Krooninen sairaus

tiivistelmä

NSCLC (ei-pienisoluinen keuhkosyöpä) usein esiintyy vastustuskykyä paklitakselihoidolla. Tunnistaminen elementit säätelevä paklitakseli vaste etenee pyrkimyksiä voittaa tällaiset vastarinnan NSCLC terapiassa. Käyttämällä

in vitro

lähestymistapoja, olemme osoittaneet, että yli-ilmentyminen mikroRNA miR-337-3p herkistää NCI-H1155-solujen paklitakseli, ja että miR-337-3p jäljittelevä on yleinen vaikutus paklitakselin vasteen NSCLC solulinjoja, jotka voivat tarjota käyttöön uusi adjuvantti strategia paklitakseli keuhkosyöpään. Yhdistämällä

in vitro

ja

in silico

lähestymistapoja tunnistimme

STST3

ja

RAP1A

suorina tavoitteita, jotka välittävät vaikutus miR-337- 3p paklitakselia herkkyys. Lisätutkimukset osoittivat, että miR-337-3p matkivat myös herkistää soluja doketakselille, toisen jäsenen taksaaniperheen, ja että STAT3 tasot ovat korreloi merkitsevästi taksaania vastarintaa keuhkosyövän solulinjoissa, mikä viittaa siihen, että endogeeninen STST3 lauseke on määräävä luontainen taksaanin resistenssi keuhkosyöpä. Koska on todettu, miR-337-3p moduloijaksi soluvastetta taksaaneja, ja

STST3

ja

RAP1A

sääntelyn tavoitteita, jotka välittävät tätä vastausta, määrittelee uusi sääntely koulutusjakson moduloiva paklitakseli herkkyys keuhkojen syöpäsoluja, jotka voivat tarjota uusia adjuvanttia strategioita yhdessä paklitakselin hoidossa keuhkosyövän ja voivat tarjota myös biomarkkereita ennustamiseen paklitakselin vasteen NSCLC.

Citation: Du L, Subauste MC, DeSevo C, Zhao Z, Baker M, Borkowski R, et ai. (2012) miR-337-3p ja sen tavoitteet

STST3

ja

RAP1A

moduloida Taksaania Herkkyys Non-Small Cell keuhkosyövässä. PLoS ONE 7 (6): e39167. doi: 10,1371 /journal.pone.0039167

Editor: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 06 helmikuu 2012; Hyväksytty: 17 toukokuu 2012; Julkaistu: 18 kesäkuu 2012

Copyright: © 2012 Du et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tuettu osittain Keuhkosyöpä SPORE P50 CA70907 (JD Minna), R01 CA129632 (A. Pertsemlidis) National Cancer Institute, ja Academic Excellence Grant EDUD-7824-021007-US (A. Pertsemlidis) Sun Microsystems. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Suurteholaskenta laitteisto saatiin Academic Excellence Grant Sun Microsystemsin. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Paklitakseli on mikrotubulia kohdistamisaineena alunperin eristettiin havupuu

Taxus brevifolia

– marjakuusi puu on pitkä historia lääkkeiden käyttötarkoituksia [1] – ja sitä käytetään laajasti hoidettaessa ihmisen syöpiä, mukaan lukien keuhkosyöpä. Sillä NSCLC, vastustuskykyä paklitakseli on yhteinen, jossa vastausprosentit vaihtelivat 21%: sta 24% [2], [3]. Mekanismit tällaisten vastus sisältävät yli-ilmentyminen P-glykoproteiinin, muutoksia tubuliinia koostumuksessa, ja mutaatiot β-tubuliinia [4], [5], [6], [7]. Tuore tutkimus osoitti, että suuri joukko proteiinia koodaavan kuuluvien geenien monenlaisia ​​toiminnallisia luokkia on mahdollisesti mukana moduloinnissa paklitakselin vastarintaa syövän hoidossa [8]. Tunnistaminen sääntelymekanismeissa ilmaisun keskeisten geenien paklitakselin vastus etenee pyrkimyksiä voittaa tällaiset vastus hoidossa keuhkosyövän.

Olemme kiinnostuneita mahdolliset osallistumista MikroRNA (miRNA) moduloinnissa paklitakselin vaste keuhkosyövän hoitoon. miRNA ovat lyhyitä, 19-23 nukleotidin RNA: t löytyy useita organismeja, jotka säätelevät geeniekspressiota pitkälti vähenevän kohde RNA: iden [9], [10] ja on osoitettu tärkeä rooli säätelyssä monenlaisia ​​patologisia prosesseja, mukaan lukien syöpä synnyssä. miRNA tasoja voidaan helposti manipuloida käyttämällä synteettisiä RNA-molekyylejä. Kemiallisesti stabiloitu, yksijuosteinen RNA-molekyyli, joka on komplementaarinen kohde-miRNA toimii estäjänä ja vähentää endogeenisten tasojen miRNA. Toisaalta, kaksijuosteinen RNA-molekyyli, jossa toinen säie on sekvenssiltään identtinen kypsän miRNA toimii matkivat luonnollisesti esiintyvän miRNA ja lisää sen solun ekspressiotasoja. Useat tutkimukset ovat tutkineet terapeuttiset vaikutukset miRNA matkii ja estäjien ja osoittanut omaavansa näiden luokkien oligonukleotidien terapeuttisina aineina [11], [12], [13], [14], [15], [16].

HSA-miR-337 (miR-337) on ihmisen miRNA lokuksen sijaitsee kromosomissa 14q32.2. miR-337-3p on erittäin ilmentyy normaaleissa kuolemattomaksi sikiön keuhkojen fibroblastit (IMR-90), ja havaittavissa kuolemattomiksi ihmisen keuhkoputken epiteelisolut (HBECs). Ilmaisu Mir-337-3p keuhkosyövän linjat on kuitenkin yleensä pienempi kuin normaalin keuhkojen epiteelin solulinjoissa (kuvio S1). Target ennuste osoittaa, että miR-337-3p mahdollisesti säätelee useiden geenien ekspressiota, jotka on tuumorigeneesiin. Olemme havainneet, että miR-337-3p herkistää keuhkosyövän soluja paklitakselihoidolla, mutta yllättäen, ei merkittävästi vaikuta solujen elinkelpoisuuteen yksin. Olemme edelleen käyttää

in vitro

ja

in silico

lähestymistapoja määritellä kohdistu suoraa miR-337-3p jotka välittävät sen vaikutus paklitakselia herkkyys. Olemme myös tutkineet mahdollisia merkitystä miR-337-3p matkivat ja sen tavoitteita määritettäessä paklitakselin herkkyyden suuressa paneelissa NSCLC solulinjojen, ja alustavasti tutkittu mahdollisuuksia miR-337-3p matkivat adjuvanttina paklitakselihoidolla

in vitro

NSCLC solulinjoissa.

Materiaalit ja menetelmät

solulinjat

solulinjat tässä tutkimuksessa käytetyt saatiin Hamon Center for Therapeutic Oncology Research at UT Southwestern Medical Center. Lines alkaa ”NCI-H” perustettiin National Cancer Institute [17], [18]. Lines alkaa ”HCC” ja HBECs vahvistettiin Hamon Center for Therapeutic Oncology Research UT Southwestern Medical Center [19]. Kaikki keuhkosyövän solulinjat kasvatettiin RPMI-1640-alustassa (Life Technologies, Carlsbad, CA), johon oli lisätty 5% naudan sikiön seerumia (Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA). HBECs kasvatettiin GIBCO® KSFM väliaineessa, jota oli täydennetty naudan aivolisäkeuutetta ja rekombinantti ihmisen epidermaalinen kasvutekijä (Life Technologies). Kaikki solulinjat olivat DNA sormenjäljet ​​käyttämällä GenePrint PowerPlex 1.2 (Promega, Madison, WI) ja vahvisti vastaan ​​sormenjälki kirjastojen ylläpitämä ATCC ja Minna /Gazdar laboratorio, ja testattiin saastuminen käyttämällä sähköistä Myco Mycoplasma PCR havaitseminen Kit (Boca Scientific , Boca Raton, FL).

solun luelinkykymäärityksillä

herkkyys NSCLC solulinjojen paklitakseliin ja doketakselin mitattiin käyttämällä standardia protokollaa, kuten on kuvattu Zhou et al. [20]. Lyhyesti, solut maljattiin 96-kuoppaisille muodossa, jossa paklitakseli lisättiin eri pitoisuuksina 24 tunnin kuluttua, jonka jälkeen inkuboitiin lääkkeen kanssa 96 tunnin ajan. Solujen elinkyky määritettiin käyttämällä CellTiter 96® vesikerros Solution Cell Proliferation Assay (MTS, Promega). Vaikutus miR-337-3p ja tavoitteensa määritettiin lyhytaikaisella transfektiolla joko miR-337-3p matkivat tai siRNA oligoja kohdistaminen geenit. Yleensä solut käänteisfaasi-transfektoitiin ilmoitetuilla oligot 96-kuoppainen formaatti ja viljeltiin 72 tuntia, jonka jälkeen inkuboitiin lääkkeiden vielä 72 tuntia. Solujen elinkyky määritettiin käyttämällä CellTiter 96® vesikerros Solution Cell Proliferation Assay (MTS, Promega) tai CellTiter-Glo Luminescent solunelinkykyisyysmääritys (ATP, Promega).

Virtaussytometria

Solut transfektoitiin ilmoitetuilla oligot 6-kuoppalevyillä 48 tuntia, minkä jälkeen seuraa käsittely joko paklitakselin tai kantajan vielä 16 tuntia. Sekä irrottaa ja kiinnittää soluja sentrifugoitiin 1000 rpm: ssä 5 min. Solut pestiin kerran 1 x PBS: llä (fosfaattipuskuroitu suolaliuos), ja kiinteän 1X PBS: llä, joka sisälsi 1 mM EDTA: ta ja 85% etanolia 4 ° C: ssa. 1 tunnin kuluttua solut kerättiin sentrifugoimalla 1400 rpm 5 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Solut suspendoitiin uudelleen 1 x PBS: llä ja käsiteltiin 50 ug /ml propidiumjodidia ja 100 ug /ml RNaasi A: lla 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Solusykliä koskevat tiedot koottiin Cytomics FC 500 virtaussytometrillä (Beckman Coulter, Brea, CA), jossa on 20.000 tapahtumaa kerättiin näytettä kohti. Tiedot arvioitiin käyttämällä FlowJo data-analyysi-ohjelmisto, versio 9.1 (TreeStar, Ashland, OR).

kvantitatiivinen RT-PCR (qRT-PCR) B

miRNA ilmentyminen mitattiin ABI PRISM 7900 Sequence Detection System käyttäen TaqMan® microRNA Analyysit (Life Technologies) kanssa RNU19 RNA ilme sisäisenä kontrollina normalisointia RNA lastaus. mRNA-ekspressio mitattiin käyttämällä TaqMan® Gene Expression Analyysit kanssa GAPDH mRNA: n ilmentymisen sisäisenä kontrollina. Kynnyssyklistä kertaa (C

t) saatiin ja suhteellinen geenin ilmentymistä laskettiin käyttäen vertailevaa syklin ajan menetelmällä.

Western blotit

Solulysaatit valmistettiin käyttäen NP-40-puskurissa. Proteiinipitoisuus määritettiin käyttäen Pierce BCA-määrityksellä (Thermo Fisher, Rockford, IL). Elektroforeesi, yhtä suuret määrät solulysaattia erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin Immun-Blot PVDF-kalvoille (Bio-Rad, Hercules, CA). Kalvot blokattiin ja koetettiin seuraavilla vasta-aineilla: kanin RAP1A tai anti-STAT3 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA), tai vuohen anti-aktiini (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Sitoutuneet vasta-aineet havaittiin toissijaisen vasta konjugoitu piparjuuriperoksidaasiin (HRP) (Santa Cruz Biotechnology) ja visualisoitiin vahvistettua kemiluminesenssireagenssia (ECL) alustan (Thermo Fisher). Suhteelliset muutokset proteiini kvantitoitiin densitometrillä käyttämällä Määrä Yksi ohjelmisto (Bio-Rad).

miRNA tavoite ennustus

Tunnistaa sääntelyn kohteet miR-337-3p, käytimme miRmate kehitetty menetelmä meidän lab kuten aiemmin on kuvattu [21]. Lyhyesti, menetelmä palkintoja täydellinen komplementaarisuus asemissa 2-8 on miRNA (siemenet alue), epäsuhta ja insertioita Keski pullistuma asemissa 9-11 miRNA, jotkut toisiaan mahdollisimman 3′-päässä, ja tietyssä järjestyksessä sävellystä asemat 1 (A) ja 9 (A tai C) miRNA mukaan havaintojen Lewis et al. [22].

lusiferaasireporttiterilla määrityksissä

segmentti villityypin (WT) 3’UTRs sisältävä ennakoi maalin sivustoja

RAP1A

(NM_002884) ja

STAT3

(NM_003150) kloonattiin alavirtaan lusiferaasin cDNA pMIR-REPORT (Ambion, Austin, TX), joka on vektori, joka sisältää sekä lusiferaasia ja β-galaktosidaasi cDNA: iden valvonnassa erillisten nisäkkään promoottori /terminaattori järjestelmiä. Mutantti konstruktioita (

RAP1A

MU ja

STST3

MU) ja asento 3 (2

nd nukleotidin kohde siemen järjestyksessä) muuttunut G: stä A ja asennossa 1 (välittömästi 3 ”siemenen sekvenssi) muutetaan A-U, tehtiin käyttämällä QuikChange Site Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA). Lusiferaasiaktiivisuus ja β-galaktosidaasin aktiivisuus mitattiin käyttäen Luciferase Assay System, ja β-galaktosidaasi Assay System (Promega), vastaavasti.

mRNA: n ilmentymisen profilointi

NCI-H1155-solut transfektoitiin asennuspalveli- 337-3p matkivat tai negatiivinen kontrolli matkivat. Kokonais-RNA eristettiin käyttäen Mirvana ™ miRNA Isolation Kit (Ambion), merkitty ja hybridisoidaan HumanWG-6 V3 Expression BeadChips (Illumina, San Diego, CA) käyttäen standardimenetelmiä. Diat skannattiin koskevasta Illumina BeadStation ja signaali intensiteetit tiivistää käyttämällä BeadStudio v3.3 (Illumina). Taustan vähentäminen ja quantile normalisointi suoritettiin käyttäen MBCB algoritmia [23].

Korrelaatio lausekkeen 3’UTR motiivi sisältö

korrelaatio muutoksia geenien ilmentymisen aiheuttama miR-337-3p over -ilmaisu ja motiivi niiden sisällön 3’UTRs analysoitiin käyttämällä sylamer (https://www.ebi.ac.uk/enright/sylamer), joka laskee kumulatiivisen ja hypergeometrisen p liittyviä arvoja pieni sana poikkeamista paremmuusjärjestyksessä seuraavat suurempien sekvenssit, tässä tapauksessa 7-mer esiintymästä joukko RefSeq 3’UTRs, ja käyttäen lineaarista regressiota toteutettuna miReduce [24], [25]. Jälkimmäisessä kukin aihe sisältämä 3’UTRs katsotaan osaltaan lineaarisesti kertaluokkamuutos profiilin, ja miReduce iteratiivisesti laskee motiiveja, jotka vaikuttavat eniten. Regressio kerroin kunkin motiivi voi olla positiivinen tai negatiivinen, riippuen siitä, onko vuorovaikutus johtaa suppression tai aktivoitumista ilmentymisen kohdegeenin. Kun on kyse yli-ilmentämään miRNA, odotamme sisältävien transkriptien motiiveja, jotka ovat komplementaarisia microRNA siementen sekvenssin vähennetään ilmaisun niin, että motiivi olisi kielteisiä regressiokerroin.

Reverse-Phase Protein Array (RPPA) B

Protein lysaatit valmistettiin käyttäen kuumaa lyysipuskuria (2% SDS, 0,06 M Tris-Cl, pH 6,8; 5% glyseroli) proteinaasi ja fosfataasi-inhibiittorit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO ; Santa Cruz Biotechnology) ja β-merkaptoetanolia juuri lisätty. Lysaatit denaturoitiin keittämällä 5 min supernatantit on saatu sentrifugoimalla 13000 rpm: llä 7 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Ennen ryhmittelyn diat, proteiini lysaatit suodatettiin 96-suodatin levyt 25 um huokoskoko kalvoja (Phenix Research Products, Candler, NC) poistamiseksi aggregaatteja. Yhtä suuret määrät lysaatit puettu kolmena kappaleena on ONCYTE® AVID

TM nitroselluloosa kalvo liukuu (Grace Bio-Labs, Bend, Oregon) käyttäen SpotArray

TM24 Microarray tulostusjärjestelmä (PerkinElmer, Waltham, MA) alle 55-60 %: n kosteudessa. Sillä immunovärjäyksessä, kalvot ensin inkuboitiin RT: ReBlot Plus Lievä Solution (EMD Millipore, Billerica, MA) ja vähemmän kuin 7 min rentoutua proteiinin rakennetta ja pestiin sitten TBS-T-puskuria ja inkuboitiin sitten Pierce SEA BLOCK estopuskuria (Thermo Fisher), salvattiin avidiini ja biotiini (Dako, Glostrup, Tanska), ja inkuboitiin joko STAT3 (EMD Millipore) tai pSTAT3 (S727, Cell Signaling Technology) vasta-ainetta 4 ° C: ssa yön yli. Objektilasit pestiin sitten ja niitä inkuboitiin biotinyloidun sekundaarisen vasta-aineita (Vector Laboratories, Burlingame, CA) 30 minuuttia, mitä seurasi blottauksella Qdot 655-streptavidiini-konjugaatti (Life Technologies) 30 minuutin ajan. Objektilasit skannattiin ProScanArray Microarray Scanner (PerkinElmer). Proteiinin ilmentyminen kvantitoitiin käyttäen MicroVigene ™ (Vigene Tech, Carlisle, MA) ohjelmistojen ja normalisoidaan eroista proteiinin lastaamista SYPRO Ruby ™ (Life Technologies) proteiini tahra signaalit saadaan erillisellä dia painettu samassa erässä.

miRNA ilmentymisen profilointi kasvain yksilöiden

10-20 um leikesarjojen 249 kirurgisesti resektoitiin NSCLC yksilön (myös 172 adenokarsinomia ja 76 okasolusyöpää) saatiin käyttämällä Leica kryostaattia ja homogenoidaan käyttäen Omni TH homogenisaattorilla (Omni International, Kennesaw, GA). Kokonais-RNA eristettiin käyttäen TRI-reagenssia (Life Technologies), ja kvantitoitiin käyttäen Nanodrop 1000 spektrofotometrillä (Thermo Fisher). RNA laatu määritettiin Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA).

microRNA analyysin näytteet leimattiin käyttäen miRNA Complete Labeling ja Hyb Kit ja hybridisoitiin Agilent Human miRNA microarray versio 3 sirut (Agilent Technologies), joka sisältää koettimia 866 ihmisen ja 89 ihmisen virus MikroRNA perustuu miRBase v12.0 (https://microrna.sanger.ac.uk). Hybridisaatiot suoritettiin ruostumatonta terästä SureHyb kammiot (G2534A) 55 ° C: ssa 22 tuntia, minkä jälkeen taulukot pestiin ja skannataan käyttäen Agilent DNA Microarray Scanner (Agilent Technologies). miRNA ekspressiotasoja uutettiin käyttämällä Feature Extraction ohjelmisto (Agilent Technologies) ja prosessoitiin Bioconductor [26] paketti AgiMicroRna korjaamiseksi tausta, poista ohjaus ja un-havaittavissa sekvenssit, ja kvantiili- Normalize ja kokoaa tietoja.

tulokset

Yli-ilmentyminen miR-337-3p herkistää NCI-H1155 solujen paklitakselin ja parantaa paklitakselin aiheuttama G

2 /M pidätys

vaikutuksen tutkimiseksi asennuspalveli- 337-3p paklitakselia herkkyyttä keuhkosyöpäsoluissa, käytimme miR-337-3p matkivat (Dharmacon) lisätä miR-337-3p tasot NCI-H1155-soluja, keuhkosyöpä solulinjaa luonnehtia kohtalaisen vastustuskykyinen paklitakselia aikaisemmassa tutkimus [8]. Kuten kuviossa 1A on esitetty, miR-337-3p yli-ilmentyminen merkitsevästi herkistää solut paklitakselihoidolla, vähentämällä IC

50 – määritellään pitoisuutena, joka johtaa 50%: n lasku solujen elinkelpoisuuden – alkaen 27,27 nM (95% CI 25,97-28,90) ja ohjaus oligo on 14,60 nM (95% CI 14,08-15,15) kanssa miR-337-3p matkivat (p 0,0001). Seuraavaksi testasimme annoksesta riippuvuus vaikutus miR-337-3p paklitakselia herkkyys ja solujen elinkelpoisuus transfektoimalla NCI-H1155-soluissa eri pitoisuuksina joko miR-337-3p matkivat tai valvontaa oligo seuraa käsittely joko 16 nM paklitakselia tai kantajaa. Kuten kuviossa 1B on esitetty, miR-337-3p matkivat merkittävästi herkistää solut paklitakseliin verrattuna kontrolliin oligo niinkin pienillä pitoisuuksilla kuin 0,5 nM (p = 0,0168), mutta ei merkittävästi vähentää solujen elinkelpoisuuden puuttuessa paklitakselin konsentraatioissa jopa yhtä suuri kuin 200 nM. Arvioitava edelleen sääntelyä paklitakselin vasteen miR-337-3p, tutkimme vaikutus miR-337-3p inaktivaation paklitakselia herkkyyttä H1155 soluissa. Kuten kuviossa 1C on esitetty, inaktivaatio miR-337-3p by miR-337-3p inhibiittori vähentää merkittävästi vaste H1155 paklitakseliin hoitoon, jossa suhteellinen solujen elinkelpoisuus kasvaa 17,81 ± 5,31% (p 0,0001) suhteessa kontrolliin oligot.

(A) annos-riippuvainen vaikutus paklitakselin solun elinkelpoisuuden läsnä ollessa tai poissa ollessa miR-337-3p matkivat. Solujen elinkelpoisuus mitattiin käyttäen MTS-määritystä. (*, P 0,05; **, p 0,01; ***, p 0,001, ns, ei merkitsevä) (B) Solujen elinkelpoisuus funktiona oligo konsentraation läsnä ollessa tai poissa ollessa paklitakseli. Solujen elinkyky mitattiin käyttämällä ATP: n pitoisuudet määrityksessä. (C) vaikutus miR-337-3p Knockdown kanssa miR-337-3p estäjän (50 nM) paklitakselia herkkyyttä H1155 soluissa. Näkyy on suhteellinen solujen elävyys läsnäollessa 16 nM paklitakselin normalisoitu hallita oligojen. (****, P 0,0001) (D) Solusyklianalyysiä funktiona miR-337-3p yli-ilmentymisen ja paklitakselihoidolla. Osa solujen G

1, S ja G

2 vaihetta arvioitiin käyttäen Watson käytännöllinen malli, jossa suhde G

2 G

1 jakeet paklitakselin käsitellyissä soluissa normalisoitu havaitut valvonnan olosuhteissa (R = [G

2 /G

1]

paklitakseli /[G

2 /G

1]

carrier).

taksaanit sitoutuvat β-alayksikön tubuliinin ja estää normaalin dynamiikkaa mikrotubulusten purkaminen, mikä johtaa stabiloitujen mikrotubuluksiin ja pitkäaikainen pidätys solujen G

2 /M vaiheen solusyklin ja lopulta solukuolemaan [27 ], [28]. Vertasimme vaikutus miR-337-3p over-ilme solusyklin kanssa tai ilman paklitakselihoidolla, ajanhetkellä (16 h) ennen paklitakseli indusoi merkittävän apoptoosin. Kuten kuviossa 1D, läsnäollessa paklitakseli, miR-337-3p matkivat indusoi dramaattisen G

2 /M pidätys, jossa normalisoitu G

2 /G

1 suhde R = 4,38, suhteessa R = 2.48 torjunta- oligo, R = 2,34 mir-337-5p matkivat, ja R = 2,31 varten mock transfektion taas miR-337-3p ei vaikuta solusyklin jakautuminen puuttuessa paklitakseli.

edellä esitetyt tulokset osoittavat, että miR-337-3p moduloi paklitakselin herkkyys NCI-H1155-soluissa erityisesti parantamalla solu pidätyksen G

2 /M vaiheessa solusyklin vaikuttamatta merkittävästi solujen selviytymistä yksin.

Expression erilaisia ​​analyysi osoittaa, että monet ennustivat tavoitteista miR-337-3p ovat alassäädetty mRNA tasolla miR-337-3p yliekspressio

jotta kattavasti etsi kohde geenit, jotka välittävät vaikutus miR-337-3p paklitakselia herkkyydestä NCI-H1155-soluissa, olemme profiloitu geeniekspressiota microarray tunnistaa selostukset, jotka alas-säätelee miR-337-3p yliekspressio, koska yhä osoittavat, että miRNA säädellä kohdegeenin ilmentymisen vähenemisen kautta mRNA [29]. Suuruus miR-337-3p over-ilmentyminen (kuvio 2A) on verrattavissa erot endogeenisen ilmentymisen havaittiin eri kudoksissa ja välillä IMR-90 sikiön keuhkojen fibroblasteja ja HBECs (kuvio S1). Koska useimmat tuoreet tutkimukset tukevat täydellinen täydentävät toisiaan 7-meerejä siemen alueella (joka kattaa asemat 1-8) kypsä miRNA sekvensseillä 3’UTR mRNA transkriptin kriittinen tekijä välisen vuorovaikutuksen miRNA ja kohdegeenin [30], [31], arvioimme korrelaatio ilmaisu ja motiivi sisältö mRNA-transkriptien perustuu esiintyminen 7-meerin niiden 3’UTRs. Kuten kuvassa 2B on esitetty, merkittävästi enemmän 1211-geenien sisältävän 7-mer UAUAGGA komplementaarinen miR-337-3p siementen sekvenssi – emäkset 2-8, pidetään vahvin determinantti miRNA: kohde vuorovaikutus – lasku ilmaisu kuin lisäys (p = 1,37 x 10

-2), joista 32 geenit vähentävät ≥2 kertaiseksi ja vain 3 geenit lisätä ≥2 kertaiseksi (kuvio 2D). Sen sijaan suunnilleen yhtä moni 19262 geenien ei sisälsi 7-mer lasku ja nousu ilme. Lisäksi Kuviot 2C ja 2D osoittavat, että joukossa 16384 7-mer motiiveja esiintyviä 3’UTRs ihmisen mRNA-transkriptien, useat ovat yliedustettuina siinä 3’UTRs geenien väheni soluissa ohimenevästi transfektoitu miR-337-3p jäljittelevät suhteessa negatiiviseen kontrolliin matkia (kuvio 2C), jossa on vain 10 motiiveja osoittaa merkittävää negatiivista korrelaatiota mRNA ekspressiotasot ja niiden läsnäolo 3’UTRs (kuvio 2D). 5 motiivien vastaavat siemenen alueelle tunnetun miRNA (miR-337-3p), joista 1 motiivi vastaten emäksiä 2-8 ja 4 vastaavat kohtia 1-7 ja 2-7, viimeaikaiseen työtä siemen alue tulitikut [30], [31]. Kiinnostavaa kyllä, huomasimme, että yksi motiivi (GUAGGAA) sisältää G: U emäsparin asemassa 7, mikä viittaa siihen, että tekijöitä miRNA tavoitteita voivat olla ei-Watson: Crick täydentävät toisiaan. Kuvio 2E osoittaa, että vaikka monet kohdegeenien tunnistetaan 5 kuviot ovat päällekkäisiä, ylimääräinen 4 motiivien tunnistamiseksi ainutlaatuinen tavoitteita. Kaiken kaikkiaan edellä esitetyt tulokset osoittavat, että huomattava määrä geenejä sisältävien otaksutun miR-337-3p kohdesivustot ovat alas-säätelee miR-337-3p mRNA-tasolla ja korostavat arvon tyhjentävästi miRNA tavoitteet perustuvat 7- mer täydentävät siemenen alueelle.

(A) Expression tasot miR-337-3p kuluttua 72 h transfektion NCI-H1155-solujen 50 nM miR-337-3p matkivat mitattuna qRT-PCR. (B) Histogrammi muutoksia mRNA: n ilmentymisen tason funktiona miR-337-3p yli-ilmentyminen. Palkit mustana osoittavat suhteellisen taajuuksilla havaittujen log

2-kertaiseksi muutoksia kaikille geenit, kun taas palkit punaisilla jakelua varten geenien kanssa 3’UTRs sisältävät vähintään yhden 7-mer vastaava miR-337-3p siemen alue. (C) merkitys maiseman kuvaaja 7-meerejä kaikissa geenit, lajiteltu muutos ilmaisun, useimmista laski eniten kasvoi, mikä osoittaa 7-meerejä, jotka ovat erittäin rikastettu 3’UTRs geenien vähenevät ilme. (D) välinen korrelaatio mRNA ilmaisun ja aihe sisältöä 3’UTRs aiheuttama miR-337-3p over-ilmaisua. Näkyy ovat: (1) 7-mer aihe, korostettu näyttää komplementaarisuutta miR-337-3p, (2) regressio kerroin, (3) p-arvo, (4) joukko geenejä sisältäviä motiivin, (5 ) mirna johon motiivi vastaa, jossa nukleotidiasemat täysin komplementtinen korostetun sekvenssit sarakkeessa 1 esitetty suluissa, ja määrä geenejä, jotka (6) vähenee ilmentyminen tai (7) lisäys ilmentymisen ≥2-kertaiseksi . 6 sarakkeen määrä geenejä, jotka sisältävät luettelossa aihe, mutta eivät sisällä kanoninen miR-337-3p siemen sekvenssi tavoite, on suluissa. (E) Suhteellinen Venn-kaavio, joka esittää suhdetta joukossa geenit, jotka vähentävät ≥2 kertaiseksi ilmaisun ja sisältävät yhden tai useamman viidestä 7-meerejä, jotka vastaavat kypsää miR-337-3p sekvenssit.

STST3

ja

RAP1A

ovat suoria tavoitteita, jotka välittävät vaikutus miR-337-3p paklitakselia herkkyydestä

Niistä geenit alas-säätelee miR-337-3p

RAP1A

ja

STAT3

, joita alassäädetty 60% ja 63% vuoteen miR-337-3p yliekspressio, vastaavasti, molemmat ennustetaan olevan kohdistu suoraa asennuspalveli- 337-3p (kuvio 3A) ja potentiaalisesti säätelyyn osallistuvan paklitakselin herkkyys. Vahvistaa nämä vuorovaikutukset, rakensimme lusiferaasireportteri- vektoreita, jotka sisältävät villityypin 3’UTRs on

STAT3

ja

RAP1A

ja vastaava ohjaus 3’UTRs mutaatioiden kanssa ensimmäisen ja kolmannen nukleotidin kohde site-sekvenssejä (kuvio 3A), jotka on osoitettu olevan ratkaiseva haitta miRNA: kohteen vuorovaikutuksista, [22]. Kuten on esitetty kuviossa 3B, miR-337-3p yli-ilmentyminen väheni merkittävästi lusiferaasin aktiivisuus soluissa, jotka ekspressoivat villityypin 3’UTRs verrattuna ei ole 3′-UTR tai mutatoituja 3’UTRs, mikä osoittaa, että miR-337-3p vuorovaikutuksessa suoraan tarkat sivustoja 3’UTRs on

STST3

ja

RAP1A

. Kuvio 3C osoittaa, että vaikutus miR-337-3p on mRNA: n ilmentymisen tasoja kahden geenin on kytketty down-regulation endogeenisen proteiinin ilmentymisen tasot H1155-soluissa. Olemme edelleen tutkittiin, mikä vaikutus miR-337-3p ilmentymisen vaikutus STST3 ja RAP1A tasoilla H1993, joka on NSCLC solulinja, joka määritellään paklitakseli-resistenttejä, jossa määrittelemättömän IC

50. Kuten H1155-solujen, miR-337-3p myös alas-säätelee STAT3 ja RAP1A tasoilla mRNA: ta ja proteiinia tasot H1993-soluissa, kuten on esitetty kuviossa 3D. Nämä tulokset viittaavat siihen, että miR-337-3p on yleinen sääntelyn vaikutus STST3 ja RAP1A ilmentymistä keuhkosyövässä soluissa.

(A) miR-337-3p ja arvioitua vuorovaikutusta tavoite sivustoja

RAP1A

ja

STST3

. Siinä on esitetty rakenteet ja sekvenssit miRNA: tavoite vuorovaikutusten miR-337-3p ja 3’UTRs on

RAP1A

ja

STAT3

, ja ennustettu vapaa energia hybridisaatio. Siemen sekvenssi on korostettu punaisella. Emäkset muuttaa mutageneesillä on alleviivattu. (B) lusiferaasireporttiterilla määrityksessä. NCI-H1155-solut ko-transfektoitiin osoitetuilla oligot ja lusiferaasireportterigeenin vektorit. Lusiferaasi ja β-galaktosidaasi-aktiivisuudet mitattiin 72 tunnin jälkeen, ja lusiferaasin aktiivisuus normalisoitiin P-galaktosidaasin aktiivisuuden. (C) Expression of

RAP1A

ja

STST3

mRNA ja proteiini tasoilla kuluttua 72 h transfektion NCI-H1155-soluissa joko 50 nM miR-337-3p, 25 nM siRNA suunnattu vastakkain geeneistä tai negatiivisen kontrollin oligojen. Näkyy ovat keskimäärin qRT-PCR tulokset kolmen itsenäisen transfektioista ja edustava Western blot kuvia ja kvantifiointiin kaistaintensiteettejä. (D)

RAP1A

ja

STST3

mRNA ja proteiinin ilmentyminen NCI-H1993-soluissa. *, P 0,05; **, P 0,01; ***, P 0,001.

Jotta voidaan arvioida, onko

STST3

ja

RAP1A

välittävät vaikutusta miR-337-3p paklitakselia herkkyys, me pudotti kunkin geenin erikseen ja molemmat yhdessä. Kuvio 4A osoittaa, että knockdovvn

STST3

ja

RAP1A

lisääntynyt herkkyys NCI-H1155 solujen paklitakselihoidolla verrattuna ohjaus oligoilla, mutta ei vaikuttanut merkittävästi solujen eloonjääminen ilman paklitakselin . Yhdistämällä kaksi siRNA: t puoleen pitoisuus johtaa suurempaan vähentää solujen elinkelpoisuus kuin havaittiin joko siRNA yksinään (p = 0,017 varten

RAP1A

ja p = 0,041 varten

STAT3

), mikä viittaa siihen että yhdistetty pudotus on synergistinen vaikutus paklitakselin vaste (kuvio 4B). Lisäksi kuvio 4C esittää, että knockdovvn

STST3

tai

RAP1A

parantaa merkittävästi G

2 /M pidätetty alle paklitakselihoidolla verrattuna ohjaus oligoilla, jossa normalisoitu G

2 /G

1 suhde R = 3,02 ja R = 3,70, vastaavasti, suhteessa R = 1,93 tarkastukselle ja verrattavissa R = 4,37 transfektioon kanssa miR-337-3p matkivat.

( A) vaikutus knockdovvn

RAP1A

ja

STST3

ilmentymisen siRNA solun elinkelpoisuuden läsnä ja poissa ollessa paklitakseli. Punaisella on solujen elinkelpoisuuden 16 nM paklitakselia normalisoitu elinkelpoisuuden operaattorin funktiona kasvavia pitoisuuksia siRNA: iden vastaan ​​

RAP1A

tai

STST3

. Mustia on solujen elinkelpoisuuden puuttuessa paklitakseli. (B) vaikutus yhdistettynä knockdovvn

RAP1A

ja

STST3

paklitakselia herkkyys. Näkyy on suhteellinen solujen elävyys läsnä 16 nM paklitakselia normalisoitu hallita oligojen. (C) knockdovvn STAT3 ja RAP1A parantaa paklitakselin aiheuttama G

2 /M pidätys mitattuna virtaussytometrialla. Suhde (R) on G

2 G

1 jakeet aiheuttama Paklitakselihoidon määritettiin kuten edellä. (D) Solujen elinkelpoisuus funktiona oligo pitoisuus (miR-337-3p matkivat tai negatiivinen kontrolli matkivat) läsnä ollessa cucurbitacin. *, P 0,05.

lisääminen todisteet tukevat soveltaminen STAT3-inhibiittorit, kuten cucurbitacin, terapeuttisina aineina hoidettaessa erilaisia ​​syöpiä. Siksi vaikutus testattiin miR-337-3p yli-ilmentyminen on vaste NCI-H1155-solujen käsittely cucurbitacin, sytotoksisuus, joka on ainakin osittain perustuu esto STAT3 toimintaa [32], [33]. Kuten on esitetty kuviossa 4D, miR-337-3p matkivat herkistää solut cucurbitacin, vähentää IC

50 1,14 uM (95% CI 1,03-1,28) ja 0,37 uM (95% CI 0,33-0,42) (p 0,0001), mikä osoittaa, että kohteena sekä

STST3

ilmaisutapoja miR-337-3p matkivat ja STAT3 aktivoinnin cucurbitacin on synergistinen vaikutus syöpäsolujen selviytymisen, ja viittaa siihen, että miR-337-3p voi myös toimia adjuvanttina jotta STAT3 estäjiä.

miR-337-3p herkistää sekä paklitakseli-herkkä ja paklitakseli-resistenttejä solulinjoja samoin kuin eri histologisia alatyyppejä

testaamiseksi yleispätevyyttä vaikutus