Krooninen sairaus

tiivistelmä

Prosessi vatsakalvon etäpesäke liittyy läpi kulussa vatsaontelonsisäisestä paisutettu mahasyövän soluihin mesothelial yksisolukerrokset; kuitenkin liittyvän molekyylitason mekanismeja tässä prosessissa ovat vielä epäselviä. Heterocellular kuilu-junktionaalinen solujen välisen viestinnän (GJIC) välillä mahasyövän solujen ja mesoteelisolujen voi olla aktiivinen rooli läpi kulussa. Tässä tutkimuksessa havaittiin ilmaisua konneksiini 43 (Cx43) perusterveydenhuollossa mahasyövän kudoksiin, vatsaontelon sisäisen kuorinnan syöpäsoluja, ja Hyväksytty metastaattisen vatsakalvon kudoksiin. Olemme havainneet, että ilmentyminen Cx43 primaarisissa mahasyövän kudoksissa oli merkittävästi vähentynyt; vatsaontelonsisäisestä hilseillyttä syöpäsolujen ja Hyväksytty metastasoituneen vatsakalvon kudoksissa näytteillä käytetään yhä useammin verrattuna ensisijaisen mahasyövän kudoksiin. BGC-823 ja SGC-7901 ihmisen mahasyövän solut muokattu ekspressoimaan Cx43 tai Cx43T154A (mutantti proteiini, joka vain parit aukkoliitokset mutta ei tarjoa solujen välinen viestintä), ja ne olivat viljeltiin yhdessä ihmisen vatsakalvon mesoteelisolujen (HPMC). Heterocellular GJIC ja läpi kulussa läpi HPMC monokerrokset Matrigelillä kuorrutettu peitelaseja tutkittiin. Olemme havainneet, että BGC-823 ja SGC-7901 mahalaukun syövän solut, jotka ilmentävät Cx43 muodostettu toiminnallinen heterocellular aukkoliitokset HPMC yksisolukerrokset tunnin kuluessa. Merkittävä nousu läpi kulussa havaittiin suunniteltu Cx43 ilmentäviä soluja verrattuna Cx43T154A ja kontrolliryhmään soluja, mikä viittasi siihen, että havaitut säätelyä läpi kulussa in Cx43 ilmentäviä soluja tarvitaan heterocellular GJIC. Lisäksi tutkimus osoitti, että mahalaukun syöpäsolut transmigrated läpi solujen väliseen välisen tilan mesoteelisolujen kautta parasellulaarista reittiä. Tuloksemme viittaavat siihen, että epänormaali ilmentyminen Cx43 on keskeinen merkitys vatsakalvon etäpesäkkeitä ja että Cx43 välittämä heterocellular GJIC välillä mahasyövässä solujen ja mesoteelisolujen voi olla tärkeä sääntelyn askel aikana etäpesäke. Lopuksi, havaitsimme, että läpi kulussa kuorituista mahalaukun syöpäsolujen kautta mesothelial esteet on toteuttamiskelpoinen reitti parasellulaarista muuttoliikettä.

Citation: Tang B, Peng Zh, Yu PW, Yu G, Qian F, Zeng Dz, et al. (2013) Poikkeava ilmentäminen Cx43 liittyy Peritoneaalisille Etäpesäke mahasyövän ja Cx43 välittämä Gap Junction Parantaa mahasyövän Cell läpi kulussa peritoneaalisista Mesothelium. PLoS ONE 8 (9): e74527. doi: 10,1371 /journal.pone.0074527

Editor: Johanna M Brandner, University Hospital Hamburg-Eppendorf, Saksa

vastaanotettu: 19 tammikuu 2013; Hyväksytty: 06 elokuu 2013; Julkaistu: 11 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Tang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat apurahan nro 30801097 ja nro 81272366 National Natural Science Foundation of China. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

ilmaantuvuus mahalaukun syövän on vähenemässä mutta on edelleen merkittävä syy syöpään liittyvät kuolemat maailmanlaajuisesti. Hallitseva piirteet mahalaukun syövän soluihin kuuluvat niiden invasiivisen ja metastaattisen valmiuksia. Peritoneaalisille etäpesäke on kriittinen ominaisuus syövän etenemisen edennyt mahasyöpä [1]. Prosessin aikana vatsakalvon etäpesäkkeiden, mahalaukun syövän solut ovat vuorovaikutuksessa intercellularly useita solutyyppejä, ja vuorovaikutus vatsaontelonsisäisen hilseillyttä mahasyövän solujen ja vatsakalvon mesoteelisolujen on erityisen tärkeää. Jatkuvina ihmisen vatsakalvon mesothelial solujen (HPMC) yksikerroksia este vastaan ​​vatsakalvon etäpesäke, kun läpi kulussa kuorituista mahalaukun syöpäsolujen kautta mesothelial yksisolukerroksiin tapahtuu, runsas verenkiertoa matriisissa alla mesothelium tarjoavat mukavan ympäristön mahalaukun metastasoivaa syöpäsolut ja edistää niiden kolonisaatio. Siksi läpi kulussa kuorituista mahasyövän soluihin mesothelial yksisolukerroksen on olennainen askel aikana vatsakalvon etäpesäke. Näiden välinen vuorovaikutus solujen mukana solujen välisen viestinnän (IC), joka on pääasiassa välittävät solu-solu-aukkoliitokset [2]. Aukkoliitokset muodostetaan solukalvon konneksiinit, joista jokainen koostuu kuudesta konneksiinit (CXS) [3]. Tähän mennessä 20 eri konneksiini isoformia on identifioitu ihmisillä. Cx43 on yleinen isoformin ilmaistu useimmissa epiteelikudoksissa. Aiemmat tutkimukset [4-6] osoitti, että Cx43 ilmaisu laskivat kasvaimen kehittymisen ja sen vuoksi luokiteltu tuumorisuppressorina. Kuitenkin on olemassa yhä enemmän todisteita, jotka konneksiinit voi olla mukana intravasation ja ekstravasaatio syöpäsoluja ja myönteinen rooli tässä prosessissa etäpesäkkeiden [7,8]. Olipa Cx43 välittämä aukkoliitos tärkeä rooli läpi kulussa mahasyövän solujen läpi vatsakalvon mesothelial este jää epäselväksi. Vastatakseen hypoteesin selvitimme ilmentymistä Cx43 perusterveydenhuollossa mahasyövässä kudoksiin, paisutettu mahalaukun syöpäsoluja, ja vatsakalvon metastaattisen kudoksiin. Olemme rakentaneet Cx43 ilmentävä vektori ja Cx43T154A sivuston mutaatio vektorin. Sitten käytimme kahta ihmisen mahasyövän solulinjoissa (BGC-823 ja SGC-7901), joka on GJIC puutteellinen eikä ilmaise mitään tiedetä konneksiinit [9]. Koska mesoteelisolujen runsaasti ilmaista Cx43 me valmistimme mahalaukun syöpäsolujen ilmaista joko villityypin Cx43 tai paikkasidonnainen mutantti onko potentiaali mahasyövän solujen läpi kulussa läpi mesothelium muuttuisi molemmissa tai jompaakumpaa näistä edellytyksistä. Tässä tutkimuksessa osoitamme, että Cx43 ilmentymistä säätelee lisäävästi kasvainsolun läpi kulussa kautta GJIC-riippuvaisen mekanismin.

Materiaalit ja menetelmät

2,1: Reagenssit ja vasta-aineet

Anti-konneksiini 43 polyklonaalista vasta-ainetta (Zymed, San Diego, CA, USA), Matrigel (Becton-Dickenson, Bedford, MA, USA), 1, 1′-diocta-dekyyli-3, 3, 3 ’, 3’-tetrametyyli-percholate (Dil; Molecular Probes, Eugene, OR, USA), Calcein-AM (Dojindo, Kumamoto, Japani), ja FITC-konjugoitua phalloidin hankittiin Sigmalta (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA).

2,2 : kudosnäytteitä ja Osteri

kaikki osallistujat kirjallinen lupa (niiden huoltajiensa tarvittaessa). Tutkimus tehtiin mukaisesti opinkappaleisiin Helsingin julistuksen ja sen muutokset ja hyväksyi eettinen komitea Varsinais sairaala, The Third Military Medical University. Tutkimus koostui 42 potilasta, jotka luokiteltiin vaiheessa IV mukaan seitsemännen painoksen UICC TNM luokittelu pahanlaatuisia kasvaimia. Ennusteeseen viittaavia muuttujat on lueteltu taulukossa 1. Kaikki osallistuneista potilaista tutkimuksessamme kävi lievittävä tai valmistelevan leikkausta. Primaarikasvaimen ja metastaattinen vatsakalvon kudokset kerättiin ennen loppua leikkaus, ja paisutettu mahasyövän solut kerättiin sentrifugoinnilla ja askites tai vatsakalvon huuhtelu nestettä (jos askites ei ole). Tumallisten solujen kerros levitettiin lasilevylle ja värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (HE). Kaksi kokenutta cytopathologists suoritettu sytologista arvioinneissa. CEA: ta käytettiin biomarkkerina auttaa tunnistamaan adenokarsinoomasoluja immunofluoresenssilla positiivista värjäytymistä. Tapauksia jätettävä tämän tutkimuksen tutkimuksen tuloksia molempien cytopathologists eivät olleet yksimielisiä.

Ryhmä

Number

prosenttia (%)

Sex male2764.0 female1536.0Age (vuosia) 501740,4 ≥502559.6Tumor sijainti Antral2150.0 Body1228.6 Fundic911.4Pathological tyyppi No differentiated24.7 Kohtalaisen differentiated49.5 Huonosti differentiated3685.8Bormann kirjoittamalla I00 II12.4 III1228.5 IV2969.1Ascites Yes1535.7 No2764.3Surgical lähestymistapa lievittävä gastrectomy2457.1 valmisteleva + biopsy1842.9Table 1. kliiniset ja patologiset ominaisuudet 42 tapausta potilaiden mahalaukun syöpä.

CSV Lataa CSV

2.3: immunohistokemia

Parafiini kudosnäytteitä primaarikasvainten ja metastaattinen vatsakalvon kudokset sarjoittain leikattiin ja HE värjäämällä varmistunut, että mahasyövän. Peräkkäiset osat poistettiin parafiini, kuivattu, ja altistettiin antigeenille haku järjestyksessä. Leikkeitä inkuboitiin kanin polyklonaalisella anti-Cx43-vasta-ainetta 24 tuntia 4 ° C: ssa. Sitoutumiskohdat visualisoitiin 3, 3′-diamino-bentsidiiniä (DAB) kanssa 5 minuutin reaktio. Leikkeet vastavärjättiin Mayerin hematoksyliinillä, kuivattu, poistetaan ja asennetaan. Poisjättäminen ensisijainen vasta-ainetta käytettiin negatiivisena kontrollina. Immunohistokemiallinen värjäys arvioitiin määrittämällä pisteet perustuu laajuuden ja intensiteetin immunoreaktiivisuus. Värjäys määrin arvioitiin semikvantitatiivisesti sytoplasmassa ja kalvo negatiivisina (0 5% soluista värjätty), positiivinen 1 + (6-25% soluista värjätty), positiivinen 2 + (26-50% soluista värjätty) tai positiivisia 3 + ( 50% soluista värjätty). Värjäytymisintensiteettiä pisteytettiin 0 (ei värjäystä), 1 (heikko värjäystä, keltainen ruskea), 2 (kohtalainen värjäytyminen, keltainen ruskea), tai 3 (voimakas värjäytyminen, ruskea). Immunovärjäyksen tulokset pisteytettiin summana laajuuden ja intensiteetin immunoreaktiivisuus, harkitsee pisteet ≥3 positiivinen ja pistemäärä 3 negatiivinen.

2.4: Immunofluoresenssikoe

Cx43 ilmentymistä vatsansisäisten kuorinnan mahalaukun syöpäsolut arvioitiin käyttäen immunofluoresenssilla. Neljäkymmentä kaksi tapausta otettiin tutkimukseen. Solut levitettiin lasipeitinlevyjä kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä ja pestiin PBS: llä, joka sisälsi 0,5% BSA: ta (huuhtelupuskurilla). Sitten soluja inkuboitiin 24 tunnin ajan 4 ° C: ssa anti-Cx43-vasta-ainetta (1: 150). Peitinlasit pestiin ja inkuboitiin FITC-konjugoidun vuohen anti-kaniini-vasta-ainetta. Tumat värjättiin 10 ug /ml DAPI (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Peitinlasit kuvannettiin käyttäen fluoresenssimikroskooppia (Siemens, Saksa). Säätimet (ensisijainen vasta-aineet korvattiin PBS) olivat negatiivisia kaikissa kokeissa (tietoja ei esitetty).

2,5: Soluviljely ja pysyvää ilmentymistä Cx43 ja Cx43 mutantit

pahanlaatuisten ihmisen kuolemattomiksi mesoteelisolut MeT-5A, saatiin ATCC: ltä. Nämä solut pidettiin ja kasvatettiin Medium 199, joka sisälsi 1,5 g /l natriumbikarbonaattia, 10% naudan sikiön seerumia, 3,3 nM epidermaalinen kasvutekijä (EGF), 400 nM hydrokortisoni, 870 nM sinkki-naudan insuliinia, 20 mM HEPES, ja 3,87 ug /L seleenihapoke (H2SeO3).

ihmisen mahalaukun adenokarsinooman solulinjoja BGC-823 ja SGC-7901 saatiin Shanghai Institute solu pankki, kiinalainen Academy of Science. Cx43- ja Cx43T154A-ilmentävillä vektoreilla muokattiin käyttäen lentivirus infektio. PTA2-Cx43, joka sisälsi ihmisen Cx43-koodaava sekvenssi, rakennettiin laboratoriossamme. Cx43T154A mutaatio vektorin rakentaminen suoritettiin käyttäen Päällekkäisyys PCR-pidennyksellä, joka koodasi proteiinia, joka toimi aukkoliitos ilman IC kuten aikaisemmin on kuvattu [10]. CDNA: Cx43 ja Cx43T154A insertoitiin lenti-GFP-vektorilla ja transfektoitiin 293T-pakkaus-solulinja. Lentiviruksen Supernatantti kerättiin 48 tunnin kuluttua, suodatettiin 0,45 um: n suodattimen ja käytettiin infektoimaan BGC-823 ja SGC-7901-soluja. Väliaine korvattiin RPMI1640 24 tuntia infektion jälkeen, ja soluja viljeltiin rutiininomaisesti. Yli 90% kasvainsoluista ilmaistuna Cx43 tai Cx43T154A kolmen kierroksen jälkeen virusinfektion; onnistuneesti infektoidut solut kerättiin virtaussytometrialla.

2,6: Proteiinin uuttaminen ja Western blot-analyysi

suunniteltu Cx43- ja Cx43T154A-ilmentävät BGC-823 ja SGC-7901 mahalaukun syövän solut hajotettiin . Proteiinia (50 ug) kustakin solutyypistä erotettiin 12% SDS-polyakryyliamidigeelillä ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille. Nitroselluloosamembraanit 5% rasvatonta kuivamaitoa, ja sitten tutkittiin varten Cx43 proteiinin käyttäen polyklonaalista anti-Cx43-vasta-ainetta (1: 500). Immunoblotit koetettiin sopivan piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineilla (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 1: 10000 laimennos. Proteiinit visualisoitiin käyttäen SuperSignal West Pico Chemiluminescent substraattia (Pierce Chemical Co.) ja immunoblot altistettiin Amersham Hyperfilm (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA), 30 s.

2,7: Kasvainsolun /mesoteeli- Soluadheesiokoe

mesoteelisolujen kasvatettiin, kunnes yksikerroksista konfluenssiin lasipeitinlevyille 24-kuoppaisilla levyillä. Muokatuista Cx43- ja Cx43T154A ilmentäviä mahasyövän-solut leimattiin 10 ug /ml Dil liuosta 15 minuuttia 37 ° C: ssa. Dil on yleisesti käytetty fluoresenssi- koetinta, joka näyttää oranssin-punaisen fluoresenssin kalvot ja käytettiin tutkimuksessamme merkitä mahalaukun syöpäsoluja. Nämä leimatut solut lisättiin sitten mesothelial yksisolukerrokset ja inkuboitiin 1 h 37 ° C: ssa. Tarttumattomat solut poistettiin pesemällä ja solut, jotka oli kiinnitetty mesothelial yksisolukerrokset fiksattiin 4% paraformaldehydillä. Viljelmä Objektilasit asennettu Mowiol (Calbiochem) ja tutkittiin käyttäen fluoresenssimikroskopiaa (Leica MPS 60).

2,8: Kasvainsolun /mesothelial Cell GJIC määritys

suunniteltu Cx43- ja Cx43T154A ilmentäviä BGC-823 ja SGC-7901 mahalaukun syövän solut leimattiin 15 minuutin ajan 37 ° C: ssa 2 ml: lla Opti-MEM, joka sisälsi 10 ug /ml kalseiini-AM ja 10 ug /ml Dil. Calcein-AM on fluoresoiva substraatti, joka pilkkoutuu in elävien solujen kalvoon läpäisemätön muodossa, joka voi kulkea toiminnallisten aukkoliitokset, mutta ei muita solukalvon kanavia. Mesothelial yksisolukerrokset esikäsiteltiin 4 h 150 um karbenoksoloni (CBX) estää homotyyppisessä GJIC ja käsiteltiin sitten 15 minuutin ajan 10 ug /ml kalseiini-AM: n (Molecular Probes) kanssa Opti-MEM-liuosta. Hyvin valmistautunut merkitty mahalaukun syövän soluja lisättiin MeT-5A yksisolukerrosten Matrigel, ja heterotyyppisten GJIC välillä mahasyövän solujen ja mesoteelisolujen havaittiin. Fluoresenssi elpyminen valkaistu soluissa vain, mikäli väriaine kulkee aukkoliitokset viereisten valkaisemattoman mahalaukun syöpäsoluja. Yksittäiset mesoteelisolujen vieressä mahalaukun syöpäsolut valkaistiin noin 30 s käyttäen Zeiss laserkeilauksen -konfokaalimikroskoopilla ja argonlaser 33% teholla jokaista kokeellista kunnossa. Yhden mesothelial soluja, jotka eivät voi perustaa GJIC valittiin läpi blenching kontrolleina. Käsittelemättömiä soluja käytettiin tausta muutetaan soluja. Keskimääräinen fluoresenssin intensiteetti valkaistua /valkaisemattomia soluihin mitattiin ajan käyttäen Scion kuvankäsittelyohjelma, ja fluoresenssi talteenotto laskettiin sekä (Kt = (Ib-Ib0) /Iu x 100%, Kt: fluoresenssi hyötykäyttöaste hetkellä t; Ib: fluoresenssi-intensiteetin valkaistu solun hetkellä t, Ib0: fluoresenssin intensiteetin valkaistu solun hetkellä t = 0; Iu: fluoresenssin voimakkuus viereisessä valkaisematon solun ajankohtana t) [11].

2,9: Transmesothelial migraatiokokeessa

transmesothelial migraatiomääritys suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [12]. Lyhyesti, 1 x 10

5 Met-5A mesoteelisolujen ympättiin 12 mm lasipeitinlevyille, jotka oli päällystetty Matrigel (Becton-Dickenson, USA). Yksikerrokset saavutti yhtymäkohta kuten määritetään valomikroskoopilla. Peitelaseja siirrettiin 24-kuoppalevylle ja viljeltiin 48 h EGM. Mahalaukun syöpäsolut jaettiin tyhjän vektorin ryhmästä, Cx43 ilmentävä ryhmä, Cx43T154A ilmentäviä ryhmä ja CBX esikäsiteltyjä ryhmä (Cx43 ilmentäviä mahasyövän soluja esikäsiteltiin 4 h 150 pm karbenoksoloni (CBX) estää homotyyppisessä GJIC) ja leimattiin Dil . Noin 1 x 10

5 solua lisättiin mesothelial yksisolukerrokset suhteessa 01:10 (kasvainsolun: mesothelial solu). Solut ko-viljeltiin eri aikoina (1, 4 tai 7 h) ennen elää havainnointiin tai kiinnitys ja immunovärjäyksellä. Sokaisi tutkijat määrällisesti läpi kulussa käyttäen LSM, kuten aiemmin on kuvattu [7]. Lyhyesti, co-viljelmät kiinnitettiin ja värjättiin F-aktiini. Läpi kulussa kvantitoitiin kuten tuumorisolujen lukumäärän, jotka olivat yhteydessä mesothelium ja luokiteltu kolmeen vaiheeseen niiden asemaan suhteessa Mesothelium: 1) pyöristettynä – kasvainsolujen pallomainen muoto apikaalisella pinnalla Mesothelium; 2) vaeltavat – tuumorisolut oli tunkeutunut läpi mesothelial yksisolukerrokset at mesothelial soluliitos osan kanssa solun rungon yläpuolella mesothelium ja osa solun elin levittää Matrigel alla mesothelial solujen F-aktiini stressiä kuituja; ja 3) alapuolelle – koko kasvain solun elin oli tason alapuolella mesothelial solujen stressiä kuituja. Siirtyminen ja alapuolella solut luokiteltiin transmigrating. Noin 100 Mesothelium tarttumattomat solut tallennetaan ja laskettiin per peitelasi, ja kaikki kokeet toistettiin kolme kertaa kolmena kappaleena peitinlasit.

2,10: Tilastollinen analyysi

Kaikki tilastollinen analyysi suoritettiin SPSS-ohjelmiston ( versio 13.0). Todennäköisyydet P 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

3,1: Cx43 ilmentyminen ensisijainen kasvaimia ja Hyväksytty metastasoituneen vatsakalvon kudosten

Neljäkymmentäkaksi normaalin epiteelin (100%) ilmaistuna Cx43 tyypillisiä kalvomainen ja sytoplasminen värjäys (kuvio 1A). Yksitoista 42 primaarikasvainten (26,2%) olivat positiivisia Cx43, joka oli merkittävästi laski verrattuna viereiseen normaaliin epiteelin (p 0,05). Cx43 ilmentyminen oli heterogeeninen eri kudosnäytteistä: hyvin eriytetty mahasyövässä kudoksissa, Cx43 ilme osoitti suurta sekoitettu (soluliman ja membranous) värjäytymistä (kuvio 1 B); kohtalaisesti eriytetty mahasyövän kudoksiin oli vain sytoplasmisen Cx43 ilmaisu (kuvio 1 C); ja Cx43 oli tuskin ilmaistu huonosti eriytetty mahasyövässä kudoksiin (kuvio 1 D). Sen sijaan, Cx43 ekspressio lisääntyi merkitsevästi 29 42 metastaattisen vatsakalvon kudoksissa (69,0%) ja sillä oli tyypillinen sytoplasman ja kalvo värjäytymistä (p 0,05) (kuvio 1 E) (taulukko 2).

(A) Cx43 ilmaistiin normaalin epiteeli tyypillisiä kalvomainen ja sytoplasmista värjäytymistä. (B) Cx43 ilmentymistä hyvin eriytetty mahasyövän kudoksia, syöpäsolut oli positiivista ja sytoplasman värjäytymistä kuvio. (C) Cx43 osoittivat suurta positiivista värjäytymistä sytoplasmassa kohtalaisen eriytetty mahasyövässä kudokset (D) Cx43 ilmentyminen huonosti eriytetty mahasyövässä kudoksia, kasvainsolujen näyttää negatiivisesti värjätty kuvio. (E) Cx43 ilmentymistä metastaattisessa vatsakalvon kudoksissa osoitti positiivista värjäytymistä kuvio. (F) Vatsansisäiset hilseillyttä mahasyövän solut määritettiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H ja E) värjäystä. (G, H, I) ilmentymistä Cx43 in vatsaontelon sisäisen hilseillyttä mahasyövän solujen käsiksi immunofluoresenssilla. Alkuperäinen suurennus: (AF, × 400).

Konneksiini 43

Ensisijainen mahasyövän (tapaukset) (%) B Vieressä normaalin kudoksen (tapaukset) (%) B Metastasoitunut vatsakalvon kudoksen (tapaukset ) (%) B Negatiivinen (pisteet 3) 31 (73,8%) 0 (0) 13 (31,0%) Positiivinen (score≥3) 11 (26,2%) * 42 (100%) 29 (69,0%) † Taulukko 2. immunohistokemia tulokset konneksiini 43 ilmentymisen ensisijaisen mahasyövän kudosten vieressä normaali mahan kudoksissa ja vatsakalvon metastaattinen kudosten (N = 42).

* verrattuna viereisiin normaaleissa kudoksissa, ilmaus konneksiini 43 väheni merkittävästi (p 0,05); † Verrattuna ensisijainen mahasyövän kudoksissa, ilmaus konneksiini 43 metastaattisessa vatsakalvon kudoksen lisääntynyt merkittävästi (p 0,05). CSV Lataa CSV

3.2: Cx43 ilmentyminen vatsaontelon sisäisen hilseillyttä mahalaukun syöpäsoluja

Useimmat vatsaontelossa hilseillyttä mahasyövän solujen olemassa monisoluisten pallosia (kuvio 1 F). Positiivinen Cx43 immunovärjäys havaittiin 35 42 tapausta vatsaontelonsisäisestä hilseillyttä syöpäsolujen sekavin sytoplasmista ja kalvomainen värjäys, ja positiivinen korko on 83,3% (kuvio 1 G, H ja I). ​​

3.3 : n ilmentyminen eksogeeninen Cx43 in BGC-823 ja SGC-7901 mahalaukun syövän solujen

mahasyöpää solut muokattu ekspressoimaan toiminnallista Cx43, Cx43T154A ja tyhjä lentivirusvektorikirjastojen kontrollina tutkia vaikutuksia Cx43 ilmaisua biologinen käyttäytyminen näissä soluissa. Cx43 ilmentyminen oli poissa tyhjän vektorin ryhmästä, mutta kaksi muuta suunniteltu ryhmää havaittiin ilmaista joko Cx43 tai Cx43T154A (kuvio 2A).

(A) Cx43 ja Cx43T154A ilmentyminen BGC-823 ja SGC-7901 mahasyöpä solujen transfektion jälkeen. (B, C) vaikutukset Cx43 in vitro tarttumista BGC-823 ja SGC-7901 mahalaukun syövän solujen mesoteelisolut. Kiinnittyneet kasvaimen solut laskettiin (suurennos: x 200), tulokset osoittivat, että adheesion transfektoitujen solujen Cx43 tai Cx43T154A lisääntyi merkitsevästi verrattuna soluihin transfektoitu tyhjällä vektorilla (* P 0,05). Tiedot esitetään keskiarvona ± SEM.

3,4: Adhesion ominaisuudet Mahalaukun syöpäsolujen mesoteelisolujen

vaikutus Cx43 tarttumiseen mahasyövän solujen mesoteelisolut tutkittiin myös. Muokatut mahasyövän soluja, jotka ilmentävät joko villin tyypin Cx43 tai Cx43T154A osoitti merkittävää kasvua kiinnittyminen mesoteelisolujen verrattuna tyhjällä vektorilla (p 0,05). Ei merkittäviä eroja tarttuvuus kyky ei havaittu Cx43- ja Cx43T154A ilmentäviä ryhmät (P 0,05), mikä viittaa siihen, että Cx43 edistää mahalaukun syövän soluadheesiota, joka on riippumaton GJIC (kuvio 2B).

1.photobleaching mesoteelisolut; 2.adjacent mahalaukun syöpäsoluja. A ennen valkaisua; B, C, D, E, F, jotka edustavat kuvia 0, 1, 2, 3, 4 min sen jälkeen, kun Valovalkaistuminen, vastaavasti.

Optiset osat saadaan laserkeilauksella konfokaalimikroskopialla polttopisteeseen tasot ilmoitetaan ( A, E, I) asetettiin kolme tärkeintä vaihetta läpi kulussa: kierroksen päälle (A-D), vaeltavat kautta (E-H), tai alapuolella (I-L) mesothelium. (B) Mahalaukun syöpäsolut pyöreäksi oli filopodial laajennukset esitetään sytoplasmassa (nuolet). (H) Mahalaukun syöpäsolut sijaitsevat mesothelial solujen soluliitos oli pitkä kara ja paksu nippujen F-aktiini esitetään lähellä sytoplasmaan (nuolet). (K, L) Ne, jotka valmistunut läpi kulussa osoitti näkyvästi stressi kuidut jaetaan väljästi solulimassa (nuolet).

3.5: Engineered Cx43 ilmentävien BGC-823 ja SGC-7901 solut muodostavat toiminnallisen aukkoliitos kanavaa mesothelial yksisolukerrokset

Teemme yhteistyötä viljelty suunniteltu Cx43- ja Cx43T154A ilmentäviä mahasyövän soluja mesothelial yksisolukerroksiin tutkia kykyä Cx43 ilmentävien solujen muodostamiseksi aukkoliitokset ja luoda GJIC kanssa mesoteelisolut. Tulokset osoittavat, että mahalaukun syöpäsolujen joko tyhjän vektorin ryhmästä tai Cx43T154A ryhmä ole osoittanut GJIC viereisten vatsakalvon mesoteelisolujen jälkeen laser valkaisu, kun taas Cx43 ilmentävä ryhmä saattoi todeta GJIC vatsakalvon mesoteelisolut onnistuneesti. Solunsisäisen fluoresenssin intensiteetti havaittiin ennen valkaisua, sillä hetkellä, valkaisu, ja joko 1 min, 2 min, 3 minuuttia tai 4 minuuttia sen jälkeen, kun valkaisu. Tulokset osoittavat, että Cx43 ilmentäviä ryhmä, solunsisäisen fluoresenssin voimakkuus valkaistun mesothelial solujen laskivat nopeasti valkaisun jälkeen. Fluoresenssin intensiteetti sitten vähitellen takaisin johtuu väriaine läpi aukkoliitokset naapurikuntien valkaisemattomien mahalaukun syöpäsoluja, ja fluoresenssikeskiarvo elpyminen oli 35,6 ± 0,9% ja 39,4 ± 0,8% 4 min kuluttua blenching in BGC-823 ja SGC-7901-soluissa, vastaavasti, mikä oli merkittävästi suurempi kuin vuonna Cx43T154A ja tyhjät vetor (p 0,05) (kuvio 3, taulukko 3).

Ryhmä

fluoresenssikeskiarvo hyötykäyttöaste (%,

x

± s ) (t=4min)

BGC-823Cx4335.6±0.9*BGC-823Cx43T154A12.1±0.6BGC-823v13.4±0.7SGC-7901Cx4339.4±0.8†SGC-7901Cx43T154A15.3±0.4SGC-7901v14.7±0.6Table 3. Vertailu fluoresenssikeskiarvo hyödyntämiskiintiöt jälkeen valkaisun in BGC-823 ja SGC-7901 mahalaukun syöpäsolujen (fluoresenssin voimakkuuden,

x

± s).

CSV Lataa CSV

3,6: Morfologiset arviointi tuumorisolujen läpi kulussa

Perustimme

in vitro

järjestelmän kuvantamiseen transmesothelial migraatio mahalaukun syöpäsolujen tutkia mekanismi ja reitti läpi kulussa. Tämä määritys jäljittelee näkökohtia verisuonen seinämän ja sitä on käytetty aikaisemmin analysoimaan leukosyyttien läpi kulussa [11]. Dil-leimattuja kasvainsoluja pisteytettiin niiden morfologian ja sijainnin suhteen mesothelium. Olemme määritelleet kolme erillistä vaihetta siirtolaiskysymyksen konfokaalimikroskopia: pyöristetty (kuva 4A); muuttavia (kuvio 4E); ja alapuolella (kuvio 4I). Tuumorisolujen päällä mesothelium ennen läpi kulussa esillä pyöreä tai ovulaarisesti muoto, ja tämä muoto on ylläpidetään apikaalisella (kuvio 4B) on pohjapinta (kuvio 4C, D). Vaeltavat kasvainsolujen kulkee vierekkäisten mesoteelisolujen muuttaa muotoaan ovulaarisesti pitkä kara solunsisäisten F-aktiini kootaan aktiinifilamentin nippujen (kuvio 4F, G, H). Tuumorisolut valmistunut läpi kulussa oli sijoitettu kokonaan alla mesothelium. Solun muoto vähitellen muuttunut pitkä kara pyöreämpiä muoto, ja solunsisäinen F-aktiini filamentit vähitellen laajentaa ja ne harvaan järjestetty filamentteja (kuva 4J, K, L). Tutkimuksemme osoitti, että mahalaukun syöpäsolut ”läpi kulussa tapahtui kautta parasellulaarista reittiä.

3,7: Cx43 välittämä GJIC parannettu mahasyövän solujen läpi kulussa

yhteistyössä viljellyt Cx43-, Cx43T154A ilmentäviä gasric syöpä solut ja CBX esikäsitellään Cx43-ilmentävien solujen kanssa mesoteelisolujen 1, 4 ja 7 tunnin verrata niiden läpi kulussa tehokkuutta [1,2]. Nämä solut pisteytetty kuvattua kriteereitä muuttoliikettä. Prosenttiosuus siirtyvät Cx43T154A ja CBX esikäsitellään solut eivät olleet merkittävästi erilaiset tyhjän vektorin ryhmästä soluja kuluttua 7 h yhteistyön kulttuuri (p 0,05), mutta läpi kulussa tehokkuutta Cx43 ilmentävien ryhmä soluissa oli merkittävästi suurempi kuin muut kolme ryhmää (p 0,05); (B) Prosenttia kiinnittyneet vaeltavien solujen SGC-7901 ryhmä soluja (%), verrattuna SGC-7901v (kontrolli), merkittävä kasvu läpi kulussa on SGC-7901Cx43 soluissa havaittiin 1, 4 ja 7 h (* p 0.05).

keskustelu

Gap risteyksissä ja konneksiini alayksikköä vaimentua erilaisissa syövissä [4,13,1,4]. Viimeaikaiset raportit kuitenkin osoittavat, että konneksiinit ”ilmaisua ei aina samana alentuneesta aikana syövän etenemiseen; päinvastoin, ne voivat olla läsnä myöhemmissä vaiheissa syövän, lisäämällä siirtyminen kapasiteetin invasiivisen solujen [2,15-11,7]. Tämä uudelleen syntyminen konneksiinit on selvästi havaittu etenemisen ihmisen rintasyövän, jossa Cx26- ja Cx43-negatiivinen ensisijainen kasvaimia kehittyi Cx26- ja Cx43-positiivisia etäpesäkkeitä imusolmukkeissa [18,1,9]. Samanlaisia ​​tuloksia on saatu myös hiiren ihon syövän synnyn; Cx26 ilmentyminen vähenee alkuvaiheessa syövän, mutta palautuu metastaattisessa imusolmukkeisiin [20]. Nämä tutkimukset tarkoita, että konneksiinit pelata erilaisia ​​rooleja prosessin aikana syövän. Tutkimuksemme oli ensimmäistä kertaa ekspression tutkimiseksi Cx43 eri vaiheissa mahasyövän etenemisen (ensisijainen mahasyöpä kudoksiin, vatsaontelon sisäisen hilseillyttä mahalaukun syöpäsoluja ja Hyväksytty metastasoituneen vatsakalvon kudokset). Tulokset osoittavat merkittävää laskua Cx43 ilmentymisen ensisijainen mahasyövän kudoksiin verrattuna viereisen normaali mahan kudoksissa (p 0,05). Sen sijaan Cx43 ilmentyminen vatsaontelon sisäisen hilseillyttä mahasyövässä solujen ja metastasoituneen vatsakalvon kudosten lisääntyi merkittävästi. Nämä tulokset viittaavat siihen, että Cx43 todennäköisesti tärkeä rooli vatsakalvon etäpesäkkeitä.

Tutkiakseen, onko Cx43 ilmaisu on vaikutusta vatsakalvon etäpesäkkeitä, Cx43 transfektoitiin BGC-823 ja SGC-7901 mahalaukun syövän soluja, ja Cx43T154A site mutaatio rakennettiin merkityksen määrittämiseksi kuilu junktionaalinen viestinnän prosessissa vatsakalvon etäpesäke. Tarttuvuus ja verisuonten läpi kulussa kasvainsolujen mesothelial yksisolukerrokset on kaksi kriittistä vaihetta muodostumista vatsakalvon etäpesäkkeiden.

in vitro

soluadheesioanalyysissä paljasti, että Cx43- ja Cx43T154A-ilmentävät BGC-823 ja SGC-7901-soluissa esiintyi enemmän tehokas kiinnittyminen mesothelial yksisolukerrokset kuin tyhjän vektorin soluja ja että adheesio tehokkuus Cx43T154A ilmentävien kasvainsolut oli samanlainen Cx43-ilmentäviä soluja. Nämä tulokset viittaavat siihen, että Cx43 edistää tarttumista mahalaukun syövän solujen mesoteelisolujen, joka on riippumaton aukkoliitos viestintää. Mitä tulee siihen liittyvän mekanismin, edellisessä tutkimuksessa oli ilmoittanut, että Cx43 voi olla vuorovaikutuksessa soluadheesiota liittyvien proteiinien, kuten E-kadheriinin, jotka osallistuvat parhaillaan tartunta [21], joka voi ehdottaa positiivista roolia Cx43 ilmaisun lisäämisessä soluadheesiota.

läpi kulussa mahalaukun syövän solujen kautta mesothelial yksisolukerrokset

in vitro

tutkittiin lisää meidän kokeita. Tutkimuksemme osoitti, että läpi kulussa on Cx43 ilmentävien mahalaukun soluissa merkittävästi parannettu verrattuna Cx43T154A ilmentäviä soluja, mikä viittaa siihen, että Cx43 ilmaisu vaikutti solun motiliteettia, mikä oli yhdenmukainen useiden aikaisempien raporttien [2, 14, 22, ja 23]. On kuitenkin vielä selvittämättä, onko Cx43 ilmentyminen liittyi solujen väliseen viestintään. Sitten tutkitaan, onko GJIC on keskeinen rooli läpi kulussa.