Krooninen sairaus

tiivistelmä

Johdanto

Käyttö 5-alfa-reduktaasin estäjät (5-ARIS) finasteridi ja Dutasteridi varten eturauhasen syövän ehkäisyä on vielä keskustelu. FDA äskettäin todennut, että lisääntynyt esiintyvyys korkealaatuisesta kasvaimia joukossa 5-ARI saaneista potilaista ei saa laiminlyödä, ja he päättivät kieltää käytön 5-ARIS eturauhassyövän ehkäisyyn. Tämä tutkimus suoritettiin tarkistaa vaikutukset finasteridi eturauhasen solujen vaeltamiseen ja invaasion ja siihen liittyvät entsyymit /proteiineja normaaleissa ihmisen ja kasvainten eturauhasen solulinjoissa.

Materiaalit ja menetelmät

RWPE-1, LNCaP, PC3 ja DU145-soluja viljeltiin 60% konfluenssiin ja altistettiin eri ajanjaksoina joko 10 uM tai 50 uM finasteridia joka laimennettiin viljelyalustaan. Esikäsitelty väliaine kerättiin ja väkevöitiin, ja MMP2 ja MMP9 toimintaa ja TIMP-1 ja TIMP-2-proteiinin ekspressio määritettiin. Solujen elinkelpoisuus, muuttoliike ja invaasio analysoitiin, ja loput solu-uutteet toimitettiin androgeenireseptorin (AR) havaitseminen western blottaustekniikoissa. Kokeita tehtiin kolmena kappaleena.

Tulokset

Solujen elinkelpoisuus ei vaikuttanut merkittävästi finasteridia altistumista. Finasteridi merkittävästi vaimentua MMP2 ja MMP-9 toimintaa RWPE-1 ja PC3-soluissa ja MMP2 in DU145 soluissa. TIMP-2 ilmentymisen RWPE-1-soluissa voimistunut altistumisen jälkeen. Solu hyökkäys kaikkien neljän testattujen solulinjojen estyi altistuminen 50 uM finasteridia, ja kulkeutumistestis- vain tapahtunut RWPE-1 ja LNCaP-soluissa. AR ilmaistiin LNCaP, RWPE-1 ja PC3-soluissa.

Johtopäätökset

Vaikka keskustelu korkeampi esiintyvyys korkealaatuisesta eturauhasen syöpä 5-ARI saaneista potilaista säilyy, meidän havainnot osoittavat, että finasteridi voi heikentää tuumorin aggressiivisuus ja invaasio, joka voi vaihdella riippuen androgeenin reagoida potilaan eturauhasen soluissa.

Citation: Moroz A, Delella FK, Almeida R, Lacorte LM, Favaro WJ, Deffune E, et ai. (2013) Finasteride Estää Human Eturauhassyöpä Cell Invasion kautta MMP2 ja MMP-9 alassäätely. PLoS ONE 8 (12): e84757. doi: 10,1371 /journal.pone.0084757

Toimittaja: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 25 tammikuu 2013; Hyväksytty: 27 marraskuu 2013; Julkaistu: 30 joulukuu 2013

Copyright: © 2013 Moroz et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat FAPESP (tutkimuksen toimikunta valtion São Paulo) rahoitus (prosessi n. 2010 /16671-3) ja CAPES Ph.D. stipendi. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on yleisin pahanlaatuinen kasvain miehillä ja osuus $ 8 miljardia keskimääräiset kustannukset ovat $ 81658 potilasta kohden, diagnoosista kuolemaan, USA: ssa [1]. Useita aineita tutkitaan parhaillaan ehkäisyyn eturauhassyövän [2]. Finasteridi, tyypin 2 5-alfa-reduktaasi-inhibiittori (5-ARI), joka estää testosteronin (T) dihydrotestosteroniksi (DHT) [3], on hyvin tunnettu lääke, joka käytetään eturauhasen hyvänlaatuisen liikakasvun [ ,,,0],4], ja on ehdotettu toimia chemopreventive aineena eturauhassyövän. Eturauhasen syövän ehkäisemisen Trial (PCPT) osoitti 24,8%: n vähennys yleisen ja heikompilaatuisen eturauhassyövän riskiä antamisen kanssa finasteridin. Kuitenkin korkea-asteen syöpiä havaittiin 6,4% finasteridia saaneista potilaista verrattuna 5,1% miehistä, jotka saivat lumelääkettä [5], [6]. Tämä havainto johti tärkeä kysymys: ei finasteridi aiheuttaa korkealaatuisesta syövän tai lisätä sen havaitseminen? Tätä kysymystä seurasi voimakas keskustelu tosiasiallisesti tai keinotekoista yliarviointi korkealaatuisesta tapauksia finasteridi saaneilla potilailla [3], [7], joka jakautuu urologit ja eturauhasen tutkijoita. Viime aikoina REDUCE tutkimus raportoitu vastaavia tuloksia kuluttua 5-ARI dutasteridiryhmässä. Pitää tärkeänä tätä asiaa, Food and Drug Administration (FDA) on äskettäin analysoitiin uudelleen datan peräisin PCPT ja vähentää kokeiden ja päätteli, että finasteridi ja dutasteridi hoidot saattavat lisätä riskiä vakavampi muoto eturauhassyövän. Siksi he päättivät kieltämään näiden lääkkeiden käytön eturauhasen syövän ehkäisyä [8]. Lisäksi äskettäin julkaistussa kokeellinen tutkimus paljasti samanlaisia ​​tuloksia kuin PCPT ja vähentää tutkimusten [9]. Kirjoittajat osoittivat, että esiintyvyys huonosti eriytetty karsinooma nostettiin C57BL /6 TRAMP × FVB hiiriä ruokittiin finasteridia täydentää ruokavaliota, ja piti tätä haitallinen vaikutus finasteridia hoidon sijasta artefaktana vaikutus [9].

Korkeatasoinen eturauhassyöpä tapauksia, kuten havaitaan 5-ARI-hoitoa saaneilla potilailla, ovat yleisesti liittyy lisääntynyt ilmentyminen metalloproteinaasien (MMP: t), perheen sinkki ja kalsium riippuvaisia ​​endopeptidaasit jotka ovat vastuussa ekstrasellulaarisen matriisi (ECM) remodeling, joka edistää invasiivinen ja metastaattinen fenotyypit eturauhassyöpäsolujen [10] – [13], ja vähentynyt ilmentyminen kudoksen estäjä metalloproteinaasien (TIMP: t) [13], luokka luonnollisesti esiintyviä estäjien MMP että tiukasti säädellä toimintaa ja ilmaistaan ​​erilaisissa solutyypeissä [11].

Koska ECM hajoamisen tiedetään olevan merkittävä askel aikana syövän etenemisessä [10], [12], [13], ryhmämme on tutkinut vaikutukset finasteridi kun MMP ja TIMP modulaatio yrittää selittää miksi finasteridia saaneilla potilailla oli korkeamman asteen eturauhasen syöpiä. Olemme aiemmin osoittaneet, että finasteridi käsittely lisäsi ekspressiota MMP-9 ja vähentynyt ilmentyminen MMP2 rotan ventraalisessa eturauhasessa [14], [15] ja että se vaimentua mRNA tasoja TIMP-1 ja TIMP-2: n rotan ventraalisessa eturauhasessa [ ,,,0],15]. Lisäksi olemme hiljattain osoittaneet, että finasteridi vähentää myös MMP2 Gelatinolyyttinen aktiivisuus erilaisissa ihmisen eturauhasen solulinjojen [16]. Teimme tässä tutkimuksessa onko finasteridin hoitoon häiritsee muuttoliike ja invasiivisia potentiaalia normaalin ihmisen eturauhasen solulinja RWPE-1 ja kasvainten epiteelisolujen linjojen LNCaP, PC3 ja DU145, joilla on erilaiset androgeenireseptorin (AR) profiilit.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljelmät

Yksi pullo kukin RWPE-1 (ei-kasvainten, villityypin AR

+), LNCaP (kasvainten, mutatoitunut AR

+) ja PC3 (kasvainten, AR

-) solulinjat hankittiin American Type Culture Collection (ATCC ™). DU145 (kasvainten, AR

-) solut ystävällisesti lahjoitti Dr. Heloisa Sobreiro Selistre de Araújo osastolta Physiology – UFSCar, Brasilia (alun perin hankittu ATCC ™). Vaikka ei isogeenisiin, nämä solulinjat valittiin edustavan 3 erillistä in vivo finasteridia altistustilanteita: potilaan normaali eturauhanen (edustaa in vitro RWPE-1 solulinja), potilas androgeenin herkkä eturauhassyöpä (jota edustaa in vitro LNCaP solulinja) ja potilaan kastraatio kestävät eturauhassyöpä (jota edustaa in vitro PC3 ja DU145 solulinjoilla). Kokeet suoritettiin kahden kuukauden kuluttua hankinnan solulinjoissa. RWPE-1-soluja viljeltiin käyttäen Keratinosyyttien Serum Free Medium (Invitrogen ™), johon oli lisätty 0,05 mg /ml naudan aivolisäkeuutetta, 5 ng /ml ihmisen rekombinantti epidermaalista kasvutekijää (EGF) ja 1% antibiootti /antimykootti-liuosta (Invitrogen ™). LNCaP, PC3 ja DU145-soluja viljeltiin käyttäen RPMI (Invitrogen ™), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (SFB) (Invitrogen ™) ja 1% antibiootti /antimykootti-liuosta (Invitrogen ™). Kaikki soluviljelmässä toimenpiteet suoritettiin tiukoin steriileissä olosuhteissa ja säilytetään sisällä 5% CO

2-inkubaattorissa (Thermo Scientific ™). Alkuperäisen injektiopullo kunkin solulinjan laajentaa jopa 10 pulloa ja yksilöllisesti kryosäilöttiin vastaavaan soluviljelyväliaineessa, jota oli täydennetty 20% FBS: ää ja 10%: iin dimetyylisulfoksidia (DMSO) (Sigma-Aldrich ™) muodostavan solun pankki.

Finasteridi Exposure ja elinkykyyn

Kaikki solulinjat sulatettiin sitten ja yksilöllisesti ympättiin 2 x 10

4 solua /cm

2 6-viljelylevyille (TPP ™). Kokeet suoritettiin kolmena kappaleena. Finasteridi pitoisuudet valittiin perustuvat edellisessä tutkimuksessa, jossa 10 uM ja 50 uM indusoi merkittäviä metabolisia modulaatio upon eturauhasen tuumorisoluissa [17]. Päästyään 60% konfluenssiin, solut pestiin kolme kertaa steriilillä D-PBS: ssä (GIBCO /Invitrogen ™), ja suositeltava viljelyalustaan ​​(FBS free) lisättiin seuraavasti: 1) kontrolli käsittely – täydennetty 0,1% DMSO: ta; 2) pieniannoksisen finasteridin käsittely – täydennettynä 0,1% DMSO plus 10pM finasteridi (Sigma ™); ja 3) korkea-annos Finasteridi käsittely – täydennettynä 0,1% DMSO plus 50 uM finasteridi (Sigma ™). Finasteridi laimennettiin DMSO: hon, ja DMSO /finasteridi liuos laimennettiin viljelyalustaan. Kaikissa finasteridi altistuminen hoidot, solut havaittiin alle faasikontrasti- käännettyä mikroskooppia (Zeiss ™) yleisen morfologian ja bakteerien ja sienten saastuminen. 24, 48 ja 72 tunnin altistuksen jälkeen väliaine (CM) otettiin talteen ja erikseen säilytettiin -80 ° C: ssa. Loput Liitteenä solut erikseen hakea trypsiinillä pilkkomalla, ja alikvootti arvioitiin kannattavaksi trypaanisineä värjäystä. Jäljelle jääneet solut erikseen sentrifugoitiin 1200 rpm 10 minuuttia, jolloin saatiin solupelletti tuottamiseksi proteiinin uutteita. FBS poistettiin aikana finasteridia valotuksen koska se tiedetään sisältävän korkeita MMP, joka häiritsisi myöhemmin Gelatinolyyttinen määrityksiä.

kunnostetun alustan ja solu-uute Processing

CM väkevöitiin 10X käyttämällä Centriprep® 10000 MWCO (Millipore ™) putket sentrifugoimalla 4900 rpm 30 minuuttia. Vastaavat Solupelletit toimitettiin proteiini uuttamalla käyttämällä in-house-tuotetaan 50 mM Tris-HCl, 0,2 M NaCl, 10 mM CaCl

2, 0,1% Triton X-100-proteiinin uuttopuskuria täydennetty 1% proteaasiestäjäseostabletit (Sigma-Aldrich ™), jolloin saatiin solu- uutteet. Proteiini uuttopuskuria valittiin jälkeen verrattuna kaupallisesti saatavilla puskuria (RIPA-puskuri, Thermo Scientific ™), joka paljasti paremmin säilyneitä MMP Gelatinolyyttinen aktiivisuutta zymografian (tuloksia ei ole esitetty). Proteiini uutto suoritettiin toistuvia pipetoimalla ja vorteksoimalla, ja sen jälkeen 1 tunnin levon jäällä ja lopullinen sentrifugointi 5000 rpm 20 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Lopuksi CM ja proteiinia uutteet toimitettiin proteiinin kvantifiointiin käyttäen NanoDrop 2000 (Thermo Scientific ™) spektrofotometrillä ja Protein A280 /260-protokollaa. On tärkeää korostaa, että CM oli FBS ilmaiseksi; Siksi, kaikki proteiinit CM tuotettiin solujen.

MMP2 ja MMP-9 Activity Analyysit

Yhteensä (pro-muoto + aktiivinen muoto) MMP2 ja MMP-9 toimintaa CM ja solu-uutteiden mitattiin käyttäen Biotrak® -aktiivisuusmäärityksiä (GE Healthcare LifeSciences ™) mukaan valmistajan ohjeita. Lyhyesti, yhtä suuret määrät (100 ug) yhdistetään CM tai solu-uute (per kolmena kappaleena käsittely) pipetoitiin 96-kuoppalevylle, päällystettiin anti-ihmis–MMP2 tai anti-ihmis-MMP-9-vasta-aineita. Standardit ihmisen yhdistelmä-pro-MM2 tai pro-MMP9 pipetoitiin kuoppiin, joiden arvot vaihtelevat 0,19-3 ng /ml (for MMP2) ja 0,125-4 ng /ml (for MMP-9) kuin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Sen jälkeen kun oli inkuboitu yön yli 4 ° C: ssa ja pesu, 50 ui 0,5 mM p-aminophenylmercuric asetaattia (APMA) pipetoitiin kaikkiin kuoppiin aktivoida pro-muotojen MMP2 ja MMP9. Sen jälkeen 50 ui detektioreagenssia (modifioitu urokinaasi + S-2444 ™ peptidisubstraatti) lisättiin kaikkiin kuoppiin. Levyjä inkuboitiin 37 ° C: ssa 6 (MMP2) tai 2 tuntia (MMP-9), ja integroitu optinen tiheys (IOD) mitattiin 405 nm: ssä käyttäen spektrofotometrisellä levynlukijalla. Lopuksi kertamuutosta graafinen tehtiin jakamalla saatu IODs hoidetuista CM /otteita niiden valvonta-arvot. Vaihtoehtoisesti MMP2 ja MMP9 toimintaa arvioitiin käyttäen standardia gelatiinitsymografialla, kuten aiemmin on kuvattu [16].

TIMP-1 ja TIMP-2-proteiinin kvantitointi

TIMP-1 ja TIMP-2 proteiinipitoisuuden lasku CM mitattiin kiinteän faasin ELISA Biotrak® Human Analyysit (GE Healthcare LifeSciences ™) mukaan valmistajan ohjeita. Lyhyesti, yhtä suuret määrät (100 ug) yhdistetään CM (per kolmena kappaleena käsittely) pipetoitiin 96-kuoppalevylle, päällystettiin anti-ihmis-TIMP-1 tai anti-ihmisen-TIMP-2-vasta-aineita. Standardit ihmisen rekombinantti TIMP-1 tai TIMP-2: ta pipetoitiin vastaaviin kuoppiin, joiden arvot vaihtelevat 3,13-50 ng /ml (ja TIMP-1), ja 8-128 ng /ml (ja TIMP-2). Sen jälkeen, kun 2 tunnin inkuboinnin 25 ° C: ssa ja pesu, 100 ui peroksidaasikonjugaattia pipetoitiin kaikkiin kuoppiin, ja levyjä inkuboitiin edelleen 2 tuntia 25 ° C: ssa. Sen jälkeen, 100 ui tetrametyylibentsidiiniä (TMB) /vetyperoksidiliuosta lisättiin kaikkiin kuoppiin. Levyjä inkuboitiin huoneen lämpötilassa 30 minuuttia, ja IOD mitattiin 630 nm: ssä käyttäen spektrofotometrisellä levynlukijalla. Lopuksi kertamuutosta graafinen tehtiin jakamalla saatu IODs hoidetuista hoitoja niiden kontrolliarvoihin.

migraatiokokeessa

muuttopotentiaalia Kaikkien solulinjojen tutkittiin käyttäen BD BioCoat ™ Migration Insert (BD Biosciences ™). Huokoinen kalvo (8 um huokoskoko), hydrattiin 500 ui seerumitonta bikarbonaatti-väliaineessa 2 tuntia. Hydraation jälkeen, 500 ui RPMI 1640 -alustaa, jossa oli 5% FBS: ää (ja LNCaP, PC3 ja DU145-solut) tai 500 ui keratinosyyttien väliainetta, jossa 5% FBS: ää (ja RWPE-1-soluissa) lisättiin alempaan kammioon 24-kuoppaisen levy. Nämä eturauhasen solulinjat aiemmin viljeltiin 50 uM finasteride keskipitkällä tai vertailualustassa 72 tunnin ajan, kerättiin ja erikseen viljeltiin 200 pl seerumia (tai ilman 50pM finasteridia) insertin tiheydellä 1 x 10

5 solua yhteensä. Levyjä inkuboitiin 5% CO

2 37 ° C: ssa 22 tunnin ajan mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Solut, jotka eivät muuttaneet, jotka sijaitsevat päällä insertin kalvon, kaavittiin pois pumpulipuikolla. Solut, jotka vaelsivat kalvon huokosten läpi, jotka houkuttelevat FBS, fiksattiin 100% metanolilla ja värjättiin 0,1% toluidiinisinisellä liuosta 2 minuuttia. Siirrettyjä soluja digitaalisesti valokuvattiin 200X suurennuksella valomikroskoopilla (Nikon ™). Kokeet suoritettiin kolmena kappaleena ja 5 satunnainen kentät valokuvattiin ja alistettiin soluun laskemalla käyttäen ImageJ® vapaita ohjelmistoja. Siirtyminen indeksi laskettiin keskiarvo ± SD solujen laskettiin per-kentän, ja ohjaus soluja verrattiin finasteridia käsiteltyjä soluja. Ihmisen ihon fibroblasteja (WS1- ATCC) käytettiin positiivisina verrokkeina ja altistettiin samat määritysolosuhteissa kuin eturauhasen soluja.

haavan paraneminen Pitoisuus

Solun muuttoliikettä tutkittiin tarkemmin käyttäen eri muuttoliikkeen määritys, PC3 ja DU145-solulinjat, jotka oli viljelty 6-kuoppalevyillä 4 x 10

4 solua /cm

2, kunnes 100% konfluenssiin saavutettiin. Yksisolukerrokset haavoittui (naarmuuntunut) suoraviivaisesti poikki hyvin 200 ui pipetin kärki käyttäen steriiliä, 6-kuoppaisen kuoppalevyn kuoppaa kantta hallitsija, saada säännöllistä naarmu. Haavoittuneen yksittäiskerroksia pestiin sitten kahdesti D-PBS: llä (GIBCO /Invitrogen ™) solujätteen poistamiseksi. Viljelyalusta tai ilman 50pM finasteridia lisättiin kontrolli- ja kaivoja. Haava-alue tarkastettiin myöhemmin 24, 48, 72 ja 96 tuntia käyttäen käänteisen faasikontrastimikroskooppia digitaalikamera. Haava paranemista nopeutta laskettiin prosenttiosuutena alkuperäisen haavan kunnes koko haava suljetaan eri ajankohtina käyttäen ImageJ® vapaita ohjelmistoja.

matrigeelin invaasiomääritys

invasiivisia potentiaalit Kaikkien neljä solulinjoja tutkittiin käyttämällä BD BioCoat ™ matrigeelin ™ Invasion lisäosien (BD Biosciences ™). Matrigel-pinnoitettu huokoinen kalvo (8 um huokoskoko), hydrattiin 500 ui seerumitonta bikarbonaatti-väliaineessa 2 tuntia. Hydraation jälkeen, 500 ui RPMI 1640 -alustaa, jossa oli 5% FBS: ää (ja LNCaP, PC3 ja DU145-solut) tai 500 ui keratinosyyttien väliainetta, jossa 5% FBS: ää (ja RWPE-1-soluissa) lisättiin alempaan kammioon 24-kuoppaisen levy. Nämä eturauhasen solulinjat aiemmin viljeltiin 50 uM finasteride keskipitkällä tai vertailualustassa 72 tunnin ajan, kerättiin ja erikseen viljellään 200 ul seerumia (tai ilman 50pM finasteridia) insertin tiheydellä 1 x 10

5 solua yhteensä. Levyjä inkuboitiin inkubaattorissa 5% CO

2 37 ° C: ssa 22 tuntia, mukaan valmistajan ohjeita. Uninvaded solut päällä insertin kalvon raaputettiin pois pumpulipuikolla. Solut, jotka tunkeutuivat Matrigel matriisi ja siirtynyt vastakkaiselle puolelle kalvon, jotka houkuttelevat FBS, fiksattiin 100% metanolilla ja värjättiin 0,1% toluidiinisinisellä liuosta 2 minuuttia. Tunkeutuneet Solut digitaalisesti valokuvattiin 200X suurennuksella valomikroskoopilla (Nikon ™). Kokeet suoritettiin kolmena kappaleena ja 5 satunnainen kentät valokuvattiin ja alistettiin soluun laskemalla käyttäen ImageJ® vapaita ohjelmistoja. Invaasio indeksi laskettiin keskiarvo ± SD solujen laskettiin per-kentän, ja ohjaus soluja verrattiin finasteridia käsiteltyjä soluja.

Western-blottaus

Loput solu-uutteita käytettiin määrittämään AR ekspressiotasot. Tämä määritys suoritettiin, koska poikkeava kirjallisuudessa näiden reseptoreiden ekspression näiden solulinjojen. Lyhyesti, proteiini näyte (70 ug), joka oli aiemmin mittaamaan NanoDrop 2000 (Thermo Scientific ™) spektrofotometriä ladattiin 10% SDS-PAGE-geelillä pelkistävissä olosuhteissa. Proteiinit siirrettiin nitroselluloosakalvolle (Sigma Co ™), joka on tämän jälkeen tukittiin 5% naudan seerumialbumiinia (BSA) 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl: a ja 0,1% Tween-20 (TBS- T) 1 tunnin ajan. Membraanit inkuboitiin sitten 4 ° C: ssa yön AR (Genetex ™) vasta-ainetta. Kalvot pestiin 5 kertaa 5 minuuttia TBS-T: n ja inkuboitiin 2 tuntia huoneen lämpötilassa asianmukaista, peroksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita (Abcam ™). Pesun jälkeen TBS-T, kalvot visualisoitiin käyttämällä 3,3′-diaminobentsii- ja valokuvataan.

Tilastollinen analyysi

Saadut tiedot analysoitiin käyttämällä INSTAT ™ ohjelmiston kahden tailed Studentin t-testiä (P 0,05) vertailla erilaisia ​​hoitoja ja niiden valvonta (elinkelpoisuus, maahanmuutto, invaasio), tai käyttämällä ANOVA ja Dunnet post hoc testi (MMP ja TIMP määritykset).

tulokset

finasteridi Exposure ja elinkykyyn

Solujen elinkelpoisuus ei vaikuttanut merkittävästi jommankumman finasteridin annoksia, jotka olivat esillä olevassa tutkimuksessa. Solut eivät esittäneet näkökohtia solukuoleman tai menetyksestä elinkelpoisuus, vaikka 72 tunnin jälkeen 50 uM finasteridi altistuminen (kuva S1).

MMP2 ja MMP-9 Activity Analyysit

ohjaus olosuhteissa, se havaittu, että PC3-soluja erittää kaksi kertaa niin paljon MMP2 ja MMP9 niiden CM kuten RWPE-1-soluja (IOD arvot – tietoja ei ole esitetty). LNCaP-solut eivät eritä havaittavia määriä MMP2 tai MMP9 niiden CM (IOD arvot data – ei ole esitetty). Kuitenkin, DU145-soluja erittää suuria määriä MMP2 ja MMP9 (kuva 1a). Solun uutteet, ei solulinja esitetty havaittavissa MMP2 tai MMP9 toimintoja, jotka osoittavat, että nämä solulinjat eivät pidä MMP niiden kalvon (tuloksia ei ole esitetty).

a) Vakioitu alusta (CM) käsittelemättömien (kontrolli ) ja finasteridi käsiteltyjen DU145 solut kerättiin, konsentroitiin ja analysoitiin MMP2 ja MMP-9 toimintaa käyttäen gelatiinitsymografialla määritystä. (S) Standards, (P) Tissue uute mahahaava, jota käytettiin positiivisena kontrollina. Nämä solut erittyy suuria määriä MMP2 ja MMP-9 niiden CM, mikä näkyy kirkas bändit tummalla taustalla. b) Korkea-annos Finasteridi (50 uM) vaimentua MMP2 aktiivisuus jopa 43% 72 tunnin kuluttua altistuksen, kuten mittaamaan ImageJ ™ -ohjelmistoa. Tiedot ilmaistaan ​​kertamuutosta graafisesti IOD arvot saatiin bändejä (a) luku finasteridia käsiteltyjä soluja haltuunsa soluja. (**) Tilastollisesti merkitsevä arvoja p 0,01. Kokeita tehtiin kolmena kappaleena.

Kun finasteridia altistumisen havaittiin, että RWPE-1 solut palveluksessa pienellä annoksella (10 uM), 72 tunnin altistus oli riittävä aiheuttamaan merkittäviä downregulation sekä toiminnan sekä MMP: iden CM (kuvio 2a); nämä arvot alenivat 25% ja 30% MMP2 ja MMP-9, vastaavasti, suhteessa kontrolliarvoihin. Toisaalta, että palveluksessa finasteridi suuren annoksen (50 uM), The MMP2 ja MMP-9 toimintaa merkittävästi vaimentua kaikkina ajankohtina, jotka testattiin, jopa 90% ja 55% 72 tunnin kuluttua altistuksen, vastaavasti (kuva 2a) .

a) elatusaine käsittelemättömän (Control) ja finasteridia saaneilla RWPE-1 solut kerättiin, konsentroitiin ja analysoitiin MMP2 ja MMP-9 toimintaa käyttäen omia Biotrak® aktiivisuusmäärityksillä. Pieni annos Finasteridi (10 uM) 72 tunnin altistuksen vaimentua MMP2 ja MMP9 aktiivisuutta 25% ja 30%, vastaavasti, verrattuna kontrolliarvoihin. High-annos Finasteridi (50 uM) vaimentua MMP2 ja MMP-9 toimintaa kaikilla testatuilla ajankohtina, jopa 90% ja 55% 72 tunnin kuluttua altistuksen, vastaavasti. b) Vakioitu alusta käsittelemättömän (Control) ja finasteridia saaneilla RWPE-1 solut kerättiin, konsentroitiin ja analysoitiin TIMP-1 ja TIMP-2-proteiinin ilmentymisen käyttäen omia Biotrak® määritykset. Finasteridi altistuminen, molemmilla annoksilla, indusoi säätelyä TIMP-2-ilmentymisen 72 tunnin kohdalla, jopa 150% enemmän ilmaisun kuin kontrolli tasolle. Data on ilmaistu kertamuutosta graafisesti IOD arvoja, jotka saatiin finasteridin käsiteltyjä soluja yli kuin torjunta-soluja. (*) Tilastollisesti merkitsevä arvoja p 0,05.

PC3-solulinjassa, pieniannoksisen finasteridin altistus indusoi merkittävän downregulation MMP2 ja MMP-9 toimintaa ainoastaan ​​24 tunnin kohdalla (kuvio 3a ). Toisaalta, korkea-annos finasteridi merkittävästi indusoi downregulation MMP2 klo 48 tunnin ja 72 tunnin ajankohtina ja MMP-9 kaikkina ajankohtina, jotka arvioitiin, jopa 70%: n vähennys (kuva 3a).

a) elatusaine käsittelemättömien ja finasteridin käsiteltyjen PC3-solut kerättiin, konsentroitiin ja analysoitiin MMP2 ja MMP-9 toimintaa käyttäen omia Biotrak® aktiivisuusmäärityksillä. Pieniannoksisen Finasteridi altistus (10 uM) ei indusoinut downregulation MMP2 tai MMP9 pl klo 24 tunnin kohdalla. Korkean annoksen finasteridin indusoi downregulation MMP2 klo 48 tunnin ja 72 tunnin ajankohtina ja MMP-9 kaikkina arvioidaan ajankohtina, jopa 70% vähennys. b) Vakioitu alusta käsittelemättömän (Control) ja finasteridia saaneilla PC3-solut kerättiin, konsentroitiin ja analysoitiin TIMP-1 ja TIMP-2-proteiinin ilmentymisen käyttäen omia Biotrak® määritykset. Finasteridi altistuminen ei aiheuttanut merkittävää modulaatio TIMP-1 ja TIMP-2: n ilmentymisen, paitsi 10gM finasteridi annos 24 tunnin kuluessa altistumisesta. Data on ilmaistu fold-muutos IOD saatuja arvoja finasteridin käsiteltyjen solujen yli kontrollisoluihin. (*) Tilastollisesti merkitsevä arvoja p 0,05.

Koska tulokset muista solulinjoista osoitti, että vain korkea-annos Finasteridi kohdistuu vaikutuksia MMP toimintaa, vain suuren annoksen 72 tunnin tutkittiin varten DU145 solulinjan. Sillä DU145 solulinjaa, korkea-annos finasteridi indusoi merkittävän downregulation MMP2 toimintaa noin 43% (kuvio 1 b) (p 0,01). Kuitenkin MMP-9: n aktiivisuudet eivät merkittävästi moduloitu finasteridi altistus (kuvio 1 b).

TIMP-1 ja TIMP-2-proteiinin kvantitointi

Kun solulinjoja viljeltiin ilman finasteridi, PC3-solut tuottivat kaksi kertaa enemmän TIMP-1 kuin RWPE-1-solut; kuitenkin, määrä TIMP-2 oli sama (IOD-arvot). LNCaP-solut tuottivat alhaisia ​​TIMP-1 ja TIMP-2, joka lähestyi alempi detektioraja määrityksen (IOD-arvot). DU145-solut tuottivat korkeita määriä TIMP-1 (IOD arvot – tietoja ei ole esitetty).

Kun finasteridi altistuminen testattujen RWPE-1-solulinjassa, sekä annoksilla merkittävästi indusoi ylössäätely TIMP-2: n ilmentymisen on 72 tunnin ajankohta, joka on jopa 150% enemmän ilmentymistä kuin ohjaus käsittelyä (kuvio 2b). Kuten PC3-soluja, TIMP-1 ja TIMP-2: n ilmentymisen ei ollut merkittävää modulaatiota, lukuun ottamatta 10 uM finasteridi annos 24 tunnin altistus (kuvio 3b). Finasteridi ei aiheuttanut merkittäviä muutoksia ilmaisua TIMP-1 tai TIMP-2 LNCaP tai DU145 solulinjoissa (tuloksia ei esitetty).

migraatiokokeessa

tavanomaisessa viljelyväliaineessa, The testattu solulinjoissa ilmeni eri muuttoliikkeen potentiaaleja. RWPE-1-soluissa liikkui enemmän (keskiarvo 32 solua /kenttä) kuin PC3-solut (keskiarvo 24 solua /kenttä), joka puolestaan ​​siirtynyt enemmän kuin LNCaP-soluja (keskiarvo 8 solua /kenttä). DU145 oli kaikkein vaeltavat solulinja tutkittiin (keskiarvo 85 solua /kenttä) (kuva 4). 72 tunnin finasteridia altistuksen (50 uM), muuttoliike estyi merkittävästi RWPE-1-solut (p 0,01) ja LNCaP-soluja (p 0,05). PC3 ja DU145 solumigraatio oli hieman estyy; kuitenkin, inhibitio ei ollut merkittävä (p 0,05) (kuvio 4). Ihmisen WS1 fibroblasteissa (positiivinen kontrolli) siirtyi nopeasti kalvojen läpi (kuva 4).

eturauhasen solulinjojen aiemmin viljeltiin 50 uM finasteridi tai ohjata väliaine 72 tuntia ja erikseen viljellään 200 ul: ssa seerumitonta keskipitkän (tai ilman 50pM finasteridia) maahanmuuttoprosessissa insertin tiheydellä 1 x 10

5 solua yhteensä. 22 tunnin kuluttua solut, jotka vaelsivat läpi 8 um huokoinen kalvo kiinnitettiin, värjättiin ja lasketaan viiden satunnaisen kentät valomikroskoopilla. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Edustavia mikrovalokuvia käsittelemättömien ja finasteridin käsiteltyjä soluja näkyvät vasemmalla puolella. Ihmisen fibroblasteja (WS1 solulinja) työskentelivät maahanmuuttoon positiivisena kontrollina soluja, ja edustava kuva näkyy alhaalta vasemmalta puolelta. Mittakaava = 40 pm. Finasteridi inhiboi merkittävästi solun migraation RWPE-1 ja LNCaP solulinjoissa, mutta ei PC3 ja DU145 solulinjat. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD vaeltavat solut. (*) Tilastollisesti merkitsevä arvoja p 0,05. (**) Tilastollisesti merkitsevä arvoja p 0,01.

haavan paraneminen Pitoisuus

Sen varmistamiseksi, että PC3 ja DU145 solulinjaa muuttoliikettä potentiaaleja ei vaikuttanut finasteridi altistuminen, eri migraatiomääritys suoritettiin näistä solulinjoista. Kun haava alue aiheutuminen yksisolukerroksista, voitiin todeta, että molempien solulinjojen, finasteridin hieman esti solujen vaeltamiseen (kuvio 5a ja 5c); kuitenkin, tämä ero ei ollut merkittävä (kuvio 5b ja 5d), joka vahvisti tulokset, jotka oli saatu aiemmin siirretyt insertin määrityksessä (kuvio 4).

Soluja viljeltiin 6-kuoppalevyillä 4 x 10

4 solua /cm

2, kunnes 100% konfluenssiin saavutettiin. Yksisolukerrokset naarmuuntunut suorassa linjassa, ja haavoittuneita yksisolukerrokset sitten annettiin viljelyalustaan ​​tai ilman 50pM finasteridia. Haava-alue tarkastettiin 24, 48, 72 ja 96 tuntia käyttäen käänteisen faasikontrastimikroskooppia digitaalikameralla. a) edustaja esittävät kuvat haavansulkemiseen finasteridi-käsiteltyjen ja kontrolli PC3-solujen 0-72 tuntia. Red korostettiin alueet edustavat avoimen haavan alueella. Mittakaava = 50 pm. b) Alkuperäinen punainen esiin alueita mitattiin käyttäen ImageJ ™ -ohjelmistoa, ja loput alueet laskettiin prosentteina alkuperäisestä haavan alueella. Haava-suljin graafinen tehtiin jakamalla alueen arvoja, jotka saatiin tällä ilmoitettuina ajankohtina torjunta- ja finasteridi käsiteltyjä soluja. Finasteridi hieman esti solujen vaeltamiseen; kuitenkin, tämä ero ei ollut tilastollisesti merkitsevä (p 0,05). c) edustaja esittävät kuvat haavansulkemiseen finasteridi-käsiteltyjen ja kontrolli DU145 solujen 0-72 tuntia. Red korostettiin alueet edustavat avoin haava-alueella. Mittakaava = 50 pm. d) Kuten havaitaan PC3-solut, finasteridin hieman esti solujen vaeltamiseen (p 0,05).

matrigeelin invaasiomääritys

tavanomaisessa viljelyväliaineessa, solulinjat osoittivat eri hyökkäys potentiaalit . DU145 ja PC3-solut olivat invasiivisia solulinjoista, joiden avulla 97 solua /kenttä ja 75 solua /kenttä, vastaavasti (kuvio 6). LNCaP-solulinja, joka oli myös kasvainten, uteliaana osoitti alhainen invasiivisia potentiaali, ja keskiarvo oli 5 solua /kenttä (Kuva 6). Ei kasvaimen solulinja RWPE-1 oli myös alhainen invasiivisia potentiaali, odotetusti, ja keskiarvo oli 9 solua /kenttä (kuva 6).

eturauhasen solulinjojen aiemmin viljeltiin 50 uM finasteridi tai valvontaa väline 72 tuntia ja erikseen viljellään 200 ul seerumia (tai ilman 50pM finasteridia) on Matrigelillä® hyökkäyksen insertti tiheydellä 1 x 10

5 solua yhteensä. 22 tunnin kuluttua solut, jotka hyökkäsi läpi matrigeelin matriisin ja huokoinen kalvo kiinnitettiin, värjättiin ja lasketaan viiden satunnaisen kentät valomikroskoopilla. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Edustavia kuvia käsittelemättömien ja finasteridin käsiteltyjä soluja näkyvät vasemmalla puolella. Mittakaava = 40 pm. Finasteridi estivät merkittävästi soluinvaasiota kaikkien testattujen solulinjojen. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD hyökkääviä soluja. (*) Tilastollisesti merkitsevä arvot, jossa p 0,05. (**) Tilastollisesti merkitsevä arvot, jossa p 0,01. (***) Tilastollisesti merkitsevä arvot, jossa p 0,001.

Finasteridi esti soluinvaasiota kaikissa testattujen solulinjojen. DU145 ja PC3 soluinvaasion väheni merkitsevästi (p 0,001), minkä jälkeen RWPE-1 (p 0,01) ja LNCaP (p 0,05) (kuvio 6).

Western-blottaus

AR havaittiin uutteita LNCaP ja RWPE-1-solulinjoja, kuten odotettua. Kokeet suoritettiin kolmena kappaleena.