Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kalliokielo

lektiini (POL), eristetty perinteisen kiinalaisen lääketieteen yrtti

(Mill.) B Druce, on kiinnittänyt nousee huomiota, koska sen laaja biologisia vaikutuksia. Esillä olevassa tutkimuksessa, anti-kasvain vaikutuksia, kuten apoptoosi- ja autophagy aiheuttavia ominaisuuksia POL, määritettiin sarja solubiologian menetelmiä, kuten MTT, solun morfologiassa havainto, virtaussytometrialla, immunoblottauksella. Tässä huomasimme, että POL voisi samanaikaisesti apoptoosin ja autophagy ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä A549-soluja. POL aloitti apoptoosia estämällä Akt-NF-KB-reitin, kun taas POL laukaisi autophagy

kautta

tukahduttaa Akt-mTOR-reitin, mikä viittaa molekyyli kytkin roolia Akt säätelyssä välillä POL aiheuttaman apoptoosin ja autophagy. Lisäksi ROS oli mukana POL inhiboivan vaikutuksen Akt ilmaisun, ja voisi siten toimia välittäjänä sekä apoptoosin ja autophagy A549-soluissa. Lisäksi POL ei osoittanut merkittävää sytotoksisuutta kohti normaalia ihmisen alkion keuhkojen fibroblastien helf soluja. Koska kasvaimen vastaisen toiminnan, POL voisi tulla voimakas syöpälääkettä tulevaisuudessa terapiassa, mikä saattaa tasoittaa tietä tutustua GNA liittyvien lektiinien tehokkaiksi lääkkeiksi syövän hoidossa.

Citation: Li C, Chen J, Lu B, Shi Z, Wang H, Zhang B, et al. (2014) Molecular Switch rooli Akt in

Kalliokielo

Lectin indusoiman apoptoosin ja Autophagy Human ei-pienisoluinen keuhkosyöpä A549 Cells. PLoS ONE 9 (7): e101526. doi: 10,1371 /journal.pone.0101526

Editor: Jin Q. Cheng, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 15 tammikuu 2014; Hyväksytty: 8 kesäkuu 2014; Julkaistu: 3. heinäkuuta 2014

Copyright: © 2014 Li et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain National Natural Science Foundation of China (nro 81373311, No. 31300674, No. 30970643, nro 81173093 ja nro J1103518), Special Nuoriso tiede ja teknologia Innovative Research Group Sichuanin maakunnassa, Kiina (No. 2011JTD0026). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Lektiinit nimetty hiilihydraatteja sitovia proteiineja, jotka laajasti olemassa eläimiä, kasveja ja mikro-organismeja, ja ne voivat sitoa hiilihydraatteja agglutinoitava soluja tai saostua polysakkaridien ja glycoconjugates [1]. Rapid edistystä on saavutettu eristämistä ja karakterisointia kasvien lektiinien, ja äskettäin luokittelu lektiinien on emended 7 perheitä 12 perheet [2] – [4].

Huomattavaa on, että syöpä liittyy ohjelmoitu solukuolemaa (PCD), joka pelaa tärkeä rooli homeostaasin säilyttäminen, solujen erilaistumista, kasvua ohjaus, solu puolustus ja jne., yhdessä tiivistys lopullinen kohtalo syöpäsolujen [5]. Yleensä on kahta päätyyppiä PCD viitaten apoptoosin ja autophagy. Autophagy on evoluutiossa säilytetyn solumekanismi puhdistumaan vahingoittuneita tai turhia makro-kompleksit ja soluelimiin eukaryoottisoluissa, mikä johtaa joko pro-säilymisen tai pro-kuolema vaikutuksia [6]. Apoptoosi, joka voidaan säätelevät lukuisat molekyyli signalointi polkuja, on pääasiassa suunnattu kasvaimen itsemurhan. Autophagy ja apoptoosin kantaa erillisiä morfologisia ominaisuuksia ja fysiologinen prosessi on kuitenkin vielä olemassa monimutkaisia ​​keskinäiset suhteet ne [7].

Kalliokielo

(Mill.) Druce, tyypillinen edustaja Liliaceae perhe, on tärkeä perinteinen kiinalainen rohdosvalmiste koska sen laaja lajikkeiden biologisesti aktiivisia yhdisteitä.

Kalliokielo

lektiini (POL), eristetty

Kalliokielo

(Mill.) Druce, on mannoosia sitova erityinen

lumikello

agglutiniini (GNA) liittyvien perhe lektiini, ja saa aikaan merkittävän kasvun estymistä vaikutuksia vastaan ​​A375-soluissa [8]. Edellinen raportti on osoittanut, että POL indusoi L929-solujen apoptoosin kautta sekä kuoleman reseptori ja mitokondrioiden polkuja sekä monistettu TNFa-indusoidun L929-solujen apoptoosin [9]. Kuitenkin myös POL voisi samanaikaisesti apoptoosin ja autophagy syöpäsoluissa ovat vielä lapsenkengissään. Ja tähän asti vain

Polygonatum cyrtonema

lektiini (PCL) voi samanaikaisesti aiheuttaa sekä apoptoosin ja autophagy ihmisen melanooman A375-solujen [10] ja L929-solujen [11]. Siksi apoptoosi- ja autophagy aiheuttavia vaikutuksia POL on tutkittava.

Materiaalit ja menetelmät

Molekyylimallinnus

kolmiulotteisen rakenteen POL rakennettiin käyttämällä SWISS -mallissa palvelin (https://swissmodel.expasy.org/) rakenteen kanssa PCL (ATE ID: 3A0E) templaattina [12], [13].

Soluviljely

keuhkojen A549 solulinjat hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, USA), kun taas normaali ihmisen alkion keuhkojen fibroblastien helf solulinjoja ostettiin solusta pankin (Chinese Academy of Sciences, Shanghai, Kiina). Ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä, A549-soluja viljeltiin RPMI-1640-alustassa (Gibco), joka sisälsi 10% FBS: ää, 100 mg /ml streptomysiiniä (Invitrogen), 100 U /ml penisilliiniä (Invitrogen), ja pidettiin 37 ° C: ssa 5% CO

2 kosteutetussa ilmakehässä. Ja ihmisalkion keuhkon fibroblastien helf soluja, käytettiin vastaavaa kontrolliryhmään, viljeltiin Dulbecco minimal essential väliaine (Gibco), joka sisälsi samoja materiaaleja.

reagenssit

POL puhdistettiin ja ylläpitää meidän lab [8]. Naudan sikiön seerumia (FBS), 3- (4,5-dimetrylthiazol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT), 3,3-diaminobentsidiinitetrahydrokloridilla (DAB), monodansylcadaverine (MDC), autophagy estäjä 3- metyyliadeniinin (3-MA), akridiini oranssi (AO), rodamiini-123 ja z-VAD-fmk ostettiin Sigma Chemical (St. Louis, MO, USA). Sytokromi

c

Apoptotic WB vasta-cocktail (ab110415) saatiin MitoSciences (Eugene, Oregon, USA). Pieni häiritsevät RNA: t (siRNA: t) vastaan ​​ihmisen Beclin1 (# 6222), LC3 (# 6212) ja ohjaamaan siRNA (# 6568) ostettiin Cell Signaling Technologies, USA.

jälkeen vasta-aineet hankittiin Santa Cruz Biotech: pro-caspase3 (# sc-7148), pro-caspase9 (# sc-56073), Bax (# sc-493), Bid (# sc-6538), Bcl-2 (# sc-492), Bcl-X

L (# sc-8392), PARP (# sc-7150), NF-KB (# sc-109), Phospho-NF-KB (Ser536) (# sc-136548) ja β-aktiini (# SC- 47778). Lisäksi vasta-aineet mukaan lukien Phospho-Beclin1 (Ser234) (ab183335), mTOR (ab2732) ja Phospho-mTOR (Ser2448) (ab109268) olivat Abcam. Vasta-aineet LC3 (mAb # 12741), Akt (pan) (mAb # 4685), Phospho-Akt (Thr308) (mAb # 2965), Phospho-Akt (Ser473) (mAb # 4060), Phospho-p70S6K (Thr389) ( mAb # 9234) ja Phospho-4EBP1 (Thr37 /46) (mAb # 2855) ostettiin Cell Signaling Technologies, USA. Proteiinit saatiin näkyviin käyttämällä anti-kaniini tai anti-hiiri-IgG, joka oli konjugoitu peroksidaasiin (HRP) ja 3,3-diaminobentsidiinitetrahydrokloridilla (DAB), kun HRP-substraattia.

konstitutiivisesti aktivoitua Akt (Myr-Akt, Addgene plasmidi 9008 ), NF-KB: n (T7-RelA, Addgene plasmidi 23251), mTOR (Flag-mTOR, Addgene plasmidi 26603), tyhjän vektorin (pcDNA3, Addgene plasmid10792) ostettiin Addgene.

kasvun estäminen määrityksessä

A549-soluja ympättiin 96-kuoppalevyille ja niitä viljeltiin ilmoitetun ajan, ja sytotoksisia vaikutuksia eri pitoisuuden POL suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [14]. Absorbanssi 570 nm: ssä mitattiin spektrofotometrillä (Model 3550 Microplate Reader, Bio-Rad).

Solujen elävyys (%) = (OD

570 nm (lääke) /OD

570 nm (kontrolli )) x 100%.

mannoosi inhibitiotesti

MTT-määritystä määritettiin kuten edellä on mainittu, paitsi että lektiinit esi-inkuboitiin 37 ° C: ssa 30 min eri mannoosia, kuten mannoosin α (1,3), mannoosi α (1,6) ja mannoosi α (1,3:1,6), joka voi kokonaan estää hemagglutinoiva aktiivisuus eri pitoisuuksilla POL.

Apoptosis määritys

A549 ja helf soluja käsiteltiin PBS: lla ja 23 ug /ml POL 12 h, 24 h, 36 h ja 48 h. Solujen morfologia kuvioitiin faasikontrastimikroskopiassa (Leica, Wetzlar, Saksa) sekä fluoresenssimikroskopian (Olympus, Tokio, Japani) ja Hoechst 33342 värjäystä. Sitten yhteensä 6 x 10

5 A549-soluja /kuoppa maljattiin 6-kuoppaisille levyille ja niitä inkuboitiin 24 h, ja käsiteltiin PBS: ää tai 23 ug /ml POL vielä 12 h, 24 h, 36 h tai 48 h inkuboinnin jälkeen. Kerätyt solut analysoitiin virtaussytometrialla määrityksellä kuten edellä on kuvattu [15]. Jotta edelleen luokitella varhain ja myöhään apoptoosin POL-käsiteltyjen A549-solut, anneksiini V-FITC /PI kaksinkertainen värjäys Analyysi suoritettiin anneksiini V-fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) apoptoosin havaitseminen pakki mukaan valmistajan ohjeiden (BD Pharmingen, San Diego , CA, USA).

Autophagy määrityksessä

inkuboinnin jälkeen 23 ug /ml POL varten osoitetun ajan, A549 ja helf soluja viljeltiin 0,05 mM MDC 37 ° C: ssa 60 min. Fluoresenssin voimakkuus solujen analysoitiin virtaussytometrialla. Lisäksi, A549-soluja inkuboitiin PBS: ää tai 23 ug /ml POL varten ilmoitettu aika värjättiin akridiinioranssilla (10 ng /ml) 15 minuutin ajan ja altistettiin virtaussytometrialla. Solut vastaavasti transfektoitu Beclin1 siRNA, LC3 siRNA ja ohjaus siRNA 33 nM käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen) mukaan valmistajan ohjeiden. Transfektoituja soluja käytettiin seuraavissa kokeissa 24 tuntia myöhemmin.

Caspase määrityksessä

Apoptoosi arvioitiin mittaamalla kaspaasi-3 käyttämällä kaspaasi-3-aktiivisuus kit (Beyotime Biotekniikan instituutti Haimen, Kiina) seuraten valmistajan ohjeita.

havaitseminen mitokondrion kalvon potentiaalia

mitokondrioiden kalvojännite mitattiin käyttäen fluoresoivaa väriainetta rodamiini-123, kuten aiemmin on kuvattu [15]. Fluoresenssin voimakkuus A549 haittasi 23 ug /ml POL 12 h, 24 h, 36 h ja 48 h analysoitiin virtaussytometrialla.

määritys solunsisäisen ROS

käsittelyn jälkeen eri pitoisuus POL varten osoitetun ajanjaksojen, A549-soluja inkuboitiin 10 uM 2 ’, 7’-dikloorifluoresiinidiasetaattia (DCFH-DA) 60 min 37 ° C: ssa. Fluoresenssin voimakkuus A549-solut mitattiin virtaussytometrialla viritysaallonpituudella 480 nm ja emissio aallonpituudella 525 nm. Solunsisäinen GSH sisältö ja GPX entsyymin aktiivisuus mitattiin mukaan valmistajan ohjeiden.

transfektoinneilla

A549 Solut maljattiin 60 mm: n annoksia RPMI 1640, joka sisälsi 10% FBS: ää ja 1% penisilliini-streptomysiiniä saavutettu tiheys 1 x 10

6 solua /malja. Sitten A549-soluja jatkuvasti viljelty PRMi 1640 ilman 10% FBS: ää ja 1% penisilliini-streptomysiiniä toiset 2 tuntia. Jotta muodostuu plasmidi-Lipofectamine LTX monimutkainen, plasmidit sekoitettiin 25X laimentimen Lipofectamine LTX, ja inkuboitiin 20 min huoneen lämpötilassa. Sitten Transfektiot vastaavasti suoritettiin OptiMEMiin vähensi seerumin väliaineessa (Invitrogen), joka sisälsi 1 mg /ml DNA: ta, 0,1% PLUS-reagenssia ja 0,3% Lipofectamine LTX transfektioreagenssia, ja lisättiin väliaine plasmidin 60 mm astiat vielä 48 h kulttuuri A549-soluja. Lopuksi transfektiotehokkuus havaittiin Western blot analyysillä.

Western blot-analyysi

A549-soluja käsiteltiin 23 ug /ml POL varten osoitetun ajan, ja sen jälkeen molemmat kiinnittyneet sekä kelluvat solut kerättiin. Western blot-analyysi solulysaateista suoritettiin, kuten aiemmin mainittiin, [16] [17].

tilastollinen analyysi tietojen

Kaikki tiedot ilmaistiin keskiarvona ± SEM vähintään kolmen erillisen kokeen . Tilastolliset vertailut tehtiin kaksisuuntainen ANOVA ja yksisuuntainen ANOVA Bonferronin post hoc testi. A s value≤0.05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

Molecular mallintaminen POL

lektiinien GNA liittyvistä perhe on eri aminohapposekvenssin perustuslaki, mutta ne kaikki näytteillä samanlainen kolmiulotteinen rakenne. GNA liittyvät perheen lektiinien kantaa tiukat mannoosia sitova aktiivisuus, ja niitä ylläpidetään aminohappo motiivi ”QXDXNXVXY” näyttelee tärkeä rooli mannoosi tunnustusta. POL hallussaan kolme säilyneitä ”QXDXNXVXY” aliverkkotunnuksia ja siksi, POL oli tiukka mannoosia sitova lektiini. Kuten on esitetty kuviossa. 1A, kolmiulotteinen rakenne POL oli rakennettu, ja monomeeri POL osoitti β-tynnyri, joka käsittää kolme alidomainit (I, II, III), kukin aliverkkotunnus koostuu kolmesta tai neljästä osa-antiparallel β arkin vuorovaikutuksessa by Ω silmukan.

(A) molekyylirakenne POL monomeerin. (B) paksusuolikarsinooma Caco-2-solut, kohdunkaulan karsinooma HeLa-soluja, ei-pienisoluinen keuhkosyöpä A549-soluja, maksasyövän HepG

2 ja 7721-solujen, rintasyöpä MCF-7-soluissa, melanooma A375-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla POL 24 tuntia, ja IC

50-arvot kvantitoitiin MTT: llä (keskiarvo ± SEM,

n

= 3). (C) A549-soluja käsiteltiin eri pitoisuus POL, ja sitten solujen elinkykyisyys määritettiin MTT-määrityksellä ilmoitettuina ajankohtina (keskiarvo ± SEM,

n

= 3). (D) eri pitoisuus POL esi-inkuboitiin 37 ° C: ssa 30 min mannoosin (1-3), mannoosi (1-6) ja mannoosia (1-3, 1-6), ja käsiteltiin sitten A549-solujen 24 h. Solu estävä suhde mitattiin MTT: llä (keskiarvo ± SEM,

n

= 3).

sytotoksiset vaikutukset POL A549-soluissa

kasvua estävä vaikutukset POL arvioitiin MTT: llä on ihmisen syöpäsoluja, mukaan lukien paksusuolen syöpä Caco-2-solut, kohdunkaulan karsinooma HeLa-soluja, ei-pienisoluinen keuhkosyöpä A549-soluja, maksasyövän HepG

2 ja 7721-solujen, rintasyöpä MCF- 7-soluissa, melanooma A375-soluja, ja IC

50-arvot olivat 47 ug /ml, 30 ug /ml, 23 ug /ml, 42 ug /ml, 38 ug /ml, 50 ug /ml ja 26 ug /ml , vastaavasti (Fig. 1 B). Tämä tulos osoitti, että POL oli herkempi ei-pienisoluinen keuhkosyöpä A549-soluja, ja siten, A549-solut valittiin lisätutkimusta.

POL aiheuttama A549 solukuolemaa annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla, ja 0 ug /ml 100 ug /ml POL kohdistuu voimakkaita inhiboivia vaikutuksia kasvuun A549-solut (Fig. 1 C). 24 tunnin inkuboinnin jälkeen 23 ug /ml POL, inhibointimäärän oli lähes 50%.

Korrelaatio sokeria sitova ja antiproliferatiivinen aktiivisuus POL

mannoosi Inhibiitiotesti määrittämiseksi suoritettiin suhde sokerin sitova aktiivisuus POL ja sen anti-proliferatiivista omaisuutta. Eri pitoisuus POL esi-inkuboitiin mannoosin α (1,3), mannoosi α (1,6) ja mannoosi α (1,3:1,6) 30 minuuttia, vastaavasti. Johtuen mannoosia sitova aktiivisuus POL, kaikki kolme mannoosia estivät täysin hemagglutinoiva aktiivisuus POL. Kuten on esitetty kuviossa. 1D, kasvua estäviä vaikutuksia eri pitoisuuden POL menetettiin vastaavalla tasolla menettää mannoosi-sitoutumisaktiivisuus, mikä osoittaa, että voi olla läheinen yhteys hemagglutinoivat aktiivisuutta ja antiproliferatiivista omaisuutta POL.

POL indusoi apoptoosia A549-soluja

merkittyjen apoptoottisten morfologisia muutoksia kalvon rakkuloituminen, solun tilavuuden pienentämiseksi ja pyöristys, havaittiin 23 ug /ml POL-käsiteltyjen A549-solut faasikontrastimikroskopiassa (Fig. 2A). Lisäksi huomattava DNA-fragmentaation ytimet havaittiin POL-indusoidun A549-soluja, kun taas PBS: llä hoidetusta kontrolliryhmästä oli normaalia, pyöreä ja homogeenisesti värjätty ytimet (Fig. 2B). Kuitenkin 23 ug /ml POL ei johtanut ilmeinen apoptoottinen morfologia ei-syöpä helf soluissa, sen jälkeen 24 h tai 48 h hoidon (Fig. 2C ja Fig. 2D). Nämä tulokset viittaavat siihen, POL voisi indusoivat selektiivisesti A549-soluja apoptoosin, mutta ei laukaista apoptoosin normaalien helf soluja. Lisäksi, kuten on esitetty kuviossa. 2E, 23 ug /ml POL selvästi johtanut parantamiseksi Sub-G

1 faagi osuus A549 solujen ajasta riippuva tavalla (b: 27,34 ± 4,1%, c: 39.27 ± 5,8%), mikä osoittaa, että POL aiheuttama apoptoosin A549-soluja. Lisäksi anneksiini V-FITC ja PI kaksinkertainen värjäys suoritettiin luokitella keskuudessa elävien solujen (anneksiini V- /PI-), varhainen apoptoottinen (anneksiini V + /PI), myöhäinen apoptoottiset (anneksiini V + /PI +) ja nekroottinen soluja (anneksiini V – /PI +). Kuten on esitetty kuviossa. 2F, kun 23 ug /ml POL hoitoa, prosenttiosuus elossa soluja alennetaan asteittain (a: 98,25 ± 1,3%, b: 74,63 ± 4,7%, c: 55,71 ± 3,9%), kun taas suhde alussa (b: 15,34 ± 2,6%, c: 23,75 ± 2,8%) ja myöhäiset (b: 13,94 ± 3,6%, c: 22,14 ± 4,5%) apoptoottisia soluja parannettu lisäämällä ajan.

(A) A549-soluja käsiteltiin PBS: llä (24 h) tai 23 ug /ml POL varten osoitetun ajan, ja morfologisia lajikkeet havaittiin faasikontrastimikroskopialla ja (B) fluoresenssimikroskopialla (200 x). (C) jälkeen, käsiteltiin helf solut PBS: llä (24 h) tai 23 ug /ml POL varten osoitetun ajan, morfologisia lajikkeet havaittiin faasikontrastimikroskopialla ja (D) fluoresenssimikroskopialla (200 x). (E) eri vaiheissa osuus A549-soluja haittasi 23 ug /ml POL 24 h tai 48 h mitattiin virtaussytometrialla. Kontrolliryhmä käsiteltiin PBS: llä 24 tuntia. (F) A549-solut altistettiin 23 ug /ml POL 24 h tai 48 h, suhteet varhaisen apoptoosin ja myöhäisen apoptoosin mitattiin virtaussytometrialla käyttämällä anneksiini V-FITC /PI kaksinkertainen värjäys määrityksessä. Kontrolliryhmä käsiteltiin PBS: llä 24 tunnin ajan.

POL laukaisee autophagy A549-soluissa

Jotta muodostumisen havaitsemiseksi autophagic Vakuoleissa MDC fluoresoiva intensiteetti 23 ug /ml POL käsiteltyä A549 ja helf soluja 24 h tai 48 h analysoitiin virtaussytometrialla. Kuten on esitetty kuviossa. 3A, autophagic vacuoles muodostettiin A549-soluja, jotka oli esillä lisääntyneet MDC fluoresenssin voimakkuus, että niissä on autophagic solukuoleman. Kuitenkin, kuviossa. 3B, MDC fluoresoiva intensiteetti helf käsiteltyjen solujen POL ei lisääntynyt eikä kuluttua 24 h eikä 48 tuntia, mikä viittaa autophagic vacuoles ei muodostunut POL aiheuttama helf soluissa. Olemme voi sisältyä, että POL voi indusoivat selektiivisesti autophagic solukuoleman A549-soluja, mutta ei helf soluissa. Edelleen käyttämällä akridiinioranssivärjäyksellä, muodostuminen happamien vesicular soluelimiin (AVO) in POL-laukaisi A549-solut oli osoitettu (Fig. 3C). Koska Beclin1 parantaminen ja transformaatio LC3I jotta LC3II olivat ominaisuuksia autophagy, ilmaukset Beclin1 ja LC3 in POL aiheuttama A549-solut havaittiin. Kuten on esitetty kuviossa. 3D, POL indusoi ajasta riippuva parantaminen Beclin 1 taso ja niiden kertymisestä LC3-II A549-solut. Myöhemmin ilmaukset Beclin1 ja LC3 tippuu alas käyttämällä erityisiä siRNA (Fig. 3E). Transfektio Beclin1 tai LC3 siRNA vähentynyt POL aiheuttama solujen kasvun esto (Fig. 3F). Kaikki nämä tulokset osoittavat, että POL indusoi autophagy A549-soluissa.

A549-soluja (A) ja helf soluja (B) käsiteltiin PBS: llä (24 h) tai 23 ug /ml POL varten osoitetun ajan, ja MDC fluoresoiva intensiteetti analysoitiin virtaussytometrialla. (C) A549-soluja käsiteltiin PBS: llä (24 h) tai 23 ug /ml POL varten osoitetun ajan, ja akridiinioranssi fluoresenssin voimakkuus mitattiin virtaussytometrialla. (D) A549-soluja käsiteltiin 23 ug /ml POL varten osoitetun ajan, jonka jälkeen Western blot -analyysi havaitsemiseksi fosforyloidun-Beclin1 ja LC3 tasolla. β-aktiini käytettiin yhtä latauskontrollina. (E) A549-soluja transfektoitiin Beclin1, LC3 tai valvoa siRNA 24 h Beclin1 ja LC3 tasot tutkittiin Western blot -analyysillä. (F) A549-soluja transfektoitiin Beclin1, LC3 tai valvoa siRNA 24 h, mitä seurasi stimulaatio kanssa tai ilman 23 ug /ml POL 24 tuntia, solun kasvun inhibitio suhde mitattiin MTT-määrityksellä (keskiarvo ± SEM,

n

= 3).

POL indusoi kaspaasi-riippuvaista apoptoosia in A549-soluja

Kuten kuviossa. 4A, kun autophagic estäjä 3-MA hoito, 23 ug /ml POL merkittävästi parannettu kaspaasi-3-aktiivisuus on ajasta riippuva tavalla, mikä osoittaa, POL-indusoitua apoptoosia tapahtuu aktivoitumisen kautta yhteisen apoptoottisten pesänselvittäjät, kuten kaspaasi-3. Lisäksi Western blot analyysit jälkeen autophagy estyi osoittivat, että hoidon jälkeen 23 ug /ml POL varten ilmoitettuun aikaan kaspaasi-3 ja -9 katkaistiin, koska prokaspaasi-3 ja -9 laskivat taas lohkaistaan ​​kaspaasi-3 ja -9 olivat lisääntynyt (Fig. 4B). Myös ylössäätöä proapoptootti- Bax ja Bid proteiineja sekä alas-säätely anti-apoptoottisten Bcl-2 ja Bcl-X

L-proteiineja havaittiin jälkeen POL hoidon. Lisäksi 23 ug /ml POL johti pilkkomisen PARP peräisin 116 kDa kaistalta 89 kDa fragmentti yhä ajan (Fig. 4B b), ja sytokromi

c

vapautettiin mitokondrioiden solulimaan jälkeen POL hoidon (Fig. 4B c). Kuten on esitetty kuviossa. 4C ja kuvio. 4D, jolloin autophagy vaimeni 3-MA, POL vähensi rodamiini 123 fluoresenssin intensiteetti on ajasta riippuva tavalla. Lisäksi pilkkominen kaspaasi-3 ja -9 voitaisiin pelastaa läsnä ollessa 10 uM z-VAD-fmk: in POL-indusoidun A549-solut (Fig. 4E). Ja Sub-G

1 solujen osuus analyysi ja anneksiini V /PI kaksinkertainen värjäys osoitettiin myös, että kaspaasiestäjä z-VAD-fmk voisi suojata A549 soluja apoptoottista solukuolemaa (Fig. 4F ja Fig. 4G). Kaikki nämä tulokset osoittavat selvästi, että POL aiheuttaman apoptoosin kautta mitokondrioiden välittämää väylän A549-solut.

(A) Vaikutukset 23 ug /ml POL on kaspaasi-3 aktivaatio lisääntyy ajan (keskiarvo ± SEM,

n

= 3) (* p 0,05

vs

. 0 h ryhmä). (B) 23 ng /ml POL indusoi pilkkominen kaspaasi-3, kaspaasi-9 (a). POL johti pilkkominen PARP, ylössäätöä proapoptootti- Bax ja Bid sekä alas-säätely anti-apoptoottisten Bcl-2 ja Bcl-X

L kanssa viljelemisen aika (b). Solulysaatit fraktioitiin eristää soluliman ja raakaöljyn mitokondrioita, ja läsnäolo sytokromi

c

soluliman ja mitokondrioiden jakeet arvioitiin WB analyysi käyttämällä ApoTrack vasta-cocktail. β-Actin käytettiin sytosoliin yhtä suuri kuormituksen valvonta, kun taas prohibitin käytettiin mitokondrioita loading ohjaus (c). (C) vaikutus 23 ug /ml POL eheyden mitokondrioiden kalvot mitattiin rodamiini 123 värjäystä, ja fluoresenssin intensiteetti analysoitiin virtaussytometrialla. (D) lajikkeet mitokondrioiden kalvot mahdollisten olivat edelleen esitetty pylväsdiagrammi (keskiarvo ± SEM,

n

= 3) (** p 0,001

vs

. Vertailuryhmä, ns: no merkittäviä

vs

. kontrolliryhmä). (E) Western blot-analyysi pro-kaspaasi 3, pilkottiin kaspaasi 3, pro-caspase9 ja halkaistut caspase9 tasot A549-soluja käsiteltiin 23 ug /ml joko yksin tai yhdessä 10 uM: kaspaasi-inhibiittori z-VAD-fmk: ssa 24 tuntia. (F) A549-soluja käsiteltiin 23 ug /ml POL yksin tai yhdessä 10 uM: kaspaasi-inhibiittori z-VAD-fmk: ssa 24 tuntia ja värjättiin propidiumjodidilla (PI), kvanti- PI-värjäyksellä tiedot esitetään prosenttiosuudet solujen in SubG

1 vaihe. (G) vaikutus kaspaasi 23 ug /ml POL aiheuttama SubG

1 vaihe suhde oli edustettuna bar kaavio (keskiarvo ± SEM,

n

= 3) (## p 0,001

vs.

POL ryhmä, ns: ei merkittävää

vs.

POL ryhmä).

esto autophagy heikentää osittain POL indusoiman apoptoosin

kuviossa. 5A, sen jälkeen, kun autophagy tukahdutettiin, POL-indusoidun solun kasvun estymistä oli merkittävästi vähentynyt. Inhibitio autophagy jonka 3mA tai knockdovvn Beclin1 esikäsittelemällä Beclin1 siRNA (Fig. 5B) laski suhde MDC-positiivisten solujen (Fig. 5C a), joka osoittaa, että autophagy tukahdutettiin 3mA ja Beclin1 siRNA. Lisäksi painamalla POL-indusoidun autophagy inhiboi POL-indusoitua apoptoosia A549-soluja, jotka olivat esillä pelkistämällä osa-G

1 faagi-DNA-pitoisuus (Fig. 5C b), sekä varhaisen ja myöhäisen apoptoottiset osa (kuvio . 5C c). Tasaisen, tukahduttaminen autophagy joko 3mA tai Beclin1 siRNA johti myös vähenevän PARP pilkkominen ja LC3-II ilmentymistä POL käsiteltyjen A549-solut (Fig. 5D ja Fig. 5E). Kaikki nämä tulokset osoittivat, että estäminen autophagy heikentää osittain POL aiheuttamaa apoptoosia A549- soluissa.

(A) A549-soluja esikäsiteltiin 2 mM 3mA 1 h ennen hallinnon 23 ug /ml POL varten ilmoitettuina ajankohtina ja solun inhiboiva suhde mitattiin MTT-määrityksellä. Kontrolliryhmä käsiteltiin PBS: llä. (Keskiarvo ± SEM,

n

= 3) (* p 0,05, ** p 0,001

vs.

Vertailuryhmä, ns: ei merkittävää

vs

. Ohjaus ryhmä, # p 0,05, ## p 0,001

vs

. POL ryhmä). (B) A549-soluja transfektoitiin ohjaus siRNA ja erityisiä Beclin1 siRNA 24 tuntia, Beclin1 taso tutkittiin Western blot -analyysillä. (C) A549-soluja esikäsiteltiin 2 mM 3mA tai transfektoitu erityisten Beclin1 siRNA antamista edeltävä 23 ug /ml POL 24 tuntia, ja MDC fluoresoiva intensiteetti (a), SubG

1 faagia solusuhteen (b ) ja varhainen sekä myöhään apoptoosin (c) analysoitiin virtaussytometrialla. Kontrolliryhmä käsiteltiin PBS: llä 24 tuntia. Tiedot olivat edustettuina bar kaavio. (Keskiarvo ± SEM,

n

= 3) (* p 0,05, ** p 0,001

vs.

Vertailuryhmä, ns: ei merkittävää

vs.

Ohjaus ryhmä, # p 0,05, ## p 0,001

vs.

POL ryhmä). (D) katkotun PARP ja LC3-II ilmaisuja A549-soluja käsiteltiin 23 ug /ml POL 24 h puuttuessa tai läsnä ollessa 3mA (2 mM) mitattiin. Edustaja luvut on esitetty. (E) A549-solut valikoivasti transfektoitu ohjaus siRNA tai erityisiä Beclin1 siRNA 24 h ennen 23 ug /ml POL hoitoa vielä 24 tuntia, ja lohkaisu PARP sekä ilmaus LC3II mitattiin.

POL laukaisee apoptoosin kautta tukahduttaa Akt-NF-KB-reitin ja aloittaa autophagy

kautta

estämään AKT-mTOR-reitin

Western blot-analyysit osoittivat, että hoito A549-solujen kanssa 23 ug /ml POL varten ilmoitettu aika alensivat ilmauksia fosforyloidun-NF-KB (p65) (Ser536), fosforyloitu-Akt (Ser473), fosforyloitu-Akt (Thr308), fosforyloitu-mTOR (Ser2448), fosforyloitu-70S6K (Thr389) ja fosforyloitua-4E -BP1 (Thr37 /46) (Fig. 6A). Ja loppupään substraattien mTORC1, p70S6K (70 kDa ribosomaalinen S6-kinaasi) ja 4E-BP1, myös tehokkaasti defosforyloidaan POL käsittely A549-solut (Fig. 6A). Sen vahvistamiseksi signalointi väylän POL-käsiteltyjen A549-solut, käytimme geneettistä lähestymistapaa vastaavasti yli-express Akt, NF-KB ja mTOR (Fig. 6B) in POL-käsiteltyjen A549-solut. Kuten on esitetty kuviossa. 6B, oli voimakas aktivaatio Akt, NF-KB: n ja mTOR transfektoiduissa A549-soluja verrattuna vektori transfektoitiin niistä, vahvistaa transfektion tehokkuutta. Transfektio Myr-Akt A549-soluja (yli-ilmentyminen Akt) päinvastaiseksi POL aiheuttama väheneminen fosforyloitua-NF-KB (p65) (Ser536) ja fosforyloitua-mTOR (Ser2448) (Fig. 6B). Kuitenkin transfektio T7-RelA (yliekspressio NF-KB) tai Flag-mTOR (yliekspressio mTOR) ei aiheuttanut mitään päinvastaisessa proteiinien (Fig. 6B), mikä osoittaa, että Akt voisi olla ylävirtaan NF-KB ja mTOR in POL-käsiteltyjen A549-solut.

(A) jälkeen käsitelty 23 ug /ml POL varten ilmoitettuun aikaan, tasot fosforyloitua-Akt, Akt, fosforyloitu-NF-KB (p65) NF-KB (p65), fosforyloitu-mTOR, mTOR, fosforyloitu-p70S6K ja fosforyloitu-4E-BP1 havaittiin. β-aktiini käytettiin yhtä latauskontrollina. (B) A549-solut transfektoitiin tyhjällä vektorilla, Myr-Akt (aktivoitu), T7-RelA (aktivoitu) ja Flag-mTOR (aktivoitu), ja sitä käsiteltiin 23 ug /ml POL 0 h tai 24 h. Tasot fosforyloitua-Akt, Akt, fosforyloitu-NF-KB (p65), NF-KB (p65), fosforyloitu-mTOR ja mTOR mitattiin. β-aktiini käytettiin yhtä latauskontrollina. (C) jatkuva aktivointi Akt, NF-KB: n ja mTOR prio 23 ug /ml POL hoitoa 24 h, morfologisia lajikkeet havaittiin faasikontrastimikroskopialla. Kontrolliryhmä käsiteltiin PBS: llä 24 tuntia. (D) Kun jatkuva aktivointi Akt, NF-KB: n ja mTOR, 23 ug /ml POL käsiteltiin A549-soluja 24 tunnin ajan, SubG

1 faagi-suhde (a), sekä varhaiset myöhään apoptoosin suhde (b ), MDC fluoresoiva intensiteetti (c), ja AVO fluoresenssin voimakkuus (d) analysoitiin virtaussytometrialla. Kontrolliryhmä käsiteltiin PBS: llä 24 tuntia. Tiedot olivat edustettuina bar kaavio. (Keskiarvo ± SEM,

n

= 3). (* P 0,05, ** p 0,001

vs

. Vertailuryhmä, ns: ei merkittävää

vs.

POL ryhmä, # p 0,05, ## p 0,001

vs.

POL ryhmä).

edelleen varmistamiseksi, ovatko nämä proteiinit osallistui POL aiheuttaman apoptoosin tai autophagy, morfologia havaitseminen ja virtaussytometria määritys sovellettiin. Kuten on esitetty kuviossa. 6C, yli-ilmentyminen Akt päinvastaiseksi POL-solukuolema, kun taas yli-ilmentyminen NF-KB: n ja mTOR vielä osittain yllä POL-solukuolema. On osoitettu, että Akt voisi olla vastuussa POL aiheuttaman sekä apoptoosin ja autophagy A549-soluissa. Lisäksi Akt yli-ilmentyminen johti vähenemiseen SubG

1 osa (Fig. 6D a), varhainen apoptoottinen (anneksiini V + /PI) ja myöhäiset apoptoottiset (anneksiini V + /PI +) solujen (Fig. 6D b), MDC fluoresenssin voimakkuus (Fig. 6D c) sekä hapan vesicular organelles (AVO) muodostuminen (Fig. 6D d). Nämä tulokset osoittivat, että yli-ilmentyminen Akt voisi kääntää POL-indusoitua apoptoosia ja autophagy samanaikaisesti, mikä osoittaa, Akt-proteiinia voi sisältyä sekä POL-indusoitua apoptoosia ja autophagy. Kuitenkin yli-ilmentyminen NF-KB johtanut ainoastaan ​​tukahduttaminen apoptoottisten ominaisuuksia, kuten merkittävästi vähentynyt osia SubG

1 (Fig. 6D a) sekä varhainen ja myöhäinen apoptoottisten solujen (Fig. 6D b). Vaikka yli-ilmentäminen mTOR peruutetaan POL-indusoidun autophagy, jolle on ominaista alentunut fluoresenssin voimakkuus MDC: tä (Fig. 6D c) ja AO (Fig. 6D d). Yhdessä voimme päätellä, että POL aiheuttaman apoptoosin kautta tukahduttaa Akt-NF-KB-reitin, kun aloitetaan autophagy

kautta

estämään AKT-mTOR kautta. Akt ajaa vaihtaa autophagy ja apoptoosin POL-käsiteltyjen A549-solut.

POL aiheuttama molekyyli kytkin rooli Akt on ROS-riippuvainen

ROS tasot todettiin käyttäen ROS-havaitsemaan fluoresoivaa väriainetta DCFH -DA. On osoitettu, että ROS kertymistä parannettiin POL aiheuttaman A549-solut annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla (Kuva. 7A). Lisäksi inkubointi A549-solujen kanssa 23 ug /ml POL johti vähentämiseen GSH sisällön ja GPX entsyymiaktiivisuuden ajasta riippuva tavalla, mikä viittaa siihen, että POL kumottu GSH antioksidanttisysteemiä ja lopulta johtivat massiivinen ROS kertymistä A549-soluja (kuvio . 7B). Ja tämä 23 ug /ml POL-indusoidun ROS voitiin estää esikäsittelemällä ROS puhdistusainetta, NAC (Fig. 7C).