Krooninen sairaus

tiivistelmä

Aiemmin kolme onkogeeni siirtogeenisiä zebrafish linjat indusoituvan ilmentymisen

xmrk

,

kras

tai

Myc

maksassa on luotu ja nämä siirtogeeniset linjat kehittää onkogeeni-addiktoitunut maksakasvaimien kemiallisella induktion. Nykyisessä tutkimuksessa vertailevia transcriptomic lähestymistapoja käytettiin tutkimaan korrelaatiota kolmen indusoidun siirtogeenisiä maksasyöpien ihmisen maksan syövät. RNA profiilit kolmen zebrafish kasvaimia osoitti suhteellisen pieni päällekkäisyydet merkittävästi vapautettu geenien ja biologisia polkuja. Kuitenkin kolme siirtogeenisiä kasvain allekirjoitusta kaikki osoitti merkittävää korrelaatiota kehittyneitä tai hyvin kehittynyt ihmisen maksasolusyövän (HCC). Mielenkiintoista, molekyylimerkkiaineet kustakin onkogeeni aiheuttama zebrafish maksakasvain korreloivat vain pienessä määrässä ihmisen HCC näytettä (24-29%) ja siellä oli säilytetty sääteli polkuja välillä seeprakala ja korreloi ihmisen HCC alaryhmä. Kolme Seeprakala maksasyövän malleja yhdessä muodostivat lähes puolet (47,2%) ihmisen HCCs taas jotkut ihmisen HCCs osoitti merkittävää korrelaatiota enemmän kuin yksi allekirjoitus määritellään kolmen onkogeeni-koukkuun seeprakalan kasvaimia. Sen sijaan yleisesti vapautettu geenit (21 ylös ja 16 alas) kolmessa zebrafish kasvainmuodoista yleensä osoitti yhtäpitävä vapauttaminen useimmissa ihmisen HCCs, mikä viittaa siihen, että nämä geenit voitaisiin entistä johdonmukaisemmin vapautettiin laajaa ihmisen HCCs eri molekyylitason mekanismeja ja siten palvella yhteisiä diagnoosimarkkereina ja terapeuttisia tavoitteita. Niinpä nämä siirtogeenisiä seeprakala mallien kanssa hyvin määritelty onkogeeni aiheuttama kasvaimet ovat arvokkaita työkaluja molekyyli luokittelu ihmisen HCCs ja ymmärrystä molekyylien kuljettajien hepatokarsinogeneesin kussakin ihmisen HCC alaryhmä.

Citation: Zheng W, Li Z , Nguyen AT, Li C, Emelyanov A, Gong Z (2014)

Xmrk

,

Kras

ja

Myc

Siirtogeenisten Zebrafish Maksasyöpä mallit Jaa Molecular allekirjoitukset kanssa osajoukot of Human maksasyövän. PLoS ONE 9 (3): e91179. doi: 10,1371 /journal.pone.0091179

Editor: Xiaolei Xu, Mayo Clinic, Yhdysvallat

vastaanotettu: 2. lokakuuta, 2013 Hyväksytty: 09 helmikuu 2014; Julkaistu: 14 maaliskuu 2014

Copyright: © 2014 Zheng et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat apurahan National Medical Research Council of Singapore. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Zhiyuan Gong on tällä hetkellä akateeminen toimittaja PLoS ONE; Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Human maksasolusyövän (HCC) tiedetään olevan hyvin heterogeeninen sairaus, erityisesti väli- ja edennyt pitkälle [1]. Koska monipuolinen ja monimutkainen etiologies edistää HCC esiintyvyys, erilaisia ​​geneettisiä mutaatioita tai muuttunut molekyyli polkuja voi olla vastuussa hepatokarsinogeneesin. Toistaiseksi useat karsinogeeninen reittejä on tunnistettu olla mukana kehittymistä ja etenemistä HCC, mukaan lukien VEGFR, EGFR, ja mTOR polkuja [2]. Sen pyrkimys tulkita roolin eri onkogeenisten polkuja, useita siirtogeenisen hiiren mallia on vahvistettu [3], [4] ja vertailevia transcriptomic analyysejä on käytetty tunnistamaan paras siirtogeenisen hiiren mallina ihmisten HCCs [4].

seeprakala on yhä useammin arvokkaana kokeellinen malli ihmisen sairauksiin, erityisesti syöpien [5] mukaan lukien maksan syövät [6] – [11]. On osoitettu, että seeprakala kasvaimia oli silmiinpistävää yhtäläisyyksiä ihmisen syövän histologisesti [12], [13]. Transcriptomic ja epigeneettiset analyysit ovat myös todenneet säilytetty piirteitä karsinogeeni aiheuttama zebrafish HCC ihmisen HCC [14] – [16].

Aiemmin olemme onnistuneet tuottamaan useita maksakasvain malleja Siirtogeeniekspression kolmen eri onkogeenien (

Kras xmrk

tai

Myc

), erityisesti zebrafish maksassa ja nämä siirtogeeniset seeprakala yleensä tuottaa maksakasvaimien vaihtelevalla voimakkuudella peräisin maksasoluadenooman (HCA) ja HCC [6] – [9]. Kolme onkogeenit käytimme zebrafish kaikilla on osoitettu olevan osallisena hepatokarsinogeneesin.

KRAS

on mutatoitunut -7% maksan syöpien ihmisen [17], mutta Ras-signalointi kaikkialle aktivoidaan HCC [18].

Xmrk

on luonnossa esiintyvä variantti EGFR kalan suvun

Xiphophorus

(platyfish ja Miekkapyrstöt) stitutiivisella autofosforylaation ja aktivointi alavirran signaalit [19]. Aktivointi EGFR signaali korreloidaan huonon ennusteen HCC potilaista [20].

MYC

yleisesti monistetaan monissa syövissä kuten HCC ja korkeampi ekspressiotaso MYC liittyy kehittyneempiä asema HCC [21]. Olemme osoittaneet, että yli-ilmentyminen

kras

ja

xmrk

että seeprakala maksassa voivat aiheuttaa HCC [7] – [9], kun taas yli-ilmentyminen

Myc

indusoi enimmäkseen HCA [ ,,,0],6].

Comparative transcriptomic analyysit eläinmalleissa ja kliinisissä näytteissä tehokas väline tunnistamiseen säilyneitä molekyyli polkuja ja biologisten merkkiaineiden geenit diagnosoinnin ja hoidon [15], [22]. Nykyiset onkogeeni siirtogeenisiä zebrafish mallit ovat hyvin määriteltyjä säätely ylöspäin kuljettajan onkogeenin ja tämä saattaa antaa arvokas väline tunnistaa molekyylitasolla voimat ihmisen syövän synnyn vertailevalla transcriptomic analyysejä. Näin ollen tässä tutkimuksessa käytimme RNA sekvensointitekniikan verrata transcriptomic profiilit kolmen onkogeenin aiheuttaman maksavaurion kasvaimia siirtogeenisissä seeprakalan. By vertailevat analyysit ihmisen maksan transcriptomes välillä kirroottisiin maksa hyvin kehittyneitä HCC, huomasimme, että ne kaikki osoittivat vahvaa molekyyli korrelaatio edistynyttä tai hyvin kehittynyt ihmisen HCCs. On kuitenkin olemassa aivan erillinen vapautuneilla biologisia polkuja perustuu vapautettiin geenien kolmessa onkogeenin siirtogeenisiä malleja. Mielenkiintoista on, että jokainen seeprakala maksakasvain malli korreloi osajoukko ihmisen HCCs ja kukin osajoukko on joitakin selviä molekyyli- piirteitä. Osoitimme, että siirtogeenisiä zebrafish mallien kanssa hyvin määritelty kuljettajan geenin toiminnan pitäisi olla arvokas luokittelun ihmisen HCCs ja ymmärtämiseksi molekyylitason mekanismeista kunkin HCC alatyyppiä.

Materiaalit ja menetelmät

Hoito ja induktio maksasyövän Three Zebrafish Siirtogeenisten mallit

Zebrafish säilyivät seuraavan hyväksytyn tutkimussuunnitelman Institutional Animal Care ja käyttö komitea National University of Singapore (Protocol 079/07). Sukupolvi

xmrk

ja

Myc

siirtogeenisiä zebrafish aiemmin kuvattu ja ne ilmaisua kuin

TO (xmrk) B [9] ja

TO (Myc)

[6] vastaavasti edellisessä julkaisuissa. Kaksi transgeenisten linjojen konstruoitiin käyttämällä tetrasykliiniä-indusoituva siirtogeenisiä järjestelmä ja onkogeenin ilmentyminen indusoitiin doksisykliini.

kras

V12

siirtogeenisiä linja käytetään tässä tutkimuksessa oli vastikään luotu käyttämällä mifepristonin-indusoituva järjestelmä [7] yhdessä Cre-loxP-järjestelmä (julkaisematon). Sillä

xmrk

ja

Myc

siirtogeenisiä linjoja, siirtogeenisiä kaloja ja niiden ei-siirtogeenisiä sisarukset käsiteltiin 60 ug /ml doksisykliiniä (Sigma, USA) alkaen 3,5 MPF (kuukausi post lannoitus) 6 viikon ajan. Kaikki

xmrk

kala kehittynyt HCC ja kaikki

Myc

kala kehittynyt HCA. Kaikkiaan jokaisen siirtogeenisiä linja, yksi kasvain näyte (siirtogeenisiä kaloja hoidettiin doksisykliini) ja kolme kontrollinäytteitä (ei-siirtogeenisiä sisarukset samalla doksisykliinillä, siirtogeenisiä sisarukset ilman doksisykliinikäsittely, ja ei-siirtogeenisiä sisarukset ilman doksisykliinikäsittely) kerätty RNA-sekvensoinnilla. Kaikissa tapauksissa, maksan käytettyjen näytteiden RNA-sekvensointi yhdistettiin neljästä viiteen uros kalaa. Sillä

kras

V12

siirtogeenisiä kaloja, yhden kuukauden ikäinen siirtogeenisiä kaloja käsiteltiin 1 uM mifepristonin (Sigma, USA) 36 tuntia aiheuttaa Cre-välitteisen rekombinaatio aktivoimiseksi

kras

V12

ilmentymistä maksassa.

kras

V12

aktivoitu siirtogeenisiä kaloja sitten annettiin kasvaa kuusi kuukautta kehittää HCC ja HCC Sitten näytteet kerättiin RNA sekvensoinnilla. Kolme maksan kasvainten aiheuttamaa siirtogeenisiä kaloja ja kolme normaali maksa Indusoimattomista siirtogeenisiä kaloja yhdistettiin erikseen kasvain ja kontrollinäytteitä. Kaikki näytteet käytettiin olivat mies- kalasta ja kaksi biologista rinnakkaisnäytteitä käytettiin.

tunnistaminen Signature Gene -listat Kukin Zebrafish Maksasyöpä Model

Kokonais-RNA eristettiin käyttäen TRIzol reagenssia (Invitrogen, USA ) ja käsiteltiin DNaasi I: llä poistaa genomista DNA-kontaminaation. 3 ’RNA-SAGE (serial analyysi geenien ilmentymistä) sekvensointi suoritettiin ABI vankan pohjan Mission Biotech (Taiwan) mukaan valmistajan protokollaa ja 10-23 miljoonaa lukee muodostettiin kustakin näytteenottaja (taulukko S1). Lyhyesti, mRNA puhdistettiin käyttäen Dynabeads Oligo (dT) EcoP (Invitrogen), ja suoritettiin cDNA-synteesi. Saatu cDNA digestoitiin Nlalll ja EcoP15I johtaa 27 nukleotidin cDNA tag kahden sekvensointi adapterit. Tunnisteet kartoitettiin että NCBI RefSeq (viite Sequence) mRNA tietokanta zebrafish kanssa kriteerinä sallii enintään 2 nukleotidin epäsuhta. RNA-Seq tiedot toimitettiin Gene Expression Omnibus tietokantaan seuraavat tunnusluvut: GSE53342 varten

xmrk

ja

Myc

tiedot ja GSE53630 varten

kras

tiedot. Tag laskee kullekin transkriptin normalisoitiin TPM (selostukset per million) vertailun helpottamiseksi eri näytteitä. Differentiaalisesti geenien

Myc

– ja

xmrk

– aiheuttama maksasyöpien tunnistettiin käyttämällä yhden näytteen t-testiä aikaisemmin kuvatulla [23], ja ilmennetty eri geenit

kras

indusoimaan maksasyövän tunnistettiin käyttämällä kaksisuuntaisella Studentin t-testiä.

helpottamiseksi toiminnallinen vaikutuksia zebrafish transcriptome, kaikki seeprakala geenejä kartoitettu selityksin ihmisen geenejä voidakseen käyttää olemassa olevia online-ohjelmistot kehitetty ihmisen geeneistä. Siten ihmisen homologia kartoitus zebrafish Unigene klusterien haettiin Genome Institute of Singapore Seeprakala Annotation Database (https://123.136.65.67/). Sillä Unigene klusterit kartoitettu useampi kuin yksi transkripti merkinnät, korkein TPM käytettiin edustamaan ilmentymistason Unigene klusterin. Jotkut Seeprakala Unigene klustereita kartoitettiin useamman kuin yhden ihmisen Unigene klustereita, jotka yleensä ovat peräisin samasta geenistä perheeseen. Voit poistaa irtisanomisia ja välttääkseen aiheuttamasta harha toiminta-analyysejä, vain ensimmäinen ihmisen Unigene klusteri luettelossa valittiin edustamaan seeprakala Unigene klustereita. Luettelot merkittävästi säädelty zebrafish geenejä, jotka kartoitettiin ihmisen homologit ja käyttää vertailu- analyese ihmisen HCC tiedot on esitetty taulukossa S2.

Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) B

GSEA käytettiin luoda sukulaisuuden välillä transgeenisten zebrafish malleja ja ihmisen maksan syöpien [24]. GSEA on laskennallinen menetelmä, joka ratkaisee, onko

priori

määritellyistä geenien osoittaa tilastollisesti merkitseviä, yhtäpitävät erot kahden biologiset näytteet; se laskee rikastamiseen pisteet käyttäen käynnissä sum tilastoa läpi paremmuusjärjestykseen geenien ilmentymisen tietokokonaisuutta. Ihmishomologit on huomattavasti ylöspäin geenien päässä zebrafish kasvainkudoksista käytettiin syövän allekirjoitukset jokaisen siirtogeenisiä zebrafish malli transcriptomic verrattuna ihmisen HCC tietoja. Jokainen valittu fenotyyppi ihmisen HCCs (joko yhden tietyn HCC vaiheessa tai tietyn HCC näyte) on verrattuna muuhun näytteiden samassa aineisto. Kaikki geenit valitussa fenotyypin rankattiin t-testi määrittää ilmaisun eroja eri HCC vaiheissa tai eri HCC näytteitä. Rikastamisen pisteet ennalta määritellyn siirtogeenisiä zebrafish syöpä allekirjoituksen laskettiin käyttäen käynnissä sum tilastoa kautta sijoittui geenejä. Tilastollinen merkitys rikastamiseen pisteet arvioitiin käyttämällä empiiristä fenotyyppi-pohjainen permutaatio testimenettelyä. FDR (väärä löytö rate) arvo saatiin käyttöön säätö useiden hypoteesin testaukseen. Ihmisen maksasyöpä transcriptome tietoja haettiin Gene Expression Omnibus (GEO) tietokantaan. Ihmisen aineisto, mukaan lukien eri vaiheissa HCCs vertailussa käytettiin oli GSE6764 [25]. Kymmenen ihmisen HCC aineistoja tutkimisessa käytettävä edustus zebrafish maksasyövän geeni allekirjoitukset on koottu taulukkoon S3. Lisäykset tiedot noudetaan SOURCE (https://smd.stanford.edu/cgi-bin/source/sourceSearch). Useiden koettimia, jotka voidaan kuvata yhteen Unigene klusterin, maksimi signaalin intensiteettiä valittiin edustamaan ilmentymistason Unigene klusterin.

GSEA Pre-sijoittui Analysis

GSEA pre-sijoittui vaihtoehto käytettiin analysoimaan vapautuneilla reittejä kunkin siirtogeenisissä zebrafish malli ja alaryhmien ihmisen HCCs. Lyhyesti, koko transcriptome oli paremmuusjärjestykseen logaritmi muuttaneet p-arvo (base 10). Ylös geenien annettiin positiivisia arvoja, ja alas geenien negatiivisia arvoja. Kuraattori kanoninen tapoja valmistaa MSigDB (Molecular Signature Database) käytettiin. Määrä permutaatio käytettiin 1000.

RT-qPCR Validation

Yhteensä RNA käänteistranskriptoituneet käyttäen SuperScript II cDNA Synthesis Kit (Invitrogen). RT-qPCR suoritettiin sama sarjaa cDNA käytetään SAGE sekvensointiin käyttämällä LightCycler 480 SYBR Green I Master-järjestelmä (Roche). Reaktiot suoritettiin kolmena rinnakkaisena kullekin cDNA näytettä ja alukesekvenssit on esitetty taulukossa S4. Geeniekspressiotasot kullekin valvonta tai siirtogeenisiä maksanäytettä normalisoituivat tasoon

β-aktiini

mRNA sisäisen valvonnan. Tukin

2-kertaiseksi muutoksia välillä kasvain ja kontrollinäytteiden laskettiin CT menetelmää kaavan mukaisesti: log

2 kertamuutoksia = -ΔΔCT = – [(CT geeni-CT

β-aktiini

) siirtogeenisiä näytteenvastaanottopinnassa (CT geeni-CT β-aktiini) kontrollinäytteestä]. Kaksisuuntainen heteroscedastic t-testi suoritettiin käyttämällä normalisoitua CT-arvot (CT geeni – CT β-aktiini) ja muutokset p 0,05 pidetään merkittävänä.

Tulokset

tunnistetiedot ilmentyvät eri geenit Three siirtogeeninen Zebrafish Maksasyöpä mallit

kolme onkogeeni transgeenisten linjojen (

xmrk, Myc

ja

kras

V12

) indusoitiin kehittää maksan kasvaimia ( Kuvio S1), ja nämä kasvaimen näytteet altistettiin RNA-SAGE sekvensoinnilla. Jonka valintaperusteet kertaluokkamuutos 1,5, p-arvo 0,05 ja TPM 10 (joko ohjaus- tai kasvain näytettä), ilmentyvät eri geenit valittiin kolmesta kasvain sarjaa. Oli 2892, 797 ja 494 geenit säädellään ylöspäin ja 169, 902 ja 676 geenit alassäädetty

xmrk

-,

kras

– ja

Myc

– indusoitu seeprakala maksasyövän, vastaavasti (kuvio 1A, B). Vapautettu geenit kolmesta siirtogeenisten mallien osoitti suhteellisen vähäisiä päällekkäisyyksiä, mikä osoittaa, että kolme onkogeenien säännelty täysin erillisiä sarjaa geenien. Tämä on sopusoinnussa raportissa, että morfologisesti yhtenäisiä syöpätyypin usein luokitellaan eri alaryhmiin perustuu niiden erilliset geeniekspressiomalleja [26]. Kiinnostavaa oli 21 säädelty ja 16 alas geenien esiintyy yleisesti kaikissa kolmessa kasvainmuodoista (kuvio 1A, B, taulukko 1).

(A) Venn kaavio säädelty geenien kolme seeprakala siirtogeenisiä HCC malleja. (B) Venn kaavio alas geenien kolmessa zebrafish siirtogeenisiä HCC malleja. (C) vapautettiin reittejä kolmessa onkogeenin siirtogeenisiä maksakasvaimien. Ylä- ja alassäädetty reittejä kussakin zebrafish siirtogeenisiä HCC malli analysoitiin GSEA ennalta sijoittui analyysi. Punainen ja vihreä osoittavat ylös-ja alassäätöä vastaavasti ja värin koodi FDR näkyy vasemmalla. Väylät korreloi harmaita soluja ei havaittu mitään muutoksia. Ylös säädelty reittejä jaettiin seitsemään syövän tunnusmerkki luokat (lukuun ottamatta mahdollistaa replikatiiviset kuolemattomuuden) mukaan Hanahan ja Weinberg [27] ja alassäädetty reittejä luokiteltiin perustuu eri näkökohtia maksan aineenvaihdunnan (katso taulukko S1 lisätietoja).

Distinct Väylät säätelemä Three Zebrafish maksakasvain mallit

Pathway analyysin avulla GSEA osoitti, että kolme siirtogeenisiä maksasyövän malleissa on erilaisia ​​reittejä vapautettiin (kuvio 1 C, taulukko S5) . On yleisesti hyväksytty, että on olemassa kahdeksan syöpää tunnusmerkkejä monivaiheista tumorigenesis ja monimutkaisia ​​kasvainten [27], [28]. Huomasimme, että GSEA identifioitu reittejä pudonnut vähintään seitsemän syövän tunnusmerkit (paitsi mahdollistaa replikatiivisen kuolemattomia).

Xmrk

pääasiassa säädelty reittejä mukana kiertäessään kasvun suppressors ja välttää immuunijärjestelmän tuhoa, johon sisältyi aktivoivat solusykliä, edistää RNA transkriptio, up-säätelevä proteasomin ja muuttamalla immuunijärjestelmän ominaisuuksia.

Kras

edellyttäen kasvainsolujen kykyyn omavaraisia ​​proliferatiivisia signaaleja jopa säätelevä EGFR, Raf-MEK-ERK, PI3K-AKT-mTOR ja GSK3 signalointireitteihin. Erityisesti, se on myös muuttanut polttovälin liima merkkiä kasvainsolujen, jotka voivat aktivoida ja metastaasit.

Myc

pääasiassa säädelty käännös ja proteolyysin auttaa syöpäsolujen kiertää kasvun vaimentimet, ja se myös säädelty VEGF-reitin, mikä saattaa angiogeneesin. Vaikka ei ollut mitään yhtä oikeaa merkittävästi säädelty kaikissa kolmessa kasvainmuodosta, oli joitakin väyliä säädellään ylöspäin kaksi mallia, kuten proteasomin

xmrk

ja

Myc

malleja, ja IGF1- polku, mTOR koulutusjakson tRNA biosynteesiä ja fokaalisen adheesion

xmrk

ja

kras

malleja. Sen sijaan reittejä uudelleenohjelmointi energia-aineenvaihdunnan olivat yleensä alassäädetty kaikissa kolmessa mallissa vaikka alassäätöä

Myc

malli oli vähemmän ilmeinen kuin muissa malleissa. Samaan aikaan monet muut reittejä mukana normaali maksan toiminta kuten veren tekijät, aminohappo aineenvaihduntaa, vieroitus ja xenobiotic aineenvaihduntaa, rasvahappojen aineenvaihduntaan, ja sappi synteesin tasaisesti alassäädetty kaikissa kolmessa kasvainmuodoista. Kuitenkin yksi poikkeus oli hormoni asetuksen, joka oli ilmeisesti säädellään ylöspäin

kras

kasvaimia.

korrelaatio Kolmen Gene allekirjoitukset Seeprakala maksakasvaimien eri vaiheisiin Human HCCs

up-geenien, 2892, 797 ja 494 välillä

xmrk

,

kras

ja

Myc

kasvaimet vastaavasti, käytettiin allekirjoituksen geenit kunkin mallin. Nämä up geenien muunnettiin 1362, 490, ja 146 ihmisen Unigenes tässä järjestyksessä verrata saatavissa transcriptomic tiedot ihmisillä tutkimuksista. Sitten verrataan kolmea allekirjoitusta geeni, joissa on joukko ihmisen transcriptomic data (GSE6764) eri vaiheista ihmisen maksan olosuhteet: kirroosipotilailla maksa, huono laatu dysplastisia kyhmyt (LGDN), korkealaatuista dysplastisia kyhmyt (HGDN), ja hyvin varhain, varhainen , kehittynyt, ja hyvin kehittynyt HCC (veHCC, eHCC, aHCC ja vaHCC), jossa patologinen HCC vaiheita on määritellyt kasvaimen koon, erilaistumista tila ja etäpesäkkeiden tasolla [25]. Kolme allekirjoitus geeni sarjaa olivat kaikki sääteli sairauden edetessä, mutta ne alkoivat olla säädelty eri vaiheissa tumorigeneesin (kuva 2).

xmrk

allekirjoitus positiivisesti korrelaatio HCCs alkaen eHCC, ja se korreloi merkitsevästi aHCC ja vaHCC.

kras

allekirjoitus korreloi positiivisesti aHCC ja vaHCC ja se oli vain korreloi merkitsevästi vaHCC.

Myc

allekirjoitus verrokkeja positiivinen korrelaatio HCCs alkaen eHCC, samanlainen aiempien tuloksen käyttämällä riippumaton sarja RNA-seq dataa samalta siirtogeeniset rivi [6]. Mielenkiintoista, yhteinen 21 ylös geenien kaikissa kolmessa kasvainmuodoista osoitti ylössäätö jopa hyvin varhaisessa vaiheessa HCC, mikä osoittaa näiden geenien korreloi koko neoplastisen prosessin.

sääteli geeni allekirjoitukset kolmen siirtogeenisen kasvaimet (xmrk, kras ja Myc) ja 21 yleisesti ylöspäin geenien (Common) käytettiin GSEA ja Ness (normalisoitu rikastus tulokset (y-akseli) piirretään eri vaiheissa ihmisen HCCs (x-akseli ). NES on lueteltu taulukossa ja tähti osoittaa tilastollista merkittävyyttä: FDR 0,25. lyhenteet: CL, kirroosipotilailla maksa; LGDN, huono laatu dysplastisia kyhmyjä, HGDN, korkealaatuista dysplastisia kyhmyjä, veHCC, hyvin varhain HCC; eHCC, varhainen HCC; aHCC, advanced HCC; vaHCC, hyvin kehittynyt HCC.

edustus kolmen Gene allekirjoitukset seeprakala maksakasvaimien Human HCC näytteitä

Koska erottuva reittejä muuttunut kolmessa seeprakalan maksassa kasvainmuodoista ja korkeatasoisen heterogeenisyys ihmisen HCC potilailla, pyrimme tutkimaan aste edustaa kolmen zebrafish maksasyövän malleja ihmisen HCC näytteissä. Tutkimme kymmenen sarjaa julkaistut kliiniset HCC microarray tiedot, joista kukin sisältyy vähintään 80 kliinisistä näytteistä. Kymmenen aineistot sisältävät yhteensä 1272 näytettä, jotka kattavat eri etnisten ryhmien ja riskitekijät (taulukko S2). Huomasimme, että

xmrk

,

kras

ja

Myc

geeni allekirjoitukset korreloi merkitsevästi 30,8%, 24,8% ja 25,6% kaikista kliinisistä näytteistä, vastaavasti. 47,2% ihmisen HCC näytteillä oli merkittävää korrelaatiota ainakin yksi kolmesta zebrafish geenin allekirjoituksia (taulukko 2, kuvio S2). Eri ihmisen HCC aineistoja, vaihteluväli 22,0%: sta 60,4%. Lisäksi jotkin kliiniset näytteet korreloivat kaksi tai jopa kolme seeprakala geenin allekirjoituksia. Co-korrelaatio kahden geenin allekirjoitusta, eli

xmrk Twitter /

kras

,

kras Twitter /

Myc

ja

kras

/

Myc,

osuus 17,5%, 13,5% ja 12,4% ihmisen HCC näytteitä. 9,3% ihmisen näytteessä oli co-korrelaatio kaikkien kolmen geenin allekirjoitukset. Siten näyttää siltä, ​​että kolme siirtogeeninen seeprakala maksakasvain mallit ovat molekyylitason mekanismeja hepatokarsinogeneesin lähes puoli ihmisen HCC tapauksissa ja toinen puoli ihmisen HCC voi johtua eri molekyylitason mekanismeja.

osoittivat lisäksi, että osajoukot ihmisen HCCs jotka osoittivat merkittävästi positiivinen korrelaatio saman geenin allekirjoitus myös jaettu samanlainen sääteli väyliä (kuva 3, taulukko S6). Tätä analyysiä varten, kullakin ihmisen HCC sarjaa erotettiin kahteen alaryhmään: ne, jotka osoittavat merkittävää korrelaatiota yhden zebrafish allekirjoituksia, ja loput. Differentiaalisesti ilmentyvien geenien kahden ryhmän välillä havaittiin kaksisuuntaisella t-testillä, ja reitti analyysit suoritettiin GSEA ennalta sijoittui analyysi. Polut altistettiin hierarkkinen klusterointi by logaritmi-transformoituja FDR arvoja MeV [29], [30]. Kuten kuviossa 3 on esitetty, kanavat säädellään eri tavalla ihmisen HCCs, joka osoitti merkittävää korrelaatiota yhden seeprakalan allekirjoitukset oli selvä kuvioita. Reitti klusteri A koostui väyliä säädelty kaikissa kolmeen alaryhmään, kuten proteasomin, tRNA biosynteesiä ja oksidatiivisen fosforylaation. Ribosomien, transkriptio ja kääntäminen, ja solusyklin olivat myös erittäin säädelty, mikä viittaa siihen, että ihmisen HCC näytteet korreloi merkitsevästi tahansa zebrafish allekirjoitukset olivat luultavasti enemmän proliferatiivinen kuin ei korreloi merkittävästi. Reitti klusteri B sisältää väyliä alassäädetty useimmissa alaryhmien liittyy

xmrk

mutta säädellään ylöspäin alaryhmiin liittyvät

kras

ja

Myc

. Mielenkiintoista, opinnäytteet reitit olivat yhdenmukaisia ​​erittäin alassäädetty reittejä

xmrk

indusoimaan zebrafish HCC, kuten energia-aineenvaihduntaan, aminohappo aineenvaihduntaa, rasvahappojen aineenvaihduntaan, sappihapon biosynteesiin, komplementtireittiä, biosynteesissä steroidi, ja N-glykaanin biosynteesin. Reitti klusteri C on enemmän säädellään ylöspäin

kras

-associated HCC alaryhmissä, kuten glutamaatin aineenvaihdunta ja glykolyysin. On raportoitu, että

Kras

voisi lisätä glukoosin konversio glutamaatin, ja tämä oli välttämätöntä

Kras

välitteinen kasvainten muodostumiseen [31]. Reitti klusteri D oli yleensä säädellään ylöspäin

xmrk

– ja

kras

-correlated ihmisen HCCs, mutta osoitti epäsuhtaisessa kuviota

Myc

-correlated ihmisen HCCs . Tämä klusteri sisälsi monia kinaasi polkuja, jotka vapautettiin

xmrk

– ja

kras

indusoimaan zebrafish maksasyövän, mutta ei merkittävästi muuttunut

Myc

n aiheuttamaa seeprakalan maksan syöpä. Reitti klusteri E oli varsin heterogeeninen. Reitti klusteri F oli hyvin erillään kaikista muista ja se sisälsi polkuja jotka olivat enimmäkseen alassäädetty kaikissa ihmisen HCC alaryhmien liittyy zebrafish allekirjoituksia, mukaan lukien hematopoieettisten solujen linjaa, sytokiinien koulutusjakson, kalsium- signalointi, ja GPCR polku. Koska useimmat näistä alassäädetty reittejä ovat mukana tulehdusreaktio, on todennäköistä, että alaryhmiä ihmisen HCCs eikä jää kolmen zebrafish malleissa on ankarampaa tulehduksellinen tila.

Väripalkit edustavat logaritmi transformoituja FDR arvot. Sääteli reittejä annetaan positiiviset arvot (punainen) ja alassäädetty väyliä negatiiviset arvot (vihreä). Väylät korreloi harmaita soluja ei havaittu reitin analyysit. Väylät joko FDR = 1 vai ei havaittu yli viisi ulos 30 yhdistelmiä ennalta pois analyysistä.

Yhteisesti Up ja Down-geenien in Zebrafish maksakasvainten ovat myös Tasaisen up ja Down-säädellään Human HCCs

Vaikka kolme geeniä allekirjoitukset edustavat ylössäätöä erillisten reittejä ja korreloi eri alaryhmiä ihmisen HCCs, pyrimme tutkimaan, ovatko 21 yleisesti sääteli ja 16 yleisesti alas geenien kaikissa kolmessa siirtogeenisissä mallia olisi säännellään vastaavasti ihmisen HCCs. Niistä kymmenen ihmisen HCC aineistoja käytimme pystyimme tutkimaan kaksi aineistoja, jotka sisälsivät sekä HCCs ja niitä vastaavat ei-kasvain kudosten (GSE14520 ja GSE25097). Kuitenkin vain GSE14520 voitiin verrata zebrafish tiedot, koska suurin osa ihmisen geenien homologisia yhteiseen seeprakala geenit voitiin tunnistaa mikrosirun alustan mukaan: 19 21 ylös geenien (paitsi

FOXA3

ja

MRPS9

) ja 12 16 alas geenien (paitsi

cyp2ad2

,

slco1d1

,

TDH

ja

MIOX)

. GSE14520 aineisto sisältää 229 ensisijainen HCCs ja vastaava pariksi ei-kasvain maksan kudoksissa [32], [33].

xmrk

,

kras

ja

Myc

allekirjoitukset korreloi merkitsevästi 30,5%, 20,0%, ja 20,5%: n HCC näytteiden, ja yhteensä 47,6%: n HCC näytteet osoittivat merkittävästi lisäävä säätely ainakin yhden zebrafish maksasyövän allekirjoituksia (taulukko 2). Niistä 19 ylös geenien, 16 heistä säädellään ylöspäin enemmän kuin puolet HCC potilaiden, ja joista 9 oli säädellään ylöspäin yli 75%: lla potilaista (kuva 4).

STMN1

oli säädellään ylöspäin 96,9% ihmisen HCCs siitä aineisto, joka on kaikkein ubiikisti sääteli.

STT3A

ja

SRP14

olivat säädellään ylöspäin 93,0% ihmisen HCCs. Niistä 12 alas geenien, 11 heistä alassäädetty yli puolet HCC potilaista.

FBP1

oli säädellä vähentävästi 96,9% tutkituista ihmisen HCCs. FBP1 on glukoneogeneesin säätelyentsyymi ja se toimii antagonisoida Glykolyysivaiheen mahasyövän [34].

FBP1

on säädellä vähentävästi useimmissa ihmisen HCCs metylointi [35]. Palauttaminen FBP1 ilmentymisen ihmisen HCC solulinjoissa merkittävästi esti solun kasvua, mikä viittaa siihen, että se voisi toimia tuumorisuppressorina [35].

19 ylös geenien ja 12 alas geenien tunnistettiin in microarray alustalla. Punainen väri osoittaa ylössäätö, ja vihreä väri osoittaa alassäätöä.

Lisäksi ilmaus näiden 19 ylä- ja 16 alas geenien myös vahvistanut RT-qPCR kaikissa kolme erilaista kasvaimia. Kuten kuviossa S3, suurin osa geenin useimpien testit (~90%) vahvisti yhdenmukainen suuntaus muutoksista tuumorin näytteissä.

Keskustelu

On hyvin tunnettua, että ihmisen HCCs ovat erittäin heterogeeninen; Näin, rajat laji vertailevia tutkimuksia tällä transcriptomic tason tulisi olla arvokasta tunnistaa konservoituneen ja kriittiset polut karsinogeneesis- selkärankaisten lajeista. Täällä ensin määritetty vapautuneilla polkuja kustakin onkogeenin siirtogeenisen seeprakalan malli. Vaikka kolme siirtogeenisiä kasvainmuodoista oli varsin selvä vapautuneilla biologisia polkuja, he kaikki korreloi laajennettuihin tai hyvin pitkälle HCCs verrattuna geeni allekirjoitukset ihmisen HCCs. Lisäksi olemme myös havainneet, että kukin seeprakalan mallin edustavat osajoukkoa ihmisen HCCs. Koska meidän onkogeeni siirtogeenisiä linjoja ovat hyvin määriteltyjä ajo reittejä Karsinogeneesin saatujen tietojen siirtogeeninen seeprakala pitäisi olla arvokas ymmärtämiseksi tärkein molekyylitason mekanismeja kunkin HCC alaryhmä, joka on välttämätöntä kehittää tehokkaampia hoitomuotoja spesifisiä kullekin alaryhmä. Mielenkiintoista, meidän kolme onkogeeni siirtogeenisiä zebrafish mallit merkittävästi muodostavat vain alle puolet ihmisen HCCs ja on tarvetta kehittää ja eri onkogeeni siirtogeenisiä eläinmalleja, jotka kattavat useamman ihmisen HCCs edelleen ymmärtämistä erillisiä molekyylitason mekanismeja hepatokarsinogeneesin, jossa keskitytään tulehduksellinen polkuja.

Tässä tutkimuksessa olemme myös yksilöinyt joukon yleisesti vapautettiin geenien maksakasvainten aiheuttamien eri onkogeeninen signaaleja tunnistettiin ja niiden ilmaisulliset muutoksia ihmisen HCC näytteet validoitu

in silico

(taulukko 1, kuvio 4). Nämä geenit voitaisiin palvella mahdollisina terapeuttisina kohteina, koska ne olivat riippumattomia yksittäisten onkogeenisten polkuja. Ylös geenien sisältää ne proteiinia käännös ja käsittely (

eif5a2

,

abce1

,

rrp9

,

srp14

,

itm1 <