai Rapamysiini (100 nM) 18 tuntia. (C): n ekspressio MMP-2/9 ja E-kadheriinin määritettiin western blot -tekniikalla, A549-solut, joita oli käsitelty DMSO: ta (0,1%), Dasatinibia (10 nM) tai Rapamysiini (100 nM) 24 tuntia.

lisäksi vaikutus Dasatinibi ja Rapamysiinin siirtyvien kyky A549-solut arvioitiin haavan paranemista määrityksessä käytetään fyysisesti haavoittunut soluja (kuvio 5B). Klo 18 h kuluttua ei naarmuunnu, käsittelemättömien A549-soluja tehokkaasti muuttivat viilto, ja vaikutus Rapamysiini yksin solujen vaeltamiseen ilmestynyt rajoitettu. Sen sijaan, siirtyminen oli ilmeisesti inhiboi dasatinibihoidon. baareja, SD. baareja, SD. baareja, SD.