Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Keuhkosyöpä on johtava syy syövän kuolleisuus kaikkialla maailmassa, mutta terapeuttinen edistyneeseen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) on rajoitetusti tehokkaita. Lisäksi, validoitu histonideasetylaasi- (HDAC) estäjien kiinteiden kasvainten vielä kehitettävä. Tässä ehdotamme uutta HDAC estäjä, OSU-HDAC-44, kuten kemoterapeuttinen lääke NSCLC.

Menetelmät /Principal Havainnot

sytotoksisuus vaikutus OSU-HDAC-44 tarkasteltiin kolme ihmisen NSCLC solulinjojen A549 (p53 villityypin), H1299 (p53 null), ja CL1-1 (p53 mutantti). Antiproliferatative mekanismeja OSU-HDAC-44 tutkittiin virtaussytometrisellä solusyklin analyysi, apoptoosin määritykset ja genominlaajuisten chromatin immunosaostus-on-chip (Chip-on-chip) analyysi. Hiiret, joilla on todettu A549 -tuumoriksenografti käsiteltiin OSU-HDAC-44 tai ajoneuvon ohjaus ja käytettiin arvioitaessa vaikutuksia kasvaimen kasvuun, sytokineesin inhibitio ja apoptoosin. OSU-HDAC-44 oli yleiseurooppalainen HDAC estäjä ja sillä 3-4 kertaa enemmän tehoa kuin suberoylanilide hydroksaamihappo (SAHA) tukahduttamaan solujen elinkelpoisuuden erilaisissa NSCLC solulinjoissa. Kun OSU-HDAC-44 hoito, sytokineesin estyi ja johti sittemmin mitokondriot-välitteistä apoptoosia. Sytokineesiin esto johtui OSU-HDAC-44-välitteisen hajoamista mitoosin ja sytokineesiin sääntelyviranomaisten Auroroa B ja surviviinin. Vapautuminen F-aktiini dynamiikka aiheuttama OSU-HDAC-44 liittyi vähenemiseen RhoA aktiivisuuden johtuvat srGAP1 induktio. Chip-on-chip-analyysi paljasti, että OSU-HDAC-44 aiheuttama chromatin löystymistä ja helpottanut transkriptio geenien ratkaiseva signaalireitteihin kuten apoptoosin, aksoniohjauksen ja proteiinia ubikitinaatio. Lopuksi OSU-HDAC-44 tehokkaasti inhiboi A549 ksenograftin kasvaimen kasvua ja aiheuttama asetylointi histonien ja ei-histoni proteiineja ja apoptoosin

in vivo

.

Johtopäätökset /merkitys

OSU -HDAC-44 suppressoi merkittävästi kasvaimen kasvua indusoimalla sytokineesin vika ja luontainen apoptoosin prekliinisissä malleissa NSCLC. Tuloksemme antaa vakuuttavia todisteita siitä, että OSU-HDAC-44 on voimakas HDAC kohdennettu estäjä voidaan testata NSCLC kemoterapiaa.

Citation: Tang YA, Wen WL, Chang JW, Wei TT, Tan Y-HC, Salunke S, et ai. (2010) romaani histonideasetylaasi Inhibitor Näytteillä antituumorivaikutus kautta apoptoosin, F-Actin häiriintyminen ja Gene asetylointi in Lung Cancer. PLoS ONE 5 (9): e12417. doi: 10,1371 /journal.pone.0012417

Editor: Chun-Ming Wong, University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 22 helmikuu 2010; Hyväksytty: 02 elokuu 2010; Julkaistu: 14 syyskuu 2010

Copyright: © 2010 Tang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain apurahoja NSC97-2627-M-006-005 ja NSC99-2628-B-006-004-MY3 National Science neuvosto ja myöntää DOH98-TD-G-111-024 päässä Department of Health (sen Executive Yuan, Kiina). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on johtava syy syövän kuolleisuus kaikkialla maailmassa. 5 vuoden eloonjääneiden kokonaismäärästä ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) on alle 15% monissa maissa [1], [2]. Standardi terapeuttinen edistyneeseen NSCLC on platina-pohjainen kaksoisagenttia kemoterapia joka kuitenkin osoittaa tasapainotilaa tehon parantamisessa potilaiden selviytymiseen [3], [4]. Vain muutama ”tavoite aineet” ovat osoittaneet etuja, kun sitä käytetään yhdessä platinapohjaisen double-aine NSCLC kemoterapiaa, kuten bevasitsumabi, erlotinibi ja gefitinibi, vuonna potilasalaryhmässä [5], [6]. Siksi kehittää uusia molekyyli kohdennettuja lääkkeitä yleisempiä tehokkuus keuhkosyöpäpotilaita on välttämätöntä tehtävän.

epigeneettisellä muutoksia sekä geneettisiä muutoksia liittyy kasvaimen kehittymisen [7]. Tuoreessa raportissa yksilöidään että epigeneettiset muutoksille muutoksia histonien H2A ja H3 NSCLC potilaat vaikuttavat yleiseen eloonjäämiseen ja taudista vapaan eloonjäämisen, joka tarjoaa ennusteen arvioinnissa histonien muutoksia [8]. Se paljastaa myös perustelut huumeiden käyttöä vastaan ​​histonimodifikaation terapeuttisena strategiaa NSCLC.

histonideasetylaaseja (HDAC: t) ovat entsyymejä, jotka katalysoivat deasetyloinnin histonien ja epigeneettiseltä säädellä chromatin arkkitehtuuri ja geenien ilmentymisen. On osoitettu, että esto HDAC: t kääntää poikkeavien epigeneettisellä tila ja osoittaa voimakas antituumoriaktiivisuuksia indusoimalla solusyklin pysähtymiseen, erilaistumiseen ja /tai apoptoosin erilaisissa syöpäsoluissa [9], [10]. HDAC-inhibiittorit luokitellaan kuuteen ryhmään niiden kemiallisia rakenteita ja vähintään 12 heistä on edennyt kliinisiin tutkimuksiin [9], [11]. Tähän mennessä Yhdysvaltain elintarvike- ja lääkevirasto hyväksyy kaksi HDAC-inhibiittorit, vorinostat (SAHA, suberoylanilide hydroksaamihappo, Zolinza®) ja romidepsin (FK228, depsipeptidin, Istodax®), hoitoon ihoilmenemismuotojen ihon T-solulymfooman (CTCL ) [12]. Kuitenkin jotkut haittavaikutuksia esiintyy hoidetuilla potilailla vorinostat tai muiden HDAC-inhibiittorit, jotka voivat johtua korkeita pitoisuuksia käytettiin annosta hoidon aikana kiinteiden kasvainten kliinisissä tutkimuksissa [11], [13].

esillä olevassa tutkimuksessa, ehdotamme uusi luokka tehokkaita fenyyli–pohjainen HDAC-inhibiittori, OSU-HDAC-44 [4- (2,2-dimetyyli-4-fenyyli-butyryyliamino) –

N

– hydroksi-bentsamidi ], johdannainen tunnettu HDAC-inhibiittori,

N

-hydroksi-4- (4-fenyylibutyryyli-amino) bentsamidi (HTPB) [14]. Antitumoorinen toimintaa ja mekanismeja OSU-HDAC-44 tutkittiin NSCLC solussa ja hiirillä ksenograftimalleissa. Huomasimme, että OSU-HDAC-44 oli yleiseurooppalainen HDAC estäjä ja näytteillä 3-4 kertaa enemmän tehoa tukahduttamaan solujen lisääntymistä

in vitro

ja kasvaimen kasvu

in vivo

verrattuna SAHA tai trikostatiini A (TSA). Lisäksi OSU-HDAC-44 aiheuttama mitoosin ja sytokineesiin vika seurasi mitokondrioiden välittämää apoptoosia sekä solu- ja eläinmalleissa. Kromatiinin-immunosaostus-on-chip-analyysi paljasti genomin laajuinen tavoite geenejä, jotka indusoitiin OSU-HDAC-44-välitteisen hyperasetylaation kromatiinin. Tuloksemme viittaavat siihen, että OSU-HDAC-44 oli HDAC estäjä ja voitaisiin soveltaa kohdennettuja syöpälääkettä varten NSCLC kemoterapiaa.

Tulokset

OSU-HDAC-44 inhiboi solujen lisääntymistä ja näyttää synergiavaikutukset sisplatiinin kanssa riippumatta p53:

rakenne OSU-HDAC-44 ja SAHA: on esitetty kuviossa. 1A. Telakointi analyysi osoitti, että OSU-HDAC-44 vuorovaikutuksessa katalyyttinen domeeni HDAC 8, mikä viittaa suora funktio OSU-HDAC-44 kohdistamista HDAC: ien (Fig. 1 B).

(A) kemiallinen rakenne OSU -HDAC-44 ja SAHA:. (B) Molecular telakointi analyysi OSU-HDAC-44 ja SAHA:. Rakenteet OSU-HDAC-44 ja SAHA: laskettiin ja telakointi tilassa katalyyttinen domeeni HDAC8 ennustettiin käyttämällä telakointiohjelmaa GOLD 4.0.1. (C) annosriippuvaisesti vaikutukset OSU-HDAC-44 (

jäljellä

) ja SAHA (

oikea

) solujen elinkelpoisuutta IMR90, H1299, A549 ja CL1-1 soluja. Soluja käsiteltiin 0,5-10 uM OSU-HDAC-44 tai SAHA: ssa 48 tuntia, ja solujen elinkyky arvioitiin trypaanisiniekskluusiolla määrityksessä. (D) OSU-HDAC-44 synergized sisplatiinin tukahduttaa solujen lisääntymistä. Solut altistettiin sisplatiini (cis) yksin 4 h, OSU-HDAC-44 (HDAC-44) yksinään 48 tunnin ajan, tai esikäsitelty OSU-HDAC-44: ssa 48 tuntia ennen sisplatiinia hoito 4 h, ja sitten lääke oli vetäytyi ja soluja inkuboitiin lääkkeetön media lisää 48 tuntia. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin trypaanisinieksluusiolla määrityksessä. CL1-1 soluja käsiteltiin 4,4 uM sisplatiinin tai 0,3 uM OSU-HDAC-44. A549-soluja käsiteltiin 1,6 uM sisplatiinin tai 0,2 uM OSU-HDAC-44. Tiedot edustavat keskiarvoa ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. *

P

0,05; **

P

0,01; ***

P

0,001.

solukasvuneston toimintaa OSU-HDAC-44 arvioitiin kolmessa ihmisen NSCLC solulinjojen A549 (p53 villityypin) , H1299 (p53 null), ja CL1-1 (p53 mutantti). SAHA sisällytettiin positiivisena kontrollina HDAC estäjä. OSU-HDAC-44 esti merkittävästi solujen lisääntymistä kaikissa syöpäsolulinjoissa eroista huolimatta p53 taustalla, eikä aiheuttanut ilmeisiä sytotoksisuus IMR90 soluihin, normaali keuhko-solulinjassa (kuvio. 1 C). OSU-HDAC-44 tukahdutetaan solujen elinkelpoisuus A549 ja CL1-1 solujen submikromo- laarisena IC

50-arvot (0,65 ± 0,08 ja 0,67 ± 0,01 uM, tässä järjestyksessä) ja IC

50 arvo H1299 ekstrapoloitiin olevan 1,14 ± 0,14 uM. Varsinkin OSU-HDAC-44 näytteillä 3-4 kertaa enemmän tehoa kuin SAHA vuonna syövänvastainen kapasiteetti (IC

50: A549, 1,90 ± 0,16; CL1-1, 2,85 ± 0,27; H1299, 4,87 ± 0,98 uM). Lisäksi Fig. 1D osoitti, että OSU-HDAC-44 toiminut synergia sisplatiinin parantaa solukuolemaa CL1-1 ja A549-soluja, jotka olivat molemmat sisplatiini-resistentit solut.

OSU-HDAC-44 indusoi sytokineesiin eston ja apoptoosin

tutkimiseksi oleva mekanismi solujen kasvun tukahduttamisen OSU-HDAC-44, vaikutukset OSU-HDAC-44 solusyklin etenemisen arvioitiin virtaussytometrialla. Hoito 2,5 uM OSU-HDAC-44 24 tuntia aiheutti A549 ja H1299 solujen kerääntyä G2 /M vaiheessa (4N solut), ja tämän jälkeen johti apoptoosin (sub-G1-solut) 48 tunnin käsittely, kun altistus korkeamman pitoisuuden (5 uM) SAHA: ssa 48 tuntia oli samanlainen vaikutus (Fig. 2A), mikä osoittaa, että OSU-HDAC-44 kohdistuu voimakkaampi solusyklin sääntelyn vaikutus kuin ei SAHA. Tutkia solun seurauksia OSU-HDAC-44-välitteisen kertymistä 4N solujen nopeutus mikroskooppiset analyysit tehtiin. Kuten on esitetty kuviossa. S1A, OSU-HDAC-44 aiheutti ulkonäkö viallisen katkaisun vako rakenne ja kaksi tytär solut sulatettu takaisin yhteen, kun taas käsittelemättömät solut johdetaan normaalisti läpi solunjakautumisen. Yhtäpitävästi, noin 20% soluissa, joita käsiteltiin OSU-HDAC-44 oli kertynyt bi-tumallisia soluja, verrattuna alle 5% kontrollisolujen (Fig. 2B ja kuvio. S1B). OSU-HDAC-44 aiheuttivat mikrotumia muodostumista ja häirinnyt normaali rakenne F-aktiini A549 ja H1299-soluissa (kuvio. 2B). Näin ollen nämä tulokset viittaavat siihen, että OSU-HDAC-44 voi aiheuttaa poikkeavaa sytokineesiin ja johti sittemmin apoptoosin keuhkojen syöpäsoluja.

(A) vaikutukset OSU-HDAC-44 solusyklin jakeluun A549 ja H1299 solut. Soluja käsiteltiin 2,5 uM OSU-HDAC-44 tai 5 uM SAHA varten osoitetun kertaa ja arvioidaan virtaussytometrialla.

Vasen

, tulokset yhdestä edustavasta kokeesta esitetään.

Oikea

keskimääräinen prosenttiosuus G2 /M ja sub-G1 osa väestöstä on piirretty histogrammissa. (B) bi-tumallisten solujen ja dysregulaatio F-aktiini aiheuttama OSU-HSAC-44. Soluja käsiteltiin 2,5 uM OSU-HDAC-44 48 tuntia, ja sitten kiinnitettiin ja värjättiin DAPI (DNA) ja phalloidin (F-aktiini). Asterisk viittasivat bi-ydin. Mittaviivat: 30 pm. (C) OSU-HDAC-44 aiheuttama hajoaminen Aurora B ja surviviinista kautta 26S-proteasomin reitin.

Upper

, ajasta riippuvainen pienenemistä Aurora B ja Surviviiniproteiini tason jälkeen 2,5 uM OSU-HDAC-44 hoitoa.

Lähi

, A549-soluja käsiteltiin 2,5 uM OSU-HDAC-44: n läsnä tai poissa ollessa MG132: ssa 24 tuntia.

Ala

, A549-soluja käsiteltiin 2,5 uM OSU-HDAC-44: ssa 24 tuntia, ja solulysaatti saatettiin IP-määritys käyttämällä anti-Aurora B tai anti-surviviiniperäisten spesifisten vasta-aineiden ja niitä blotattiin anti-ubikitinaation-vasta-ainetta ( anti-Ub). (D) kaspaasiaktiivisuus määritys (

vasemmalla) B ja Western blot-analyysit (

Oikea) B vahvisti, että OSU-HDAC-44 aiheuttama luontainen apoptoosireitin. Soluja käsiteltiin 2,5 pM OSU-HDAC-44 osoitetun kertaa ja saatettiin kaspaasiaktiivisuus määritys ja Western blot -analyysit. Tiedot edustavat keskiarvoa ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. *

P

0,05; **

P

0,01.

tunnistamiseksi molekyylimekanismin mukana OSU-HDAC-44 aiheuttama sytokineesi esto, solusyklin-säätelyproteiineja tutkittiin. Värähtelyn mitoosi estäjä Weel ja mitoosi markkereita fosforyloituu histoni H3 ja sykliini B ilme osoitti, että OSU-HDAC-44-käsitellyt solut olivat M vaiheessa 12 tunnin kuluttua hoidon ja sen jälkeen poistutaan M vaiheessa (Fig. S1C), johon liittyy sytokineesin vika. Lisäksi OSU-HDAC-44 aiheutti proteiiniin heikkenee tasoilla Aurora B ja surviviini (Fig. 2C, ylempi), jotka ovat välttämättömiä etenemisen mitoosin ja sytokineesiin [15], [16]. Varsinkin OSU-HDAC-44 aiheuttama ubikinaa- Aurora B ja surviviinin ja yhteiskäsittely kanssa proteosomin estäjä MG132 esti OSU-HDAC-44 aiheuttama hajoaminen Aurora B ja surviviini (Fig. 2C, keski-ja alemman). Seuraavaksi käytimme nokodatsoli synkronoida soluihin ennalta metafaasiin ja edelleen vahvistaa, että OSU-HDAC-44 todellakin laukaisi epänormaali hajoaminen Aurora B ja surviviinista klo mitoottisiin vaiheessa. Kuten on esitetty kuviossa. S1D ja E, hoito nokodatsoli 24 tuntia aiheutti kertymistä Aurora B ja surviviinista proteiineja, kun taas yhdistelmä OSU-HDAC-44 ja nokodatsoli johti vähenee Aurora B ja Surviviiniproteiini tasojen päälle 24 tunnin kuluttua altistuksesta. Nämä tulokset viittaavat siihen, että OSU-HDAC-44-välitteisen epäonnistuminen sytokineesin saattaa osittain johtua downregulation Aurora B ja surviviinista proteiinien kautta 26S-proteasomin reitin.

OSU-HDAC-44 aktivoi luontainen apoptoottisen reitin

edelleen selvittämiseksi OSU-HDAC-44: n indusoiman apoptoosin, teimme fosfatidyyliseriini (PS) värjäys analysoi havaitsemaan varhaisessa vaiheessa prosessiin apoptoosin. Kuten on esitetty kuviossa. S2, OSU-HDAC-44 hoitoa 24 tuntia lisääntynyt intensiteetti PS värjäytymisen vastakohtana matalan värjäytymisen intensiteettiä heti DMSO hoitoa A549 ja H1299 soluja. Lisäksi OSU-HDAC-44 hoito merkitsevästi stimuloi kaspaasi-3 ja kaspaasi-9 (indikaattori luontaisen mitokondrioiden reitti) toimintaan 24 tunnin kuluttua hoidon taas kaspaasi-8 (indikaattori ulkoista membraanireseptoriin reitti) pysyi ennallaan A549 ja H1299-soluissa (kuvio. 2D, vasen). Lisäksi hoito 2,5 uM OSU-HDAC-44 12 tuntia vähensi antiapoptooppinen proteiini Bcl-x

L, mutta nousi pro-apoptoottisen proteiinin, Bad, 6-12 tuntia hoitoa A549 ja H1299-solut (Fig. 2D, oikealla). Vapautumista sytokromi c: sytosoliin mukana pilkkomalla pro-kaspaasi-9 havaittiin myös, kun OSU-HDAC-44 hoito 24-48 tuntia. Nämä tulokset vahvistivat lisäksi, että OSU-HDAC-44 voisi aiheuttaa luontainen apoptoottisen reitin keuhkojen syöpäsoluja.

OSU-HDAC-44 indusoi proteiinia asetylointi sen kyky kohdistaa lukuisia HDAC

biomarkkerit HDAC esto ovat asetylointi histoni ja ei-histoni proteiineja, ja induktio p21

CIP1 ilmentymistä p53-riippumattomalla tavalla [17], [18]. Altistuminen OSU-HDAC-44 indusoi asetylaatio histoni H3, histoni H4 ja p53: n annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 3A) ja ajasta riippuvaisella tavalla (kuvio. 3B), vaikka se ei vaikuta HDAC1 ja HDAC6 proteiinin tasot (Fig. 3B ja kuvio. S3). Erityisesti tällaisia ​​vaikutuksia olivat suurempia verrattuna SAHA. Huolimatta p53 tila, OSU-HDAC-44 indusoi ilmentymistä p21

CIP1 mRNA ja proteiini A549 ja H1299-soluissa (kuvio. S4). Tutkia kohde spesifisyys OSU-HDAC-44 luokan I, II ja IV HDAC,

in vitro

HDAC eston määritys suoritettiin. Kuten on esitetty kuviossa. 3C deasetylaasi- toimintaa eri HDAC isotyyppien lukien luokan I (HDAC1 ja HDAC8), luokka II (HDAC4 ja HDAC6), ja luokka IV (HDAC11) oli merkitsevästi inhiboi OSU-HDAC-44. Tällaiset vaikutukset olivat suuremmat verrattuna SAHA, tunnettu yleiseurooppalainen HDAC estäjä. Nämä tulokset viittaavat siihen, OSU-HDAC-44 aiheuttama proteiinin asetylaatio aiheuttamalla laaja estävä aktiivisuus perustuvat moniin HDAC: ien.

Annoksesta riippuvia vaikutuksia (A) ja ajasta riippuvia vaikutuksia (B) OSU-HDAC-44 on histoni ja ei-histoni-proteiinien. Ac-H3, asetyloitu histoni H3; Ac-H4, asetyloitu histoni H4; Ac-p53, asetyloitu p53; p53, yhteensä p53. (C) OSU-HDAC-44 tukahdutti toimintaa luokan I (HDAC1 ja HDAC8), luokka II (HDAC4 ja HDAC6), ja luokka IV (HDAC11) HDAC: t. Eri HDAC-isotyyppejä immunosaostettiin H1299 ydin- uutteesta spesifisiä vasta-aineita, ja sitten altistettiin

in vitro

HDAC inhibitiomäärityksessä, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät osassa. Tiedot edustavat keskiarvoa ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. **

P

0,01; ***

P

0,001.

OSU-HDAC-44 kasvattaa geenin ilmentymisen avaamalla kromatiinirakenteeseen

määrittämiseksi suorat vaikutukset OSU- HDAC-44 kromatiinin rakennetta ja geeniekspressiota, kromatiinin immunosaostus (chIP) -on-chip-analyysi suoritettiin käyttäen vasta-aine löysä kromatiinin tavaramerkki, asetyloidut lysiinien 9 ja 14 histoni H3 (H3K9K14Ac), kun 2,5 uM OSU- HDAC-44 hoitoa 2 tuntia A549 ja H1299 soluja. Induktio histoni asetylointi 33 yhteistä geenilokukset A549 ja H1299 tunnistettiin jälkeen OSU-HDAC-44 hoito (taulukko S1). Useat näistä 33 geenien oli osoitettu tärkeä rooli tiettyjen signalointireiteissä, kuten apoptoosi, oksidatiivisen stressin vastetta, aksoniohjauksen ja proteiinin ubikitinaatio reitit (taulukko 1). Vahvista microarray data, me validoitu kromatiinin rakenteen joidenkin geenilokusten lukien

srGAP1

,

NR4A1

ja

FOXO4

Chip-PCR: llä käyttäen vasta-ainetta H3K9K14Ac. Kuten on esitetty kuviossa. 4A, hoito 2,5 uM OSU-HDAC-44 2 tuntia korotti

srGAP1

,

NR4A1

ja

FOXO4

promoottori DNA irtonaisella kromatiinirakenteeseen verrattuna käsittelemättömiin solut. Yhtäpitävästi, mRNA tasot

srGAP1

,

NR4A1

ja

FOXO4

korotettiin jälkeen OSU-HDAC-44 hoitoa 24 tuntia (Fig. 4B).

(A) Kromatiini-immunosaostus-PCR-analyysit vahvistivat, että käsittely 2,5 uM OSU-HDAC-44 2 h indusoi asetylaatio histoni H3 (H3K9K14Ac) on promoottorialueen

srGAP1

,

NR4A1

ja

FOXO4

geenejä. (B) OSU-HDAC-44 lisäsi mRNA-tasoja on

srGAP1

,

NR4A1

ja

FOXO4

geenejä käyttäen reaaliaikaista RT-PCR-analyysit. Soluja käsiteltiin 2,5 pM OSU-HDAC-44: ssa 24 tuntia, ja kokonais-RNA uutettiin ja reaaliaikaisen RT-PCR-analyysit. Tiedot edustavat keskiarvoa ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. *

P

0,05. (C) Immunosaostaminen määritys osoitti, että lisääntynyt vuorovaikutus srGAP1 ja RhoA indusoitiin OSU-HDAC-44. A549-soluja käsiteltiin tai ei käsitelty 2,5 uM OSU-HDAC-44: ssa 24 tuntia ja suoritettiin IP-Western-analyyseillä. (D) si-srGAP1 kumosi OSU-HDAC-44 aiheuttama lasku RhoA aktiivisuuden (

ylempi

) ja pelasti normaali rakenne F-aktiini jälkeen OSU-HDAC-44 hoitoa (

alempi

). A549-soluja, jotka on transfektoitu srGAP1 siRNA hoidettiin 2,5 uM OSU-HDAC-44: ssa 24 tuntia ja saatettiin RhoA aktivaatiomääritys ja immunofluoresenssilla analyysit. Mittaviivat: 30 pm.

OSU-HDAC-44 down-regulation F-aktiini dynamiikka kautta srGAP1 induktion

OSU-HDAC-44 indusoi F-aktiini aggregaatiota (Fig. 2B). Aiempi tutkimus on osoittanut, että srGAP1 sitoutuu aktiivisten muotojen RhoA ja Cdc42 ja estää niiden toiminnan säätelyssä aktiini polymerointi hermosolujen [19]. Kuitenkin biologisen toiminnan srGAP1 sitoutumisen RhoA edelleen epäselvä muissa soluissa. Käyttämällä immunosaostuksella (IP) -Western, osoitimme että OSU-HDAC-44 lisäsi vuorovaikutusta srGAP1 ja RhoA A549 keuhkosyövän soluja (Fig. 4C). Mielenkiintoista on, että pudotus on srGAP1 paitsi poisti OSU-HDAC-44-välitteinen väheneminen RhoA-GTP tason (Fig. 4D, ylempi), mutta myös palautti dynamiikkaa F-aktiini jälkeen OSU-HDAC-44 hoitoa (Fig. 4D , alempi). Nämä tulokset osoittivat, että OSU-HDAC-44 alassäädetty RhoA toimintaansa osittain kautta srGAP1 induktion, joka johtaa tuhoaminen normaali F-aktiini kuituja.

OSU-HDAC-44 estää keuhkojen -tuumoriksenografti kasvu

in vivo

edelleen arvioimista antituumorivaikutuksen OSU-HDAC-44, Lamppu /c null hiirillä A549 keuhko -tuumoriksenografti ruiskutettiin intraperitoneaalisesti 7,5-30 mg /kg OSU-HDAC-44, 3 päivää /viikossa kolmen viikon ajan. TSA 0,5 mg /kg, joka on osoitettu osoittavan anti-kasvaimen kasvun vaikutukset vierassiirrekokeissa rinta- ja virtsarakon syövän solujen [20], [21], käytettiin positiivisena kontrollina lääkettä. Kuten on esitetty kuviossa. 5A, hoito 7,5, 15 ja 30 mg /kg OSU-HDAC-44 inhiboi merkittävästi kasvaimen kasvua 62%, 78% ja 90%, vastaavasti, 33. päivänä jälkikäsittely verrattuna ajoneuvon hallinnan. Hoito OSU-HDAC-44 ei vaikuta haitallisesti kehon painon ja aiheuttanut havaittavaa myrkyllisyyttä tutkittiin hematoksyliinillä ja eosiinilla värjäys tärkeimpien elinten (Fig. 6A, B). Hematologinen biokemia tutkimuksissa on normaalirajoissa varten OSU-HDAC-44 käsiteltyjen eläinten (Fig. 6C).

(A) Hiiret, joissa on perustettu A549 kasvaimet (-50 mm

3) ruiskutettiin intraperitoneaalisesti 7,5, 15 tai 30 mg /kg OSU-HDAC-44 tai 1,5 mg /kg TSA 3 päivää /viikossa kolmen viikon ajan. Kahdeksan hiirtä ryhmää kohti käytettiin ksenograftin kokeessa. Kasvaimen tilavuutta hiirillä mitattiin. Points, keskiarvo; virhepalkkien, 95%: n luottamusväli.

P

arvot olivat vertailussa ajoneuvon ohjaus (*

P

0,05; **

P

0,01; ***

P

0,001). (B-D) hiirillä vahvistettu (noin 100~200 mm

3) A549 kasvaimia ruiskutettiin intraperitoneaalisesti yhden annoksen OSU-HDAC-44 60 mg /kg. Hoidon jälkeen osoitetun ajan, kasvaimet kerättiin ja alistettiin Western blot tai immunohistokemia analyysejä. (B) Kasvaimet kahdesta edustavan hiiren kunkin aikapisteen (a-f) kerättiin ja alistettiin Western blot-analyysit käyttämällä mainituilla vasta-aineilla. (C) Immunohistokemia analyysit suoritettiin käyttäen vasta-ainetta vastaan ​​lohkaista-muoto kaspaasi 3 (väriltään). Alkuperäinen suurennus × 200. (D) Fluoresenssi immunohistokemia analyysit suoritettiin käyttäen vasta-ainetta vastaan, Aurora B ja DAPI (DNA). Kuvat (d-f ja j-l, asteikko baareja: 10 um) on suurennettu alkaen kehystetty olevista (a-c ja g-I, asteikko baareja: 30 pm).

(A) OSU-HDAC-44 hoidot eivät aiheuttaneet merkittävää kehon painon menetys testattujen eläinten. (B) H 0,05;