Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tarkoitus

nonequilibrium ilmanpaine plasma (NEAPP) hoito on viime aikoina keskittynyt uutena hoitokäytännön. Käytetään soluja, joiden hankittu paklitakselia /sisplatiinia vastus, me selvitetty vaikutuksia epäsuoran NEAPP-aktivoitua keskipitkän (NEAPP-AM) altistumisen solujen elinkelpoisuuden ja kasvaimen kasvua

vuonna vitr

o ja

in vivo

.

Methods

käyttäminen krooninen paklitakseli /sisplatiini-resistenttejä munasarjasyöpäsoluja, käytimme epäsuoria NEAPP-alttiina väliaineen soluihin ja

ksenosiirrettyjä

kasvainten hiirimallissa. Lisäksi olemme tutkineet rooli reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) tai niiden puhdistavien edellä mainittujen EOC-soluissa.

Tulokset

arvioi elinkelpoisuus NOS2 ja NOS3 solut altistetaan NEAPP- AM, joka oli valmistettu ennalta säteilyttämällä NEAPP varten ilmoitettuun aikaan. Vuonna NOS2 soluissa, elinkelpoisuus laski noin 30%, kun NEAPP-AM 120-sec hoito (

P

0,01). Kasvua inhiboivia vaikutuksia NEAPP-AM olivat täysin inhiboi N-asetyylikysteiini hoitoa, kun taas L-buthionine- [S, R] -sulfoximine, estäjä ROS puhdistusainetta käytetään NEAPP-AM, laski solujen elinkelpoisuutta 85% jälkeen NEAPP-AM 60-sek hoitoon (

P

0,05) ja 52% sen jälkeen 120 s, verrattuna kontrolliryhmään (

P

0,01). Vuonna hiiren ihonalainen kasvaimen muodostumisen malli, NEAPP-AM injektio johti keskimäärin eston NOS2 solun siirrostamattomassa kasvain 66% (

P

0,05) ja NOS2TR solu-ympätty kasvain 52% (

P

0,05), verrattuna kontrolliin.

Johtopäätös

osoitettu, että plasma-aktivoitu väliaine oli myös anti-kasvain vaikutus chemo-resistenttien solujen

in vitro

ja

in vivo

. Epäsuora plasma hoito on lupaava hoitovaihtoehto EOC ja voivat edistää parempaa potilaan ennusteen tulevaisuudessa.

Citation: Utsumi F, Kajiyama H, Nakamura K, Tanaka H, ​​Mizuno M, Ishikawa K, et al . (2013) vaikutus Epäsuora nonequilibrium Ilmanpaine plasma- Anti-lisäkasvuaktiivisuus vastaan ​​Krooninen Chemo hylkivät munasarjasyöpäsoluja

In vitro

ja

In Vivo

. PLoS ONE 8 (12): e81576. doi: 10,1371 /journal.pone.0081576

Editor: Mohammed Yousfi, University Paul Sabatier, Ranska

vastaanotettu: 15 maaliskuu 2013; Hyväksytty 15. lokakuuta 2013. Julkaistu: 18 joulukuu 2013

Copyright: © 2013 Utsumi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Grant-in-tuki tieteellisen tutkimuksen Innovatiivinen Areas, Grant nro 24108008 alkaen opetus-, kulttuuri-, urheilu-, Science and Technology of Japan. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Dr. Kano on presidentti NU Eco-Engineering Co, Ltd. Kaikki kirjoittajat ovat keksijöiden kansainvälinen patenttihakemus. Patentti nimi (otsikko): ”Kasvaintenvastainen Solution ja antisyöpälääkeaine ja tuotantomenetelmien Sentähden” ja numero PCT /JP2013 /001139, joka jos myönnetään, kuuluisi Nagoyan yliopisto ja NU Eco. Ei ole muita patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

epiteelikasvaimet munasarjasyöpäpotilailla (EOC) on viides johtava syy syövän liittyvä kuolema ja edelleen yksi aggressiivinen kasvaimet kaikista gynecologic pahanlaatuisia kasvaimia länsimaissa. Mukaan Cancer tilastot 2012 arvioitiin 15500 kuoli tautiin Yhdysvalloissa [1]. Suurin osa potilaista, joilla EOC on kehittynyt vatsaonteloon etäpesäkkeitä diagnoosin koska tämä syöpä usein jää kliinisesti hiljainen. Koska hoito strategia koostuu enintään sytoreduktiivisen leikkausta seuraa taksaania plus platina kemoterapiaa perustettiin, lyhyen aikavälin ennusteen potilaita, joilla on EOC on parantunut. Huolimatta verrattain korkean tason herkkyys EOC paklitakseliin, ennuste kehittyneiden tai toistuvia tapauksia on edelleen huono, koska useimmat kuolleisuus tapaukset ovat seurausta etäpesäkkeiden joka on tulenkestävä näiden kemoterapeuttisten aineiden. Vaikka erilaisia ​​muita molekyyli- kohdistamisen hoitoja, mukaan lukien anti-angiogeeninen aineita, on tutkittu, jotta voidaan voittaa tällaiset paklitakselin vastus, vaikutus tällaisen hoidon ei ole tyydyttävä [2], [3].

Plasma, yleisesti työskentelee fysiikan, on pohjimmiltaan ionisoidun kaasua, jossa osa atomien tai molekyylien ionisoivat [4]. Plasma aktiivisena ionisoidun väliaine ylläpiti energian sisältävien vapaita varauksia, vapaita radikaaleja, innostunut molekyylejä ja energinen fotonien voi aiheuttaa prosesseja yleensä saadaan kemiallista käsittelyä tai sädehoidon [5]. Teknisen kehityksen myötä, uuden sukupolven plasma nimeltään nonequilibrium ilmakehän paineessa plasmaa (NEAPP), joka tunnetaan myös nimellä kylmä plasma tai ei-terminen plasma, on itse asiassa tullut käytännössä [6]. Äskettäin NEAPP hoito on keskittynyt uutena lääketieteellisen käytännön mukaisesti [7] – [9]. Alkuvuodesta plasmassa käytettäväksi life-science, terminen plasma käytettiin kirurgisen työkalun ja sterilointi. Viime plasma sovelluksissa, tutkijat keskitytään pääasiassa ei-terminen plasma vaikutuksia, joihin liittyy sen reaktiivisen lajien (RS) biologisia esineitä. On ollut tehotutkimuksiin sovelletaan aloilla kudoksen sterilointi, veren hyytymisen, haavan paranemista edistäminen, ja hampaiden valkaisu [10] – [12]. Lisäksi viime aikoina on raportoitu, että plasman kohdistama antiproliferatiivisia vaikutuksia erilaisia ​​syöpäsoluja, apoptoosin indusoimiseksi, joka tunnetaan nimellä ohjelmoitu solukuolema [5], [13], [14]. Tutkimuksen mukaan päässä Sensenig et al., NEAPP hoito indusoi apoptoosia kautta, joka näyttää olevan riippuvainen tuotannon solunsisäisten ROS, mikä johtaa annoksesta riippuvainen DNA-vaurioita melanoomasoluissa [14]. Lisäksi sen sijaan, että suora vaikutus solujen altistuminen keskipitkän käsitelty plasma erotetaan soluista (epäsuora plasma) vähensi solun leviämisen nisäkkäiden rintojen epiteelisolujen ja HeLa-soluissa kautta sukupolven ROS keskipitkällä [13 ], [15]. Huomionarvoista oli se, että sähköeristeessä plasma, eräänlainen ei-terminen plasma käyttää epäsuorana plasma lähde, säie päästöjä kosketuksessa suoraan väliaineen vastaelektrodina vastaan ​​eristävä elektrodia virtansa aikana hoitoja. Siksi tarkka roolit ionien ja radikaalien tuotettu sähkö päästöt ovat ratkaisematta.

Toisaalta, valikoiva kohdentaminen syöpäsolujen lisäksi ympäröivä normaaleista soluista on ratkaiseva tahansa syöpälääkkeen terapeuttisia strategioita. Meidän äskettäisessä raportissa, kaksi riippumatonta ihmisen EOC solulinjoissa ja normaaleja fibroblastisoluja käsitelty high-flux NEAPP arvioitiin myrkyllisyyden ja proliferaatiomäärityksillä. Tämän seurauksena molemmat EOC-soluja discriminately tapettiin kautta indusoimiseksi tehostetun apoptoosin, kun taas plasma-käsiteltyjen fibroblastisoluja ole vaurioitunut [16]. Viime aikoina olemme myös osoittaneet, että glioblastoma solut indusoida selektiivisesti apoptoosin, kun niitä käsitellään välillisiä plasma-alttiina väliaineen läpi AKT alassäätöä [17]. Esillä olevassa tutkimuksessa käytetään soluja, joiden hankittu paklitakselia /sisplatiinia kestävyys, jotka on luotu aiemmin [18], [19], me selvitetty vaikutuksen epäsuora NEAPP-aktivoitua keskipitkän (NEAPP-AM) altistumisen solujen elinkelpoisuuden ja kasvaimen kasvua

vuonna vitr

o ja

in vivo

. Lisäksi tutkimme roolin reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) tai niiden puhdistavien kroonisissa antineoplastiset kestävä EOC soluissa. Mahdollinen soveltamisesta Technologic liikennemuotojen terapeuttisena kohteena EOC ehdotetaan.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

NOS2 ja NOS3 (tunnetaan myös; TAOV) solut, jotka ovat peräisin vakavien EOC, perustettiin meidän instituutti [20], [21]. Nämä solulinjat pidettiin RPMI-1640 (Sigma, St. Louis, MO, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ja penisilliini-streptomysiinillä 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2 .

perustaminen paklitakselia /sisplatiinia kestävä EOC solujen

NOS2TR ja NOS2CR soluja, perustettiin vanhempien NOS2 solujen meidän instituutti [18], [19], oli hankkinut krooninen resistenssi paklitakseliin ja sisplatiinia, vastaavasti. Lisäksi näitä rivejä, me juuri muodostettujen toiset kaksi krooninen paklitakselia /sisplatiinia kestävä linjat vanhempien NOS3 soluista: NOS3TR (paklitakseli) ja NOS3CR (sisplatiini). Lyhyesti, NOS3 solut pestiin perusteellisesti PBS: llä ja siirrettiin RPMI-1640-väliaineessa, joka sisälsi 10% FBS: ää ja penisilliini-streptomysiiniä. Solut altistuvat jatkuvasti paklitakseli (Bristol Myers satiiri, Tokio, Japani) tai sisplatiinin (Nihon Kayaku, Tokio, Japani) yli 6 kuukautta, jona aikana väliaine vaihdettiin joka 3-4 päivä, ja soluviljelmiä siirrostettiin trypsinaation jälkeen subkonfluenssiin saavutettiin. Vähitellen, nämä solut näytetään vastustuskyky kasvua estäviä ominaisuuksia paklitakselin tai sisplatiinia. Nämä solulinjat, nimetty paklitakselia tai sisplatiini-resistenttejä, viljeltiin vielä 3 kuukautta väliaineessa, joka sisältää näitä syöpälääkkeet ennen kuvaamista tutkimuksista. Näiden prosessien lopulta syntyy neljä paklitakselia /sisplatiinia kestävä EOC solulinjoja {NOS2TR ja NOS3TR (paklitakseli), NOS2CR ja NOS3CR (sisplatiini)}. Nämä solulinjat pidettiin RPMI-1640, jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja penisilliini-streptomysiinillä 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2.

Experimental tunniste ja tuotanto nonequilibrium ilmakehän paineessa plasma-aktivoitu keskipitkän (NEAPP-AM) B

yksityiskohdat kokeellisen NEAPP järjestelmä, kuten kuvassa. 1, on kuvattu aikaisemmin. Virtaama olosuhteet olivat argon kaasun (2 standardi l /min, SLM) vaikuttaa kohdistamalla 10 kV, 60 Hz: n kaupallinen virtalähde kaksi elektrodit 8 mm [16]. Lyhyesti, NEAPP ultra-high electron tiheys (noin 2 x 10

16 cm

-3) edellyttäen tunnusomaisesti ultra-high O tiheys arvioidaan noin 4 x 10

15 cm

-3 [22], [23]. Lisäksi reaktiivisten hapen lajien (ROS), kuten hydroksyyliryhmä, singletti happiradikaaleja, typen oksidien ja typpi, vahvistettiin optinen emissio-spektroskopialla (OES). Olemme altistuvat edellä NEAPP RPMI-1640 erillään soluja, jotka on nimetty ”nonequilibrium ilmakehän paineessa plasmaa aktivoitu keskipitkän (NEAPP-AM). Erotettu välinen etäisyys plasman lähteen ja väliaineen (L) on kriittinen jatkuvasti toistaa dataa, joten kaikki kokeet suoritettiin samoissa olosuhteissa, L = 15 mm, jossa ei plasmapurkaus saatettiin kosketukseen väliaineen. Kesto plasmakäsittely vaihtelivat 0: 300 sekuntia

in vitro

tutkimuksissa. Kuusi ml RPMI-1640-väliaine pantiin 60 mm: n malja. Keskellä kunkin 60-mm astia käsiteltiin useita valotusaika (30, 60, 120, 180, ja 300 s) ja NEAPP, merkitty NEAPP-AM-30, -60, -120, -180 ja -300 vastaavasti alla. Eläimille, neljä ml kasvualustaa laitettiin 21 mm: n astiaan ja käsiteltiin NEAPP 600 sekuntia.

Kemosensitiivisyys määritys

paklitakseli /sisplatiini kemiallis-herkkyyden määritys suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [24]. Lyhyesti, solut ympättiin kolmena rinnakkaisena 96-kuoppalevyillä tiheydellä 2000 solua tilavuudessa 100 ui elatusainetta, joka sisälsi 10% FBS: ää. Kun oli inkuboitu 24 tunnin ajan 37 ° C: ssa, kasvualusta korvattiin tuoreella kasvualustalla, kanssa tai ilman eri pitoisuuksilla paklitakselin ja sisplatiinin. Kun oli kulunut vielä 72 tuntia, solun elinkelpoisuus määritettiin käyttäen Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay -kittiä (Promega, Madison, WI, USA), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Absorbanssi mitattiin sitten 490 nm: ssä mikrolevylukijalla (Multiskan Bichromatic, Labsystems, Helsinki, Suomi). IC50-arvot osoittavat pitoisuuksien tuloksena 50%: n vähennys kasvu verrattuna kontrolli solujen kasvua.

solunelinkykyisyysmääritys

vaikutus NEAPP-AM on Solujen elinkelpoisuus määritettiin vesipitoinen Yksi ratkaisu Cell Proliferation Assay -kittiä (Promega, Madison, WI, USA) on kuvattu julkaisussa ”Kemosensitiivisyys määrityksessä”. Solut maljattiin 96-kuoppalevyille tiheyteen 1 x 10

4 solua per kuoppa 100 ui täydellistä kasvatusalustaa. Seuraavana päivänä soluja käsiteltiin NEAPP-AM (30-300 sekuntia /6 ml) 24 tunnin ajan, ja edellä mainitut olosuhteet on optimoitu havaitsemaan NEAPP-AM herkkyys soluja. Jokainen aktivoitu aika NEAPP-AM toistettiin 6 kuoppiin. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Reactive oksidatiivisia lajeja (ROS) eston ja L-γ-glutamyyli-L-kysteinyyli-glysiini (GSH) väheneminen

inhiboivat ROS, N-asetyylikysteiini ( NAC, Sigma-Ardrich, St. Louis, MO, USA), solunsisäinen ROS puhdistusainetta, on käytetty. Lisäksi L-buthionine- [S, R] -sulfoximine (BSO, Sigma-Ardrich, St. Louis, MO, USA) on inhibiittori GSH synteesin. Tiedetään, että GSH on yleisin ja tehokas osa puolustusjärjestelmää vapaita radikaaleja vastaan ​​sisältäen ROS. Yhdisteitä NAC ja BSO lisättiin soluihin loppupitoisuuteen 4 ja 2 mM PBS: ään, vastaavasti. Tarvittava määrä kutakin lääkettä lisättiin suoraan loppuun soluviljelyalustaan ​​2 tuntia ennen NEAPP-AM hoitoon ja NEAPP-AM halutun lopulliset konsentraatiot vastaavasti. Solujen elinkelpoisuus tutkittiin kanssa ”solujen elinkelpoisuuden määritys”.

solun apoptoosimäärityksessä /kaspaasi-3/7 aktiivisuuden määritys

kaspaasi-3/7 määritettiin kanssa CellEvent ™ kaspaasi -3/7 Green Detection Reagent (Molecular Probes Invitrogen, Calsbad, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. NOS2 ja NOS2TR soluja (1,5 x 10

4 /kuoppa) siirrostettiin 8 hyvin kuvantaminen kammio (Lab-Tek Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA), inkuboitiin 24 tuntia, ja sitten käsiteltiin NEAPP- AM tai seerumivapaassa väliaineessa kontrollina. Sen jälkeen, kun 2 tunnin inkuboinnin CellEvent ™ kaspaasi-3/7 Green Detection Reagent lisättiin kuoppiin lopulliseen pitoisuuteen 10 uM. Neljä tuntia sen jälkeen, kun NEAPP-AM hoitoon, soluja havaittiin kevyt ja fluoresenssimikroskoopilla. Tämä koe toistettiin vähintään kolme kertaa.

Detection solunsisäisten ROS kertymistä

Solunsisäinen ROS kertymistä seurattiin käyttäen 5-6-kloorimetyyli-2’7′-dichlorodihydroflorescein diasetaatti, asetyyli esteri (CM H

2DCFDA; Molecular Probes Invitrogen, Calsbad, CA). Havaitsemaan solujen ROS tasolla, CM-H

2DCFDA (4 uM) PBS: ssä lisättiin 15 minuutin ajan 37 ° C: ssa pimeässä. Latauksen jälkeen puskuri vaihdettiin kasvatusalustaan ​​tai NEAPP-AM, ja soluja inkuboitiin 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa, ja havaittiin fluoresenssimikroskopialla. Tuotanto ROS voidaan visualisoida muutokset johtuvan fluoresenssin solunsisäistä tuotantoa CM-DCF aiheuttamaa hapettumista CM-H

2DCF.

Eläinkokeet

Yhteensä 1 x 10

3 NOS2 ja NOS2TR solut suspendoitiin 150 ui seerumittomalla väliaineella ja 150 ui Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA, USA), ja käytettiin ihon alle siirrostamiseen molemmin puolin kylkeen 8- viikkoisen naaras-nude-hiirten (BALB /C) (N = 12) (Japan SLC, Nagoya, Japani) käyttämällä 27-gaugen neula, ja sitten niitä satunnaisesti kahteen yhtä suureen ryhmään, vastaavasti. Tämä eläinkoe ​​protokolla hyväksyttiin Animal Experimental komitean Graduate School of Medicine, Nagoyan yliopisto.

Yksi hiirten ryhmä sai 200 ui NEAPP-AM ihonalaisena injektiona kummallakin puolella, ja toinen ryhmä sai sama tilavuus kuin plasma alttiina RPMI-1640-väliaineessa kuin kontrolliryhmä. NEAPP-AM valmistettiin kuten edellä on kuvattu. Nämä hoidot toistettiin 3 kertaa viikossa, pohjimmiltaan maanantaisin, keskiviikkoisin ja perjantaisin, alkaen 24 tunnin kuluttua solujen injektion. Kun kasvain alkoi kasvaa, se mitattiin jarrusatulat ja tilavuus laskettiin käyttäen kaavaa: π /6 x (suurin halkaisija) x (pienin halkaisija)

2. Päättyessä kokeen (29 päivää istutuksen jälkeen), hiiret uhrattiin ja kasvaimen kudokset otettiin talteen ja punnittiin. Hematoksyliini-eosiini (H 0,05.

Tulokset

vaikutus NEAPP-AM solun kasvuun ja kannattavuuden

arvioitiin ensin anti-kasvain potentiaali NEAPP-AM kasvuun kahden eri ihmisen EOC solulinjoissa

in vitro

käyttäen solunelinkykyisyysmääritys. Kuvio 2 A-B esittää solujen elinkelpoisuus NOS2 ja NOS3 solut altistettiin NEAPP-AM 24 tuntia, joka oli valmistettu ennalta säteilyttämällä NEAPP varten ilmoitettuun aikaan. Vuonna NOS2 soluissa, elinkelpoisuus väheni noin 30%, kun soluja käsiteltiin NEAPP-AM-120, ja 70%, kun hoidetaan NEAPP-AM-180 (

P

0,01) verrattuna ei- NEAPP altistuneet väliaine hoitoa. Samanlainen suuntaus on myös esitetty NOS3 soluja, joissa solujen proliferaatio on alas-säätelee noin 30%, kun hoidetaan NEAPP-AM-60 (

P

0,05), ja 90% sen jälkeen, kun hoidon NEAPP-AM-120 (

P

0,01). Sen sijaan, altistumista lyhyemmäksi ajaksi, soluproliferaatioon oli säädelty tapahtuu noin 20%: n lisäys.

elinkelpoisuus NOS2 ja NOS3 soluja käsiteltiin NEAPP aktivoituvan keski- (NEAPP-AM) mitattuna solunelinkykyisyysmääritys. NOS2 (A) ja NOS3 (B) ihmisen munasarjasyöpä soluja maljattiin 96-kuoppalevyille ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 5% CO2. 24 tunnin kuluttua elatusaine korvattiin NEAPP-AM, ja soluja inkuboitiin vielä 24 tuntia. Prosenttiosuudet eloonjääneiden solujen kustakin solulinjasta lasketaan suhteessa kontrolleihin. Plasman valotusajan nolla määritettiin kanssa solunelinkykyisyysmääritys. Kukin pylväs edustaa keskiarvon ja palkit osoittavat SD. Tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen. * P 0,05, ** P 0,01 verrokkiin nähden.

rooli ROS ja tehostetun NEAPP-AM herkkyys BSO

Myöhemmin me tutki ROS tuottama NEAPP ovat anti -tumor vaikutuksia. Testata rooli ROS NEAPP-AM hoitoon, NOS2 soluja esi-inkuboitiin NAC tai BSO, minkä jälkeen lisättiin NEAPP-AM varten osoitetun valotusaikaa. Elinkelpoisuuden NOS2 solujen määritettiin 24 tunnin kuluttua NEAPP-AM hoitoa käyttäen solunelinkykyisyysmääritys. Kuten on esitetty kuviossa. 3, kasvua estäviä vaikutuksia NEAPP-AM-180 olivat täysin esti sille on esikäsitelty NAC, kun taas elinkelpoisuus väheni noin 30%, kun NEAPP-AM-300 NAC, joka osoittaa, että saattaa olla riittämätön molekyylejä NAC poistamaan ROS toimintaa. BSO kanssa NEAPP-AM laskenut solujen elinkelpoisuuden kaikissa käsittely olosuhteissa; varsinkin, BSO kanssa NEAPP-AM-120 johtanut merkittävään laskuun 50%, verrattuna kontrolliin (NEAPP-AM hoito yksinään) (

P

0,01). Nämä tulokset viittaavat siihen, että ROS soluissa tuotettu NEAPP-AM on kriittinen rooli antituumoriselta vaikutuksia vastaan ​​EOC soluihin.

A, B:

vaikutus solunsisäisten ROS modulaatio NAC ja BSO on NEAPP-AM-solukuolema. V: NOS2 solut esikäsiteltiin NAC (4 mM) (A) tai BSO (2 m M) (B) 2 tunnin ajan ja sitten altistettiin NEAPP-AM NAC tai BSO vielä 24 tuntia. Solujen elinkelpoisuuden määritystä käytettiin arviointiin. Jokainen sarake edustaa keskiarvoa ja baarit ovat SD. Tiedot edustavat vähintään kolmen riippumattoman kokeen. * P 0,05, ** P 0,01 verrokkiin ilman NAC hoitoa.

vaikutus NEAPP-AM on Chemo-resistenttejä solulinjoja

Sen arvioimiseksi, onko NEAPP-AM hoito voisi vaikuttaa kemiallis-resistenttejä solulinjoja, käytimme paklitakselin ja sisplatiinin-resistentit solut syntyvät NOS2 ja NOS3 soluja (NOS2TR, NOS2CR, NOS3TR, ja NOS3CR solut). Olemme ensimmäinen vahvistettu, missä määrin resistenssin paklitakselista tai sisplatiinin näiden solujen. Kuvio 4 esittää paklitakselin tai sisplatiinin-herkkyyden määritys vanhempien NOS2 ja kestävä NOS2TR soluja. Merkitty chemoresistance paklitakseliin ja sisplatiinin todettiin NOS2TR ja NOS2CR soluja, verrattuna vanhempien NOS2 soluihin, tässä järjestyksessä. IC 50-arvot nämä solut olivat seuraavat: paklitakseli: 1,9 /231,8 in NOS2 /NOS2TR soluja, sisplatiini: 38,2 /135,6 in NOS2 /NOS2CR soluja. Samanlaisia ​​tuloksia vahvistettiin NOS3TR ja NOS3CR soluja {IC50-arvo: paklitakseli: 0,9 /18,2 NOS3 /NOS3TR soluja, sisplatiini: 38,2 /132,2 sisään NOS3 /NOS3CR soluja}. Kuten on esitetty kuviossa. 5A, solujen elinkyky arvioitiin 24 tunnin kuluttua NEAPP-AM hoitoa käyttäen solunelinkykyisyysmääritys. Proliferaationopeudet molemmissa NOS2, ja NOS2CR solut alennetaan noin 70%, kun NEAPP-AM-120 käsittelyä. Mielenkiintoista, leviämisen kurssi NOS2TR alennettu 9% jälkeen NEAPP-AM-120 käsittely, joka herkempiä NEAPP-AM. Lisäksi, samanlainen suuntaus havaittiin muissa NOS3TR ja NOS3CR-soluissa (kuvio. 5B).

A, B

: Paklitakseli-herkkyyden määritys resistenttejä NOS2TR (A) ja NOSCR soluja ( B) verrattuna vanhempien NOS2 soluihin.

C, D

: Cisplatin-herkkyyden määritys Resistensseissä NOS3TR (C) ja NOS3CR soluja (D) verrattuna vanhempien NOS2 soluihin. Jokainen piste edustaa keskiarvoa ja palkit osoittavat SD. Tiedot edustavat vähintään kolmen riippumattoman kokeen. * P 0,05, ** P 0,01 verrattuna emo-soluja.

Solun elinkelpoisuus NOS2 (A) NOS3 (B), vanhempien solut ja paklitakselin

39 tai sisplatiinin (CR) resistenttejä NOSTR ja NOSCR solut käsiteltiin NEAPP-AM mitattiin solunelinkykyisyysmääritys. Tulokset esitetään keskiarvoina ± SD, joka edustaa vähintään kolmen itsenäisen kokeen. * P 0,05, ** P 0,01 verrattuna 0 s ohjaus.

mekanismi on NEAPP-AM-indusoidun apoptoosin NOS2 ja NOS2TR solujen

Edellisessä tutkimus, suora NEAPP indusoi solujen apoptoosin EOCs. Olemme sittemmin arvioitava, sytotoksista vaikutusta NEAPP-AM liittyi apoptoosin. Kaspaasi 3/7 aktiivisuus tutkittiin 4 tunnin kuluttua NEAPP-AM hoito kuormittamalla loisteputki alustan CellEvent ™ kaspaasi 3/7 Green Detection Reagent. Kuten odotettua, verrattuna kontrollisoluihin, NEAPP-AM hoidon aiheuttamia morfologisia muutoksia (kutistuu, pyöristäminen ja irrottautuminen astiat), jotka olivat tyypillisiä apoptoosin, ja aktivointi caspase3 /7 molemmissa solutyypeissä (kuvio. 6).

kaspaasi-3/7 määritettiin kanssa CellEvent ™ kaspaasi-3/7 Green Detection Reagent (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Neljä tuntia sen jälkeen, kun NEAPP-AM hoidon NOS2 (A) ja NOS2TR (B) havaittiin mikroskoopilla ja fluoresenssimikroskopialla. Morfologisia muutoksia tutkittiin mikroskoopilla. Oli kutistuminen ja kupliminen soluja käsiteltiin NEAPP-AM, mikä osoittaa apoptoosin induktio. Mittakaavapalkki vastaa 100 um.

Nämä tulokset viittaavat siihen, että NEAPP-AM: n indusoiman apoptoosin kautta kaspaasi-3/7 aktivointi.

Lisäksi on raportoitu, että NEAPP hoidon aloittamisesta -regulates tuotannon solunsisäisten ROS, joka johtaa apoptoosin syöpäsoluissa. Sen määrittämiseksi roolin ROS pelaa NEAPP-AM aiheuttaman apoptoosin, ensin tarkasteltiin tuotannon ROS käyttää hapettimen herkän fluoresoiva koetin CM-H

2DCFDA. Tulokset paljastivat, että hoito NEAPP-AM lisääntynyt intensiteetti DCF-signaalin verrattuna kontrolliin sekä NOS2 ja NOS2TR solut (Fig. 7).

A, B

: ROS havaitseminen tai ilman NEAPP-AM hoitoa. NOS2 (A) ja ROS2TR (B) käsiteltyjä soluja tai ilman NEAPP-AM kanssa esikuormituksen CM-H

2DCFDA. NOS2 (A) ja NOS2TR (B) Soluja esiladattu CM-H

2DCFDA 15 minuuttia ja käsiteltiin NEAPP-AM. Kuvat visualisoitiin fluoresenssimikroskoopilla. Edustavat kuvat solujen kolmesta itsenäisestä kokeesta on esitetty. Mittakaavapalkki vastaa 100 um.

kasvua estävää vaikutusta NEAPP-AM on tuumoriksenografteja hiirimallissa

Olemme vihdoin tutkineet mahdollisia kasvaimen vastainen ominaisuuksia NEAPP-AM nude-hiirissä sai ihonalaisen ksenografti. Koeolosuhteet Tässä

in vivo

mallia asetettiin arvioida, NEAPP-AM voisi estää kasvaimen muodostumisen takia microdissemination. Ihon alle kasvaimen muodostumisen havaittiin vähintään noin 10 päivää inokulaation jälkeen hiirten NOS2 tai NOS2TR soluja. Myöhemmin säännöllinen s.c. hoidon NEAPP-AM suoritettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Kuten on esitetty kuviossa. 8, lasketut kasvaintilavuudet päivänä 28 olivat 300 ± 136 (mm

3 ± SD) ja 163 ± 91 vuonna NOS2 ja NOS2TR kontrolliryhmiin ja 55 ± 60 ja 104 ± 66 vuonna NOS2 ja NOS2TR ryhmiä käsiteltiin NEAPP -AM, vastaavasti (p = 0,0014 ja 0,097, vastaavasti). NEAPP-AM injektio johti keskimäärin eston NOS2 solu-ympätty kasvaimen painoksi 66% (

P

= 0,017) ja NOS2TR solu-ympätty kasvaimia 52% (

P

= 0,014) , verrattuna kontrolliin. Niinpä NEAPP-AM vähensi kasvua sekä vanhempien ja Chemo kestävä EOC kasvaimia. Kokeilun aikana olemme vahvistaneet, että NEAPP-AM annosta oli myrkyttömiä havainnoimalla hiiri painoilla, selviytyminen, ja käyttäytymistä, eikä komplikaatioita, kuten anafylaksian ja ihonekroosi havaittiin.

A, B

: makroskooppiset havainto kantavien nude-hiirten ihon alle NOS2 (A) ja NOS2TR (B) kasvaimen molemmissa kyljissä. Hiiret injektoitiin NOS2 ja NOS2TR solut ja sitten sai keskisuurten yksin tai NEAPP-AM. Kaikkiaan 0,4 ml keski- tai NEAPP-AM annettiin paikallisesti osaksi molemmin puolin hiiriä kolme kertaa viikossa. Kaikki hiiret lopetettiin 29 päivää istutuksen jälkeen. Green arrowheads osoittavat kasvaimen muodostumisen.

C, D

: Aika riippuvat muutokset kasvaimen tilavuus ksenosiirrettyjä malleja on esitetty, pelkällä väliaineella (♦) tai NEAPP-AM (▪). Jokainen piste linjalla kuvaaja kasvaimen keskimääräinen tilavuus (mm

3) kullekin ryhmälle tiettynä päivänä istutuksen jälkeen, ja palkit edustavat SD. * P 0,05, ** P 0,01 vs. kontrolli.

E

: Pylväsdiagrammi osoittaa kasvaimen keskipaino leikatun NOS2 ja NOS2TR kasvaimia NEAPP-AM tai kontrolliryhmiin. P-arvot verrattuna kontrolliryhmään olivat 0,017 ja 0,014 vuonna NOS2 ja NOS2TR potilaista.

F, G:

histologinen analyysi kasvaimia. Edustavat kuvat hematoksyliinillä ja eosiinilla värjäys parafinoidut kudososat ksenosiirrettyjä istutettujen kasvaimien NOS2 (F) ja NOS2TR (G). Mustat nuolet osoittavat nekroottinen ydin sisällä kasvain. Mittakaavapalkki vastaa 100 um.

Havaitsimme myös histologista eroja kasvainleikkeissä välillä NEAPP-AM-käsiteltyjen ja -untreated ryhmät molemmissa solulinjoissa.

Olisi huomattava, että papillaarisen kasvu, selkeän merkin munasarjan serous adenokarsinooma, josta NOS2 ja NOS2TR olivat eristetty, havaittiin. Päinvastoin, NEAPP-AM-käsiteltyjen kasvainten menettänyt tämän ominaisuuden. Se oli samankaltaisuutta, että molemmat kasvain ryhmillä oli keskeinen kuolion. Vuonna ihonalainen kasvaimia muodostettu istuttamalla NOS2TR soluja, olemme huomanneet saman histologinen ulkonäkö identtinen serous adenokarsinooma ja Keski kuolion vaikka se oli vähemmän kuin vanhempien NOS2 soluja. Tämä osoitti, että NEAPP-AM esti kasvaimen leviämisen mutta ei ollut näyttöä auttaa valaista ilmiön

in vivo

.

Keskustelu

Lukuisat EOC potilaat reagoivat hyvin platinaa yhdessä paklitakselin, joka on ensimmäinen valinta EOC. Kuitenkin suurin osa näistä potilaista kehittyy toistuminen ja kehittynyt resistenssi eri kemoterapia-aineiden. Vaikka tällaiset potilaat todellisuudessa vastaanottanut toistuvaa tai muunlaisia ​​sytotoksisen aineen kanssa selvästi tuskallinen sivuvaikutuksia, nämä hoidot eivät ole johtanut tyydyttävään onkologisesta lopputulokseen. Jos tällaisia ​​potilaita hoidetaan tehokkaasti vaihtoehtoisia, vähemmän myrkyllisiä terapia, ne voitaisiin säästyä tarpeettomia kivuliaita oireita.

Aikaisemmassa raportissa, osoitimme, että suora säteilytys NEAPP merkittävästi vähentynyt proliferaatio määrien EOC solujen verrattuna fibroblastisoluista [16]. Tämä viittaa siihen, että plasman voidaan selektiivisesti tappaa EOC soluihin apoptoosin. Kun kuitenkin otetaan huomioon tunnetut ominaisuudet EOC, levittämällä ja istuttamalla koko vatsaonteloon, vatsaonteloon (IP) hoito voi olla käytännöllisempää kliinisestä näkökulmasta. Jos me sovelletaan plasmassa IP hoitomuotoa, uuden terapeuttisen tekniikkaa voidaan kehittää kohdistaminen vatsaonteloon mikroskooppiset ja /tai makroskooppinen kasvaimia, helpottaa korkeampi kasvaimen levinneisyys ja kertyvät sytotoksisten vaikutusten vatsaonteloon. Olemme hiljattain vahvistanut, että NEAPP-AM osoittaa myös selektiivinen kasvainten vastainen vaikutus glioblastoomasolut (U251SP), mutta ei normaaleissa ihmisen aivojen astrosyytit (ACBRI-371) [17], olettaen, että NEAPP-AM osoittaisi matalan tason toksisuuden elävässä järjestelmään. Kuitenkin, ei ole raportti vaikutus plasman tai plasma-aktivoitu välineen, Chemo-resistenttien solujen huolimatta siitä, että plasmakäsittely on raportoitu aiheuttavan solukuolemaa erilaisissa syöpäsoluissa [5], [14], [15] , [25]. Siten nykyinen tutkimus, yritimme tarkistaa, onko plasma on myös anti-kasvain vaikutus Chemo kestävä EOC, joka on aiemmin osoitettu [18], [19].

Useat aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että plasma tuottaa suuren määrän ROS, mikä johtaa DNA-vaurioita ja solukuolemaan [5], [14], [15], [25]. Todellakin, meidän plasma-järjestelmä (NEAPP) on myös ominaista aiemmissa raporteissa, joissa jotkut ROS, kuten hydroksyyliryhmä singlettihappea radikaalit, typen oksidien ja typen, havaittiin plasmasta OES [16]. Täällä, käytimme ’nonequilibrium ilmanpaine plasma-aktivoitu keskipitkän (NEAPP-AM) ”; Näin, meidän pitäisi huomata, mitä reaktiivisia lajeja (RS) nestefaasissa johtavat kasvaimen vastaisen vaikutuksia EOCs. On raportoitu, että vesi altistetaan plasmassa tuli happamaksi, jossa vetyperoksidi ja typpihappo /typpihapokkeeksi olivat liuenneet, mikä inaktivoimiseksi mikrobin [26] – [28]. Lisäksi plasma-käsitelty väliaine myös alassäädetty solujen elinvoimaisuuden RS ja toisen valmistettujen materiaalien keskipitkällä, kuten on osoitettu aiemmissa raporteissa [13], [15]. Kuitenkin ilman vakiintunut NEAPP generaattori, eri tutkijat ovat kehittäneet näitä laitteita. Näin ollen on vaikea yksinkertaisesti verrata ominaisuuksia kesken plasma-tuottavien järjestelmien.