Krooninen sairaus

tiivistelmä

Nisäkkäillä vuorokausirytmin keskeinen generaattori koostuu vuorovaikutussuhteita kellon geenit, kuten

Per1 /2/3

,

Cry1 /2

,

Bmal1

, ja

Kello

. Vuorokausirytmin häiriöitä saattaa lisätä riskiä syöpää, ja sääntelyn purkaminen kellon geenit on yhdistetty moniin syöpätyyppeihin. Näistä geeneistä,

Per2

on raportoitu olevan kasvaimia estävä ominaisuuksia, mutta tiedetään vain vähän korrelaatio

Per2

ja HIF, joka on tärkein tavoite munuaissolukarsinooma (RCC) hoito . Tässä tutkimuksessa, rytminen ilmaus

Per2

geeni ei ollut havaittavissa munuaisten syöpäsolulinjoissa, lukuun ottamatta Caki-2-soluissa. In Caki-2-solut, HIF1α lisääntynyt amplitudi

Per2

värähtely suoraan sitoutumalla HIF-sitoutumiskohdan sijaitsee

Per2

promoottori. Nämä tulokset osoittavat, että HIF1α voi lisätä amplitudi

Per2

vuorokausirytmin.

Citation: Okabe T, Kumagai M, Nakajima Y, Shirotake S, Kodaira K, Oyama M, et al. (2014) Vaikutusten HIF1α on

Per2

vuorokausirytmin munuaisten Cancer Cell Lines. PLoS ONE 9 (10): e109693. doi: 10,1371 /journal.pone.0109693

Editor: Shin Yamazaki, University of Texas Southwestern Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 9. tammikuuta 2014; Hyväksytty: 12 syyskuu 2014; Julkaistu: 21 lokakuu 2014

Copyright: © 2014 Okabe et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

munuaissolukarsinooma (RCC) on yleisin maligniteetti aikuisten munuaisen, mikä on noin 2% syövistä maailmanlaajuisesti [1]. Somaattinen mutaatio Von Hippel-Lindaun (

VHL

) geeni on yleisin geneettinen muutos havaittu RCC [2], ja viimeaikaiset pyrkimykset ovat kohdistuneet VHL-hypoksian indusoima tekijä (HIF) -välitteisen hypoxia- aiheuttama geeni reitti RCC terapia [3]. HIFs ovat heterodimeerisiä transkriptiotekijöitä, jossa on kaksi rakenteellisesti sukua alayksiköstä: happi-herkkä HIFα alayksikön ja konstitutiivisesti HIFß tai aryylihiilivetyreseptori ydin- translocator (ARNT) alayksikkö [4]. Vuonna normoksia, HIFα molekyylit altistetaan sääntelyn prosessia entsymaattisen hydroksylaation säilyneitä prolyyli ja asparaginyylijäännökset, johtaa nopeaan VHL proteiini-välitteisen ubikinaation ja proteasomaalisten hajoaminen [5]. Hypoksia tai mutaatiot

VHL

geenin inaktivoivat tämän reitin. Lisääntynyt HIFα aktiivisuus ylössäätelee osallistuvien geenien monessa syövän etenemisen, kuten metabolinen sopeutuminen, apoptoottiset vastus, ja angiogeneesi [3]. RCC, voimakas kasvaimen verisuonten verkkoja voidaan katsoa johtuvan sopimatonta kerääntymistä HIFα johtaa angiogeenisen geenin induktion. Verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF) on yksi voimakkaimmista pro-angiogeenisten tekijöiden, joiden ilmentyminen on transaktivoidun HIF1α /ARNT sitoutumisen kautta hypoksia-vaste-elementti (HRE)

VEGF

promoottori [6] [7]. Lisääntynyt VEGF: n ilmentyminen liittyy myös pahanlaatuisten etenemisen ja huono hoitotuloksen [8]. Näin ollen tukahduttaa HIF-välitteisen geenin reitti voi olla tärkeä terapeuttinen strategia hoitoa varten RCC [3].

Monet fysiologiset, biokemiallisten ja käyttäytymiseen prosessit ovat alle vuorokausirytmin asetuksen, joka syntyy sisäinen aika -keeping mekanismi kutsutaan biologisen kellon lähes kaikissa organismeissa bakteereista nisäkkäisiin [9], [10]. Vuorokausirytmiä ohjataan geneettisiä verkostoja transkriptio-translaatio palaute silmukoita, joihin kellon geenit, kuten

Per1 /2/3

,

Cry 1/2

,

Bmal1

, ja

Kello

[11]. Yhteinen teema taustalla vuorokausirytmiä rytmiä on, että heilahdukset kello geenitranskriptien ovat seurausta solunsisäisen transkription translaation palaute silmukoita. Esimerkiksi nisäkkäillä, transkriptiotekijät CLOCK ja BMAL1 hetero- ja aktivoida ilmentymistä kolmessa

Per

geenit ja kaksi

Cry

geenejä sitoutumalla E-box elementtejä niiden promoottorien. Proteiini tuotteita näiden geenien multimerize ja siirtyvät tumaan, jossa PER ja HUUTO proteiinien tukahduttaa transkriptionaalista aktiivisuutta CLOCK-BMAL1 dimeeri [12], [13].

Näistä kellon geenit,

Per2

vastaa asettaa värähtelytaajuuden [14]. Lisäksi

Per2

on kasvain-vaimennin ominaisuuksia ja on usein mutatoitunut tai vaimentua ihmisen rintasyöpiä [15], [16]. Vuonna munuaissyöpä, muuttunut ilmentyminen

Per2

geeni on tiettävästi mukana taudin puhkeamiseen ja etenemiseen, mutta molekyylitason mekanismi vastaa edelleen epäselvä [17].

Tässä tutkimuksessa mittasimme tasot on

Per2

promoottorin aktiivisuutta ja mRNA kahdeksassa munuaisten syöpäsolulinjoissa deksametasonikäsittelyn jälkeen.

Per2

promoottorin aktiivisuutta ja mRNA-tasolla oscillated yli noin 24-h sykli Caki-2-solut, jotka sisältävät BMAL1, CLOCK, ja HIF1α proteiineja. Olemme myös havainneet, että HIF1α lisääntynyt amplitudi värähtelyn suoraan sitoutumalla HRE kaltainen elementti sijaitsee

Per2

promoottori. Nämä tulokset osoittavat, että HIF1α voivat vaikuttaa amplitudi

Per2

vuorokausirytmiä munuaisten syövän solulinjoissa.

Materiaalit ja menetelmät

Solut ja soluviljelmät, kemikaalit, ja entsyymit

perustettu ihmisen RCC solulinjat (A704, ACHN, 786-O, A498, 769-P, ja Caki-2) saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). RCC4 + pelkällä vektorilla ja RCC4 + VHL saatiin Sigma (St. Louis, MO, USA). Näiden munuaisten solulinjoja pidettiin yllä Roswell Park Memorial Institute (RPMI) -1640 väliaineessa (Kojin Bio, Tokio, Japani), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), 24 U /ml penisilliiniä ja 25 ug /ml streptomysiiniä (Gibco, Grand Island, NY, USA) standardin kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa ilmakehässä, jossa 5% CO

2. Käytimme myös hiiren fibroblastien NIH3T3 ja ihmisen osteosarkooma U2OS solumalleja autonomisen vuorokausirytmin kellon [18], [19]. Nämä solulinjat saatiin myös ATCC, ja pidettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM), jota oli täydennetty 10% FBS: ää, penisilliiniä (24 U /ml), ja streptomysiinillä (25 ug /ml). Chrysin ostettiin Sigma, ja sen puhtaus ylitti 96%. Kantaliuos chrysin valmistettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO). Chrysin liuotettiin DMSO: hon kolmessa eri pitoisuuksina (1, 10, ja 100 mM), ja lisättiin kukin 2 ui 2 ml viljelyväliaineeseen (lopullinen pitoisuus; 1, 10, 100 uM). Soluja käsiteltiin elatusaineet sisältävät 1, 10, 100 uM chrysin tai saman pitoisuuden DMSO kontrollina 2 tuntia.

Plasmidi rakentaminen

rakentamiseksi reportteri vektorit, joissa m

Per2

promoottori, m

Per2

promoottorin fragmentti (-279-112 bp, jossa +1 tarkoittaa oletetun transkription aloituskohdasta) oli polymeraasiketjureaktio (PCR) -amplified peräisin C57BL /6J hiiren genomin ja kloonattiin Nhel /Xhol-pGL3 Basic (Promega, Madison, WI, USA). Tulikärpäsen lusiferaasi (FLuc) korvattiin

Nco

I ja

Xba

I fragmentti pSV40-dFLuc, jolloin m

Per2

-dFLuc. HRE-mutantti m

Per2

promoottorireportterivektori tuottamista käänteinen PCR käyttäen KOD-Plus-mutageneesi Kit (Toyobo, Osaka, Japani).

Reaaliaikainen raportointi vuorokausirytmin-säänneltyjen geeni ilmaisu käyttämällä lusiferaasin bioluminesenssia

Kaikki solut ympättiin (5 x 10

4 maljaa kohti) on 35 mm: n malja 2 päivää ennen transfektiota, ja toimittaja transfektoitiin käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Sopiva määrä reportteriplasmidilla kunkin solulinjan määritettiin eroista transfektiotehokkuuden joukossa solulinjat. Yksi päivä transfektion jälkeen solut käsiteltiin 100 nM deksametasonia (Nakalai Tesque, Kioto, Japani) 2 h, ja elatusaine korvattiin elatusaineella ilman fenolipunaista, jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja 100 uM D-lusiferiini (Toyobo ). Bioluminenssi mitattiin 37 ° C: ssa 5% CO

2 ilmapiiri ja integroitu 1 min välein 10 min käyttäen lautasen-tyyppinen luminometriä, AB-2550 Kronos Dio (ATTO, Tokio, Japani) [20], [21]. Bioluminesenssi aktiivisuus ilmaistiin suhteellisina valon yksikköä (RLU). Kukin koe toistettiin ainakin neljä kertaa. Soluja viljeltiin luminometrissä vähintään 4 päivää, kun taas väline, lasketaan niiden bioluminenssin. Saatu raaka data (10-min kontissa) oli tasoitetaan 10 pisteen liukuvan keskiarvon menetelmää ja detrended vähentämällä 12 tunnin liukuvan keskiarvon tasoitettu data [21].

Analyysi vuorokausirytmin käyttäen bioluminescence

testaamiseksi merkityksen vuorokausirytmin rytmiä ja laskea vuorokausirytmin parametrit (eli ajanjakso, amplitudi, ja acrophase), suoritimme aTK analyysin Cosinor ladattujen ohjelmistojen vuorokausirytmin Laboratory (Walterboro, SC, USA) ohjelmiston kotisivu (https://www.circadian.org/software.html) [22], [23]. Vuorokausirytmin parametrit laskettiin käyttäen tietoja 1-5 päivää deksametasonikäsittelyn jälkeen.

Automatisoitu kuvien ottamista ja analysointia

NIH3T3-soluja ympättiin (5 x 10

4 kaivoa kohden) 6.- kuoppalevyille 1 päivä ennen transfektiota, ja ekspressioplasmidin transfektoitiin käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Yksi päivä transfektion jälkeen solut käsiteltiin 100 nM deksametasonia (Nakalai Tesque), 2 h, ja elatusaine korvattiin elatusaineella ilman fenolipunaista, jota oli täydennetty 10% FBS: ää. Solut värjättiin 0,1 ng /ml Hoechst 33342 (Invitrogen) 1 tunnin ajan ja analysoitiin käyttäen ArrayScan XTI (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA).

kvantifiointi mRNA reaaliaikaisella RT-PCR

Kaikki solut kerättiin 4 tunnin väliajoin kuudesta levyjä kunakin ajankohtana alkaa 24 tunnin kuluttua deksametasonihoito. Kokonais-RNA näistä soluista uutettiin käyttäen ISOGEN (Nippon Gene, Tokio, Japani) ja käänteistranskriboitiin.

Per2

ja

GAPDH

selostukset kvantitoitiin käyttäen ABI Prism 7300 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). PCR suoritettiin käyttämällä One Step SYBR PrimeScript RT-PCR Kit (Takara Bio, Kioto, Japani), jolla on seuraavat lämpökäsittelyyn parametrit: 94 ° C: ssa 5 min, jota seurasi 40 sykliä 94 ° C: ssa 20 s ja 62 ° C: ssa 1 minuutti.

GAPDH

transkriptio käytettiin normalisoimaan jokaisen näistä transkriptio. Vuorokausirytmin rytmiä merkitys analysoitiin käyttämällä Cosinor ohjelmistoa (vuorokausirytmin Laboratory) [22], [23]. Alukkeita kutakin geeniä suunniteltiin tietojen perusteella saatavilla National Center for Biotechnology Information (NCBI). PCR-alukesekvenssit olivat seuraavat:

Per2

(GenBank tulonumero., NM_022817, amplikonin, 85 bp): sense-aluke 5′-CACACACAGAAGGAGGAGCA-3 ’ja antisense-aluketta 5’- AGTAATGGCAGTGGGACTGG-3 ’.

GAPDH

(GenBank tulonumero., M33197, amplikonin, 185 bp): sense-aluke 5′- GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3′ ja antisense-aluketta 5′- GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3 ”.

lusiferaasianalyysissä

Transfektoituja NIH3T3-soluja käytettiin Lusiferaasimäärityksiä. Yksi päivä ennen transfektiota soluja siirrostettiin (5 x 10

4 kuoppaa kohden) 24-kuoppaisille levyille, jotka sisälsivät DMEM 10% FBS: ää, penisilliiniä (24 U /ml), ja streptomysiinillä (25 ug /ml). Solut transfektoitiin käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Kutakin näytettä varten on transfektoitu DNA: ta lisättiin kuhunkin kuoppaan. Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen solut pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja hajotettiin 100 ul: lla passiivisen lyysipuskuria (Promega). Lusiferaasiaktiivisuus määritettiin käyttäen Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega) ja Ascent FS II luminometrillä (Thermo Scientific).

Western blotting

Kaikki solut synkronoidaan 100 nM deksametasonia hoitoa 2 h. Sitten elatusaine korvattiin tuoreella elatusaineella. Sen jälkeen, kun 24-tunnin inkuboinnin, nämä solut hajotettiin Cell Lyyttinen-MT (Sigma). Solulysaatit sentrifugoitiin 15000 rpm: ssä 4 ° C: ssa 10 min. Supernatantit tallennetaan kokosoluekstraktien -80 ° C: ssa käyttöön asti. Western blotting, 20 ug proteiinia erotettiin 7,5% natriumdodekyylisulfaattia polyakryyliamidi (SDS-PAA) geeleissä ja siirrettiin nitroselluloosakalvolle (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Membraanit blokattiin Tris-puskuroidulla suolaliuoksella (TBS) -Tween, joka sisälsi 5% rasvatonta kuivamaitoa. Proteiinit havaittiin käyttämällä vasta-aineita HIF1α (laimennus 1: 500; BD Transduction Laboratories, Franklin Lakes, NJ, USA), PER2 (laimennus, 1:1000; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), CRY1 (laimennus, 1:2000; Santa Cruz Biotechnology), CLOCK (laimennus, 1:1000; Thermo Scientific), GAPDH (laimennus, 1:10000, Sigma), ja BMAL1 (laimennus, 1:100; hiiren monoklonaalinen vasta-aine tuotetaan meidän lab). Suoritimme neljä jäljitellä Western blotit; edustava blot on esitetty.

ChIP määritys

ChIP kokeet suoritettiin käyttäen kaupallista kittiä mukaan valmistajan ohjeiden (Magna-siru, Millipore, Bedford, MA, USA). Lyhyesti, Caki-2-solut maljattiin 100 mm: n halkaisija annoksia (5 x 10

4 solua per malja); 24 tunnin kuluttua soluja inkuboitiin formaldehydin (lopullinen konsentraatio, 1%) 10 min 37 ° C: rajat linkin proteiinien DNA: ta. Reagoimatonta formaldehydiä sammutettiin 1 ml: lla 10 x glysiiniä. Levy pestiin kaksi kertaa jääkylmällä PBS: llä, ja pelletit kerättiin 1 ml: aan PBS: ää, jossa proteaasiestäjäseostabletit ja yhdistettiin yhdessä 1,5 ml: n putkeen. Silloitetut chromatin hajotettiin sonikoimalla 20 kertaa 1 minuutin ajan kummallakin kerralla 1 min jäähdytyksen jäissä välillä pulssien avulla Branson 2510 Ultraääni Cleaner (Branson, Danbury, CT, USA). Immunosaostuksella (IP) suoritettiin 5 ug: lla joko anti-HIF1α (laimennus 1: 500; Novus Biologicals Inc., Littleton, CO, USA), tai anti-IgG-vasta-ainetta (Millipore) negatiivisena kontrollina. Pesee ja eluutio IP DNA suoritettiin Magna-chip-protokollaa (Millipore). Kymmenen prosenttia (10%) alkuperäisestä pilkottua chromatin DNA samalla kääntää silloitettu ja puhdistettu, ja talteen DNA: ta käytettiin syötteenä kontrolli. PCR suoritettiin spesifisiä alukkeita, jotka reunustavat HRE kaltainen sekvenssi promoottorialueella ihmisen

Per2

geenin (-476–284 bp, sense: 5′-ACGCCGGAAGTGGATGAGAC -3 ’ja antisense: 5’- CGACTCCGTCTCATCTGCATACAT -3 ’) seuraavin lämpökäsittelyyn parametrit: 94 ° C 3 min, minkä jälkeen 40 sykliä 94 ° C: ssa 20 s, pariutuminen 59 ° C: ssa 30 s, ja pidennys 72 ° C: ssa 30 s.

tilastollinen analyysi

Kukin koe toistettiin ainakin neljä kertaa. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± keskivirhe. Arvioidaan merkitystä erilaisuuden Opiskelijan

t

-testissä suoritettiin. Käytimme yksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA) välisessä vertailussa lääkeaineen pitoisuus ryhmiä, minkä jälkeen soveltamalla Tukeyn post hoc testit. Kaikkien analyysien merkitys asetettiin arvoon

P

0,05. Cosinor ohjelmisto (vuorokausirytmin Laboratory) [22], [23] käytettiin analysoimaan vuorokausirytmin rytmiä.

Tulokset

Circadian ilmaus

Per2

geenin munuaissyöpäsolujen solulinjat

tutkia transkription värähtelyn

Per2

, kaikki solulinjat transfektoitiin lusiferaasireportterigeeniin vetämänä

Per2

promoottori ja reaaliaikainen seuranta määritys tehtiin Kronos Dio (AB-2550; ATTO). Lusiferaasi-sidottu promoottori Caki-2-soluissa näkyy vuorokausirytmiä 2 h kuluttua deksametasonikäsittelyn (Fig. 1A, taulukko 1), mutta rytmiä ei havaittu muissa solulinjoissa (kuvio. S1). Kukin koe toistettiin neljä kertaa ja nämä tulokset olivat yhdenmukaisia. 24 h deksametasonikäsittelyn jälkeen,

Per2

mRNA-tasot oli vuorokausirytmin in Caki-2-solut (Fig. 1 B, taulukko 1). Nämä tulokset osoittivat, että vuorokausirytmin rytmiä ja

Per2

geeni ei ollut havaittavissa munuaisten syöpäsolulinjoissa, lukuun ottamatta Caki-2-soluissa.

(A) Kaikki munuaissyövän solulinjat transfektoitiin Per2 promoottori reportteri (2 ug) ja bioluminenssi mitattiin sitten käyttäen reaaliaikainen seuranta määrityksessä. Reaaliaikainen seuranta lusiferaasin aktiivisuuden

Per2

promoottorin osoitti aktiivisuutta oscillated yli noin 24 tunnin ajan. Lusiferaasiaktiivisuudet neljä samanlaiset näytteet on esitetty. Nämä viljelmät osoittivat merkittävää vuorokausirytmiä (taulukko 1). (B) mRNA tasot

Per2

määritettiin reaaliaikaisella PCR kuusi levyä kunakin ajankohtana. Kokonais-RNA uutettiin 4 tunnin välein, alkaen 24 tunnin kuluttua deksametasonin kanssa yhteen 24 h ajan, ja

Per2

transkriptit määrällisesti. Virhe palkit ilmaisevat keskivirheet keskiarvojen (

n

= 6). Tiedot yhdestä 24 tunnin deksametasonikäsittelyn jälkeen analysoitiin käyttämällä Cosinor ohjelmisto rytmiä (taulukko 1). (C) rakenne

Per2

promoottorin ja analyysi mahdollisista transkriptiotekijän sitova kuviot tällä alueella. 2994 emäsparin alue sisältää yhden E-box-like-sekvenssin (CACGTT) ja yhden HRE kaltainen sekvenssi (ATGTG), samanlainen kuin konsensussekvenssi HRE-sekvenssin (ACGTG), joka sijaitsee ylävirtaan transkription aloituskohdasta (TSS). (D) Sekvenssivertailut: ylempi viiva, hiiri sekvenssi; alalinja, ihmisen sekvenssin. Nukleotidisekvenssi mahdollisia transkriptiotekijän sitova motiivit E-box-like-sekvenssin ja HRE-like-sekvenssin 100% konservoitunut hiiren ja ihmisen välillä.

Analyysi

Per2

promoottorialueen

Aiemmassa tutkimuksessa on osoitettu, että E-box-like sekvenssi (CACGTT) ja sen alavirran alue ovat välttämättömiä transkription värähtelyn

Per2

, olennainen osa molekyylikello [24]. Olemme keskittyneet tähän E-box-kaltainen alue ja HRE. Transkriptiotekijän sitova motiivien sijaitsee

Per2

promoottori hiirillä ja ihmisillä analysoitiin käyttämällä Matlnspector ohjelmistoa (Genomatix, Munich, Saksa). Sekvenssianalyysi

Per2

promoottorialueen paljasti korkean homologian hiiressä ja ihmisessä. Sekvenssianalyysi paljasti myös yksi E-box-like-sekvenssin (CACGTT) ja yhden HRE kaltainen sekvenssi (ATGTG), samanlainen kuin konsensussekvenssi HRE-sekvenssin (ACGTG) [25], joka sijaitsee ylävirtaan transkription aloituskohdasta (TSS) (Fig. 1 C ). Nämä sekvenssit olivat 100% konservoitunut hiirissä ja ihmisissä (Fig. 1 D). Reaaliaikainen seuranta määritys (Fig. 1A) osoitti, että promoottorialueen me kloonattu on riittävä tuottamaan vuorokausirytmin transkription värähtely ihmisen solulinjoissa.

ilmentäminen kellon geenien munuais- syövän solulinjoissa

tutkimiseksi ero Caki-2 ja muut solulinjat, tutkimme ilmentymisen BMAL1, CLOCK, PER2, ja CRY1 proteiineja. Caki-2, 786-O, ja A498-solut ekspressoivat BMAL1 proteiinia. Kaikki munuaissyövän solulinjat ilmensivät CLOCK ja CRY1 proteiinia, mutta ei ilmaissut PER2 proteiinia (Fig. 2A). Täyspitkä-täplien PER2 ja BMAL1 lisäksi positiivisena kontrollina, on esitetty kuvassa S2, S3.

Kaikki solulinjat lyysattiin ja kerättiin 24 h synkronoinnin jälkeen, 2-h deksametasonikäsittelyn. Suoritimme neljä jäljitellä Western blotit; edustava blot on esitetty. (A) Western-blotit munuaisten syövän koko-solu-uutteiden (20 ug) kanssa BMAL1, CLOCK, PER2, CRY1 ja GAPDH vasta näkyvät. Täyspitkä-täplien PER2 ja BMAL1 lisäksi positiivisena kontrollina, on esitetty kuvassa S2, 3 (B) Western-blotit munuaissyövän kokosolu-uutteita (20 ug), jossa HIF1α ja GAPDH-vasta-aineita on esitetty.

ilmentäminen HIFα proteiinin happiolosuhteissa munuaisten syöpäsolulinjoissa

Koska HIF1α proteiini voidaan yleensä yli-ilmentynyt RCC, tutkimme myös ilmentymisen HIF1α proteiinia. In Caki-2 ja RCC4 + pelkkä vektori, HIF1α proteiini yli-ilmentyy (Fig. 2B). Kun otetaan huomioon tulokset, jotka

Per2

vuorokausirytmin on esitetty vain Caki-2-soluissa, jotka sisälsivät BMAL1, CLOCK, ja HIF1α proteiinia, on mahdollista, että HIF1α liittyy

Per2

vuorokausirytmin rytmi munuaisten syövän solulinjoissa.

vaikutus HIF1α on

Per2

transkriptioaktiviteettia

tarkastella vaikutuksia HIF1α on

Per2

transkriptioaktiivisuutta, NIH3T3 ja U2OS solut transfektoitiin lusiferaasireportterigeeniin ohjaa

Per2

promoottorin ja ko-transfektoitiin

Hif1α

ja

Arnt

ekspressiovektoriin. Kotransfektion HIF1α /ARNT lisääntynyt amplitudi värähtelyn ja ei ollut vaikutusta kauden tai acrophase värähtelyn näissä solulinjoissa (Fig. 3A-D, taulukko 2). Samat tulokset havaittiin Caki-2-solut (Fig. 3E, F, taulukko 2).

(A) NIH3T3-solut kotransfektoitiin

Per2

promoottori reportteri (400 ng ) ja osoitetut ekspressioplasmidien (300 ng) ja HIF1α /ARNT tai tyhjä pcDNA3 (600 ng) kontrollina. Bioluminenssi mitattiin sitten käyttäen reaaliaikaisen valvonnan määrityksessä. Ohjaus, transfektoitu tyhjällä pcDNA3 (kloonaamaton-vektorisäätö); + HIF1α /ARNT, transfektoitiin ekspressioplasmideilla. Lusiferaasiaktiivisuudet neljä samanlaiset näytteet on esitetty. (B) Detrended bioluminesenssin on esitetty. Ajanjakso, amplitudi, ja acrophase Oskillaatioiden mitattiin päivinä 2-5 käyttäen Cosinor ohjelmistoa (vuorokausirytmin Laboratory). Amplitudi huomattavasti (keskiarvo ± SEM,

n

= 4) verrattuna kontrolliryhmään (

p

0,01, Studentin

t-

testi). Katso taulukko 2. (C) U2OS solut kotransfektoitiin

Per2

promoottori reportteri (400 ng) ja ilmoitetun ekspressioplasmidien (300 ng) ja HIF1α /ARNT tai tyhjä pcDNA3 (600 ng), kuten kontrollina. Bioluminenssi mitattiin sitten käyttäen reaaliaikaisen valvonnan määrityksessä. Ohjaus, transfektoitu tyhjällä pcDNA3 (kloonaamaton-vektorisäätö); + HIF1α /ARNT, transfektoitiin ekspressioplasmideilla. Lusiferaasiaktiivisuudet neljä samanlaiset näytteet on esitetty. (D) Detrended bioluminesenssin on esitetty. Ajanjakso, amplitudi, ja acrophase Oskillaatioiden mitattiin päivinä 2-5 käyttäen Cosinor ohjelmistoa (vuorokausirytmin Laboratory). Amplitudi huomattavasti (keskiarvo ± SEM,

n

= 4) verrattuna kontrolliryhmään (

p

0,01, Studentin

t-

testi). Katso taulukko 2. (E) Caki-2-soluja kotransfektoitiin

Per2

promoottori reportteri (2 ug) ja ilmoitetun ekspressioplasmidien (1,5 ug) ja HIF1α /ARNT tai tyhjä pcDNA3 (3 ug ) kontrollina. Bioluminenssi mitattiin sitten käyttäen reaaliaikaisen valvonnan määrityksessä. Ohjaus, transfektoitu tyhjällä pcDNA3 (kloonaamaton-vektorisäätö); + HIF1α /ARNT, transfektoitiin ekspressioplasmideilla. Lusiferaasiaktiivisuudet neljä samanlaiset näytteet on esitetty. (F) Detrended bioluminesenssin on esitetty. Ajanjakso, amplitudi, ja acrophase Oskillaatioiden mitattiin päivinä 2-5 käyttäen Cosinor ohjelmistoa (vuorokausirytmin Laboratory). Amplitudi huomattavasti (keskiarvo ± SEM,

n

= 4) verrattuna kontrolliryhmään (

p

0,01, Studentin

t

-testi). Katso taulukko 2.

HIF1α ei ole vaikutusta useissa NIH3T3-solut

Sen määrittämiseksi, onko HIF1α parantaa amplitudin värähtelyn

Per2

promoottorin toimintaa lisäämällä solujen määrää, suoritimme solumäärä käyttämällä ArrayScan XTI (Thermo Scientific). Kotransfektion HIF1α /ARNT ei ollut vaikutusta useissa NIH3T3-solut (Fig. 4). Tämä osoittaa, että HIF1α /ARNT lisäsi bioluminenssi

Per2

promoottorin toimintaan eivät vaikuta solujen lukumäärä.

NIH3T3-solut ko-transfektoitiin kanssa Per2 promoottori reportteri (400 ng), ja osoitetut ekspressioplasmidien (300 ng) ja HIF1α /ARNT tai tyhjän pcDNA3 (600 ng) kontrollina. Levyt luettiin sen ArrayScan XTI (Thermo Scientific) ja solujen määrä ilmoitetaan aika deksametasonikäsittelyn jälkeen. Numerot elävät solut eivät vaikuta HIF1α /ARNT kaikkina ajankohtina (keskiarvo ± SEM,

n

= 6, Opiskelijan

t

-testi).

HIF1α suoraan sitoutuu HRE kaltainen sekvenssi sisällä

Per2

promoottori

Voit selvittää HIF1α vaikuttaa

Per2

transkriptio kautta HRE-elementin, joka on otaksuttu HIF1α- sitovan sekvenssin, tutkimme vaikutuksia HIF1α /ARNT on

Per2

ilmaisun käyttäen lusiferaasianalyysissä NIH3T3-soluissa. HIF1α /ARNT lisääntynyt

Per2

transkriptioaktiviteettia, mutta ei vaikuttanut HRE-mutantti

Per2

promoottorit (Fig. 5A, B). CoCl

2 hoito indusoi HIF1α ilmentymistä sitoutumalla PAS domain, jolloin tukkeutuminen HIF1α-pVHL sitova ja siten HIF1α vakaus [26], [27]. Vaikutuksen tutkimiseksi CoCI

2 aiheuttamaa HIF1α ilmentymisen vaikutus

Per2

transkriptioaktiviteettia, soluja käsiteltiin CoCl

2. CoCl

2 voimistunut

Per2

transkriptio mutta ei ollut vaikutusta HRE-mutantti

Per2

promoottori (Kuva. 5C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että HRE kaltainen sekvenssin

Per2

promoottori me kloonattu vastanneet HIF1α yli-ilmentymisen. Sen tutkimiseksi, HIF1α suoraan sitoutuu HRE kaltainen sekvenssin

Per2

promoottori

in vivo

, siru-määritys suoritettiin. Silloitettu Caki-2-solut immunosaostettiin kanin anti-HIF1α vasta-aine tai kaniinin normaalilla IgG. Saatu immunosaostumat analysoitiin PCR-määrityksissä käyttäen alukkeita, jotka reunustavat HRE-kaltaiset sekvenssit (-476–284 bp)

Per2

promoottori. Huomattava kasvu intensiteetti DNA-juova havaittiin kanin anti-HIF1α vasta-aineella (Fig. 5D, kaista 3), mutta ei normaalin kaniinin IgG (Fig. 5D, kaista 2). Nämä tulokset osoittivat, että HIF1α saattaa lisätä

Per2

transkription aktiivisuutta suoraan sitovia HRE-elementin ja parantaa amplitudi värähtelyn

Per2

promoottoriaktiivisuuksien.

(A ) Kaaviokuva hiiren

Per2

promoottori. Ylempi alue edustaa villityypin hiiren

Per2

promoottorin ja alempi alue edustaa HRE-mutantti

Per2

promoottori. (B) HIF1α /ARNT voimakkaasti indusoi

Per2

promoottorin aktiivisuutta.

Per2

promoottorin ja HRE-mutantti

Per2

promoottori reportteri (60 ng) kotransfektoitiin, jossa on esitetty ekspressioplasmidien (+; 50 ng).

Per2

promoottoriaktiivisuuksien lisääntyivät merkitsevästi (keskiarvo ± SEM,

n

= 4,

p

0,01, Studentin

t

testi) verrattuna ohjaus (ilman ekspressioplasmidin), mutta HRE-mutantti

Per2

promoottori ei ollut vaikutusta. (C) Kaksikymmentäneljä tuntia hoidon jälkeen CoCl

2 (10, 30, 100 uM 6 h), lusiferaasin aktiivisuus mitattiin.

Per2

promoottoriaktiivisuuksien lisääntyivät merkitsevästi (keskiarvo ± SEM,

n

= 4,

p

0,05, yksisuuntainen ANOVA seurasi Tukeyn post hoc testit) pitoisuus -dependently kontrolliin verrattuna, mutta HRE-mutantti

Per2

promoottori ei ollut vaikutusta. (D) HIF1α nimenomaan vuorovaikutuksessa HRE kaltainen sekvenssi sisällä

Per2

promoottori. Caki-2-soluja silloitettu, lysoitiin ja immunosaostettiin anti-HIF1α vasta-aine tai kaniinin normaalilla IgG: llä (negatiivinen kontrolli). Saostunut DNA alistettiin PCR: llä alukkeilla, jotka ovat spesifisiä kohdealueen (-476 /-284). Yksi alikvootti tulon DNA: ta käytettiin positiivisena kontrollina. PCR-tuote havaittiin anti-HIF1α ChIP (kaista 3) ja 10% Input DNA: ta (kaista 4). Huomattavasti vähemmän havaittiin ei vasta-sirulla (kaista 1) ja normaali kanin IgG sirulla (kaista 2) kaistaa.

Vaikutus estävä HIF1α on

Per2

vuorokausirytmin

Chrysin on luonnollinen flavonoidi, jonka tiedetään estävän HIF1α ilmentymistä vähentämällä proteiinisynteesiä ja vähentää siten HIFα vakautta ilman, että vaikutetaan solujen elinkelpoisuus [28]. Jotta voidaan tutkia estävä vaikutus HIF1α proteiinin

Per2

vuorokausirytmin, solut esikäsiteltiin eri chrysin pitoisuuksilla. Ekspressio HIF1α proteiinin suppressoi merkittävästi sen jälkeen, kun 2-h inkubointi 100 uM chrysin in Caki-2-solut (Fig. 6A, B). Amplitudi vuorokausirytmin on

Per2

promoottorin aktiivisuus väheni merkittävästi sen jälkeen, kun 2-h inkubointi 100 uM chrysin in Caki-2-solut (Fig. 6C, D, taulukko 3). Näiden tulosten perusteella, HIF1α voi parantaa vuorokausirytmin on

Per2

on promoottorin tasolla.

(A) Caki-2-soluja viljeltiin 60-70% konfluenssiin. Soluja käsiteltiin DMSO: lla kontrollina, tai erilaisia ​​chrysin pitoisuuksina (1, 10, 100 uM) 2 tunnin ajan. (B) HIF1α proteiinin tasot mitattiin optisen tiheyden arvoja normalisoitu niiden GAPDH kuormituksen valvonta, sitten keskiarvo ± SEM, ja piirretään (suhteellinen ekspressio) ja semikvantitatiivisesti verrata proteiinin tasot (

n

= 4). HIF1α ilmentyminen merkitsevästi tukahdutettiin 100 nM chrysin verrattuna kontrolliin inkuboitiin DMSO (

p

0,05, yksisuuntainen ANOVA seurasi Tukey post hoc testi). (C) Caki-2-solut transfektoitiin

Per2

promoottori reportteri (2 ug). Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen soluja inkuboitiin 100 uM chrysin tai DMSO: ssa 2 tuntia. Bioluminenssi mitattiin sitten käyttäen reaaliaikaisen valvonnan määrityksessä. Lusiferaasiaktiivisuudet neljä samanlaiset näytteet on esitetty. (D) Detrended bioluminesenssin on esitetty. Ajanjakso, amplitudi, ja acrophase Oskillaatioiden mitattiin päivinä 2-5 käyttäen Cosinor ohjelmistoa (vuorokausirytmin Laboratory). Amplitudi laski merkittävästi (keskiarvo ± SEM,

n

= 4) verrattuna kontrolliryhmään (

p

0,05). Katso taulukko 3.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa rytmistä ilmaus

Per2

geeni havaittiin Caki-2-soluissa. Kuitenkin

Per2

promoottoriaktiivisuuksien ja mRNA-tasot eivät ole vuorokausirytmiä muulla solulinjoissa. Joitakin eroja välillä voi olla Caki-2 ja muut munuaisten syövän solulinjat. Koska

Per2

geenin transkriptio aktivoituu heterodimerisoitu transkriptiotekijä BMAL1 /CLOCK sitoutumalla E-box-kaltainen sekvenssi [24], tutkimme ilmaus BMAL1 ja CLOCK proteiinia näissä solulinjoissa. Caki-2, 786-O, ja A498-solut ilmaisivat BMAL1, ja kaikki solulinjat sisälsivät CLOCK proteiinia. Lisäksi kaikki munuaissyövän solulinjat ilmensivät CRY1 proteiinia, mutta ei näihin PER2 proteiinia. In Caki-2-soluissa, tutkimme myös ilmentymisen PER2 proteiinia 4-h välein alkaen 24 tunnin kuluttua deksametasonin kanssa. Ei kuitenkaan PER2 proteiini havaittiin kaikissa aikapisteissä (kuvio. S4).