Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Koska solun signalointi ja solujen metaboliareitteihin toteutetaan kautta proteiineja, proteiini allekirjoitukset primaarikasvainten ovat hyödyllisiä tunnistaa keskeiset solmut signalointi verkoissa, joiden muutos liittyy pahanlaatuisuuteen ja /tai kliinisiä tuloksia. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli selvittää proteiinin allekirjoitusten ensisijainen keuhkosyövän kudoksiin.

Menetelmät /Principal Havainnot

Analysoimme 126 proteiineja ja /tai proteiinin fosforylaatio sivustoja asia vastaaviin normaaleihin ja kasvaimen näytteitä 101 keuhkojen syöpäpotilaat käänteisfaasin proteiinijärjestelmäksi (RPPA) määritys. Tulokset osoittivat, että 18-molekyylit olivat merkittävästi erilaiset (

p

0,05) vähintään 30% normaalin ja kasvaimen kudoksissa. Useimmat näistä molekyyleistä rooleja solujen lisääntymisen, DNA korjaus, signaalitransduktion ja rasva-aineenvaihduntaan, tai toimivat solun pinnan /matriksiproteiinien. Olemme myös validoitu RPPA tulokset Western blot ja /tai immunohistokemiallinen analyysit joistakin molekyyleistä. Tilastolliset analyysit osoittivat, että Ku80 tasot olivat merkittävästi korkeammat kasvaimissa tupakoimattomien kuin niissä tupakoitsijoita. Sykliini B1 tasot olivat merkittävästi yli-ilmentyy heikosti eriytetty kasvaimet samalla COX2 tasot olivat merkitsevästi yliekspressoituvat neuroendocrinal kasvaimia. Korkea Stat5: n liittyy suotuisa selviytymisen tulokseen hoidetuilla potilailla leikkauksen.

Johtopäätökset /merkitys

Tulokset paljastivat, että jotkut molekyylit osallistuvat DNA-vaurioiden /korjaus, signaali transductions, rasva-aineenvaihdunnan ja solujen lisääntymistä olivat huomattavasti poikkeava keuhkosyövän kudoksiin, ja Stat5: n voi palvella molekyyli- merkkiaine ennusteeseen keuhkosyövässä.

Citation: Hän Y, Zhou Z, Hofstetter WL, Zhou Y, Hu W, Guo C , et ai. (2012) Poikkeava proteiinien ekspressio Osallisena Signaalinvälittyrnismääritykset ja DNA korjaus Väylät Lung Cancer ja niiden yhteyksiä kliinisiin parametrit. PLoS ONE 7 (2): e31087. doi: 10,1371 /journal.pone.0031087

Editor: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 21 heinäkuu 2011; Hyväksytty: 02 tammikuu 2012; Julkaistu: 10 helmikuu 2012

Copyright: © 2012 He et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukevat National Cancer Institute apurahat: R01CA-092487 (myönnetty BF), RO1CA-124951 (myönnetty BF), National Institutes of Health Core Grant 3P30CA-016672-32S3, The University of Texas MD Anderson Cancer Center Support Grant CA- 016672 – Lung Program ja Functional Proteomiikka Reverse-Phase Protein Array Core laitos, Homer Flower Gene Therapy Research Fund, Charles Rogers Gene Therapy Fund, Flora ja Stuart Mason Lung Cancer Research Fund, Charles B. Swank Memorial Fund for ruokatorven syöpä tutkimus, George O. Sweeney rahaston ruokatorven syöpä tutkimusministeriö, Phalan rintakehä Gene Therapy Fund, ja MW Elkins Endaumentin rahastolle Thoracic Surgical Oncology, Chapman Foundation, National Natural Science Foundation of China (81172113, 81071912) ja ”1510 projekti ”kolmannen Military Medical University of China (myönnetään YH). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Molecular profilointi keuhkosyövän geenijärjestelyillä määrityksissä mRNA ja microRNA on johtanut tunnistamiseen molekyyli allekirjoituksia, jotka ovat mahdollisesti käyttökelpoisia ennustettaessa potilaan selviytymisen ja sairaus on uusiutunut ja /tai vastauksena yksittäisiin kemoterapeuttisten perustuu hierarkkiseen ja todennäköisyyspohjainen klusterointi mRNA [1] ja microRNA tasolla [2]. Myös tutkimukset yhden nukleotidin polymorfismien genomisen DNA: n ovat johtaneet potentiaalisten geenilokusten kromosomissa 15q25 alueen [3], jotka koodaavat asetyylikoliinin nikotiinireseptorin alayksikön geenit, jotka ovat erittäin liittyy keuhkosyövän herkkyys. Kuitenkin, useimmat geenit, ei ole merkittävää korrelaatiota mRNA: ta ja proteiinia tasolla [4]. Siten avain signalointi polkuja, jotka heijastavat taudista muuttamassa prosesseja vielä tunnistamatta. Koska useimmat signaalitransduktion, ja reitti asetus tehdään proteiinit, joille posttranskriptionaalisella muutoksia, kuten fosforylaation, jota ei voida havaita DNA, mRNA tai miRNA analyysit, karakterisointi proteiinin tasoja ja proteiini fosforylaatio tila on tarpeen saada proteiinia allekirjoituksia, jotka heijastavat funktionaalisia ja /tai metabolisen muutoksia keuhkosyöpä ja /tai vastaus terapeuttisia aineita, kuten kinaasin estäjät.

on pyritty määrittämään proteiinin allekirjoitusten keuhkosyöpä käyttämällä kaksiulotteista geelielektroforeesia ja sen jälkeen proteiinin tunnistus massasta spektrometria määritys tai käyttämällä suoraa massaspektrometrialla analyysit [5]. Vaikka tämä tekniikka on käyttökelpoinen proteiinien tunnistamiseksi differentiaalisesti ilmaistut tuumorikudoksissa, se ei todennäköisesti ole mukautettavissa nopean tekirjastoja tarpeen kliiniseen käyttöön, koska aikaa vievää prosesseja, mahdollisuus signaalin epäpuhtaudet, koska tuhansia datapisteiden mukana analyysissä, ja mahdollinen korruptio tietokokonaisuuksien vuoksi kokeellisen suunnitteluun liittyviä asioita [6].

viime kynnyksellä proteiinin sirutekniikalla voi antaa meille mahdollisuuden tunnistaa kriittiset solmut tai vuorovaikutusta verkon solun signalointireittien . Etuna RPPA menetelmä on se, että yksittäinen testi koetin (vasta-aine) käytetään kunkin matriisin, joten testaus ehto on yhdenmukainen kunkin vasta-aineen, jolloin saadaan parempi toistettavuus ja herkkyys kuin toisen proteiinin array tekniikoita. Perusteellisesti arvioida ja tunnistaa vasta, joka on RPPA voidaan käyttää havaitsemaan signaalin eroja muutama tuhat molekyyliä testaamalla [7]. Tämän vuoksi tämä tekniikka on käyttökelpoinen muutosten seurantaan proteiinin tasot ja proteiinin fosforylaatio ajan, ennen ja jälkeen hoidon, välillä kasvaimen ja normaaleissa kudoksissa, ja niiden välillä vasteen ja ei-vastetta. Kun ero tavoitteet on tunnistettu, on mahdollista käyttää tavanomaisia ​​menetelmiä testata pienessä määrässä molekyyli biomarkkereita ennustetta tai ennustamiseen hoitovasteen. Tätä varten olemme keränneet tapauksessa, sovitettu normaalien ja malignien keuhkojen kudosnäytteistä 101 potilasta ja määrittää niiden proteiinien tasot ja proteiinin fosforylaatio tilat käyttäen RPPA menetelmää ja 126-vasta-aineita. Täällä me raportoimme että useat molekyyli solmut, jotka ovat ratkaisevia soluunkiinnittymisaktiivisuutta, DNA korjaus, solujen lisääntymistä, ja signaalitransduktion oli ilmennetty eri normaalin ja syöpäkudokset, jotkut niistä liittyi kliinisten parametrien, mukaan lukien selviytyminen tuloksia.

tulokset

potilaiden ja kasvainten ominaisuuksiin

Keräsimme tapauskohtaisesti vastaaviin normaaleihin ja pahanlaatuisten keuhkojen kudosnäytteitä 101 potilasta. Ominaisuudet niille potilaille ja kasvaimia on esitetty yhteenvetona taulukossa 1. Potilaat olivat iät 42-86 y, joiden keski-ikä 65 y, ja 55% oli naisia. Suurin osa potilaista (93%) oli valkoihoisia. Adenokarsinooma ja okasolusyöpä oli 56% ja 31% histologisia tyyppejä, vastaavasti. Suurin osa potilaista (66%) oli vaiheen I sairaus. Noin 50% kasvaimista oli huonosti eriytetty, ja 40% oli kohtalaisen eriytetty. Yhdeksänkymmentä potilasta (89%) oli ollut tupakoinnin /tupakointi. Kaksikymmentäneljä potilaista oli neoadjuvanttikemoterapian, ja yhdellä oli neoadjuvant sädehoitoa.

Differential Expression välillä kasvain ja normaali kudokset paljasti RPPA

Kunkin näytteen ja jokaisen vasta-aine, signaali on RPPA määrityksiä verrattiin normaalin ja kasvaimen kudoksissa. Signaalin välinen ero normaalien ja tuumorikudosten laskettiin seuraavasti: [(keskimääräinen kasvaimen kudokset-keskiarvo normaalien kudosten) /(keskiarvo normaaleissa kudoksissa x 100%)]. 126 proteiineja tai fosforylaatiopaikkaa analysoidaan, 18 oli signaalin eroja, jotka olivat suurempia kuin 30% ja ne olivat tilastollisesti merkittäviä (

p

0,05) kaikissa normaaleissa ja kasvainnäytteet analysoitiin (taulukko 2). Nämä 18 molekyylejä voidaan luokitella molekyylit liittyvät soluproliferaatioon (sykliini B1), sovitin molekyylejä signaalin siirtoon (14-3-3zeta, insuliinireseptorisubstraatti 1-pS307, ja IGFBP2), molekyylejä rasva-aineenvaihduntaan (COX2 ja ACC-pS79), molekyylit osallisena DNA-vaurioiden vastaukset (Ku80, Chk2, ja ATM), solun pinnalla tai matriisin molekyylejä (caveolin 1, CD31, ja kollageeni tyyppi VI), ja molekyylejä signalointireitteihin (PI3K /AKT-reitin: PI3K-p85, mTOR, ja S6K Src /Stat-reitin: Stat5: n ja Src, ja MAP-kinaasireitin: p38-pT180). Signaali intensiteetit sykliini B1, IGFBP2, ja caveolin 1 kudosnäytteitä kulloinkin on esitetty esimerkkeinä esitetty. 1. Useimmat näistä molekyyleistä on raportoitu kriittisiä rooleja erilaisten syöpien tai on muuttunut ekspressio erilaisissa syövissä. Esimerkiksi menetys caveolin 1 ilmaisun [8], [9] ja yli-ilmentyminen sykliini B1 [10], [11] keuhkosyöpää kudosta on aiemmin raportoitu tutkimuksissa cDNA taulukot ja immunohistokemiallisella analyysillä.

A) Signaalin voimakkuus (Y-akseli) jokaista tapausta (X-akseli) ja molekyylien sykliini B1, IGFBP2, ja caveolin 1. B) alighted jakeluun signaaleja normaaleissa ja tuumorikudoksissa.

Koska 88 101 tapauksessa tässä tutkimuksessa olivat joko adenokarsinooma tai okasolusyöpä, analysoimme ovatko nämä 18 molekyylit olivat merkittävästi erilaiset normaalin ja kasvainkudoksen näytteitä kaksi suurta alatyyppiä ei-pienisoluisen keuhkosyövän. Tulokset osoittivat, että 13 18 molekyylien olivat merkittävästi erilaiset normaalin ja kasvainkudoksen sekä adenokarsinooma ja okasolusyöpä (p≤0.05, taulukko S2), joka on löytää samanlainen kuin havaittiin, kun kaikki näytteet analysoitiin yhdessä. Kaksi molekyyliä (COX2 ja S6) eivät olleet merkittävästi erilaiset, kun adenokarsinooma ja okasolusyöpä analysoitiin erikseen, kun taas PI3K-p85, Src, ja mTOR pysyivät huomattavasti toisistaan ​​normaalin ja kasvaimen kudosten adenokarsinooma mutta ei okasolusyöpä. Olipa PI3K /mTOR /S6 ja Src reitit ovat kriittisempiä adenokarsinooma kuin okasolusyöpä vai onko tämä löydös johtui pienempi määrä okasolusyöpä näytteitä tutkimuksessa ei ole selvä.

validointi RPPA data

suoritettiin Western blotting-analyysi molekyylejä, joiden ilmaisuja muutettiin suhteellisen suuri määrä tuumorikudoksissa, mukaan lukien sykliini B1, caveolin 1, kollageeni VI, ACC1 /pS79, Chk2, ja IGFBP2. Tulokset osoittivat, että saadut tiedot Western blot-analyysi täsmäsi kuin RPPA määrityksen (Fig. 2, Fig. S1), joka osoittaa, että saadut tiedot RPPA määrityksessä on luotettava ja voidaan vahvistaa Western blot -analyysillä.

sykliini B1, caveolin 1, kollageeni tyyppi VI, ACC-pS79, Chk2, ja IGFBP2 normaalissa ja ensisijainen keuhkojen kasvain kudoksia analysoitiin Western blot ainakin neljässä tapauksessa, joissa RPPA osoitti signaaliero normaaleissa ja tuumorikudoksissa. Western blot Tulokset olivat yhdenmukaisia ​​tuottamien RPPA.

Ei RPPA määrityksessä eikä Western blot-analyysi tarjotaan tietoa siitä, mitä tyyppisiä soluja, kasvain tai strooman, osaltaan eroja havaittu. Määrittää solutyyppejä, jossa proteiinit ilmentyvät eri teimme immunohistokemiallinen analyysit viisi molekyylien (ACC-pS79, Chk2, IGFBP2, sykliini B1, ja caveolin 1) näytteistä, joka osoitti ero normaalin ja kasvaimen kudoksissa. Tulokset osoittivat, että erot ilmaus kaikki viisi molekyylit olivat peräisin muuttunut ekspressio syöpäsoluissa, mutta ei stroomasolut (Fig. 3). Silmiinpistävää heterogeenisyys proteiinin ilmentyminen kasvainsoluissa havaittiin sykliini B1. Vain osa kasvaimen solut värjättiin voimakkaasti sykliini B1-vasta kun taas muiden kasvainsolujen samassa kasvain oli hyvin vähäinen tai negatiivinen värjäys sykliini B1, mahdollisesti koska eri tilasta solunjakautumissykliä. Sykliini B1 ilmentyminen on tunnetusti solusyklin riippuvainen ja saavutti G2 /M [12]. Yli-ilmentyminen tai häviämisen ilmaisun muiden molekyylien oli paljon vähemmän heterogeeninen.

lisääntynyt ilmentyminen ACC-pS79, Chk2, IGFBP2, sykliini B1, Stat5: n, ATM, ja Ku80 ja vähentynyt ilmentyminen caveolin 1 kasvainkudoksissa verrattiin normaaleissa kudoksissa samasta esitetyissä tapauksissa withconsistent kanssa havaintojen tuottamia RPPA ja Western blot -analyysit. 40 x suurennus.

Nanjundan

et al.

Raportoi äskettäin RPPA profilointi analyysi 46 keuhkosyöpää 63 proteiineja tai proteiinin fosforylaatio sivustoja ja havaittiin useita proteiineja ilmentyy differentiaalisesti ensisijainen keuhkosyöpä kudoksia [13]. Siksi verrattiin tuloksia nykyisen tutkimuksen kanssa, Nanjundan tutkimuksessa. Kaksi tutkimuksissa käytettiin täysin erillistä näytejoukoille. Kaikki käytetyt näytteet Nanjundan tutkimuksessa kerättiin ennen 2000, kun taas näytteet, joita käytetään tässä tutkimuksessa kerättiin sen jälkeen kun 2006 Neljäkymmentäkahdeksan proteiinien /proteiini phosphoryaltaion sivustoja testattiin molemmissa tutkimuksissa. Kahdeksan yhdestätoista (72,7%) markkereita, jotka olivat merkittävästi erilaisia ​​normaalin ja syövän kudosten Nanjundan tutkimuksessa on samanlaisia ​​merkittäviä eroja nykyisen tutkimuksissa. Kolme molekyylit (27,3%) (FAK, β-kateniinin ja AKT), jotka olivat merkittävästi erilaiset (p = 0,002-0,003) in Nanjundan tutkimuksessa ei ollut merkittävää tässä tutkimuksessa. Tämä tulos osoittaa, että validointi RPPA tulokset erillisistä tutkimuksista on tärkeää, vaikka suurin osa eri ilmaisi molekyylit ovat yhdenmukaisia ​​kahden tutkimuksen.

kolme (caveolin-1, sykliini B1 ja Src-pY527) of neljä merkki allekirjoitus, joka erottaa NSCLC normaalista keuhko Nanjundan tutkimuksessa olivat myös merkitsevää eroa normaalin ja kasvaimen kudokset nykyisen tutkimuksissa. Siksi käytetään Nanjundan koulutus setti (25 tapausta) testata, ovatko nämä kolme markkeri allekirjoitusta voitaisiin käyttää erottamaan koko datajoukon (101 tapausta) nykyisen tutkimuksen. Tulos osoitti, että nämä kolme merkkiä, joko yksinään tai yhdistelmänä, voivat erottaa kasvaimen normaaliin nykyisen tutkimuksen eri tarkkuudet, herkkyydet ja spesifisyydet (taulukko 3). Yleensä yhdistelmä kahdesta tai kolmesta markkereita parantaa joko tarkkuus, herkkyys tai spesifisyys.

Assosiaatio Clinical Data

Analysoimme onko ilmaus 18 molekyylien taulukossa 2 tuumorikudoksista oli liittynyt kliinisiä parametrejä. Tilastollinen analyysi paljasti, että tasot näiden molekyylien kasvainkudoksissa eivät merkittävästi yhteydessä kliinisessä vaiheessa tai sukupuoli. Kuitenkin ilmaus Ku80 oli merkitsevästi suurempi näytteitä potilaista ilman tupakoinnin historiaa kuin tupakoinnin historia (

p

= 0,004). Expression of sykliini B1 oli merkitsevästi korkeampi huonosti eriytetty kasvain kudosten kuin kohtalaisen tai hyvin erilaistunut kasvain kudosten (

p

0,025). Toisaalta, ilmaus ATM, Ku80, ja S6 oli merkitsevästi korkeampi hyvin eriytetty tuumorikudoksista kuin huonosti tai kohtuullisesti erilaistunut kasvain kudosten (Fig. 4). Kun sen erilaisissa histologisia tyyppejä verrattiin, ilmaukset ATM, Ku80, IGFBP2, insuliinireseptorisubstraatti 1-pS307, ja S6 olivat merkittävästi korkeammat neuroendocrinal karsinooma kuin adenokarsinooma tai okasolusyöpä (

p

0,05). Tämä tulos viittaa siihen, että ekspression tiettyjen molekyylien oli dramaattisesti erilainen neuroendocrinal kasvaimissa verrattuna kuin adenokarsinooma tai okasolusyöpä, kun taas tasojen differentiaalisesti ilmennettyjen proteiinien taulukossa 1 olivat enemmän tai vähemmän samanlainen adenokarsinooma ja okasolusyöpä. Kuitenkin, koska on suhteellisen alhainen määrä neuroendocrinal kasvaimia tässä tutkimuksessa käytetty, ei ole selvää, onko olemassa tietty molekyyli allekirjoitus tämän syöpä.

Proteiinitasot kasvainkudoksissa havaittu RPPA määrityksessä analysoitiin yhdistysten kliinisen parametrin potilaista. Molekyyli, joka oli merkitsevästi erilainen kasvaimissa perustuu kliinisiin parametreihin analysoitiin näkyy päällekkäin kaavio. Kliiniset parametrit näkyvät alaosassa kunkin kaavion. Histologia ja erilaistuminen diagnoosit perustuivat patologisen raporttien kliinisessä tietokannassa. * Tarkoittaa, että ero oli merkittävä verrattuna muihin ryhmiin samaan kuvaajaan (

p

0,05).

Assosiaatio Survival Outcomes

Määritä onko taso proteiinit liittyvät kliinisiin tuloksiin, teimme selviytyminen analyysi differentiaalisesti ekspressoidun proteiinin markkereita on esitetty taulukossa 1, käyttäen Kaplan-Meier-menetelmää. Lyhyesti, me erottaa potilaat kahteen ryhmään perustuu mediaani ilmaus arvo kunkin yksittäisen markkerin, nimetty korkea ja matala ilme ryhmiä, ja sitten käyttämällä Kaplan-Meier Algoritmi eloonjäämiskäyriä kahden määritellyille kunkin merkin. Tulos osoitti, että tasot Stat5: n liittyi merkittävästi selviytymisen työtuloksiinsa analysoidaan sekä vaiheen I-III potilailla (p = 0,032) ja vaiheen I potilailla vain (p = 0,014) (Kuva. 5). Potilaat, joilla on korkea Stat5: n niiden tuumorikudoksissa oli suotuisa selviytymistä työtuloksiinsa verrattuna alemman tason Stat5: n, mikä viittaa siihen, että Stat5: n voisi olla hyödyllinen markkeri ennusteeseen keuhkosyövässä.

Kaplan-Meier-analyysi on yhdistys Stat5: n tasoja ja selviytymisen tuloksia vaiheen I-III (A) (n = 50 kussakin ryhmässä), ja I vaihe vain (B) potilailla (n = 33 Stat5: n korkean ryhmän 34 Stat5: n alhainen ryhmä).

keskustelu

Analysoimme molekyylitason eroja tai proteiinia fosforylaation tasojen välillä normaalin ja keuhkosyövän kudosten 101 näytteiden RPPA määrityksen. 126-molekyylit analysoitiin tunnistimme 18-molekyylejä, jotka olivat merkittävästi ( 30%) ja tilastollisesti merkitsevä (

p

0,05) eroa normaalin ja kasvaimen näytteitä. Western blot-analyysi ja /tai immunohistopatologista määrityksiä useiden molekyylien validoitu saadut tulokset RPPA paneelit, jotka osoittavat, että tulokset RPPA analyysin ovat luotettavia. Lisäksi vertaamalla RPPA tutkimus suoritetaan toisen potilaan näytteiden osoitti, että tulokset RPPA profiloinnin olivat erittäin toistettavia ja johdonmukainen erillisissä tutkimuksissa erilliset potilaan näytteitä. Tuloksemme osoittavat myös, että ilmaus useiden molekyylien tuumorikudoksissa liittyi tupakoinnin historia, erilaistumista ja histopatologisia tyypit keuhkosyövässä.

Useat biomarkkereiden tunnistettu täällä ovat yhdenmukaisia ​​raportoitu kirjallisuudessa kannalta niiden muuttuneen geeniekspressioiden kasvainkudoksissa, kuten caveolin 1 [8], [9], sykliini B1 [10], [11], 14-3-3zeta [14], Stat5: n [15], aktivoitu p38 [16], ja IGFBP2 [17]. Kuitenkin jotkut molekyylit, joitakin ristiriitaisia ​​tuloksia saatiin muiden aiemmin. Esimerkiksi Chk2 lauseke tai sen aktivointi havaittiin vähentynyt ei-pienisoluinen keuhkosyöpä kasvain kudosten kaupallisesti saatavilla kudoksen array [18], tai lisääntyi 50% kirurgisesti toistoleikattiin keuhko- ja rinta- kasvaimen näytteitä hoitamattomilla potilailla [ ,,,0],19]. Olemme havainneet, että Chk2 ekspressio lisääntyi sekä adenocarcima ja okasolusyöpä keuhkojen kudoksiin, jotka koostuvat kanssa raportoineet DiTullio et ai [19]. Lisääntynyt COX2 ekspressio havaittiin Tutkimuksessamme mutta se oli vähemmän kuin ilmoittama Hida et. al japanilaisten potilaiden, jossa merkittävä kasvu COX2 ilmentymistä havaittiin 70% invasiivisista adenokarsinooma tapauksia [20]. Tuloksemme oli sopusoinnussa raportoineet Khuri et al, joka havaittiin, että vain muutamissa tapauksissa oli vahva COX2 ilmentymisen tuumorikudoksissa [21].

Mielenkiintoista, tuloksemme osoittivat, että useat molekyylit osallistuvat DNA-vaurioiden /korjaus (ATM, Chk2 ja Ku80) korotettiin tuumorikudoksissa. Lisääntynyt mRNA tasot ATM ja DNA- PKcs, muttei Ku80, havaittiin kasvaimen kudoksissa verrattuna viereisten normaaleissa kudoksissa [22]. Kuitenkin vähän tiedetään ATM-proteiinin ilmentymistä ensisijainen keuhkosyövän kudoksia. ATM, Chk2, ja /tai Ku80 pidetään tuumorisuppressorigeeneille, jotka osallistuvat DNA-vaurioita vastauksena [23], [24]. Mielenkiintoista, konstitutiivinen aktivoituminen ATM /Chk2 polku todettiin p53 mutantti syöpäsoluissa [19]. Kasvu Näiden DNA-vaurioita vastaus /korjaaminen molekyylien kasvainkudoksissa voi heijastaa läsnäolo genomin epävakautta syöpäsoluissa, yhteinen piirre, joka erottaa syövät normaaleista kudoksista [25]. On huomionarvoista, että yli-ilmentyminen Ku80 löytyi pään ja kaulan alueen syövän ja ihosyöpää [26], [27], ja voi johtua aktivaation NFKB ja COX2 [28]. Vaihtoehtoisesti lisääntynyt ilmentyminen Ku80 ei-tupakoitsija potilaat tai neuroendokriinisiä kasvaimet saattavat heijastaa suuren kysynnän korjaamiseen kaksijuosteisen taukoja homologisella lopussa liittymällä niissä syöpä kudoksiin koska Ku80 on kriittinen tässä DNA korjaukseen liittyvän reitin. Nämä molekyylit voivat toimia markkerina syövän hoidossa on kohdistettu DNA korjaukseen liittyvä reitti [29]. Koska kaksikymmentäviisi potilasta mukana tässä tutkimuksessa oli useita neoadjuvant chemotherapies tai sädehoidon, analysoimme onko kasvanut ilmentyminen näiden molekyylien liittyi kemo- ja sädehoidon. Tilastollinen analyysi osoitti, että voimistunutta ilmentymistä ATM, Chk2 ja Ku80 ei liittynyt neoadjuvent kemoterapiaa tai sädehoitoa. Näin ollen, lisääntynyt ilmentyminen näiden DNA-vaurioiden /korjaus molekyylien epätodennäköistä indusoitiin käsittelemällä vaan luontainen ominaisuus primaarikasvainten.

Useat vapautettu tunnistettujen proteiinien tässä on tutkittu terapeuttisia kohteita syövän hoidossa. Pienet molekyylit tai estäjät kohdistaminen kasvutekijän reseptoreita ja PI3K /AKT /mTOR, Src /Stat, p38, ja ATM /Chk2 reittejä oli laajalti tutkittu syövän hoitoon, sekä esikliinisesti ja kliinisesti, mukaan lukien hoito keuhkosyövässä [29] – [ ,,,0],31]. Tuore tutkimus osoitti, että esto ATM tai Chk2 riittää herkistää p53 puutteesta kasvainsolujen muttei p53 villityypin soluissa, että genotoksinen kemoterapeuttisen aineen sisplatiini tai doksorubisiini [32], mikä viittaa siihen, että yhdistelmä sisplatiinin tai doxorubin pankkiautomaatti tai Chk2 inhibiittorit voisivat hyötyä potilaille kuljettaa p53 mutantti kasvaimia. Tuloksemme osoittivat myös, että lisääntynyt ilmentyminen Stat5: n voi olla suotuisa ennustetekijöitä biomarkkerina keuhkosyöpä hoidetuilla potilailla leikkauksen. Vaikka mekanismit vielä tutkittava tarkemmin, Stat5: n kuin tuumorimarkkeri suotuisan ennusteen on raportoitu rintasyövän [33] – [35] ja nenänielun syöpä [36]. Näyttö osoittaa, että Stat5: n edistää homotyyppistä adheesiota ja estää invasiivisen ominaisuudet ihmisen rinta- syöpäsolujen [34]. Onko sama tapahtuu keuhkosyöpään soluista on tutkittava tarkemmin. Kuitenkin merkittävä yhdistys Stat5: n kanssa kliinisiin tuloksiin, erityisesti I vaiheessa keuhkosyöpä, ehdotti, että Stat5: n voisi olla hyödyllinen ennustetekijöitä biomarkkeri keuhkosyöpään.

Materiaalit ja menetelmät

Human Lung Tissue näytteet

Normaali ja pahanlaatuisen keuhkokudoksesta kerättiin vuosien 2006 ja 2009 välillä poistaa kirurgisesti yksilöt alle tutkimussuunnitelman Lab-90-020 kanssa tietoisen suostumuksen potilailta. Tutkimuksen hyväksyi paikallinen eettinen komitea (Institutional Review Board The University of Texas MD Anderson Cancer Center). Normaali kudokset olivat vähintään 5 cm: n päässä reunasta vastaavan kasvaimia samassa yksilöitä. Sekä normaalissa ja kasvaimen kudokset kerättiin leikkaussalissa välittömästi sen jälkeen, kun näytteet oli poistettu potilailta. Kaikissa tapauksissa, histologia laadunvalvonta suoritettiin rintakehä patologi kudosleikkeissä. Kasvaimen näytteet mukana analyysissä, jos prosenttiosuus pahanlaatuisten solujen näytteessä olivat ≥70%. Normaali keuhko näytteet samoilta potilaat tarkistettiin sen varmistamiseksi, että ne eivät sisältäneet pahanlaatuisia soluja. Kaikki näytteet jaettiin kahteen osaan: yksi osa on välittömästi jäädytettiin ja varastoitiin nestemäisessä typessä proteiinin uuttamista; toinen osa kiinnitettiin formaliiniin ja upotettiin parafiiniin rutiini histologista tai immunohistokemiallista tutkimukset. Paria täsmäsi näytteitä otettiin talteen, käsitellään ja analysoidaan samalla, mukaan samoja protokollia.

RPPA Pitoisuus

RPPA määritys suoritetaan Functional Proteomics Reverse Phase Protein Array Core laitokseen meidän laitoksen kuten me aiemmin kuvattu [37]. Lyhyesti, kudosnäytteet pestiin kahdesti jääkylmällä PBS: llä ja sitten homogenisoitiin RPPA lyysipuskuria [1% Triton X-100, 50 mmol /L HEPES (pH 7,4), 150 mmol /L NaCl, 1,5 mmol /l MgCl

2, 1 mmol /l EGTA, 100 mmol /l NaF, 10 mmol /l Nappi, 10% glyserolia, 1 mmol /l Na

3Vo

4, 1 mmol /l fenyylimetyylisulfonyylifluoridia ja 10 ug /ml aprotiniinia]. Sentrifugoinnin jälkeen supernatantti otettiin talteen ja proteiinipitoisuus määritettiin rutiininomaisesti (

esim.

, Bradford) määritykset ja sitten säädettiin 1-1,5 mg /ml lisäämällä lyysipuskuria. Kudos lysaatit sekoitettiin 1/4 tilavuuden 4 x SDS-näytepuskuria, joka sisälsi 40% glyserolia, 8% SDS, 0,25 M Tris-HCl (pH 6,8), ja 10% (v /v) 2-merkaptoetanolia (juuri lisätty) . Kaksi kertaa sarjalaimennetun kudosta lysaatit (mistä laimentamattomana 1:16 laimennus) painettiin nitroselluloosalle päällystetyn dioja (Whatman, Inc.) käyttämällä GeneTAC G3 ryhmittäjällä (Perimän Solutions), sekä vastaavat positiiviset ja negatiiviset kontrollit valmistetaan laimennus puskuriin. Kaikkiaan 126 validoitu spesifisten vasta-aineiden proteiineja tai niiden fosforyloitu sivustoja, jotka ovat mukana erilaisissa signalointireitteihin oli saatavilla ja käytetään RPPA (katso taulukko S1 vasta Tässä tutkimuksessa käytetyt). Kukin dia koettimena validoitu primaarisen vasta-aineen sekä biotiini-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen. Signaali monistettiin käyttäen DakoCytomation katalysoivat järjestelmä (Dako) ja visualisoitiin 3,3′-diaminobentsidiinitetrahydrokloridilla kolorimetrisen reaktion. Levyjä skannattu, analysoitiin, ja kvantitoitiin käyttäen räätälöityjä ohjelmistoja, Microvigene (VigeneTech, Inc.), tuottaa spot intensiteettiä. Signaalit kustakin laimennus sovitettiin ei-parametrinen kehittämää laitoksella bioinformatiikan ja laskennallisen biologian MD Anderson [38]. Proteiinikonsentraatiot kunkin sarjan kalvot olivat normalisoidaan sitten ja korjata koko näytteiden lineaarisen ilmaisu arvot, käyttäen mediaani ekspressiotasoja kaikista vasta-aineen kokeiluja laskea lastaus korjauskerroin kullekin näytteelle, kuten aiemmin on kuvattu [13], [37] .

Western blot -analyysi

validoimiseksi tulokset RPPA määritykset, teimme Western blot analyysi osajoukon molekyylejä, jotka osoittivat merkitsevää eroa normaalien ja syöpäkudoksissa. Noin 40 mg kutakin jäädytettyä kudosta näytettä pestiin kahdesti kylmällä PBS: llä ja homogenisoitiin 0,5 ml: lla jääkylmää lyysipuskuria. Uutteet vastaa 50-60 ug kokonaisproteiinia erotettiin 10% SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla, siirrettiin nitroselluloosakalvoille. Western blot-analyysi suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [37]. Vasta-aineet IGFBP2, caveolin-1, Chk2 (1C12), ja fosfo-asetyyli-CoA-karboksylaasi (ACC-pS79) ostettiin Cell Signaling, vasta-aine, sykliini B1 on peräisin Epitomics, ja kollageenin tyyppi VI Santa Cruz Biotechnology.

immunohistokemiallinen värjäys ja arviointi

sama vasta-aineita käytettiin Western blot -analyysiä käytettiin immunohistokemiallisella värjäyksellä. Formaliinifiksoidusta ja parafinoidut kudosleikkeiden (5-pm paksu) poistettiin parafiini, sammutettua, ja kuumennettiin höyrystimen antigeenin haku. Objektilasit värjättiin sitten eri vasta-aineita, kuten edellä on kuvattu. Kudokset ei ole inkuboitu kontrollivasta-ainetta hiirille IgG sijaan primaarista vasta-ainetta käytettiin negatiivisena kontrollina.

Tilastollinen analyysi

Varianssianalyysi suoritettiin käyttämällä STATISTICA ohjelmisto (StatSoft, Inc. ) välisessä vertailussa ryhmissä. Opiskelijan

t

testiä käytettiin vertailuun kahden. Diagonaalinen lineaarinen erotteluanalyysi (DLDA) käytettiin luokitteluun ja ennustamista normaalien ja kasvaimen kudoksissa. Eloonjääntitulokset analysoidaan käyttämällä Kaplan-Meier menetelmällä ja Coxin suhteellista mallia.

p

-arvo 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

tukeminen Information

Kuva S1.

Proteiini tasot havaittiin Western blot analyysi 6 ylimääräistä tapauksissa IGFBP2 ja Chk2. IGFBP2 ja Chk2 normaalissa (N) ja ensisijainen keuhkojen kasvain (T) kudokset analysoitiin Western blot ylimääräisiä 6 tapauksissa, joissa RPPA osoitti signaaliero normaaleissa ja tuumorikudoksissa. β-aktiini käytettiin latauskontrollina.

doi: 10,1371 /journal.pone.0031087.s001

(TIF) B Taulukko S1.

Expression ero adenokarsinooma ja squamous syöpään. *

doi: 10,1371 /journal.pone.0031087.s002

(DOC) B Taulukko S2.

Proteiinit ja fosforylaatiopaikat käytetään RPPA tutkimuksissa.

doi: 10,1371 /journal.pone.0031087.s003

(DOC) B

Kiitokset

Kiitämme Markeda Wade toimituksellisista tarkastelua.