Krooninen sairaus

tiivistelmä

Äskettäin kohdistaminen syövän kantasolut (CSCS ) aineenvaihdunta on tulossa lupaava terapeuttinen lähestymistapa parantaa syövän hoitotuloksia. Kuitenkin, tieto metabolisen tilan CSCS pieni keuhkosyöpä puuttuu edelleen. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että CSCS oli huomattavasti pienempi hapenkulutuksen ja solunulkoisen happamoitumisen nopeammin kuin ei-varsi syöpäsoluja. Samalla tämä solujen ala- populaation kulutetaan vähemmän glukoosia, tuotti vähemmän laktaatti ja ylläpitää alhaisempia ATP-tasot. Olemme paljasti myös, että CSCS voisivat tuottaa enemmän ATP läpi mitokondrioiden alustan tason fosforylaation aikana hengitys- esto verrattuna ei-kantasolujen syöpäsoluja. Lisäksi ne olivat herkempiä tukahduttaminen oksidatiivisen fosforylaation. Siksi oligomysiini (estäjä oksidatiivisen fosforylaation) voisi vakavasti heikentää palloja muodostavan ja kasvaimen aloittamista kyvyt CSCS. Työmme osoittaa, että CSCS edustavat metabolisesti aktiivinen kasvain osapopulaatioiden ylläpitävien tilassa osoittaa alhainen aineenvaihdunta. Kuitenkin mitokondrioiden alustan tason fosforylaation CSCS voi olla aktiivisempi kuin ei-kantasolujen syöpäsoluja. Lisäksi CSCS osoitti suosita oksidatiivisen fosforylaation yli glykolyysistä täyttämään energian kysyntään. Nämä tulokset laajentaa ymmärrystämme CSCS aineenvaihduntaa, mahdollisesti aikaan uusia hoitostrategioita kohdistaminen metaboliateissä pienisoluinen keuhkosyöpä.

Citation: Gao C, Shen Y, Jin F, Miao Y, Qiu X (2016) Cancer Karan solut pienisoluinen keuhkosyöpä Cell Line H446: Higher Riippuvuus oksidatiivisen fosforylaation ja Mitokondrioiden Alustan tason fosforylaatio kuin Non-Stem syöpäsoluja. PLoS ONE 11 (5): e0154576. doi: 10,1371 /journal.pone.0154576

Editor: Rafael Moreno-Sanchez, Instituto Nacional de Cardiologia, MEXICO

vastaanotettu 25 maaliskuuta, 2015 Hyväksytty: 15 huhtikuu 2016; Julkaistu: May 11, 2016

Copyright: © 2016 Gao et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat tutkimusohjelma Applied Basic ja huipputeknologia Tianjin alle sopimuksessa nro 14JCZDJC35500.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Pieni keuhkosyöpä (SCLC) on eräänlainen erittäin aggressiivinen kasvain, joka edustaa noin 15% kaikista keuhkosyöpää [1,2]. Vaikka potilaalla on SCLC on aluksi hyvä kliininen vaste kemo- sädehoitoa, useimmat potilaat hoidettiin näiden lähestymistapojen uusiutumisen jälkeen lyhyen ajan [3]. Tämä voi osittain johtua epäonnistumaan hävittämiseksi syövän kantasoluja (CSCS), joka on kyky itse uudistaa, erilaistua useiksi suvusta ja aloittaa kasvaimia immuunipuutteisilla hiirillä [4,5]. CSCS uskotaan olevan vastustuskykyisempiä radio- ja kemoterapian hoito kuin ei-kantasolujen syöpäsoluja [5]. Siksi on tärkeää kehittää lupaavia hoitostrategioita kohdistamista CSCS poistamalla niiden lääkeresistenssi.

Äskettäin vaikuttaa yhä selvää, että ”metabolinen uudelleenohjelmointi” syöpäsolujen on syntymässä tuntomerkki syövän fenotyypin [6 , 7]. Toisin kuin normaalit solut, syöpäsolujen hyväksyä vaihtoehtoisen metaboliareitti ja osoittaa parantunutta sokeriaineenvaihduntaan ja laktaatin jopa hapen läsnäollessa [8-10]. Tämä suosita aerobinen Glykolyysivaiheen [11], kutsutaan Warburg vaikutus. Vaikka aerobinen Glykolyysivaiheen on ajateltu olevan lähes universaali ilmiö syöpäsoluissa, metabolinen piirteitä CSCS ja niiden merkitystä syöpähoitojen pysyvät edelleen kiistanalainen [12]. Ciavardelli et al [13] ovat raportoineet, että rintasyöpä kantasoluilla on enemmän glykolyyttisissä kuin niiden ei-varsi kollegansa. Tutkimuksen mukaan Liao [14] ja hänen kollegansa on myös osoittanut, että munasarjasyöpä kantasoluja kaltaisia ​​soluja pääasiallisesti aineenvaihdunta glukoosi anaerobiset Glykolyysivaiheen ja Pentoosi sykli. Samaan aikaan, Yuan et al [5] ovat osoittaneet, että glioblastooma kantasolut (GSCs) näytteille suosita Glykolyysivaiheen yli mitokondrion hengitystä. Kuitenkin Vlashi et al [15] ovat osoittaneet, että GSCs luottaa enemmän oksidatiivinen fosforylaatio (OXPHOS) kuin Glykolyysivaiheen. Lagadinou ym [16] on myös osoittanut, että CSCS osoitti suurempaan riippuvuuteen OXPHOS energiansaantiin leukemiasolujen. Pasto ym [9] ovat osoittaneet, että syöpä kantasolut epiteelin munasarjasyöpä potilasta osoitti metaboliaprofiili hallitsevat OXPHOS. Vaikka rajoitettu julkaistua tietoa, joka koskee metaboliset ominaisuudet CSCS [17], ei yhtään SCLC. Siksi suunnitella uusia hoitomenetelmiä, jotka kohdistuvat metaboliareittiä CSCS vuonna SCLC, syvällisesti metabolisen tilan tämän solun alipopulaation tarvitaan kiireellisesti [7].

tutkia metaboliset ominaisuudet CSCS, ensimmäisen tehtävän on rikastamalla CSCS sisään SCLC soluissa. Eristäminen CSCS sekä in vivo ja in vitro perustuu spesifinen pinta-biomarkkereita, jotka helpottavat lajittelua syövän solujen fenotyypiltään erilliseen alapopulaatioihin [18]. Urokinaasi-tyyppisen plasminogeeniaktivaattorin reseptorin (uPAR) on glykosyylifosfatidyyli-inositoli (GPI) ankkuroitunut proteiini [19], ja se on yleensä säädellään ylöspäin useita erityyppisiä syöpiä [20]. Tärkeää on, työmme ja toisten on tunnistanut uPAR välittäjänä syövän kantasolujen toiminto [21,22]. Esimerkiksi uPAR

+ solujen SCLC solulinjoissa osoitti monilääkeaineresistenssin ja parannettu klonogeeniset aktiivisuutta in vitro verrattuna uPAR

– soluja [23]. Edellinen työ meidän laboratorio on myös osoitti, että varsi kaltainen solualapopulaatioiden voidaan rikastettu uPAR

+ soluihin [24]. Siksi käytimme uPAR lajittelu rikastamiseksi CSCS in SCLC solulinjassa H446.

Tässä tutkimuksessa ensin verrattuna metabolisen tilan CSCS kanssa ei-varren syöpäsoluja ja totesi, että CSCS olivat metabolisesti aktiivinen kasvain alapopulaatioiden joka asui tilassa osoittaa alhainen aineenvaihdunta. Sitten tutkittiin suuria määriä energiaa tuottavien polkuja CSCS in SCLC. Toisin kuin kantasolujen syöpäsoluja, CSCS osoitti suosita of OXPHOS yli Glykolyysivaiheen täyttämään energian kysyntään. Lisäksi olemme myös havainneet, että CSCS voisi tuottaa ATP läpi mitokondrioiden alustan tason fosforylaatio.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

SCLC solulinjaa NCI-H446 saatiin American Type Culture Collection (ATCC). Nämä solut viljeltiin RPMI-1640 (Biological Industries), jota oli täydennetty 10% FBS: ää (Thermo Scientific HyClone), 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä kosteutetussa ilmassa 37 ° C: ssa, 5% CO

2.

Virtaussytometrianalyysi

solulajittelussa suoritettiin yksisolususpensioon alkaen H446 soluista värjättiin ensisijaisen vasta-aineen uPAR (hiiri monoklonaalinen vasta-aine, 1: 100, American Diagnostica, nro 3936). Sitten solut pestiin ja inkuboitiin FITC-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen (Dako) 30 minuutin ajan. Kaikki näytteet mitattiin käyttäen FACSCalibur-virtaussytometriä (BD Biosciences) ja analysoitiin CellQuest-ohjelmaa (BD Biosciences). uPAR

+ solujen ja uPAR

– soluja lajiteltu FACS käytettiin kaikissa kokeissa (S1 Kuva).

Hapen kulutus ja solunulkoisen happamoitumisen korko

solunulkoiseen Flux Analyzer mahdollistaa analysoimiseksi hapenkulutuksen (OCR) ja solunulkoisen happamoitumista rate (ECAR) on määritelty määrä soluja reaaliajassa ja seurataan niiden lääkekäsittelyyn [15]. Solut maljattiin tiheydellä 1 x 10

5-solut kussakin kuopassa 24-kuoppaisilla levyillä. Seuraavana päivänä solut pestiin ja lisättiin tuoretta väliainetta lisättiin. Pylväs ladattiin luopua kolmen metabolisen inhibiittorit peräkkäin erityistä ajankohtina: oligomysiini (estäjä ATP-syntaasi, 1 uM), ja sen jälkeen FCCP (a protonofori ja uncoupler mitokondrioiden OXPHOS, 0,3 gm), minkä jälkeen lisättiin yhdistelmä rotenone (mitokondrion kompleksi I: n estäjä, 1 uM) ja Antimysiini- (mitokondrion kompleksin III estäjä, 1 uM). Basal OCR ja ECAR mitattiin, samoin kuin muutokset ECAR aiheuttamat metaboliset inhibiittorit on kuvattu edellä. Useat parametrit vähennettiin muutoksista OCR, kuten pohjapinta OCR, maksimi mitokondrioiden kapasiteettia, ja mitokondrioiden varakapasiteettia (= [maksimi mitokondrioiden kapasiteetti] – [perus OCR]) kuten aiemmin on kuvattu [15,25].

glukoosin oton ja laktaatintuotto mittauksia ja laskentaa bioenergetic organisaation

mittaus glukoosin oton, lajitellut solut maljattiin tiheydellä 1 x 10

6 /ml /kuoppa 6-kuoppaisille levyille ja inkuboitiin glukoosi-RPMI 1640: ssa 2 h ajan 37 ° C: ssa. Lisäyksen jälkeen 2- [N- (7-nitrobents-2-oksa-1,3-diazol-4-yyli) amino] -2-deoksi-D-glukoosi (2-NBDG) lopulliseen konsentraatioon 100 uM, soluja inkuboitiin vielä 1 h, pestiin kahdesti PBS: llä, ja analysoitiin virtaussytometrialla [26]. L-laktaatti-tuotanto havaittiin käyttämällä L-laktaattia iinianalyysikitissä (Eton Bioscience, San Diego, USA) kuten aikaisemmin on kuvattu [27] mukaisesti ja valmistajan ohjeiden ja L-laktaatti normalisoitiin solujen määrä. Bioenergetic organisaatiot soluista laskettiin edellä kuvatulla raportissa Hao et ai, käytimme seuraavasti: Lac (c) = laktaattipitoisuutta vertailualustassa jälkeen 6h inkuboinnin; Lac (o) = laktaatin pitoisuus alustassa sen jälkeen, kun 6h inkubaation 2 ug /ml oligomysiini; Glykolyysin% = Lac (c) x 100 /Lac (o); ja OXPHOS% = 100 – Glykolyysi% [28].

ATP määrityksissä

Cellular ATP: n pitoisuudet mitattiin käyttäen ATP-pohjainen CellTiter-Glo Luminescent elinkykyyn kit (Promega, Madison, WI) modifioitu valmistajan protokollaa. Lyhyesti, solut maljattiin 96-kuoppaisille levyille eri tiheyksillä. Kolme tuntia myöhemmin, sama tilavuus yhdessä yhden askeleen reagenssi, jonka pakkauksessa lisättiin kuhunkin kuoppaan ja ravistettiin 10 minuuttia huoneenlämpötilassa. Cellular ATP-pitoisuus mitattiin käyttämällä luminoivaa levylukijaa. Testata ATP heikentäviä vaikutuksia aineenvaihdunnan inhibiittorit, eri pitoisuuksia yhdistettä lisättiin soluihin ympättiin 1 x 10

4 solua /kuoppa ylimääräisiä 3h, ja solujen ATP-pitoisuus mitattiin kuten edellä on kuvattu.

MTT-analyysi

solut ympättiin 96-kuoppalevylle 3000 solua kuoppaa kohti 100 ul: ssa solujen elatusaineeseen ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 24 h ja sitten käsiteltiin osoitetulla yhdisteillä eri pitoisuuksina. 72 h kuluttua inkuboinnin soluja inkuboitiin 10 pl MTT: tä (lopullisena pitoisuutena 0,5 mg /ml) 37 ° C: ssa 4 h [29]. Väliaine poistettiin ja saostunut formatsaani liuotettiin 100 ul DMSO. Kun on ravisteltu 10 min, absorbanssi 490 nm havaittiin käyttäen TECAN Genios Pro (BioTek Instruments).

Kasvain palloja muodostavan määritys

Voit hankkia aloilla kulttuurin, uPAR

+ soluja käsitelty tarkoitettu yhdisteillä 3 h. Sitten 1 x 10

3-soluja ympättiin seerumittomassa väliaineessa (SFM) (DMEM /F12), jota oli täydennetty 20 ng /ml emäksistä fibroblastikasvutekijää (bFGF) ja epidermaalinen kasvutekijä (EGF) (PeproTech), 5 ug /ml insuliinia (Sigma-Aldrich), 0,4% naudan seerumin albumiinia (BSA, Invitrogen), ja 0,02 x B27 (Invitrogen). Viljelyalusta korvataan tai täydennetty kasvutekijöillä kahdesti viikossa. Kokonaismäärä kasvaimen pallojen laskettiin 14 päivän jälkeen kulttuurin.

tuumorigeenisyystesti määritys nude-hiirissä

Eläinkokeet suoritettiin neljän viikon ikäisten BALB /ca nude-hiirissä ostetaan Beijing HFK Bio- Technology. Co, LTD (Peking, Kiina). Protokollat ​​tehtiin hyväksymisen jälkeen valiokunnan eettisen Eläinkokeiden Tianjin Medical University (Luvan numero: TMHaMEC2014030). Lajitellut uPAR

+ soluja käsiteltiin 2 ug /ml oligomysiini 24 tuntia, pestään, ja korjataan ihonalainen rokotus vasemmalla kyljissä BALB /ca nude-hiirissä. Samat numerot valvontaa soluja siirrostettiin oikealla kylkiin saman hiirillä ihon alle. Kukin inokulointipaikan ruiskutettiin 5 x 10

5 solua. Sitten hiiriä tarkkailtiin kasvainten muodostumista ilman lääkehoitoa in vivo. Hiiriä havaittiin 2-3 kertaa viikossa laboratorion henkilökunta ja seurata mahdollisten hätä (ts muutoksia ulkonäkö, hengityksen, aktiivisuus, jne.). Kasvaimet mitattiin kerran viikossa. Kaikki eläimet molemmissa ryhmissä olivat edelleen hyvässä kunnossa ennen kokeen loppuun. Mikään tarvittavien eläinten eutanasia ennen kokeellista päätepisteen. Kuuden viikon kuluttua, koe-eläimet nukutettiin natriumpentobarbitaalilla (45 mg /kg, vatsaonteloon) ja tapettiin saattamalla kaula sijoiltaan. Kasvaimen tilavuus = 0,5 × pituus × leveys

2.

elektronimikroskopialla

uPAR

+ solujen ja uPAR

– soluja lajiteltiin FACS edellä kuvatulla tavalla. Mikroskooppitutkimus analyysi lajitellut solut tehtiin kuten raportissa Varum et al [30].

Tilastollinen

Data analysoitiin SPSS for Windows-versio 17,0 ohjelmisto (SPSS Inc, Chicago , IL, USA). Jokainen koe suoritettiin vähintään kolme riippumatonta tutkimuksissa. Kaikki tulokset ilmaistaan ​​keskiarvoina ± s.e.m. ja tilastollisessa vertailussa paikkatietoaineistojen analysoitiin käyttämällä paritonta Studentin t-testiä tai ANOVA testi. P 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Solunulkoisilla flux analyysi paljasti metabolisen eroja CSCS ja ei-varsi syöpäsolujen

saada tietoa metaboliseen profiiliin CSCS ja verrata sitä ei-varsi syöpäsoluja, ensin suoritetaan solunulkoisen metabolisen flux analyysi [16]. OCR ja ECAR mitattiin. Kuten kuviossa 1A, CSCS rikastettu uPAR

+ solut osoittivat alempi pohjapinta OCR, osoittaa alemman mitokondrioiden hengityksen, verrattuna niiden uPAR

– kollegansa. Kun pohjapinta ECAR of uPAR

+ solujen ja uPAR

– soluja verrataan, uPAR

+ soluissa oli myös vähemmän aktiivisia osalta fermentatiivista Glykolyysivaiheen. Tutkia metabolisia ominaisuuksia kaksi alapopulaatioiden yksityiskohtaisesti, käytimme farmakologisen profilointi strategiaa, yhdistämällä soveltaminen kolmen metabolisen estäjien (oligomysiini, FCCP, yhdistelmä rotenone ja antimysiinin) [30]. Käsittely oligomysiini johti laskua OCR kahden solualapopulaatioiden. Kuitenkin uPAR

+ solut ilmensivät vähäisempää lasku OCR verrattuna uPAR

– soluja (kuvio 1 B). Irrottaminen OXPHOS käyttäen FCCP nousi OCR maksimi molemmissa solualapopulaatioiden, jossa vähäisempi vaste noudateta uPAR

+ soluissa (kuvio 1 B ja 1 C). Ero FCCP OCR ja pohjapinta OCR on hyvä indikaattori hengityselinten kyky (kutsutaan myös mitokondrion varakapasiteettia) näiden solujen [30]. Vaikka pohjapinta OCR on uPAR

+ soluja oli pienempi, mitokondrio varakapasiteetti uPAR

+ soluissa oli verrattavissa uPAR

– soluja (kuvio 1 C). Vaikka pohjapinta ECAR on alhainen uPAR

+ solut, on mahdollista, että uPAR

+ soluja voi sää- dellä glykolyysin, kun mitokondrion OXPHOS on estetty [16]. Tutkimaan mahdollisuutta, mittasimme ECAR näiden käsiteltyjen solujen OXPHOS estäjien, joka on parametri compensative mahdollisia glykolyysin [16]. Kiehtovan, uPAR

+ solut osoittivat merkitsevästi vähentynyt compensative potentiaalia Glykolyysivaiheen kun mitokondrioiden energiantuotannon estyi (kuvio 1D ja 1E). Lisäksi tuloksemme osoittivat, että uPAR

+ solut olivat vähentyneet ATP-tasot verrattuna uPAR

soluissa (kuvio 1 F). Yhdessä meidän tiedot viittaavat siihen CSCS rikastettua uPAR

+ solut ovat metabolisesti aktiivinen solupopulaatioiden SCLC.

(A) Basal OCR ja ECAR varten uPAR

+ ja uPAR

– osajoukot . (B) OCR käsittelyn jälkeen osoitti estäjien uPAR

+ soluja versus uPAR

– soluja. (C) Suurin mitokondrioiden hengityselinten valmiuksia ja mitokondrioiden varakapasiteettia kahdessa osapopulaatioiden. (D) ECAR käsittelyn jälkeen osoitti estäjien uPAR

+ soluja versus uPAR

– soluja. (E) Minkään compensative potentiaali Glykolyysivaiheen of uPAR

+ solujen ja uPAR

– soluja. (F) ATP-pitoisuus uPAR

+ solujen ja uPAR

– soluja. Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM. Kolmen riippumattoman kokeen. Studentin t-testiä käytetään laskettaessa tilastollista merkittävyyttä. * P 0,05.

CSCS osoittivat vähemmän glukoosin sisäänoton ja laktaatin tuotantoa SCLC

tutkimiseksi edelleen metabolisen erot uPAR

+ solujen ja uPAR

– soluja , arvioimme glukoosin oton kahden osapopulaatioiden. uPAR

+ soluilla vähemmän glukoosin oton kuin uPAR

– soluja (kuvio 2A). Meidän ECAR mittaukset osoittivat eroja laktaatti sukupolven välillä uPAR

+ solujen ja uPAR

– soluja (kuvio 1A ja 1 D). Yhdenmukaisesti näiden havaintojen, uPAR

+ solut osoittivat merkittävää alentuneesta laktaattituotanto verrattuna uPAR

– soluja (kuvio 2B). Tämä taas osoitti, että CSCS olivat vähemmän glykolyyttisissä kuin niiden ei-kantasolujen syöpäsoluja. Glutaminolysis on yleensä aktiivinen kasvainsoluissa, siksi mittasimme 2-deoksiglukoosi-herkkien laktaatin tuotantoa uPAR

+ solujen ja uPAR

– soluja. Kuten esitetään S2 kuvassa, 2-DG aiheutti huomattavaa vähentämistä laktaatin tuotantoa. Nämä tulokset viittaavat siihen, glutaminolysis ei ollut niin aktiivinen pienisoluisen keuhkosyövän solulinjassa H446 kuin muissa kasvainsoluissa.

(A) Glukoosi oton uPAR

+ solut ja uPAR

– soluihin käyttäen 2- NBDG. Vasen, histogrammi esitys 2-NBDG intensiteetti. Oikea, kvantifiointi 2-NBDG ottoon ero fluoresenssin keskimääräinen intensiteetti (MFI) välillä ja kontrollit. (B) Lactate tuotanto määriä uPAR

+ solujen ja uPAR

– soluja. Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM. Kolmen riippumattoman kokeen. Studentin t-testiä käytetään laskettaessa tilastollista merkittävyyttä. * P 0,05.

Mitokondrioiden määrän ja morfologia CSCS oli erilainen kuin muiden kuin kantasolujen syöpäsolujen

Vähentynyt mitokondriaalisen hengityksen uPAR

+ solujen voitiin katsoa alempi määrä mitokondrioissa tai kypsymättömyyttä mitokondrioiden näissä soluissa verrattuna uPAR

– soluja. Tutkimaan asian, suoritimme transmissioelektronimikroskopiaa [30] varten uPAR

+ solujen ja uPAR

– soluja. Kuten kuviossa 3, suurin osa mitokondrioiden uPAR

– soluja pyöristetty soikea, näytetään harvaa ja epäsäännöllistä kristat ja elektronin läpäisevästä matriisi. Kuitenkin uPAR

+ solut valikoivasti hallussaan aktivoitu mitokondrioita, kuten klusterointi mitokondrioita, paksuuntunut kristat, ja ”vaunun pyörän” morfologia [17,31]. Tämä morfologiset arvioinnin mukaan mitokondrioissa uPAR

+ solut ovat kypsempiä ulkonäöltään kuin uPAR

– soluja. Nämä tulokset seistä jyrkässä ristiriidassa alempien hengitysteiden toimintaa uPAR

+ solujen suhteessa uPAR

– soluja.

Ultrastructural analyysi lajiteltu uPAR

+ solujen ja uPAR

– soluja käyttämällä transmissioelektronimikroskopialla. Kuvat ovat näkyvät suurennus x 10,000 ylä- paneelien ja × 30000 alemmissa paneelit. Nuolet alempi paneeli osoittaa esimerkkejä mitokondrioita. Mittaviivat: 5 um (ylempi paneeli) ja 1 um (alempi paneeli).

Riippuvuus OXPHOS ja mitokondrioiden alustan tason fosforylaation vaihtelivat CSCS ja ei-kantasolujen syöpäsoluja SCLC

Tutkitaan suhteellisesta merkityksestä OXPHOS ja glykolyysin CSCS, päätimme pitää molempia alaryhmiin eri aineenvaihdunnan estäjien ja analysoitava uudelleen ATP tasot hoidon jälkeen [15]. 2-DG oli kilpailukykyinen Glykolyysivaiheen estäjä, ja oligomysiini käytettiin inhiboimaan ATP tuotannon kautta mitokondrioiden ATP nopaliinisyntaasin. Kuten on esitetty kuviossa 4A, ATP-tasot uPAR

+ solujen H446 väheni 43,2% ja 64,1%: n valvonnan arvoa, kun käsiteltiin 2-DG ja oligomysiini, vastaavasti. Vuonna uPAR

– soluja, 2-DG aiheutti 81,9% ATP pudotus, kun taas ATP pudota aiheuttama oligomysiini oli 54,7% (kuvio 4B). Kun vaikutus oligomysiini ja 2-pääosaston ATP-tasot verrattiin kahdessa alapopulaatioiden, oligomysiini oli voimakkaampi vaikutus uPAR

+ soluja. Sen sijaan 2-DG vaikutti uPAR

– soluja tehokkaammin kuin uPAR

+ soluja (S3 kuvassa). Tiedot osoittivat, että uPAR

+ solut olivat herkempiä OXPHOS esto verrattuna uPAR

– soluja. Tutkimaan edelleen tärkein energianlähde väylän CSCS, laskimme bioenergetic järjestöjen Glykolyysivaiheen ja OXPHOS [28] vuonna uPAR

+ solujen ja uPAR

– soluja. Bioenergetic organisaatiot ovat heterogeenisiä ja ennustaa ero bioenergetic riippuvuutta Glykolyysivaiheen ja OXPHOS molemmille alapopulaatiot (S4 kuvio). Nämä tulokset viittaavat siihen, että CSCS voi riippua enemmän OXPHOS sijaan glykolyysistä vastaamaan energiantarpeeseen. Lisäksi havaitsimme kaksi solualapopulaatioiden vielä voisi tuottaa ATP vaikka hoidettiin yhdistelmällä 2-PO ja oligomysiini. Tämä merkitsi sitä, että nämä solut voivat turvautua muihin energianlähde reittejä, kuten mitokondrioiden alustan tason fosforylaation aikana hengityslama.

(A, B) ATP pitoisuus uPAR

+ solujen ja uPAR

– soluja käsiteltiin 2-DG, oligomysiini (OLI) tai yhdistelmällä 2-PO ja OLI. (C) vaikutus yhdistelmän 2-PO ja OLI eri kertaa solunsisäisiä ATP tasoilla uPAR

+ solujen ja uPAR

– soluja. (D) uPAR

+ soluja, eikä uPAR

– solut voisivat tuottaa enemmän ATP läpi mitokondrioiden alustan tason fosforylaation hypoksisissa olosuhteissa kuin happiolosuhteissa (E) lisääminen substraatteja (SUB) voisi korjata ATP ehtyminen aiheuttama 2-PO ja OLI in uPAR

+ soluissa, mutta ei uPAR

– soluja. Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM. Kolmen riippumattoman kokeen. Studentin t-testiä käytetään laskettaessa tilastollista merkittävyyttä. * P 0,05. SUB, substraatit (α-ketoglutaraatti ja aspartaatti). ns, ei ole merkitystä.

Raportit ovat ehdottaneet, että ”pakottaa” substraatti-tason fosforylaation ylitöihin voi olla käyttökelpoinen strategia selviytyä energiakriisin aiheuttama OXPHOS vajaatoiminta hiiva [32,33] . Optimoida tätä strategiaa SCLC, me esti Glykolyysivaiheen ja OXPHOS ja siten pakotti soluja tuottamaan ATP kautta mitokondrioiden alustan tason fosforylaatio. Tätä varten lähdettiin alun perin määrittää pieni annos oligomysiini ja 2-DG joka täydellisesti esti OXPHOS ja glykolyysin toimintaa, vastaavasti. Kun hoitoon uPAR

– soluja eri annoksilla 2-DG välillä 5 80 mM: ssa 3 tuntia, ATP-tasot näissä soluissa mitattiin. ATP ei enää vähene nostamalla 2-DG 20-40 ja 80 mM, mikä osoittaa, että 20 mM 2-DG tukahdutti täydellisesti ATP tuotannon uPAR

– soluja (S5a kuvio). Samalla tavalla, ehdotimme, että 2 ng /ml oligomysiini voi estää OXPHOS täysin uPAR

+ soluja (S5B kuvio). Havaitsimme, että uPAR

+ solut tuottivat enemmän ATP sisältöä läpi alustan tason fosforylaation kuin tehdä uPAR

– soluja (kuvio 4C). Lisäksi uPAR

+ solut tuottivat enemmän ATP kautta alustan tason fosforylaation hypoksisissa olosuhteissa kuin alla happiolosuhteissa (kuvio 4D). Lisäksi ATP määritykset osoittivat, että α-ketoglutaraatin /aspartaatti lisäravinteen kasvatusalustaan ​​voisi korjata ATP ehtyminen aiheuttamat oligomysiini ja 2-pääosaston uPAR

+ soluja. Kuitenkin tämä ilmiö ei havaittu uPAR

– soluja (kuvio 4E). Nämä havainnot osoittivat lisäksi, että mitokondrioiden alustan tason fosforylaation uPAR

+ solut voivat olla aktiivisempia kuin että uPAR

– soluja.

Oligomysiini heikentynyt palloja muodostavan kyky CSCS

Meidän havainnot todistivat, että CSCS rikastettua uPAR

+ solut voivat riippuvat voimakkaasti OXPHOS sillä niiden pääasiallisena energianlähde reitin. Sitten testataan onko oligomysiini voisi johtaa tehokkaaseen tappamiseen CSCS vuonna SCLC, logiikalla että oligomysiini voisi heikentävistä solujen ATP-sisältöä olennaisesti estämällä OXPHOS. Koska in vitro kyky muodostaa klooneja pidetään indikaattorina kasvaimeen aloittamista kyky syöpäsolujen in vivo [5], testasimme vaikutus oligomysiini ja 2-PO kykyyn CSCS vuonna H446 muodostaa palloja. 2-DG voinut kumota kyky muodostaa klooneja CSCS, mutta oligomysiini vähensi ja koko pallojen viljelmässä (kuvio 5A-5C). Lisäksi 2-DG viljelyalustaan ​​osoitti, että inhibitio anaerobisen glykolyysin vakava kasvuun uPAR

– soluissa, mutta ei uPAR

+ solut. Sen sijaan, oligomysiini merkittävästi vähentynyt proliferaatio sekä solun alatyyppiä (kuvio 5D).

(A) edustaja morfologia pallojen ylläpitää seerumittomassa väliaineessa vakiinnutettiin uPAR

+ soluja käsiteltiin oligomysiini ja 2- DG. (B) määrä ensimmäisen sukupolven pallojen tuotetaan uPAR

+ soluja käsiteltiin 2-PO ja oligomysiini. Klonogeeniset potentiaali uPAR

+ solujen väheni oligomysiini hoitoa. Sen sijaan 2-DG ei merkittävästi vaikuta klonogeeniset potentiaalia CSCS. (C) määrä solua kohti pallo syntyvät uPAR

+ soluja käsiteltiin 2-DG ja oligomysiini päivänä 14. (D) Oligomysiini estää leviämisen sekä uPAR

+ solujen ja uPAR

– solut, mutta 2-DG vaikuttaa ainoastaan ​​uPAR

– soluja, mutta ei uPAR

+ soluja. Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± s.e.m. Kolmen riippumattoman kokeen. Studentin t-testiä käytetään laskettaessa tilastollista merkittävyyttä. * P 0,05.

Oligomysiini esti tuumorin-aloitetaan kyky CSCS in vivo

vaikutuksen testaamiseksi oligomysiini tappaa kasvaimen aloittamista solujen CSCS alapopulaatioiden, uPAR

+ soluja käsiteltiin menetelmällä, joka on esitetty kuviossa 6A. Sitten kaksi ryhmää inokuloitiin subkutaanisesti BALB /cA nude-hiirissä, jotka oli jaettu kahteen ryhmään. Sitten hiiriä tarkkailtiin kasvainten muodostumista ja kasvaimen kasvua ilman lääkehoitoa [12]. Kuusi viikkoa myöhemmin, ryhmä hoitaa oligomysiini ja kontrolliryhmän muodostivat kasvaimia (kuvio 6B ja 6C). Ryhmä hoitaa oligomysiini oli merkitsevästi vähensi kasvainten tilavuuden ja painon (125,8 ± 13,67 mm

3, 0,2 ± 0,1 g) verrattuna kontrolliryhmään (451,5 ± 16,23 mm

3, 0,42 ± 0,15 g) (kuvio 6D ja 6E). Nämä havainnot viittaavat siihen, CSCS säilyttävät varsi kaltaisia ​​ominaisuuksia OXPHOS in SCLC solulinjassa H446.

(A) Kokeellinen järjestelmä. (B) edustaja valokuva kasvainten muodostuu käsiteltyjen solujen oligomysiini tai kontrollisoluja. (C) edustaja valokuva BALB /ca nude uroshiirillä kasvaimen 42 päivää. (D) Kasvaimen paino ksenograftikasvaimissa tilavuudesta ryhmässä, jota käsiteltiin oligomysiini ja kontrolliryhmään. (E) kasvukäyrän ksenograftikasvaimissa tilavuudesta ryhmässä, jota käsiteltiin oligomysiini ja kontrolliryhmään. Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± s.e.m. jossa oli kuusi hiirtä. Studentin t-testiä käytetään laskettaessa tilastollista merkittävyyttä. * P 0,05.

kliinisissä sovelluksissa, se on parempi ottaa ei-syöpäsolujen huomioon. Tutkimuksessamme pitoisuus oligomysiini on 2 ug /ml, joka on paljon vähemmän kuin kuolettava annos [34], ja kaikki hiiret koeryhmän ovat edelleen hyvässä kunnossa ennen kokeen loppuun. Siksi uskomme, että sivuvaikutus oligomysiini on vain vähän tutkimuksessamme. Lisäksi muu ryhmä on osoittanut, että kohdennettu anti-mitokondrioiden terapian avulla oligomysiini on tehokas pidättämään MCF-7 sferoidiviljelmiä kasvu ilman näkyvää vaikutusta normaaleihin epiteelin rintojen kudosta samansuuruisilla annoksilla [35]. Mutta ottaen huomioon ajan ja meidän alkuperäinen tarkoitus, meillä on tapana havainnollistaa erillisiä metabolisen fenotyypit suurin osa syöpäsolujen ja CSCS. Siksi pidämme CSCS ja ei-varsi syövän tutkimus esineitä tässä paperissa.

Keskustelu

Tähän asti valtaosa tämän alan tutkimusten ovat keskittyneet suurin kasvainsoluja, jotka näytä lisääntynyt Glykolyysivaiheen vaikka läsnä hapen erilaisissa kasvaimissa [17]. On kuitenkin yhä enemmän näyttöä siitä, että metabolinen tila CSCS eroaa ei-kantasolujen syöpäsoluja [36-38]. Tiedetään vain vähän metabolisen ominaisuuksista CSCS vuonna SCLC toistaiseksi. Täällä, osoitimme että CSCS asunut tilassa osoittaa alhainen metabolinen aktiivisuus SCLC. Tuloksemme ymmärtää, että CSCS rikastettua uPAR

+ soluja lepääviä osajoukkojen SCLC. Solu lepotilamuotoja voisi tuoda etuja syöpäsoluja. Toisaalta, useimmat nykyiset hoidot on kohdistettu lisääntyvät kasvainsolut. Siten lepotilassa CSCS voi selviytyä kohdistettuja hoitomuotoja ja vastaa kasvaimen uusiutumisen. Toisaalta, tämä suhteellisen Lepotilassa todennäköisesti tekee CSCS jatkuvat, jopa erittäin rasittavissa olosuhteissa, kuten alhainen ravinteiden tai happipitoisuus [16]. Nykyinen tutkimus tarjoaa mahdollisuuksia ymmärtää monimutkaista kasvain lepotilan, mutta mekanismia prosessi on lisätutkimuksia.

miRNA pelata olennaista sääntelyn rooleja eri biologisissa prosesseissa, kuten aineenvaihdunta [27]. Edellinen työ meidän laboratorio vertasi miRNA ilmaisun profiilit CSCS ja ei-kantasolujen syöpäsolujen H446 käyttäen miRNA array myös 1212 kypsä miRNA. Array, todettiin, että 86 miRNA jotka ilmentyvät differentiaalisesti välillä CSCS ja ei-kantasolujen syöpäsolujen (P 0,01), mukaan lukien 48 ilmen- tymisen lisääntymisen miRNA ja 38 vaimentua miRNA in CSCS. Niistä 86 ilmentyvät eri miRNA, 18 48 ilmen- tymisen lisääntymisen miRNA ja 20 38 vaimentua miRNA osoitti vähintään 4-kertainen muutoksia CSCS suhteessa kuin kantasolujen syöpäsoluja [29]. Siksi seuraava työ on tutkia vaikutusta miRNA aineenvaihdunnan tilasta CSCS vuonna SCLC.

Tässä tutkimuksessa osoitimme, että CSCS osoitti etuoikeutettu käyttö OXPHOS yli Glykolyysivaiheen täyttämään energian kysyntään. Parhaan tietomme CSCS asuvat hypoksinen ympäristöissä [39]. Miksi CSCS edelleen riippuvainen OXPHOS vuonna hypoksinen mikroympäristössä? Mielestämme syyt ovat seuraavat. Ensinnäkin, happipitoisuus hypoksinen mikroympäristön on ehdotettu olevan puitteissa 8-57μM [4,40-42], joka on korkeampi kuin raja-pitoisuuden O

2 dissosiaatiovakio sytokromi-c-oksidaasi [43 ]. Siksi CSCS silti voinut voimakkaasti riippuvaisia ​​OXPHOS jopa hypoksinen olosuhteissa. Toiseksi on metabolinen symbioosi kahden alapopulaatioista syöpäsolujen erottuva riippuvuudet energiaa tuottavien reittejä [44,45]. Glykolyyttisissä syövän sivutuote laktaattia voidaan käyttää tärkeänä aineenvaihduntatuote varten OXPHOS syövän osajoukot, jotka ovat riippuvaisia ​​mitokondrioiden aineenvaihduntaan. Metabolinen symbioosi mahdollistaa syöpäsolujen täysimääräisesti käytettävissä olevia resursseja [45]. Kolmanneksi Otto Warburg ”työ on osoittanut, että erittäin lisääntyvät solut usein ensisijaisesti suorittaa Glykolyysivaiheen yli OXPHOS [17]. Läpi Glykolyysivaiheen, jotkut glukoosia tulee ohjautua asetyyli-CoA ja NADPH tarvitaan makromolekyyliyhdisteiden synteesiin [46].