Krooninen sairaus

tiivistelmä

In vitro

soluun perustuvia malleja keuhkosyövän käytetään usein tutkia invaasion ja taustalla olevia mekanismeja etäpesäke. Nämä mallit usein tutkia vain yksi solutyyppi, jossa kaksiulotteinen (2D) yksikerroksinen soluviljelmissä, jotka eivät heijasta monimutkaisuutta tulehduksen

in vivo

. Tässä kolmiulotteinen (3D) solu-yhteisviljelmässä kollageenigeelin mallia käytettiin, joka sisälsi ihmisen keuhkon adenokarsinooma soluja (HCC), ihmisen keuhkon fibroblastisoluissa (MRC-5), ja makrofagit. Soluviljelyväliaineet ja solujen kuvia kerättiin, ja matriksimetalloproteinaasi-1 (MMP-1) ja verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF) tuotantoa seurattiin eri soluviljelmässä olosuhteissa. Huomasimme, että simuloidaan hypoksiaa ja /tai seerumistarvaatio olosuhteissa aiheuttama kohonnut eritys VEGF 3D yhteistyössä kulttuuri malli

in vitro

, mutta ei MMP-1; morfologiaa HCC 2D vs. 3D yhteistyössä kulttuuri järjestelmä oli hyvin erilaisia. MMP-1 ja VEGF: ää erittyy korkeammalla tasolla sekoitettu soluryhmät sijaan mono-kulttuurin ryhmiä. Siksi joissa keuhkosyöpä, fibroblastit ja makrofagit voivat paremmin fysiologisia etäpesäke mekanismeja verrattuna mono-kulttuuri järjestelmiä. Kasvain stroomasolut, makrofagit ja fibroblastit voi edistää ja metastaasit, joka tarjoaa myös uuden suunnan suunnittelussa hoitojen suunnattu tuhota strooman kasvaimen kudokset.

Citation: Liu Xq, Kiefl R, Roskopf C, Tian F, Huber RM (2016) vuorovaikutus joukossa Keuhkosyöpä, fibroblastit ja makrofagit 3D Co-Cultures ja Vaikutus MMP-1 ja VEGF Expression. PLoS ONE 11 (5): e0156268. doi: 10,1371 /journal.pone.0156268

Toimittaja: Pankaj K. Singh, University of Nebraska Medical Center, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 27 syyskuu 2015; Hyväksytty: 11. toukokuuta 2016 Julkaistu: toukokuu 27, 2016

Copyright: © 2016 Liu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

rahoitus: kirjoittajat eivät tuki ja rahoitus raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Raportit keuhkojen pahanlaatuisten kasvainten juontavat niin paljon kuin antiikin, ja sen puoliväliin vuosisadan, keuhkosyöpä oli tullut epidemia ja sen vakiinnuttaneet asemansa johtava syy syöpään liittyvien kuolemien Pohjois-Amerikassa ja Euroopassa, seuraava käyttöönotto halpa, massatuotantona savukkeet [1]. Tällä hetkellä keuhkosyöpä on yleisin syöpä maailmassa oli yli 1,35 miljoonaa tapausta vuodessa [2]. Vaikka merkittäviä edistysaskeleita hoitoon alkuvaiheessa sairauden, eloonjäämisasteesta pitkälle edennyt keuhkosyöpä pysyvät alhaisina; Suurin osa myöhäisessä vaiheessa keuhkosyövän potilaista kuolee 18 kuukauden kuluessa diagnoosista [3]. Kertyvät näyttö osoittaa, että vaikka suurin syöpä tutkijat keskittyvät yksinomaan keuhkojen syöpäsoluja, on yhä tietoisempia siitä, että kasvain microenvironment (TME) ja kasvaimeen strooman vuorovaikutukset tärkeitä rooleja prosessin aikana keuhkosyöpään perustamisesta, invaasio, ja etäpesäkkeitä. Kasvain strooman koostuu sekä soluväliaineen (ECM) ja solun komponentteja. ECM sisältää erittyvä proteoglykaanien että pelata sekä rakenteellinen ja solu-signaloinnin roolia. Solukomponenttien ovat immuunijärjestelmän soluja, syöpään liittyvä fibroblasteissa (valuuttalisiin), endoteelisolut, adiposyytit, luuytimestä peräisin olevat solut, myofibroblasteja, ja fibroblastit [4]. Funktionaaliset genomista tutkimuksissa on todettu geeni allekirjoitukset ovat ennustavia ei-pieni keuhkosyöpä (NSCLC) elinkelpoisuudesta, mukaan lukien geenit, jotka koodaavat ECM-proteiineja [5], jossa korostetaan roolia strooman potilaan ennustetta ja selviytymistä.

tässä tutkimuksessa päätimme tutkia MMP-1 ja VEGF indikaattoreina vuorovaikutusta kasvain ja stroomasoluja, koska molemmat ovat selvästi sidoksissa kasvaimen invaasion ja metastaasin. Aiemmat tutkimukset osoittavat, että MMP olla keskeinen rooli syövän [6]. MMP voi hajota erilaisia ​​proteiineja, jotka liittyvät ECM. Tämän seurauksena kasvaimen solut voivat liikkua helpommin aikana prosessien eteneminen ja metastaasit. MMP-1 kuuluu MMP perheen ja tunnetaan kollagenaasin tai gelatinaasi, joka hajottaa kollageeni IV ja kasvaa erittäin metastaattinen syöpäsoluissa [7]. VEGF tunnistettiin ja eristettiin endoteelisolujen-mitogeeni, jolla on kyky indusoida fysiologisia patologisen angiogeneesin luomiseksi uusien verisuonten [8, 9]. Kun kiinteä kasvain, laajenemisen aikana prosessin, keskiosissa kasvain tulee hypoksinen, joka edistää VEGF: n tuotantoa ja näin ollen, leviämisen kasvaimen [10]. Lisäksi viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että VEGF: n indusoiman toiminnan kasvainsoluissa ovat kasvaimen invaasion ja metastaasin [11].

Suurin osa tutkimusryhmät ovat käyttäneet yksisolukerrokset kasvatetaan kudosviljelmässä muoveja, jotka ovat vähemmän monimutkaisia ​​ja vähemmän mukautuva, ja ei kovin edustava fysiologisia solunulkoisen microenvironment ihmisessä [12]. Kun soluja viljellään sen jäykästä muovista pinnat viljelypulloissa, ne vain voi kasvaa päässä muovin 2-ulotteinen (2D) tavalla. Lisäksi monet tutkimukset osoittavat, että 2D-soluviljelmissä voi heijastaa riittävästi fysiologista monimutkaisuus todellisen kudoksen, ja niiden käyttöä soluihin perustuvissa määrityksissä jossain määrin voi johtaa virheisiin ennustettaessa kudoksen vasteita. Soluja viljeltiin 2D muodoissa tehdään lisääntymistä ja sitten de-erilaistuminen näin ollen menettää olennaiset toiminnot [13]. Sitä vastoin solut viljeltiin 3D-matriisiin ovat dramaattisesti erilainen leviämisen kannalta, erilaistuminen, morfologia, ja matkapuhelinverkon toimivuus [14, 15]. Tässä tutkimuksessa perustimme organotyyppisen yhdessä viljelemisen malli koostuu keuhkoadenokarsinooma soluja (HCC), keuhkon fibroblastit (MRC-5), ja immuunijärjestelmän solut (makrofagi), joka paitsi mahdollistaa tutkia vuorovaikutuksia kasvainsolujen ja strooman soluja, mutta myös edustaa malli, joka on enemmän heijastava ehdoista esillä

in vivo

.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

Kaikki solun linjat toimittivat Medical Clinic V laboratorio Ludwig-Maximilians University. MRC-5-soluja kasvatettiin Eaglen Minimum Essential Medium (LGC Standards GmbH, Wesel, Saksa). Jotta täydellinen kasvualusta, lisäsimme naudan sikiön seerumia (FBS), jonka lopullinen pitoisuus on 10%. HCC-solut kasvatettiin RPMI 1640: ssä, jota oli täydennetty 10% FBS: ää (Biochrom AG, Berliini, Saksa). Makrofagit kasvatettiin Hamin F-12-K-alustassa (LGC Standards GmbH, Wesel, Saksa), jota oli täydennetty 100 U /ml penisilliiniä, 100 mg /ml streptomysiiniä liuosta, ja 2 mM L-glutamiinia (PAA).

3D kollageeni geeli yhdessä viljelemisen mallin

Ennen valmistelua kollageenigeelin, solut sulatettiin ja laimennettiin 2 x 10

5 solua kuoppaa kohti. Suhde solujen määritettiin seuraavasti: 5: 5: 1 HCC: MRC-5: makrofagi. Western blot kokeissa soluja sijoitettiin 2 x 10

5 ja 1 x 10

6 solua per ryhmä. Valmistella geelit, kollageenin (Invitrogen, Darmstadt, Saksa), steriili 10X fosfaattipuskuroitu suolaliuos (PBS), steriiliä tislattua vettä (DDH

2O), ja steriilit 1N NaOH, sekoitettiin jäissä. Kokonaismäärä kollageenin geelin laskettiin seuraavasti:

steriiliin putkeen sekoita dH

2O, 1 N NaOH: lla, ja 10X PBS: llä.

lopullinen konsentraatio kollageenia oli 1 mg /ml, ja 0,5 ml jaettiin kuhunkin viljelymaljaan osaston ja laitettiin välittömästi jäihin. Sitten solut ympättiin kollageenigeeli, joka pipetoitiin useita kertoja sekoita hyvin. Geelit poistettiin huoneen lämpötilaan, jossa ne kiinteytyi nopeasti. Viljelmiä inkuboitiin sitten 37 ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa 30-40 minuuttia, tai kunnes yrityksen geeli oli muodostunut. Kukin malja laatikolla sai sitten kokonaistilavuus 1,0 ml elatusaineita.

Western blotting

Soluviljelysupernatantit kerättiin 48 tuntia. Vivaspin putket (Sartorius STEDIM Biotech GmbH, Göttingen, Saksa) käytettiin keräämään proteiineja supernatantista, joka oli korkeampi molekyylipaino kuin 30 kDa. Proteiini mitattiin ja ei-häiritsevä proteiinin määritys kit (Calbiochem, EMD Bioscience Inc., Darmstadt, Saksa) käyttäen naudan seerumin albumiinia (BSA) standardikäyrä (Bio-Rad Laboratories, Munich, Saksa) B

anti-MMP-1-vasta-aine on tuotettu hiirissä käytettiin (Sigma-Aldrich Saint Louis, USA), jossa on vuohen anti-hiiri-IgG-HRP-vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnology Inc., Heidelberg, Saksa). 40 ug proteiinia kustakin näytteestä laimennettiin näytepuskurissa, kun taas DDH

2O lisättiin lopulliseen tilavuuteen 35 ui. Membraanit blokattiin blokkauspuskurissa huoneen lämpötilassa vähintään 1 tunnin ajan, ja sen jälkeen niitä inkuboitiin primaarisen vasta-aineen yli yön 4 ° C: ssa. Ensisijainen vasta-aineet laimennettiin 1: 200 estopuskurissa. Membraanit inkuboitiin laimennettiin 1: 5000 HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita 1 tunti huoneenlämpötilassa seuraavana päivänä. Kuvat analysoitiin käyttämällä kuvan lukija LAS-R ohjelmisto (Leica Microsystems, Saksa). IOD (integroitu optinen tiheys) arvot muodostettiin /analysoitiin Gel-Pro analysaattorin (Media Cybernetics USA).

HCC ja makrofaagisoluissa

Solut pestiin kahdesti käyttäen esilämmitettyä (37 ° C) PBS poistamiseksi jäljellä soluviljelyalusta. Sitten lisättiin 10 ml esilämmitettyä (37 ° C) CFDA SE Cell Tracer käyttöliuos (Invitrogen, Darmstadt, Saksa). Sitten soluja inkuboitiin 15 minuuttia 37 ° C: ssa. Sitten korvattu loading liuos tuoretta, esilämmitettyä väliaineessa ja inkuboitiin viljelmiä vielä 30 minuuttia 37 ° C: ssa. Tämä tekniikka värjätään HCC, makrofaagisolut ja MRC-5-solujen 3D kollageenigeeliin malli on kuvattu aikaisemmin. 48 tunnin kuluttua yhteistyön kulttuurin, solu morfologioita havaittiin konfokaalimikroskopiaa.

Jäädytetyt osat kollageenigeelien värjättiin fallotoksiinit ja DAPI

Pakastetut leikkeet valmistettiin 48 tunnin kuluttua 3D kollageenigeelistä co-kulttuuri, ja näytteet asetettiin coverslip huoneenlämpötilassa 30 minuutin ajan. Sitten näytteet pestiin kolme kertaa PBS: llä 3 min ajan joka kerta. Näytteet kiinnitettiin sitten 3,7% formaldehydiä PBS: ssä 10 minuuttia huoneen lämpötilassa. Sitten näytteet pestiin vielä kolme kertaa PBS: llä. Kukin peitelasi laitettiin sitten lasi petrimaljaan ja uutettiin liuoksella, jossa oli 0,1% Triton X-100 PBS: ssa 3-5 minuutin ajan ja pestiin jälleen kolme kertaa PBS: llä. Kun värjäämällä fluoresoivalla fallotoksiinit (Invitrogen, Darmstadt, Saksa), me laimennettu 5 ui metanolipitoista varastossa liuosta 200 ul PBS kullekin peitelasi värjätään. Vähentää epäspesifinen tausta värjäyksen näiden konjugaattien, lisäsimme 1% BSA tahra ratkaisu. Peitinlasit, jossa sijoitetaan sitten värjäysliuos 20 minuuttia huoneen lämpötilassa. Värjäyksen jälkeen peitelasit pestiin kolme kertaa PBS: llä. Counterstaining suoritettiin DAPI (Invitrogen, Darmstadt, Saksa). DAPI kantaliuos laimennettiin 300 nM PBS: ssä, ja noin 300 ui tätä DAPI-värjäyksellä liuokseen lisättiin peitelevy valmiste, joka peittää kokonaan peitelasit. Peitinlasit inkuboitiin 1-5 minuuttia ja huuhdeltiin kolme kertaa PBS: ssä 10 minuutin ajan. Sitten näytteet kuvattiin käyttäen fluoresenssimikroskooppia. Näytteet kuivattiin ilmassa, on asennettu, ja säilytettiin pimeässä 2-6 ° C: ssa.

Elisa

Soluviljelysupernatantit kerättiin eri ajankohtina ja niitä säilytettiin -20 ° C: ssa . Ihmisen MMP-1 ELISA Kit (Sigma-Aldrich Saint Louis, USA) ja ihmisen VEGF DuoSet ELISA Kit (R 0,05 tarkoittaa tilastollista eroa.

Tulokset

Expression of MMP-1 3D mono- tai yhdessä viljelemisen keuhkosyöpä mallit

HCC, MRC-5, ja makrofagi co -Kulttuuri ryhmiä, sekä MRC-5, HCC, ja makrofagi mono-kulttuuri ryhmät viljeltiin 10% FBS: ää ja O

2, kuten on kuvattu menetelmissä. Jokainen ryhmä oli 2 x10

5 kylvettyjen solujen ja suhde HCC, MRC-5, ja makrofagit Yhdessä viljelemisen ryhmässä oli 5: 5: 1, ja HCC ja MRC-5 co-kulttuuri ryhmässä oli 1 : 1.

48 tunnin kuluttua ilmentymistä MMP-1 HCC, MRC-5, ja makrofagi yhdessä viljelemisen ryhmä (1337,00 ± 42,43) oli suurempi kuin HCC ja MRC-5 yhteis- kulttuuri ryhmä (1166,25 ± 56,21), joka oli myös korkeampi kuin MRC-5 mono-kulttuuri ryhmä (991,50 ± 19,09) ja oli huomattavasti korkeampi kuin HCC (284,00 ± 18,38) ja makrofagi (98,50 ± 7,12) mono-kulttuuri ryhmiä. HCC ja makrofagi mono-kulttuuri ryhmät osoittivat lähes MMP-1 ilme. MMP-1 oli merkitsevästi korkeampi yhdessä viljelemisen ryhmät kuin mono-kulttuuri ryhmiä (n = 3,

P

0,05, taulukko 1 ja kuvio 1A, havaitaan ELISA).

(A) Expression of MMP-1 3D mono- ja yhdessä viljelemisen keuhkosyöpään malleja 48 tuntia havaita ELISA. Ilmaisu on MMP-1 HCC MRC-5 makrofagi yhdessä viljelemisen ryhmä oli korkeampi kuin vuonna HCC MRC-5 co-kulttuuri ryhmä tai MRC-5 /HCC /makrofagi mono-kulttuurin ryhmiä. Ei ollut juuri lainkaan ilmentymistä MMP-1 on HCC /makrofagi mono-kulttuuri ryhmä. (B) Expression of MMP-1 3D mono- ja yhdessä viljelemisen keuhkosyöpään mallin 48 h havaittiin Western blottauksella. Kuviossa 1B, a, molekyylipaino MMP-1 on 52 kD. Vasemmalta oikealle, kaistojen ovat: HCC mono-kulttuuri ryhmä (2 x 10

5-solut); MRC-5 mono-kulttuuri ryhmä (2 x 10

5-solut); MRC-5 ja HCC yhdessä viljelemisen ryhmä (2 x10

5-solut); HCC mono-kulttuuri ryhmä (1 x 10

6 solua); MRC-5 ja HCC yhdessä viljelemisen ryhmä (1 x 10

6 solua); MRC-5 mono-kulttuuri ryhmä (1 x 10

6 solua). MMP-1 yhteistyössä kulttuuri ryhmissä oli suurempi kuin mono-kulttuuri ryhmät (molemmat 2 x 10

5 solua ja 1 x 10

6 solua). MMP-1 on 1 x 10

6 cell ryhmässä oli suurempi kuin 2 x 10

5 solusta ryhmä, riippumatta mono- kulttuurin tai yhdessä viljelemisen ryhmä nimityksiä. Kuviossa 1B, b, keskimääräinen IOD arvot Western blot on esitetty. (C) Expression of MMP-1 eri co-viljelyolosuhteissa. Expression of MMP-1 alle 10% FBS ja O

2 (10% FBS soluviljelyelatusaineella, O

2) oli korkeampi kuin alle w /o FBS ja w /o O

2 (ilman FBS: ää ja ilman O

2) 7 eri ajankohtina. Lisäksi ilmaisu trendi MMP1 edellyttäen w /o FBS ja w /o O

2 jatkoi laskuaan 120 h.

MMP-1 tutkittiin lisää Western Blot. HCC ja MRC-5-mono-kulttuuri ryhmät ja HCC sekä MRC-5 co-kulttuuri ryhmät jaettiin 2 x 10

5-soluja ja 1 x 10

6 solun ryhmiä, kuten on kuvattu menetelmissä. Suhde HCC ja MRC-5-yhteisviljelmässä ryhmä oli 1: 1. Huomasimme, että MMP-1 yhteistyössä kulttuuri ryhmissä oli suurempi kuin mono-kulttuuri ryhmiä, sekä 2 x 10

5 solusta ryhmä ja 1 x 10

6 cell ryhmiä. Lisäksi MMP-1 on 1 x 10

6 cell ryhmät oli suurempi kuin 2 x10

5 solusta ryhmät, riippumatta mono- kulttuurin tai yhdessä viljelemisen ryhmittymä (n = 5, P 0,05, taulukko 2 ja kuvio 1 B).

ilmaisu MMP-1 on 3D yhdessä viljelemisen keuhkosyöpä mallin eri yhdessä viljelemisen olosuhteissa

ilmaus MMP- 1 HCC ja MRC-5 co-kulttuuri malli analysoitiin eri viljelyolosuhteissa: 10% FBS ja O

2 (10% FBS soluviljelyelatusaineella, O

2), ja joissa ei ole (ilman FBS ja O

2) tutkia vaikutusta simuloida hypoksian ja nälkään sikiön seerumia edellytys MMP-1 eritystä. Soluviljelysupernatantit kerättiin erikseen 3D yhdessä viljelemisen kollageenin malleja seitsemässä eri ajankohtina 48-192 tuntia. Jokainen ryhmä oli yhtä suuri määrä soluja (2 x 10

5), jossa suhde on 1: 1. Huomasimme, että MMP-1with 10% FBS ja O

2 oli suurempi kuin ilmaus ilman FBS ja O

2 kaikissa seitsemässä ajankohtina. Lisäksi MMP-1 ilmentymisen ilman FBS: ää ja O

2 laski 120-192 h (n = 3, P 0,05, taulukko 3 ja kuvio 1 C).

Expression of VEGF 3D mono tai yhdessä viljelemisen keuhkosyöpä mallit

HCC, MRC-5, ja makrofagi rinnakkaisviljelmätilanteessa ryhmiä sekä MRC-5, HCC, ja makrofagi mono-kulttuuri ryhmien viljeltiin 10% FBS ja O

2, kuten on kuvattu menetelmissä. Jokainen ryhmä oli 2 x10

5 kylvettyjen solujen ja suhde HCC, MRC-5, ja makrofageja; Yhdessä viljelemisen ryhmässä oli 5: 5: 1 sekä HCC ja MRC-5 co-kulttuuri ryhmä oli 1: 1.

HCC, MRC-5, ja makrofagi mono-kulttuuri ryhmien viljeltiin erikseen, ja soluviljelmän supernatantit kerättiin 48 tunnin jälkeen. Huomasimme, että VEGF: n ilmentymistä että HCC mono-kulttuuri ryhmä (241,97 ± 78,56) oli huomattavasti korkeampi kuin MRC-5 mono-kulttuuri (12,69 ± 5,46) ja makrofagi mono-kulttuuri (13,65 ± 7,44) ryhmiä (n = 3,

P

0,05, taulukko 4 ja kuvio 2A).

(A) Expression VEGF HCC, MRC-5, ja makrofagi Monoviljelmiä ryhmiä. Expression VEGF HCC mono-kulttuuri ryhmä oli huomattavasti korkeampi kuin ilmaisun MRC-5 /makrofagi mono-kulttuuri ryhmä alle 10% FBS ja O

2 viljelyolosuhteet. (B) ekspressio VEGF HCC, MRC-5, ja makrofagi yhdessä viljelemisen ryhmissä verrattuna HCC mono-kulttuuri ryhmä. Expression VEGF HCC MRC-5 Makrofageja yhdessä viljelemisen ryhmässä oli suurempi kuin HCC MRC-5 co-kulttuuri ryhmän ja HCC mono-kulttuuri ryhmä viljeltiin 10% FBS ja O

2 48 tuntia. (C) Expression of VEGF HCC, MRC-5, ja makrofagi yhdessä viljelemisen ryhmiä eri co-viljelyolosuhteissa. VEGF: n ilmentymistä soluissa viljelty w /o FBS (ruokittu FBS mutta O

2), w /o FBS ja w /o O

2 (ilman FBS ja ilman O

2) oli suurempi kuin 10% FBS tai O

2 (10% FBS soluviljelyelatusaineella, O

2), kun taas VEGF: n ilmentymistä kolmessa eri olosuhteissa kasvoi ensin ja sitten laski.

HCC, MRC-5, ja makrofagi rinnakkaisviljelmätilanteessa ryhmä, HCC ja MRC-5 co-kulttuuri ryhmä, ja HCC mono-kulttuuri ryhmä (kontrollina) viljeltiin erikseen, ja soluviljelmän supernatantit kerättiin 48 tuntia. VEGF: n ilmentymistä sekä HCC, MRC-5, ja makrofagi (492,84 ± 51,43) ja HCC ja MRC-5 (429,63 ± 54,13) yhdessä viljelemisen ryhmissä oli suurempi kuin HCC mono-kulttuuri ryhmä (208,31 ± 46,45). VEGF: n ilmentymistä on HCC, MRC-5, ja makrofagi yhdessä viljelemisen ryhmässä oli myös korkeampi kuin HCC ja MRC-5-yhteisviljelmässä (n = 3,

P

0,05, taulukko 5 ja kuvio 2B).

ekspressio VEGF HCC, MRC-5, ja makrofagi 3D yhdessä viljelemisen keuhkosyöpä mallin eri yhdessä viljelemisen olosuhteissa

HCC, MRC -5, ja makrofagi yhdessä viljelemisen ryhmiä viljeltiin kolmen eri olosuhteissa: 10% FBS O

2 (10% FBS soluviljelyelatusaineella, O

2), 0% FBS O

2 ( ruokittu FBS mutta O

2), ja ilman molemmat (ilman FBS ja ilman O

2). Soluviljelmän supernatantit kerättiin kymmenen eri ajankohtina. Huomasimme, että VEGF: n ilmentymistä olosuhteissa 0% FBS ja O

2 ja ilman molemmat oli suurempi kuin ilmaisua 10% FBS O

2 ryhmä, kun taas suuntaus VEGF ilmentymisen kaikissa kolmessa olosuhteet kasvoi ensin, sitten vähentynyt (n = 3,

P

0,05, taulukko 6 ja kuvio 2C).

2D- ja 3D yhdessä viljelemisen malli

3D kollageeni geeli yhdessä viljelemisen kautta luotiin (kuvio 3A). Soluviljelyväliaineessa tunkeutunut kollageenigeelin, ja viljellyn solut suspendoitiin 3D-avaruudessa.

(A) 3D kollageenin co-kulttuuri malli. Kuvio 3A: 1,0 ml soluviljelyalustaa tunkeutunut kollageenigeelin ylhäältä, ja viljellyt solut suspendoitiin 3D kollageenin geelin tilaan. Kuviossa 3A, b: 0,5 ml kollageeni geeli omistukseensa jokaisessa viljelymaljalla lokero itsenäisesti. (B) Cell morfologioita 2D- ja 3D-yhteistyön kulttuuri malleja 48 tuntia. Kuvio 3B: Kuva HCC-solujen ja makrofagien 2D-kulttuuri malli. Nuolenkärki merkitsee HCC-solu, joka on tasainen ja ei-pallomaisia. Nuolenkärki osoittaa makrofagit ympäröivä HCC solun 40X suurennus. Kuvio 3B, b: Kuva HCC-solujen ja makrofagien meidän 3D yhteistyössä kulttuuri malli. Nuolenkärki merkitsee HCC solu, joka on subglobose ja pistelee. Nuolenkärki osoittaa makrofagi. Tämä kuva osoittaa, että nämä solut ovat yhteydessä toisiinsa, katsottuna käyttäen CFDA SE Tracker on -konfokaalimikroskoopilla. (C) Kuvia HCC, MRC-5, ja makrofagi yhteisviljelyt 48 ja 168 tuntia 40X suurennus. Kuvio 3C, joka on: Makrofagit kontakti ja hyökkäys HCC-soluissa 48 tunnin kuluttua yhteistyön kulttuuri. Nuolenpäät merkitsevät HCC, makrofagien, ja MRC-5-soluissa. Kuvio 3C, b: Co-kulttuuri 7 päivän jälkeen. Kuten tässä kuvassa 7 vuorokauden viljelyn jälkeen solut alkoivat irrota ja kellua keskipitkällä, jotka ovat menettäneet niiden elinvoimaisuus ja normaalin solun morfologian. Useimmat HCC ja makrofagisoluissa olivat kuolleet. (D) fluoresenssimikroskooppiin kuvia MRC-5, makrofagi, ja HCC 3D mallin. Kuvio 3D (ylempi): Fluoresenssi mikroskooppikuvat MRC-5, makrofagi, ja HCC viljelmät (kuvio 3D, a). Solut värjättiin DAPI (kuvio 3D, c) ja fallotoksiinit (kuvio 3D, b). Kuvio 3D (alempi): Fluoresenssi mikroskooppikuvat makrofagit (kuvio 3D, d). Solut värjättiin DAPI (kuvio 3D, f) ja fallotoksiinit (kuvio 3D, e).

Cell morfologioita meidän 2D- ja 3D-malleja verrattiin (kuvio 3B). Vuonna 2D-kulttuuri malli, muoto HCC solujen oli tasainen ja ei-pallomaisia ​​(kuvio 3Ba), kun taas 3D-mallissa, HCC solut subglobose ja pistelee (Kuva 3BB). Siksi muoto HCC-solujen oli dramaattisesti erilainen 2D- ja 3D-malleja.

Lisäksi cell kuvat talteen 48 tunnin kuluttua ja yhdessä viljelemisen osoitti, että makrofagit oli ottanut yhteyttä ja hyökkäsi HCC-solut (kuvio 3Ca), kun taas 7 vuorokauden yhdessä viljelemisen voisimme nähdä soluja kelluu keskipitkällä menettäneet elinkelpoisuus ja oli muuttunut morfologioita. Sekä HCC ja makrofagien populaatiot olivat pääosin kuolleita (kuvio 3Cb). Fluoresenssimikroskooppia kuvia Jääleikkeiden MRC-5, makrofagi, ja HCC malli ja 3D-makrofagi mallin kerättiin myös (kuvio 3D).

Disscussion

haasteena kehittää uusia hoitomuotoja kehitettäessä piilee perustamisesta

in vitro

malleja, jotka heijastavat paremmin vallitsevat

in vivo

. Varhainen 2D malleja edellyttäen mekanistinen käsitys perus NSCLC etäpesäke. Nämä malli järjestelmät eivät katettava kaikki signaloinnin redundanssin ja /tai korvaavia järjestelmiä. 3D cell yhdessä viljelemisen tekniikoita käyttäviä syöpäsolujen yhdessä stroomasoluissa voisi olla lupaava polku Rakennettaessa aiempaa tyypillisestä mallista.

Tutkimuksessamme loimme kolmiulotteisen yhdessä viljelemisen kollageenin malli keuhko syöpä adenokarsinoomasoluja, keuhkon fibroblastit, ja immuunijärjestelmän solut (makrofagit). Tämä malli on kehitetty tutkia kasvaimen mikroympäris- ja vuorovaikutukset keuhkosyövän ja stroomasolujen prosessin aikana keuhkosyövän ja metastaasit. Roskelley et ai. ja Mitragotri et ai. havaitsivat, että solut viljeltiin 3D matriisiin osoitti dramaattisesti erilaisia ​​ominaisuuksia leviämisen kannalta, erilaistuminen, morfologia, ja solujen toimintaa [14, 15]. Samoin olemme havainneet, että morfologiaa HCC keuhkon adenokarsinooma soluissa oli merkittävästi erilainen 2D- ja 3D-co-kulttuuri malleja. Vuonna 2D-kulttuuri malli, muodot HCC solut litistetty ja arkkimainen makaa pohjassa Soluviljelymaljassa, kun 3D-mallissa, HCC solut subglobose ja pistelee. Tämä 3D yhdessä viljelemisen keuhkosyöpä malli ei vain soluväliaineen keuhkosyövän soluja, mikä on kriittinen niiden muodon ja toiminnan, mutta se näyttää myös paremmin simuloida elinympäristön ja solujen vuorovaikutusta, joka syntyy

in vivo

.

tutkimuksessamme havaitsimme, että MMP-1 tasot olivat lähes havaitsematon HCC ja makrofagien monokulttuuria ryhmiä. VEGF-tasot olivat myös lähes havaitsematon MRC-5 ja makrofagit monokulttuuria ryhmä, vaikka sekä MMP-1 ja VEGF: ää ekspressoidaan runsaasti yhteistyössä näiden solujen viljelmiä. Nämä havainnot osoittavat välistä vuorovaikutusta keuhkosyövän ja stroomasolujen ovat tärkeitä ilmentymisen Näiden merkkiaineiden etäpesäke. Lisäksi ilmaisuja sekä MMP-1 ja VEGF olivat korkeimmat malli, yhdistetty kaikki kolme solutyyppejä (HCC, MRC-5, ja makrofagit), jopa korkeampi kuin tasot kahden kulttuurin järjestelmä HCC ja MRC-5. Tuloksemme osoittavat myös, että makrofaagien 3D yhdessä viljelemisen malleissa ei ainoastaan ​​lisää MMP-1, mutta myös parantaa kykyä keuhkosyöpään solujen edistää angiogeneesiä. Kuitenkin prosessin aikana yhteistyön kulttuuri, huomasimme, että makrofagit myös tappoivat HCC-soluissa. Tämä havainto viittaa siihen, että toiminta makrofagien keuhkosyöpä voi olla ”kaksiteräinen miekka”, jossa niillä on sekä anti-kasvain ja kasvain edistäviä vaikutuksia merkitystä invaasio, etäpesäkkeitä, ja keuhkovaurioita. Jotkut raportit ovat liittäneet runsaasti kasvaimeen liittyviä makrofagit (TAM), jossa on huono potilaan ennusteeseen [16, 17]. Thomsen et ai. raportoitu, että tupakointi aiheuttaa tulehdusreaktion keuhkoissa, joka rekrytoi tulehdussolujen, näin ollen muuttamalla sytokiinien eritystä niin, että johtaa taipumus keuhkosyöpä [18]. Shaked et ai. osoittaneet, että luuytimestä peräisin olevia soluja, kuten lymfosyyttejä, makrofageja, neutrofiilit, ja syöttösoluissa (MC) hankitaan usein keuhkoihin vastauksena keuhkovaurion; yhdessä fibroblastien, endoteelisolujen, ja perisyyteissä, immuunijärjestelmän solut näyttävät auttaa vaatimassa kasvain microenvironment (TME) [19].

Kasvain microenvironmental hapenpuute (hypoksia) lisää myös pahanlaatuinen käyttäytymistä syöpäsolujen, osittain kautta hypoksia-indusoituva tekijä (HIF) perheen transkriptiotekijöiden. HIFs säätelemään EMT-geenien sekä edistää angiogeneesiä, solun lisääntymistä, ja kudoksen uudelleen [20]. Esillä olevassa tutkimuksessa havaitsimme ilmaus VEGF HCC, MRC-5, ja makrofagi yhdessä viljelemisen ryhmä kolmen eri olosuhteissa: 10% FBS O

2 (normaali tilanne), 0% FBS O

2 (nälkään sikiön seerumia mutta O

2), ja 0% FBS ilman O2 (simuloi hypoksia ja seerumistarvaatio olosuhteissa). Olemme havainneet, että VEGF: n ilmentymistä hypoksiassa tai seerumistarvaatio oli korkeampi kuin tavanomaisissa olosuhteissa 72 tunnin kuluttua yhteistyön kulttuurin, kun taas suuntaus VEGF ilmentymisen osoitti aluksi kasvua, jota seuraa ilmeinen vähennys. Tämä voi johtua HCC solukuoleman ajan välittämien makrofagit, joka aiheutti piilevä väheneminen VEGF-ilmentymisen. Kuten myös hiljaista, lisäksi hypoksia, nälkään olosuhteet voivat edistää VEGF: n ilmentymistä

in vitro

. Kuitenkin HCC ja MRC-5 co-kulttuuri ryhmä, jota käytettiin vertaamaan MMP-1 hypoksiassa tai seerumistarvaatio normaaleissa olosuhteissa, ei osoittanut mitään merkittäviä eroja ilmentymisessä. Me tulkitsi tämän tarkoittavan, että kumpikaan hypoksiaa tai seerumistarvaatio ovat tekijöitä, jotka vaikuttavat MMP-1. Lisäksi MMP-1 näissä olosuhteissa väheni jatkuvasti yli 120 h kokeen. Yksi selitys voi olla, että solut loppuun tarvittavat ravintoaineet kasvualustaan ​​ja /tai alhainen happipitoisuus aiheuttama jännitys heitä kasvamaan huonosti ja /tai pysäyttää solunjakautumisen.

On aikaa uudelleen nykyisen 2D malleja testata keuhkosyöpä terapeuttisten kuin kasvain microenvironment, läsnäolo stroomasolujen, ECM komponentteja, ja molekyylejä suuresti vaikuttavat ulkonäkö, terveys, ja toiminta syöpäsoluja. Ehdotamme, että parempi lähestymistapa olisi suunnitella hoitoja, jotka ovat myös kohdistettu kasvaimeen microenvironment ja stroomasoluja, jotka ovat myös tärkeitä etäpesäke ja angiogeneesiä. Therapies, jotka kohdistuvat vain ja toimivat suoraan keuhkosyöpään solut voivat olla yhtä tehokkaita, koska niillä ei ratkaista avaintekijöitä osallisena syövän etenemiseen. Keuhkosyöpä solut ovat heterogeenisiä ja niillä erilaisia ​​histologisia ominaisuuksia, sekä se, että ne ovat geneettisesti epävakaaksi taudin etenemiseen; kaikki nämä ovat merkittävä syy epäonnistumiseen keuhkosyövän hoitoja, jotka keskittyvät hyvin konkreettisia tavoitteita keuhkojen syöpäsoluja. Lisäksi, korkean resistenssin yleensä mukana hoitoja suunnattu suoraan kasvainsoluihin. Yhteenvetona näemme edut hoitojen kohdistaminen kasvaimen mikroympäris- ja stroomasolujen: 1) ne eivät kohdistu tiettyyn osa-alueeseen erittäin vaihteleva kasvainsolujen, 2) ne kohdistuvat stroomasolut, joilla vakaa geneettinen tausta ja periytyvä vakautta, ja 3) stromasoluja ovat vähemmän alttiita geneettisiä muutoksia ja lääkeresistenssi, mutta niillä on suuri vaikutus taudin etenemiseen ja etäpesäkkeitä, niin että se estää niiden toiminta voi tehokkaasti hidastaa tai pysäyttää syövän etenemiseen /leviäminen.

Johtopäätökset

kasvaimen mikroympäris- koostuu syöpäsoluja, interstitiaalinen solut, sytokiinit ja kemokiinit. Yleisesti, interstitiaalinen solut, mukaan lukien fibroblastit, immuunijärjestelmän soluja, endoteelisoluja ja epäkypsät solut ovat peräisin luuytimestä. Keskittyen ymmärtämään, miten interstitiaalinen solut toiminto kasvaimen mikroympäristössä voi johtaa parannuksiin syöpähoitojen. Työmme on osoittanut, että morfologia HCC solujen eroaa huomattavasti toisistaan ​​2D- ja 3D yhteistyön kulttuuri malleja. Ilmaisu MMP-1 ja VEGF ylössäädellään 3D yhdessä viljelemisen malleja verrattuna monokulttuuria malleihin, mikä osoittaa, että vuorovaikutukset keuhkosyövän solujen ja stroomasolujen saattaa olla merkittävä rooli mahdollistaa ja edistää etäpesäke. 3D yhteistyössä kulttuuri keuhkosyöpä malli, simuloitu hypoksia ja nälkään olosuhteet aiheuttamaa eritystä VEGF, mutta ei MMP-1. Makrofagien kasvaimen mikroympäristössä voi toimia kaksi rooleja hyökkää tuumorisoluissa, samalla upregulating signaalipolkuja tuki kasvaimen invaasion ja metastaasin.

Outlook

Therapies kohdistaminen kasvainten stroomasoluissa voi edustaa tehokkaamman lähestymistapa syövän torjuntaa. Kuitenkin vähän tiedetään nykyisin vuorovaikutuksesta tukikudosten ja kasvainsolujen;