Krooninen sairaus

tiivistelmä

Virtsarakon syöpä on neljänneksi yleisin syy syövän miehillä Yhdysvalloissa. Invasiivinen käyttäytyminen on merkittävä tekijä ennusteen. Tässä tutkimuksessa tunnistimme nisäkkään rapamysiinin kohde monimutkaisten 2 (mTORC2) keskeisenä säätelijänä virtsarakon syöpä solumigraation ja invaasiota. mTORC2 aktiivisuus arvioitiin laajuutta fosforylaation Ser473 AKT ja sen määritettiin olevan noin 5 kertaa korkeampi yksilöillä invasiivisen ihmisen virtsarakon syövän vastakohtana ei-invasiivisia ihmisen virtsarakon syöpään. Immortalisoidut pahanlaatuisia virtsarakon solulinjoissa, UMUC-3, J82 ja T24 osoittanut lähtötilanteessa korkeampi mTORC2 aktiivisuus suhteessa hyvänlaatuinen virtsarakon papilloomavirus-solulinjaa RT4 ja normaalin urothelial solulinjan HU1. Pahanlaatuisia virtsarakon syöpäsolujen myös havaittu olevan muuttoliikkeen siirtokuoppaan ja paljaaksitulo määrityksissä, lisääntynyt hyökkäys matrigeelin, ja lisääntynyt kyky hyökätä ihmisen virtsarakon yksilöitä. Gene vaiennettu rictor, kriittinen osa mTORC2, olennaisesti estyy virtsarakon syöpä solujen vaeltamiseen ja invaasiota. Tähän liittyi merkittävä lasku Rac1 aktivointi ja paksilliini fosforylaatio. Nämä tutkimukset tunnistaa mTORC2 merkittävänä kohteena neutraloivat virtsarakon syövän invaasio.

Citation: Gupta S, Hau AM, Ranta JR, Harwalker J, Mantuano E, Gonias SL, et al. (2013) Mammalian rapamysiinin kohde Complex 2 (mTORC2) on kriittinen tekijä virtsarakon syövän Invasion. PLoS ONE 8 (11): e81081. doi: 10,1371 /journal.pone.0081081

Editor: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 11 heinäkuu 2013; Hyväksytty: 08 lokakuu 2013; Julkaistu: 27 marraskuu 2013

Copyright: © 2013 Gupta et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Case Western Reserve University /Cleveland Clinic CTSA Grant Number UL1 RR024989 National Cancer Institute, ja KL2 urakehitystä palkinnon (RR024990) DE Hansel. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Virtsarakon syöpä vastaa yli 70000 uutta syöpätapausta Yhdysvalloissa vuosittain, arviolta maailmanlaajuinen esiintyvyys 386000 tapausta vuodessa [1,2]. Urothelial karsinooma (UCA) osuus on noin 95% kaikista virtsarakon syöpien, jossa hoitotuloksia ensisijaisesti vaikuta patologinen laatu ja vaihe [3]. Grade on ensisijainen tekijä käyttäytymistä ei-invasiivisia Uca joka on jaettu matala-asteista ja korkea-asteen luokkia. Matala-asteinen sairaus näkyy usein paikallisen uusiutumisen virtsarakon pintaan, mutta harvinainen eteneminen invasiivisen sairauden [4]. Korkeatasoinen tauti etenee hyökkäystä 40-50%: lla potilaista [5]. Kun hyökkäys tapahtuu, tautikohtaisia ​​selviytymisen vähenee yhä patologinen vaiheessa (ts syvyys invaasion virtsarakon seinämän) huolimatta hoitotoimenpiteitä.

Virtsarakon syöpä on edelleen suhteellisen tutkittu ilmiö sairaus ja solumekanismeja jotka määrittävät syövän etenemisessä ovat puutteellisesti. Korkeatasoinen sairaus usein näkyy

RB

ja

TP53

mutaatioita ja

PTEN

poisto; kuitenkin, nämä geneettiset muutokset voidaan havaita sekä invasiivisia ja ei-invasiivisia vaurioita. Tunnistaminen pro-invasiivisen reittejä virtsarakon syöpä on ollut haastavampaa. Viimeaikainen työ on osoittanut, että fibroblastikasvutekijäreseptori-1 (FGFR1) edistää hyökkäystä virtsarakon syövän soluissa, jotka ilmentävät ZEB1, merkki epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) [6]; FGFR esto Tässä tutkimuksessa vähensi metastaattisen leviämisen ortotooppisesti istutettiin virtsarakon syöpäsoluja. FOXQ1 ilmentyminen liittyi myös EMT allekirjoituksen virtsarakon syövän soluissa ja vaiennettu FOXQ1 lisääntynyt E-kadheriinin ilmentymisen laski vimentiinistä ilmaisun ja heikennettyjä invasiivisen käyttäytymisen [7]. Fosfoinositidi-3-kinaasi-AKT-nisäkkään rapamysiinin kohde (mTOR) reitin on kartoitettu väylän virtsarakon syövän etenemisen useissa viimeaikaisissa kliinis tutkimukset [8,9]. Vaikka olemme tunnistaneet rooli mTORC1 edistämisessä virtsarakon syövän leviämisen

in vitro

ja virtsarakon syövän ksenografti- kasvu

in vivo

[9], rooli mTOR signaloinnin virtsarakon syövän invaasio ei ole tutkittu.

mTORC2 on houkutteleva kohde estämiseen virtsarakon syövän invaasio koska sen on osoitettu vaikuttavan solun tukirangan remodeling, syöpäsolun tarttuvuus, ja muuttoliike [10-12]. mTORC2 eroaa mTORC1 jonka läsnäolo rictor, Protor ja mSin1 alayksiköistä, joita tarvitaan koko kinaasiaktiivisuuden [13,14]. Loppupään effektorit kuuluvat AKT ja Rho GTPaasit (Rho, Rac ja Cdc42), jotka säätelevät tarttuvuus ja muuttoliike [12,15,16]. mTORC2 voi myös säädellä EMT [17] ja on liitetty invaasiota ja etäpesäkkeiden paksusuolen ja rintasyövän [10,18]. Valikoiva kohdentaminen mTORC2 vähentää syövän etäpesäkkeiden hiirimalleissa [10]; kuitenkin, sen rooli virtsarakon syövän eteneminen ja metastaasit on tuntematon.

Tässä tutkimuksessa tarkastellaan roolia mTORC2 virtsarakon syöpäsoluinvaasiota. Olemme käyttäneet ihmisen virtsarakon syövän näytteet osoittavat, että lisääntynyt mTORC2 aktiivisuus liittyy invasiivisen fenotyypin. Nämä tutkimukset ovat yhdessä

in vitro

ja uusia

ex vivo

ihmisen virtsarakon seinämä invaasio määrityksiä osoittamaan kriittinen rooli mTORC2 virtsarakon syövän solujen vaeltamiseen ja invaasiota. Muutoksia Rho GTPaasina signalointi ovat yksityiskohtaisia. Tulokset tästä tutkimuksesta osoittavat, että mTORC2 voi olla jännittävä uusi kohde estossa virtsarakon syövän etenemisen.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja reagenssit

RT4, UMUC3, T24 ja J82-solut ostettiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). HU1 solut antelias lahja R. Rackley (Cleveland Clinic). Soluja kasvatettiin RPMI-1640 (GIBCO, Invitrogen Corp., Grand Island, NY) täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia (FBS, GIBCO) ja antibiootti /antimykootti-liuosta (Sigma, Inc., St. Louis, MO). Kaikkia solulinjoja pidettiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2. Seerumistarvaatio suoritettiin 16 tuntia pitämällä soluja elatusaineessa, josta puuttuu seerumi, jossa on kolme fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) pesun tämän ajanjakson aikana. Seerumin-stimuloida soluja, 10% FBS: ää lisättiin. Rapamysiini saatiin Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX).

potilasnäytteiden

Kaikki tutkimukseen liittyy ihmisen osallistujat hyväksyttiin Cleveland Clinic IRB ja kirjallinen suostumus saatiin potilailta. Tuore otettiin kudosnäytteet aikaan leikkauksen, flash jäädytetty, ja niitä säilytettiin -80 ° C: ssa. Jäädytetyt leikkeet analysoitiin mikroskopialla sen varmistamiseksi, että suurempi kuin 90% soluista yksilöiden alistettiin immunoblot-analyysillä oli kasvainsoluja. Kasvaimen varmistettiin patologi. Sillä immunoblottausanalyysi, kudosnäytteet homogenisoitiin käyttäen Power Gen 500 homogenisaattorilla (Thermo Scientific, San Diego, CA).

Rictor hiljentäminen

siGENOME ei-kohdistuksen ohjaus (NTC) siRNA ja siGENOME SMARTpool Rictor-erityisiä siRNA saatiin Dharmacon (Thermo Scientific). Transfektiot suoritettiin 48 tuntia käyttäen Lipofectamine® RNAiMAX Reagent (Invitrogen). Hiljentäminen vahvistettiin immunoblot-analyysillä.

immunoblot-analyysi

Solut ja kudosnäytteet uutettiin RIPA-puskuria, joka sisälsi proteaasi-inhibiittoriseosta (Sigma) ja fosfataasi-inhibiittorin cocktailien 1 ja 2 (Sigma) ja sille suoritettiin SDS-PAGE 4-15% kaltevuus geelejä. Proteiinit siirrettiin Hybond ECL kalvoja (GE Healthcare, Pittsburgh, PA) käyttäen Bio-Rad transblot puolikuiva siirtojärjestelmä (Life Science Research, Hercules, CA). Membraanit blokattiin 1% naudan seerumin albumiinia ja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla yli yön 4 ° C: ssa blokkausliuoksessa. Vasta-aineet, jotka on saatu Cell Signaling Technology (Danvers, MA), kohdennettuja rictor (1: 1000), s-AKT (Thr308; 1: 1000), s-AKT (Ser473; 1: 1000), pan-AKT (1 : 2000), p-S6 (1: 2000), koko-S6 (1: 2000), ja aktiini (1: 5000). Blotteja inkuboitiin alkaliseen fosfataasiin konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) huoneen lämpötilassa 1 tunnin ajan ja kehitettiin käyttäen ECF ™ Western blotting reagenssia pakkauksissa (GE Healthcare). Densitometria suoritettiin käyttäen Imagequant ohjelmistoa (GE Healthcare).

Solun leviämistä ja morfometristä analyysi

Solut trypsinoitiin ja alhaisella tiheydellä on borosilikaattilasin kammio peitelevyllä luistaa (Nalge Nunc International, Naperville, IL) päällystetty 20 ug /ml fibronektiiniä. Viivästys kuvantaminen suoritettiin käyttäen Leica TCS-SP2 kanssa Plan-Apochromat 63x /1,4 NA öljy tavoite (Leica, Buffalo Grove, IL) 24 tuntia ja solujen morfologia analysoitiin käyttämällä Image J ohjelmisto (http: //rsbweb.nih gov /ij /). Kokonaispinta-ala on yksittäisten solujen määrä määritettiin kunkin vastaavan ajankohtana ja piirrettiin suhteessa kuluneen ajan.

Modified naarmu haava muuttoliike määrityksissä

Modified naarmu haava muuttoliike määritykset suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [19 ]. Lyhyesti, kudosviljelylevyille esi-käsiteltiin 20 ng /ml fibronektiiniä PBS: ssä 1 h. Ohut nauha polydimetyylisiloksaania (PDMS) on sijoitettu keskelle kunkin hyvin ja annettiin kiinnittyä. Solut ympättiin päälle ja inkuboitiin 18 tuntia, minkä jälkeen PDMS liuskat poistettiin paljastaa häiriöttömät fibronektiinin matriisi. Useita näkökentät kuoppaa kohti oli kuvattu säännöllisin väliajoin käyttäen Leica DM IRE2 mikroskooppi (Leica) ja MetaMorph kuvankäsittelyohjelma (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

TranswellTM invaasio määrityksissä

Transwell invaasio määritykset suoritettiin aikaisemmin kuvatulla [9] käyttäen 8 mikronin PET kalvoja (Corning Life Sciences, Tewksbury, MA) päällystetään matrigeelin (BD Biosciences, San Jose, CA). -Solut ympättiin membraaneihin seerumittomassa väliaineessa (SFM) ja annettiin kulkeutua 24 h kohti pariksi kammion sisältävässä väliaineessa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää. Membraanit kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä, tehdään läpäiseviksi 0,1% Triton X-100, ja värjättiin DAPI. Yläosa kalvo pyyhittiin puhtaaksi pumpulipuikolla niin, että vain transmigrating solut laskettiin. Näkökentät 200x suurennuksella satunnaisesti kuvataan useilla Leica DMR mikroskoopilla ja solujen määrä esillä kvantitoitiin käyttäen ImageJ ohjelmistoa.

Virtsarakon seinämän invaasiomääritys

virtsarakon viipale määrityksiä, raikas, täynnä -thickness viipaletta virtsarakon seinämän saatiin potilailta voimakkaassa cystectomy ja saatiin taudista vapaan osia virtsarakon seinämään urologic patologi. Tyvikalvon oli riisuttu paljastamiseksi sidekudoksen (lamina propriasta) ja ulkoinen näkökohta perivesical rasvan upotettiin agar. Tissue pidettiin RPMI /10% FBS antibiooteilla /sienilääkkeillä 7-10 vuorokautta. Virtsarakon syövän solut leimattiin CellTrackerTM Red, ympättiin kudoksen siivu, ja inkuboitiin 3-7 päivää säännöllisesti muutokset väliaineessa 24 tunnin välein. Sen arvioimiseksi invasiivisia syvyyteen kasvainsolujen, kudos kohtisuorasti leikattiin 10 mikronin välein nähdä kaikki kudoskerros ja soluja tarkasteltiin käyttämällä hematoksyliinillä ja eosiinilla (H asteikko bar 80 mikronia);

B

, ei-invasiivisia korkealaatuisesta papillaarinen UCA (ei-inv HG; Mittakaavapalkki 80 mikronia); ja

C

, invasiivisia laadukkaat UCA määrittämiseksi mTORC2 aktiivisuuden (asteikko bar 100 mikronia).

D

, immunoblotting p-Ser473 markkerina mTORC2 aktiivisuuden tehtiin osoittaa korkeampi mTORC2 aktiivisuutta sekä ei-invasiivisia HG ja invasiivisia vaurioita.

E

, densitometrisesti käytettiin määrällisesti p-Ser473 /yhteensä AKT-signaalin intensiteettiä; keskiarvot ja standardi keskivirhe (SEM) normalisoitiin keskimääräiseen signaalin voimakkuuden ei-invasiivisia LG näytteitä.

mTORC1 ja mTORC2 aktivoituvat Pahanlaatuinen virtsarakon syövän solut

Vertasimme mTORC1 ja mTORC2 signalointia hTERT kuolemattomiksi normaalit urothelial solut (HU1) [22], hyvänlaatuinen virtsarakon papilloomavirus johdettuja RT4 soluissa ja invasiivisia UMUC-3, T24, ja J82 virtsarakon syöpäsoluja. mTORC1 aktiivisuus määritettiin mittaamalla fosforylaatio p70 S6-kinaasi (p-S6), kun taas mTORC2 aktiivisuus määritettiin p-Ser473 AKT tasoilla. Perustason olosuhteissa, seerumia sisältävässä väliaineessa, HU1 ja RT4-solut osoittivat vähäistä AKT-fosforylaation treoniini 308 (p-Thr308), joka vastaa aktivoinnin PI3K ja PDK1 ylävirtaan AKT (kuvio 2A). p-Ser473 ja p-S6 myös olivat alhaiset HU1 ja RT4 soluja. Kolme pahanlaatuisia virtsarakon syövän solulinjoissa havaittu olevan p-Thr308, p-S6, ja p-Ser473 tasoilla.

, immunoblottaus osoittaa korkeampi mTORC1 (p-S6) ja mTORC2 (p -Ser473) aktiivisuus pahanlaatuinen UMUC-3, T24 ja J82 virtsarakon syövän solut, tavanomaiseen verrattuna urothelial HU1 solut ja hyvänlaatuinen RT4 soluja.

B

, seerumi stimulaatio indusoi mTORC2 aktiivisuutta pahanlaatuisten virtsarakon syöpäsoluja. mTORC1 signalointi oli herkkä rapamysiini tässä mallissa; mTORC2 ei ollut.

Seuraavaksi arvioitiin mTORC1 ja mTORC2 aktiivisuutta virtsarakon syövän soluissa, jotka tehtiin lepotilassa seerumin nälkään ja sitten stimuloitiin lisäämällä seerumia (kuvio 2B). Vuonna RT4 soluissa, p-Ser473 oli tuskin havaittavissa ennen ja jälkeen seerumin stimulaation. Vuonna T24 ja J82-solut, p-Ser473 oli minimaalinen, kun seerumistarvaatio mutta kasvoi merkittävästi lisättäessä seerumin. UMUC-3-solut osoittivat p-Ser473 jälkeenkin seerumistarvaatio ja vaatimaton nousu p-Ser473 lisäämisen jälkeen seerumi. Nämä tulokset viittaavat siihen, että mTORC2 on aktivoitu vasteena seerumin stimulaation invasiivisia virtsarakon syövän soluissa. Sen sijaan p-S6 kasvoi vasteena seerumin stimulaation hyvänlaatuisia ja pahanlaatuisia virtsarakon syöpäsoluja. Matala annos rapamysiiniä (10 nM), estäjä mTORC1, valikoivasti tukossa p-S6 ja oli vähän tai ei lainkaan vaikutusta mTORC2 toimintaa [9].

aika kurssin kokeita J82 soluissa, mTORC2 aktiivisuus kasvoi nopeasti seuraavien seerumin stimulointi ja säilyi läpi ainakin 6 h viljelyssä (kuvio 3A). Kinetiikka mTORC2 (p-Ser473) aktivointi ja deaktivointi olivat samanlaisia ​​kuin määritetty mTORC1 (p-S6). Sen vahvistamiseksi, että p-Ser473 nimenomaan heijastuu mTORC2 toimintaa, voimme vaiennettu rictor in J82 soluissa hyödyntämällä yhdistettyjä siRNA. Kuten kuviossa 3B on esitetty, rictor-geenin hiljentämisen oli tehokas ja täysin ablatoitu fosforylaation Ser473 jäännös AKT vastauksena seerumissa. Fosforylaatiota mTORC1 kohde, S6, ei ollut vaikutusta, mikä osoittaa spesifisyyden siinä hiljentäminen tapahtumaan. Non-kohdistaminen ohjaus (NTC) siRNA ei muuttanut rictor tasoja tai vaste seerumin stimulaatiota. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin kokeissa, joissa T24-soluissa (tuloksia ei esitetä). Nämä havainnot osoittavat tehokasta rictor geenien hiljentäminen ja siihen liittyvä väheneminen mTORC2 signalointi.

, seerumi stimulaation J82 soluissa osoittaa korkea mTORC2 (p-Ser473) aktiivisuutta 5 min, että jatkuu läpi 6 h.

B

, rictor geeni-hiljentäminen hyödyntämällä yhdistettyjä siRNA vähentää dramaattisesti havaittavissa rictor proteiinia ja ablates p-Ser473 havaittuun verrattuna transfektoiduissa soluissa NTC siRNA. Ei vaikutusta mTORC1 signalointia (p-S6) havaittiin.

mTORC2 on kriittinen säätelijä solumigraation ja hyökkäyksen virtsarakon syövän

Käytimme modifioitu scratch-haavan määrityksessä arvioimaan soluvaelluksen T24 virtsarakon syövän solut, jotka transfektoitiin NTC tai rictor-spesifisiä siRNA (kuvio 4A). Kasvualusta oli fibronektiini-pinnoitettu. Transfektoiduissa soluissa NTC siRNA huomattavia muuttoliike havaittiin vain seerumin läsnä ollessa. Rictor-erityisiä siRNA päinvastainen vaikutuksia seerumin solumigraation. Kuviossa 4B esitetään yhteenveto vaikutuksia rictor-hiljentäminen on T24 solumigraation funktiona ajan. Tilastollisesti merkitsevää pienenemistä solujen vaeltamiseen liittyi rictor geeni-hiljentäminen 10-24 tuntia. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin, kun rictor on vaiennettu vuonna J82-solujen ja solujen vaeltaminen tutkittiin (tuloksia ei esitetty).

seerumistarvaatio estetty J82 virtsarakon syöpä solun liikkuvuus. Lisäksi seerumin indusoi vahvaa migraation J82-solut, jotka transfektoitiin NTC siRNA, joka määritetään käyttämällä modifioitua tyhjästä määritystä. Migration estyi rictor geeni-hiljentäminen. Mittakaava 100 mikronia.

B

, kvantifiointiin näkyy väheneminen etäisyyden maahanmuuton transfektoitujen solujen rictor erityisiä siRNA (□) verrattuna soluihin transfektoitu NTC siRNA (▲). Esitetään myös soluja, jotka olivat ei seerumia stimuloiman (♦). Kaikkiaan 6 kehysten analysoitiin kunakin ajankohtana kohti kunnossa.

C

, siirtokuoppaan invaasio Matrigelillä kuorrutettu kalvot arvo on suurempi määrä pahanlaatuisia virtsarakon syövän solut, jotka hyökkäävät. D, rictor geeni-hiljentäminen vähentää merkittävästi soluinvaasiota kaikkien kolmen pahanlaatuisia virtsarakon solulinjoilla Transvvell- määrityksessä. (*) Tilastollisesti merkitsevä vertailtavaksi opiskelija t-testi, p 0,05).

Virtsarakon syöpäsoluinvaasiota alunperin tutkittiin rekonstruoitu Matrigel sisään Boyden kammioissa. Kukin kolmesta pahanlaatuisia virtsarakon syövän solulinjat osoittivat huomattavasti hyökkäyksen kautta Matrigel, verrattuna ei-pahanlaatuisten RT4-solujen (kuvio 4C). Rictor geeni-hiljentäminen merkittävästi vähentynyt hyökkäystä pahanlaatuisia virtsarakon syövän solut (kuvio 4D). Vuonna J82-solut, invaasio estyi yli 80%. Teho rictor geenien hiljentäminen ehdotti, että mTORC2 voi olla tärkeä kohde estämään hyökkäystä virtsarakon syöpään.

Ihmisen virtsarakon seinämä hyökkäystä virtsarakon syövän solut edellyttää mTORC2

edelleen tukevat hypoteesia, että mTORC2 voi olla kriittinen säätelyssä virtsarakon syöpäsoluinvaasiota, olemme kehittäneet uuden

ex vivo

mallijärjestelmä testata hyökkäystä normaalin virtsarakon seinämä. Täyspaksut osissa aikuisen ihmisen virtsarakon että mukana lamina prop- riaan (LP, fibroblasti-hallitseva sidekudoksen verisuonia), muscularis propria (MP, tiheä nippua sileän lihaksen) ja peri-vesical rasvaa (PV rasva; ensisijaisesti fibroadipose kudoksen ja hiussuonten ) on ankkuroitu agar ja kylpi soluviljelyelatusainetta (kuvio 5A). Olemme ympättiin nämä valmisteet fluoresoivasti leimattuja pahanlaatuisten J82-soluihin ja annetaan näiden solujen tunkeutua virtsarakon seinämään 72 tuntia. J82-solut, jotka alistettiin rictor geenien hiljentäminen tai käsitelty NTC siRNA myös ympättiin virtsarakon seinämään valmisteet. Tunkeutuvat solut voidaan tunnistaa helposti valomikroskoopilla (kuvio 5B). Immunohistokemiallinen värjäys pancytokeratin (sytokeratiini- AE1 /3) vahvistettiin, että tunkeutuvat solut olivat epiteelin alkuperä (kuvio 5C). Fluoresoiva kuvantaminen hyökkäävän soluissa esitetään kuviossa 5D. Merkittävä kasvu invaasio havaittiin, kun pahanlaatuisten J82 solut verrattiin RT4 soluihin (p 0,05, kuvio 5E). Rictor geeni-hiljentäminen että J82 soluissa vähentää merkittävästi invasiivisen syvyys (kuvio 5F), mikä osoittaa keskeinen rooli mTORC2 säätelyssä J82 soluinvaasiota meidän

ex vivo

ihmisen mallijärjestelmä.

, kaaviokuva suunta ihmisen virtsarakon seinämän invaasiomääritys joka sisältää lamina prop- riaan (LP), muscularis propria (MP) ja perivesical rasvaa (PV rasva). B, H 0,05).

Rac1 on alavirtavaikuttajainhibiittorit mTORC2 virtsarakon syöpäsoluissa

Seuraavaksi tutkimme vaikutuksia rictor geeni-hiljentäminen on J82 solujen leviäminen. Solut, jotka transfektoitiin NTC siRNA ja pääsisi leviämään fibronektiinin osoittivat laaja sytoplasminen laajennuksia ja litistetty morfologisia ulkonäkö (kuvio 6A). Sen sijaan rictor geeni-hiljentäminen tuotti pienempiä munanmuotoinen soluja, jotka eivät levitä. Kvantifiointi pinta-ala kattaa kiinnittyneet solut vahvisti, että rictor geenin hiljentäminen vaimensi merkittävästi leviämisen J82-solujen (kuvio 6B). Seuraavaksi me käytetään J82 solut arvioimaan fosforylaatioon paksilliini, joka säätelee fokaalisen adheesion muodostumista ja muutosta ja voi säädellä lamellipodium muodostumisen [23]. Rictor geeni-hiljentäminen alensi fosfo-paksilliini pahanlaatuisissa J82 soluissa suhteessa NTC transfektoitujen solujen. Analyysi Rac1 aktivaation J82 solut osoittivat huomattavaa vähentämistä taso GTP-ladattu (aktivoitu) Rac1 (Rac1-GTP), kun rictor hiljennettiin (kuvio 6D). Densitometria osoitti, että rictor pudotus vähentää Rac1 tasoilla 60,2% ja rictor-ilmentävien solujen. Sen sijaan, GTP-aktivoitua RhoA vähäisessä pieneni rictor vaiennettu, jossa rictor knockdown vähentää RhoA aktiivisuus 83,3% of rictor ilmentävien solujen (kuvio 6E).

J82-solut joko transfektoitiin rictor-spesifisten siRNA tai NTC siRNA 72 h ennen kokeen aloittamista.

, immunofluoresenssivärjäyksellä osoittaa laaja soluliman prosessit ja reuna-fosfo-paksilliini soluissa, jotka on transfektoitu NTC siRNA. Tämä on pienennetty solujen rictor geeni-hiljentäminen. Mittakaava 30 mikronia.

B

, solun pinta-alat määritettiin J82-solut, jotka on transfektoitu NTC (♦) tai rictor-spesifisiä siRNA (▲) ja annettiin levitä ilmoitettu ajat (keskiarvo ± SEM, n 15 joka kerta kohta, (*) p 0,05).

C

, immunoblotting varten fosfo- paksilliini in J82 soluissa, jotka transfektoitiin rictor erityisiä tai NTC siRNA ja annettiin tarttua 30 min.

D

, GTP-Rac1 määritettiin J82 transfektoiduissa soluissa NTC tai Rictor erityisiä siRNA. Rictor Knockdown alennettu Rac1 tasoilla 60,2% valvonnan. Solut, joissa GTPyS analysoitiin positiivisena kontrollina ja BKT negatiivisena kontrollina.

E

, GTP-ladattu RhoA in J82 transfektoiduissa soluissa rictor erityisiä tai NTC siRNA. Rictor Knockdown alennettu RhoA tasolle 83,3% valvonnan.

Keskustelu

virtsarakon syöpä, paikallinen invaasio osaksi muscularis propria (tyhjentäjälihaksen lihas) on tärkeä tekijä ennusteen ja myöhemmin potilas terapiassa. Signaalipolkuja ovat yksilöllisesti mukana virtsarakon syöpäsoluinvaasiota olisi ensisijassa terapeuttisten kehittämiseen. Kuitenkin yleisesti kuvattu geneettinen ja signalointi muutoksia virtsarakon syöpä ei ole huomioitu yhteydessä hyökkäystä. HG UCA kehittävä invasiivisia käyttäytymistä potilasalaryhmässä, usein satamat mutaatiot

TP53

ja

RB

. Mutaatiot ja /tai menetys näiden onkogeenien ovat sekaantuneet viallisia solukierron säätelyssä [21]. Muutokset fosfataasin ja tensin homologi (PTEN) lipidi /proteiini fosfataasi on osoitettu noin 30%: lla virtsarakon syöpä ja käsittää homotsygoottinen geenin poisto, Heterotsygotian menetys (LOH), ja geeni mutaatio [24]. Kuitenkin lopullinen vaikutus

PTEN

loppupään signalointikaskadien kuten mTORC2 virtsarakon syöpä invaasio on epäselvä.

Tässä tutkimuksessa osoitimme, että mTORC2 aktiivisuus korreloi ihmisen virtsarakon syöpä laatu ja hyökkäystä. Tällä mekanistinen tasolla, mTORC2 ohjaa virtsarakon syöpäsolujen leviämistä, muuttoliike, ja hyökkäystä Matrigel. mTORC2 säätelee myös virtsarakon syövän invaasio uudella

ex vivo

ihmisen virtsarakon malli, joka vangitsee monimutkainen microenvironment virtsarakon seinämän. Lisääntynyt mTORC2 aktiivisuus johtaa aktivaatioon Rac1, jonka tiedetään edistää solujen levittäminen ja siirtäminen [25]. Nämä tulokset viittaavat siihen, että aktivoitu mTORC2 voi muodostaa kriittisen ja kohdistettavaksi signalointi osa virtsarakon syövän invaasio.

mTORC2 on yksi kaksi signalointi haarojen mTOR Cascade. mTORC2 olemassa monimutkainen, joka sisältää mTOR ja mLST8 ja on erotettava mTORC1 läsnäolo rictor, Protor ja mSIN1 [26]. Toisin mTORC1 monimutkainen, joka sääntelee käännös vastauksena ravinteiden tila ja kasvutekijöitä, mTORC2 ohjaa prosesseja, jotka vaativat solun tukirangan uudelleen mallinnus, kuten solujen leviämisen ja muuttoliike. mTORC2 voidaan aktivoida insuliinistimuloidun PI3K, joka edistää yhdistys mTORC2 kanssa ribosomien [27,28]. Syklisen adenosiinimonofosfaatin (cAMP) ja glykogeenisyntaasikinaasi-3β inhiboivat mTORC2 aktivointi [16,29].

Kun aktivoitu, mTORC2 fosforyloi Ser473 AKT, jota on ehdotettu säätelemään AKT-vaikutusta ja vakaus [30]. Rho perhe GTPaasit raportoidaan toimimaan suurten alavirtaan efektoreita mTORC2 [10,12,17,31]. Neutrofiilimigraatiota kohti kemoattraktantit säätelee mTORC2 mekanismilla, johon liittyy MyoII ja sääntely RhoA toimintaa [32]. Paksusuolen syöpäsoluja, rictor geeni-hiljentäminen indusoi mesenkymaalisten-epiteelin siirtyminen (MET) ja estää solun liikkuvuus, jonka vaikutuksia sekä RhoA ja Rac1 [10]. Kun taas alentunut E-kadheriinin on raportoitu pahanlaatuisten solulinjojen UMUC-3, J82 ja T24 solulinjojen suhteen RT4-solujen [6], knockdovvn rictor mallissamme järjestelmä ei näytä kääntää tämän fenotyypin (tietoja ei esitetty).

Meidän kokeissa J82 virtsarakon syövän solut, rictor geeni-hiljentäminen väheni huomattavasti Rac1 aktivointi kun ottaa enemmän vähäinen vaikutus RhoA. Monissa solun järjestelmissä, väyliä olemassa säännellä Rac1 ja RhoA vastavuoroisesti [33]. Siten jopa vaatimaton väheneminen RhoA aktivointi yhdessä rictor geeni-hiljentäminen voi olla merkittävä rakon syöpäsoluja. Merkityt vaikutukset rictor hiljentäminen solujen leviämisestä, muuttoliike, ja invaasio ovat johdonmukaisia ​​sen biokemialliset tulokset viittaa siihen, että Rac1 on tärkeä tavoite mTORC2 virtsarakon syöpään. Yksi ehto on, että rictor downdown vähentää myös p-Ser473, joka voi aiheuttaa lisää loppupään muutoksia AKT signalointi, jotka voivat vaikuttaa hyökkäys riippumatta Rho GTPaasi-aktiivisuus.

Kun verrataan mTORC2 aktivaation virtsarakon syövän solulinjoissa, olemme huomanneet, että UMUC-3-solut ovat ainutlaatuisia, että havaittavissa p-Ser473 on läsnä jopa seerumin poissa ollessa. Nousu perustason p-Ser473 UMUC-3-solut todennäköisimmin heijastaa homotsygoottisia null poistamista

PTEN

näissä soluissa [9,34], poistamalla tärkeä vaimennin mTOR signalointi. UMUC-3-solut voivat edustaa mallina virtsarakon syövän solut, joissa

PTEN

on mutatoitunut. Syöpiä

PTEN

deleetio tai mutaatio ovat usein resistenttejä kohdennettuja syövän vastaisia ​​aineita, jotka toimivat ylävirtaan PTEN kuten vastaan ​​epidermaalisen kasvutekijän reseptoria [35]. T24 ja J82-solut voivat olla edullisia malleja virtsarakon syövän, joka tapahtuu ilman

PTEN

mutaatio. Nämä solut osoittivat, olennaisesti havaitsemattomia tasoja P-Ser473 seerumin puuttuessa ja vahva stimulaatio mTORC2 aktiivisuutta, kun seerumia lisättiin.

osallistuminen Rac1 merkittävänä alavirran kohde mTORC2 säätelyssä virtsarakon syövän invaasio voi yhdistää useita viimeaikaisten havaintojen kirjallisuudessa. Eräs tutkimus osoitti, että Rac1 säätelee virtsarakon syöpäsoluinvaasiota ja aktiini uudelleenjärjestely alavirtaan integriini-sitoutuvan kinaasin (ILK) [36]. Toinen ryhmä on ilmoittanut, että rictor voi fyysisesti vuorovaikutuksessa ILK [37] aiheuttavan fosforylaation AKT at Ser473, mikä merkitsee mTORC2-erityisiä allekirjoitus. Rac1 on raportoitu suoraan vuorovaikutuksessa mTOR on GTP-riippumattomalla tavalla [38].

Yhteenvetona tutkimuksemme osoittavat, että mTORC2 on kriittinen säätelijä virtsarakon syöpä muuttoliikkeen ja invaasio, joissa vaikutukset välittämä ensisijaisesti Rac1.