Krooninen sairaus

tiivistelmä

Syöpä kantasolut (CSCS) ovat pieni joukko syöpäsoluja pystyy itse uusiminen ja kasvaimen huolto. Kitkeminen syövän kantasolut, juuren kasvaimen alkuperän ja toistuminen, on tullut yksi lupaava lähestymistapa parantaa keuhkosyöpää selviytymistä. Syöpä kantasolut raportoidaan oleskella puolelle väestöstä (SP) viljeltyjen keuhkojen syöpäsoluja. Raportoimme tässä rinnakkaiseloa erillisten väestöstä kuin SP (NSP) solut, jotka ovat vastaavia kyky uusiutua verrattuna SP solujen keuhkojen kasvain pallo määrityksessä. Verrattuna vastaaviin soluihin yksikerrosviljelmissä, keuhkojen kasvain palloja, muodostivat ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solulinjat A549 tai H1299, osoitti merkitty morfologisia eroja ja lisääntynyt ilmentyminen kantasolujen merkkiaineita CD133 ja Oct3 /4. Keuhkosyövän aloilla myös ilmeni kohonneita Tuumorigeenisuustutkimuksissa koska vain 10000 keuhkosyövän alalla soluja tarvitaan tuottamaan ksenograftien kasvaimia nude-hiirissä, kun taas sama määrä yksikerrossoluissa ei onnistunut indusoimaan kasvaimia. Osoitamme myös, että keuhkojen kasvain palloja osoitti vähentynyt 26S-proteasomin aktiivisuus verrattuna yksikerroksista. Käyttämällä ZsGreen-cODC (C-terminaalinen sekvenssi, joka ohjaa hajoamista ornitiinidekarboksylaasi), reportterimääritystä NSCLC solulinjoissa, vain alle 1% yksikerrosviljelmiä oli ZsGreen positiivisia osoittaa alhainen 26S-proteasomin, kun taas keuhkosyövän alalla oli kohonnut määrä ZsGreen- positiivisia soluja, mikä viittaa rikastumista CSCS-alalla kulttuureissa.

Citation: Pan J, Zhang Q, Wang Y, You M (2010) 26S proteasomiaktiivisuus säätyy alas in Lung Cancer Varsi kaltaisia ​​soluja Jatkokäytetty

In vitro

. PLoS ONE 5 (10): e13298. doi: 10,1371 /journal.pone.0013298

Editor: Xinwei Wang, National Cancer Institute, NIH, Yhdysvallat

vastaanotettu: 18 huhtikuu 2010; Hyväksytty: 17 syyskuu 2010; Julkaistu: 11 lokakuu 2010

Copyright: © 2010 Pan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ tukivat NIH apurahan R01CA134682. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Syöpä kantasolut (CSCS) ovat pieni säiliö omavaraisia ​​solujen yksinomainen kyky itseuudistumiseen ja kasvaimen huolto [1]. Vain pieni joukko syövän solujen kasvaimen ovat luonteeltaan kantasoluja, ja voi siten aloittaa kasvaimen, kun istutetaan [3], [4]. Otaksuttu CSCS in akuutti myelooinen leukemia (AML) eristettiin ensin vuonna 1994 [5]. Kehittymisen kanssa fluoresenssiaktivoidulla solujen lajittelu (FACS), ja äskettäin tunnistettu solun pinnan markkereita, kuten Sca-1, ja CD133, CSCS voidaan eristää paitsi verisyöpiä, mutta myös kiinteitä kasvaimia [1].

CSCS ihmisen rintasyöpä on todettu harvinainen väestö CD44

+ /CD24

– /low /ESA

+ solujen [6]. 100 näiden solujen pystyivät muodostamaan uusia kasvaimia, kun taas muut kasvainsolut ei muodostaa kasvaimia SCID-hiirissä. Rintojen CSCS myös yksilöitävä CD44

+ /CD24

– /Oct-4

+ by Ponti

et al

. vuonna 2005 [7]. CSCS paksusuolen syöpä havaittiin olevan alle 2,5% väestöstä positiivisia CD133 ilme [8], ja viime aikoina määritelty CD44

+ /CD166

+ /ESA

+ [9]. Bronchioalveolar kantasolut (BASCs) äskettäin tunnistettiin otaksutun kantasolupopulaatiosta keuhkojen adenokarsinooma, ja voitiin eristää CD45

– /PECAM

– /Sca-1

+ /CD34

+ solujen FACS [10]. CSCS pienissä solu ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä raportoitiin myös harvinainen väestö erilaistumattoman CD133

+ soluihin [11]. Nämä pystyivät itse uudistaa kuten kasvain palloja seerumittomassa väliaineessa, ja tuottaa tuumoriksenografteissa fenotyypiltään mahdoton erottaa alkuperäisestä kasvaimesta, kun pistetään SCID-hiirissä.

Vaihtoehtoinen lähestymistapa eristämiseksi kantasolukkoa kautta rikastamiseen puolella väestöstä (SP) solut [2]. SP solut tunnistetaan kyky pumpata Hoechstin värin, prosessi välittämän ATP-sitova kasetti kuljettaja rintasyövän resistance protein (BCRP-1) [12]. Koska Goodell

et al

. ensimmäinen raportoitu, että SP on rikastettu hematopoieettiset kantasolut (HSC: t) [13], SP-soluja on tunnistettu erilaisissa normaaleissa ja pahanlaatuisten kudosten, mukaan lukien keuhkojen [14]. BCRP-1 hiirissä puuttui SP luuytimessä vielä ollut merkittävää verta muodostavan poikkeavuuksia [15]. Siten tarkka välinen toiminnallinen suhde SP fenotyypin ja kantasolujen toiminto on edelleen epäselvä. Sekä SP ja NSP jakeet Daoy medulloblastoma solulinja kykenivät uudelleen käyttöön alkuperäisen vanhempien väestöä, ja vain vähäinen klonogeeniset rikastus havaittiin SP osa [16].

hematopoieettiset kantasolut (HSC: t) ilmoitetaan asuvat SP osa aikuisen hiiren luuytimen (BM), mutta äskettäin raportti osoitti rinnakkaiselo NSP HS-solujen, jotka eivät merkittävästi poikkea SP HSC: iden numeroita, ja kyky uusiutua [17]. Lisäksi CD34

– /lowc-Kit

+ Sca-1

+ sukujuuret merkki

– solupopulaation, joka on hyvin rikastettu hiiren HSC oli lähes yhtä jaettu SP ja NSP solut. Nämä olivat lepotilassa ja osoitti yhtenäinen solukierron kinetiikkaan, riippumatta siitä, ovatko he olivat SP tai NSP [17]. Edelleen luonnehdinta SP syöpäsoluissa Siksi tarvitaan täysin arvioida rooli näiden solujen olla keuhkosyöpä.

Viimeaikaiset havainnot osoittivat, että kemoterapeuttiset lääkkeet, kuten doksorubisiini ja sisplatiini, voivat aiheuttaa leviämistä CSCS

in vitro

[18]. Nämä solut säilyttivät kyky uusiutua osoituksena kasvu kasvaimen pallojen

in vitro

, ja oli korkea tuumorigeenisemmiksi ja metastaattista potentiaalia seuraavan inokulaatiokokein SCID hiiriin. Kemoterapeuttiset lääkkeet, kuten sisplatiini ja ifosfamidi, tiedetään myös alentaa ekspressiota proteasomaalisten alayksiköiden [19], ja alas-säädellä ubikitiini-proteasomin riippuvainen proteolyysin [20]. Alennettu 26S-proteasomin aktiivisuuden havaittiin olevan ainutlaatuinen ominaisuus CIC (syövän aloittamista solut) gliooman ja rintasyövän, joita voitaisiin käyttää seuraamaan CSCS

in vivo

[21]. Kuitenkin Benzyloxicarbonyl-Leu-Leu-Nle-CHO (LLNle), joka on γ-sekretaasi-inhibiittori, on raportoitu tehokkaasti tappaa ihmisen glioblastooma kasvaimen aloittamista solut (GBM TIC)

in vitro

estämällä 26S-proteasomin . Siksi edelleen selvittäminen 26S-proteasomin aktiivisuus tarvitaan, jotta täysin määrittää rooliaan CSCS ja syövän hoitoon. Viime kädessä tämä voi auttaa tunnistamaan uusia tavoitteita tulevalle terapeuttisen intervention.

Tässä tutkimuksessa olemme tutkineet onko keuhko CSCS yksin asuvat puolella väestöstä ja onko keuhkojen kasvain pallojen kanssa kyky uusiutua maasta NSCLC solulinjat voisi olla lähde rikastamista keuhkojen CSCS.

Methods

Cell Culture

Ihmisen NSCLC solulinjat A549 ja H1299 ostettiin American Type Culture Collection (Manassas, VA), ja niitä viljeltiin RPMI 1640 media, jossa oli 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (Gibco) ja penisilliiniä ja streptomysiiniä cocktail (Gibco). 293 FT-solut ostettiin Invitrogen (Carlsbad, CA), ja niitä viljeltiin Dulbeccon Modified Eagle Medium (DMEM) (Gibco), jossa oli 10% FBS: ää ja penisilliiniä ja streptomysiiniä cocktail. Kaikki solut viljeltiin kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa 5% CO

2.

solujen värjäys Hoechst 33342

Menetelmät tunnistamiseksi iden mukautettiin aiemmista raporteista [ ,,,0],22], [23]. Lyhyesti, solut trpsinized ja suspendoitiin uudelleen 1 x 10

6 solua /ml DMEM: ssä, jossa on runsaasti glukoosia, 2% (v /v) FBS: ää, ja 10 mM N- (2-hydroksietyyli) piperatsiini-N ’- (2 -etaanisulfonihappoa) (HEPES)), inkuboitiin 5 ug /ml Hoechst 33342 väriainetta (tai ilman Fumitremorgin C (MP Biomedicals, Eschwege, Saksa) 90 minuutin ajan 37 ° C vesihauteessa, ja putkia varovaisesti ylösalaisin jokaisen 20 min estää solun laskeutumisen ja paakkuuntuu. solut sentrifugoitiin 375 x g: ssä 6 minuutin ajan 4 ° C: ssa, ja suspendoitiin uudelleen sopivaan tilavuuteen kylmää Hankin tasapainotettua suolaliuosta (HBSS), jossa oli 2% (v /v) FBS: ää. solut pysyi 4 ° C: ssa kokeen loppuajan. sillä kuolleiden solujen syrjintää, 2 ug /ml propidiumjodidia (PI), lisättiin välittömästi ennen virtaussytometriaa. Cell näytteet analysoitiin MoFlo (Beckman Coulter) solujen lajittelija, ja emissio kerättiin 610 nm: n pitkän syötön puoliläpäisevä peili (DCLP) on 620 nm pitkä pass (LP) suodattimen Hoechst punaisen kerääminen ja 424/44 nm kaistanpäästö (BP) suodattaa varten Hoechstin sininen kokoelma. Puolella väestö ”SP” tunnistettiin joukko soluja voi sulkea pois Hoechst väriaine, ominaisuus lakkautetaan 10pM Fumitremorgin C hoito [22].

Sphere muodostumisen määritys

Lung kasvain aloilla eristettiin kulttuurin kautta alhaisella tiheydellä seerumissa-viljelyolosuhteissa, kuten aiemmin on kuvattu, joka mahdollisti valinta erilaistumattoman syövän kanta- ja progenitorisolujen, kun taas seerumin riippuvainen eriytetty kasvainsoluja ja ei-transformoituja lisävaruste solut negatiivisesti valitut [8], [11], [24]. A549 ja H1299 keuhkosyövän solut maljattiin kloonitiheydessä seerumivapaassa DMEM-F12-väliaineessa, jota oli täydennetty 5 mM HEPES, 0,1% natriumbikarbonaattia, 0,4% BSA: ta, glutamiinia ja antibiootteja (Gibco-Invitrogen), ja joka sisälsi 20 ng /ml EGF: ää ja 10 ng /ml bFGF: ää. Hoitamaton kudosviljelykolveissa käytettiin vähentämään solujen sitoutumista ja tukea kasvua eriytymättömiä kasvain aloilla. Medium korvattiin tai täydennettiin tuoreella kasvutekijöiden kahdesti viikossa kunnes solut alkoivat kasvaa ja muodostavat kelluvat aggregaatteja. Kasvaimen palloja kerättiin 100 um solun siivilä (BD, Bedford, MA), ja laajennettu entsymaattisella ja mekaanisella dissosiaatio, jota seurasi uudelleen pinnoitus sekä yksittäisiä soluja ja jäljellä pieniä aggregaatteja täydellisessä tuoreella alustalla.

virtaussytometria

virtaussytometrialla, kasvaimen pallojen tai yksikerrosviljelmissä hajotettiin mekaanisesti yhden soluja, pestiin ja inkuboitiin sopiva laimennos valvontaa tai spesifistä vasta-ainetta. Vasta-aineita käytettiin PE konjugoitua anti-CD133 /1 Miltenyiltä Biotec (Bergisch Gladbach, Saksa), FITC konjugoitua anti-CD44 (eBioscience, San Diego, CA), ja anti-Oct3 /4 (Santa Cruz Biotechology, CA). PE konjugoitu anti-CD133 /1, soluja blokattiin ensin salpausreagenssissa 5 min, sitten 20 min inkuboinnin vasta-aineen kanssa. Sillä Oct3 /4 lauseke, solut kiinnitettiin ja läpäiseviksi FIX PERM® reagenssit (Invitrogen) noudattaen valmistajan ohjeita ja inkuboitiin hiiren monoklonaalisella vasta-aineella Oct3 /4 (Santa Cruz Biotechnology), 20 minuutin ajan pimeässä, jonka jälkeen pestiin PBS: llä, soluja inkuboitiin pimeässä FITC-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen ( Invitrogen). Negatiivisena kontrollina solut värjättiin sopivalla isotoopilla valvontaa. FITC konjugoitua anti-CD44, soluja inkuboitiin vasta-aineiden kanssa 20 min pimeässä. Sen jälkeen pestiin PBS: llä, solut analysoitiin FACS Calibur virtaussytometrillä (Becton Dickinson).

Proteasome Function määritykset

kymotryptisen, tryptisen, ja kaspaasi proteasomin aktiivisuudet mitattiin kuten aiemmin on kuvattu [25] muutamin pienin muutoksin. A549, H1299 ja niiden ensisijainen keuhkosyövän alalla solut pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja pelletoitiin sentrifugoimalla. Solupelletit sonikoitiin homogenointipuskuriin (25 mM Tris [pH 7,5], 100 mM NaCl, 5 mM ATP: tä, 0,2% (v /v) Nonidet P-40 ja 20% glyserolia, ja solujätteet poistettiin sentrifugoimalla 4 ° C. proteiinipitoisuus tuloksena soluraakauutteet määritettiin Micro (bikinkoniini- happo) protokollaa (Bio Rad, Rockford, IL) ja BSA (Sigma) standardina. mittaamiseksi 26S-proteasomin aktiivisuus, 100 ug proteiinia soluraakauutteet kunkin näyte laimennettiin puskurilla I (50 mM Tris [pH 7,4], 2 mM ditiotreitolia, 5 mM MgCl

2, 2 mM ATP: tä) lopulliseen tilavuuteen 1 ml (määritettiin neljänä kappaleena). fluorogeenisen proteasomin substraatteja Suc-LLVY-AMC (kymotryptisen alustalle; Biomol International, Plymouth Meeting, PA), Z-ARR-AMC (tryptinen alustalle; Calbiochem), ja Z-LLE-AMC (kaspaasi-kaltainen substraattispesifisyys, Biomol International) liuotettiin DMSO: hon ja lisättiin loppukonsentraatioon 80 uM. proteolyyttiset toimintaa seurattiin jatkuvasti 2 tuntia 37 ° C: ssa mittaamalla vapautuminen fluoresoivan ryhmän, 7-amido-4-metyylikumariini (AMC), on fluoresenssilevylukijaa (Spectramax M2, Molecular Devices, Sunnyvale, CA), jossa heräte ja emissioaallonpituuksia 380 ja 460 nm, vastaavasti.

Alamar Blue Pitoisuus

Solujen elinkelpoisuus mitattiin Alamar Blue [26]. A549 ja H1299-soluja siirrostettiin 96-kuoppaisille levyille (BD Falcon) tiheyteen 2 x 10

3 solua kuoppaa kohti. Kasvaimen pallo kulttuureissa, yksittäinen solu oli entsymaattista ja mekaanista liukenevat. 24 h ymppäyksen jälkeen, solut altistettiin eri sisplatiinin tai doksorubisiinin kuten 48 tuntia. Alamar Blue (BioSource, Camarillo, CA) lisättiin suoraan viljelyalustaan ​​10% median äänenvoimakkuutta viimeisen 10 h 48 h altistuksen aikana. Fluoresoi viritysaallonpituudella 544 nm ja emissio havaitaan 590 nm: ssä mitattiin mikrolevynlukijaa käyttäen.

Generation of Stable ilmentävien solulinjojen ZsGreen-cODC fuusioproteiinien käyttö Retroviral Transduction

retroviraalinen ekspressiovektori pQCXIN-ZsGreen-cODC oli ystävällinen lahjoitus tri Frank Pajonk (Division of Molecular and Cellular Oncology, Department of Radiation Oncology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, Los Angeles, CA), jossa karboksyyli- terminaaliin hiiren ornitiinidekarboksylaasin (cODC) degron, sekvenssi, joka ohjaa lähtöpaikalle hajoamista, fuusioitiin ZsGreen toimittaja [21]. pQCXIN-ZsGreenc-ODC on ko-transfektoitiin VSV-G osaksi GP2-293 pantrofiinisen retroviruspakkauksen soluja (Clontech) ja retrovirus supernatanttia käytettiin infektoimaan A549 ja H1299-soluissa. 48 tuntia infektion jälkeen, solut valittiin G418: aa (Invitrogen). Kertyminen ZsGreen-cODC proteiinia seurattiin fluoresenssimikroskooppiin ja virtaussytometria (FL-1channel).

Generation of ihonalainen keuhkosyöpään nude-hiirissä

hiiret ksenografteja, sekä yksikerroksisen ja kasvaimen pallo solut trypsinoitiin ja mekaanisesti hajotetaan saada yksisolususpensioi- ennen ihonalaisen injektion. Kuuden viikon ikäisiä naaras nude-hiiriä (Harlan Lab, Indianapolis, IN) käytettiin. Kasvaimen pallo (1 x 10

4) ja yksikerroksista (1 x 10

4) soluja s.c. ruiskutetaan vasempaan ja oikeaan kyljet saman hiiren arvioida tuumorigeenisiä toimintaa. Hiiriä tarkkailtiin päivittäin ulkonäkö ihonalaisen kasvaimia. Hiiret lopetettiin päivänä 60 ja kasvaimen kudosta kerättiin. Kasvaimen tilavuus laskettiin kaavalla 0,52 × pituus × leveys

2. Hematoksyliinillä ja eosiini värjäystä seurasi IHC analyysi tehtiin analysoimiseksi kasvainhistologiaa. Osiot värjättiin myös vasta-ainetta β-kateniinin standardeilla IHC-protokollaa.

Tilastollinen analyysi

Data esitetään keskiarvoina ± SD. Erot määritettiin kaksi tailed Studentin t-testiä. AP arvo 0,05 katsottiin merkitseväksi.

Tulokset

SP ja NSP solut muodostavat kasvain Pallon ja samalla taajuudella ihmisen adenokarsinooman solulinjoja

SP solut ovat olleet osallisina otaksuttu CSCS kuin ne osoittavat kohonnut tuumorigeenisyystesti nude /SCID-hiiriin verrattuna NSP soluihin [27]. Sen määrittämiseksi, onko SP-soluissa on suurempi kyky uusiutua kuin NSP viljeltyjen solujen SP ja NSP soluja kahdesta ihmisen keuhkosyövän solulinjat lajiteltu perustuu kykyyn pumpata Hoechst 33342 väriaine tuottaa Hoechst sinipunainen profiilin. Selektiivinen ABCG2 estäjä, Fumitremorgin C (FTC), oli mukana inkuboitiin Hoechst 33342 estää toiminnan kuljettajaa, ja SP portti määriteltiin vähäisemmälle alueen läsnä ollessa FTC. Ihmisen adenokarsinooman solulinjoja A549 ja H1299 sisälsi 17,7% ja 0,2% SP-soluissa, vastaavasti (kuvio. 1A). Viljeleminen SP ja NSP solujen kasvaimen alalla muodostavat media, joka vain mahdollistaa valinnan erilaistumattoman klooneista tai syövän kanta- ja progenitorisolujen [11], johti keuhkojen kasvain alalla muodostus molemmista alapopulaatioiden kanssa eroa muodostumisen nopeutta (Fig. 1B ja tietoja ei ole esitetty). SP solut tyypillisesti aiheuta SP ja NSP solujen avulla epäsymmetrisen solujen jakautumisen, kun taas NSP solut eivät ole tätä potentiaalia [28]. Uudelleen värjäämällä lajitellaan SP ja NSP solujen A549 ja H1299 solujen viikon kuluttua, FACS-analyysi paljasti, että SP solut johti merkittävä osa NSP soluja. Lisäksi, eristetty NSP solut myös johtaneet samankaltaisiin osuuden SP-soluissa (kuvio. 1 C).

. Ominaisuus Hoechst 33342 väriaine värjäystä profiili Osoittamalla SP (monikulmio aidatulla) ja NSP (ellipsi aidatulla) solut ihmisen A549 ja H1299 adenokarsinoomasolua. Prosenttiosuus SP solujen on osoitettu. Solut värjättiin 5 mg /ml Hoechst33342 (HO), ja valvonta soluja yhteistyötä myös värjätään 10 mM fumitremorgin C (FTC) määrittää SP soluja. Solut lajiteltiin käyttäen Beckman MoFlo sytometrin ja tietoja selityksin käyttämällä FCS Express. B. Vaihe kontrastin valokuvat keuhkojen kasvain pallojen saatu SP ja NSP soluja. SP ja NSP soluja (1000 solua /ml) maljattiin ultra low kiinnittyvä pulloissa seerumivapaassa alusta täydennettynä kasvutekijöiden ja viljeltiin kuten on esitetty materiaalit ja menetelmät. C. Re-tahra SP ja NSP solujen A549 ja H1299 kanssa Hoechst 33342 väriainetta. Prosenttiosuus SP solujen on leimattu.

Lung kasvain aloilla näyttelytila ​​syövän kantasolujen ominaisuuksia

Koska solut kykenevät itseuudistumisen asuvat sekä sivu- ja ei-puoli populaatiot, me tutkimme, kasvain pallo solut osoittivat mitään CSC ominaisuuksia, kuten ilmaus kantasolujen markkereita, kuten CD44, CD133 ja Oct3 /4. Ensinnäkin, sulkea pois vaikutusta CSC median ilmaisun, yksikerrossoluissa kasvatettu CSC media tarkastettiin, ja eroa välillä havaittiin solut kasvavat CSC median ja säännöllinen kasvualustaa (tuloksia ei ole esitetty). Solut yksikerroksisesta ja pallo kulttuureissa A549 ja H1299 Sitten solut kerättiin talteen, ja analysoitiin CD44 ja CD133. Yli 90% A549 ja H1299 solujen yksikerrosviljelmissä olivat CD44

+, kun taas vain hyvin pieni osa soluista oli CD133

+ (0,2% A549-soluja, ja 0,55% vuonna H1299 soluissa.). Kuitenkin keuhkojen kasvain aloilla, CD133

+ solut suuresti rikastettu yli 10% A549, ja 1,7% H1299 (Fig. 2A). Transkriptiotekijän Oct3 /4 pidetään keskeisenä säätelijänä ihmisalkion kantasolujen pluripotenttisuus ja itseuudistumisen kapasiteettia. Sen ilmentyminen näyttää olevan tärkeää säilyttää erilaistumattoman tilan alkion karsinooma, sekä muissa syövissä [29], [30]. Oct3 /4

+ solujen A549 ja H1299 yksisolukerrokset olivat alle 4%, kun taas luvut olivat huomattavasti säädellään ylöspäin kasvain aloilla 36% ja 50%, erikseen.

. Keuhkosyövän aloilla osoittivat lisääntynyttä CD133 ilme. Expression of CD44 ja CD133 yksikerroksisessa ja kasvaimen alalla soluja, määritettynä kaksivärinen virtaussytometria analyysi. Isotyypin monoklonaalisia vasta-aineita, ja esi-toista antiseerumia käytettiin negatiivisina kontrolleina. Prosenttiosuus yksi- ja double-positiivisten solujen on osoitettu. B. Lung kasvain pallojen oli kohonnut Oct3 /4 ilme. Keskimääräinen fluoresenssin intensiteetti Oct3 /4 hallinnassa (harmaa alue), yksikerrossoluissa (pisteviiva) ja kasvaimen aloilla (yhtenäinen viiva) on esitetty. Prosenttiosuudet positiivisia soluja taulukon.

Lung kasvain aloilla on suuri Tuumorigeenisuustutkimuksissa

Voit selvittää keuhkojen kasvain pallojen A549 ja H1299 solut eroavat Tuumorigeenisuustutkimuksissa verrattuna -soluja kasvatettiin yksikerros-, me injektoidaan 10000 soluja ihon alle kunkin näistä populaatioista osaksi paljaiden hiirien kylkiin. Kasvaimen kasvu havaittiin kaikissa hiirillä, jotka inokuloitiin kasvaimen alalla solujen, jotka ovat peräisin A549, kun taas mitään kasvaimen kasvua ei havaittu istuttamisen jälkeen yksikerroksista A549-soluja (taulukko 1). Kasvain pallo soluja H1299 solut kasvoivat 2 ulos 3 nude-hiirten, kun taas sama määrä yksikerrossoluissa ei aiheuta kasvainten jopa laajennettu 4 viikkoa tarkkailujakson (taulukko 1 ja tuloksia ei esitetty). H 0,05, ** p 0,01 ja *** p 0,001 (kolme toistoa per koe).

Lung kasvain aloilla on rikastunut soluilla, joilla on alhainen proteasomiaktiivisuus

proteasomaalisten hajoaminen useimpien proteiinien täytyy ensin käydä läpi ubikinaa- reitin ennen hajotetaan proteasomia. Kuitenkin ornitiinidekarboksylaasi (ODC) on hyvin tunnettu solujen proteiini kohteena ubikitiinistä riippumaton proteasomaalisten hajoamista, ja kerran tunnustettu 26S-proteasomin, se johtaa välittömästi hajoaminen proteiineja, jotka sisältävät sitä [21]. Retrovirus ilmentävät ZsGreen-cODC (eli fuusio fluoresoivan proteiinin ZsGreen, ja C-pää hiiren ornitiinidekarboksylaasin (cODC) degron) sallii sellaisten solujen tunnistamisen, joilla on alentunut 26S-proteasomin toiminnan vuoksi ZsGreen fluoresenssin. Tämä on aiemmin raportoitu seurata CIC vuonna gliooma ja rintasyövän

in vitro

perustuu sen kyky merkitä eläviä soluja matalalla 26S-proteasomin aktiivisuus [21]. Sen vahvistamiseksi, että kasvain alalla solut rikastetaan keuhkojen CSCS, me tartunnan A549 ja H1299 solujen ZsGreen-cODC ilmentävien retrovirus. Havaitsimme, että yksikerroksisiin A549 ja H1299 esillä alhainen tausta fluoresenssi yli 98% soluista, ja vain hyvin harvat solut (2%), joka näkyy korkea ZsGreen (Fig. 6A ja tietoja ei ole esitetty). Mielenkiintoista, keuhkojen kasvain pallojen johdettu ZsGreen-cODC tartunnan A549 ja H1299 solut suuresti rikastettu ZsGreen-positiivisia soluja, mikä osoittaa alhainen proteasomin aktiivisuus ja siten erittäin rikastetun lähteen CSCS (Fig. 6B). Edelleen vahvistaa, että CSCS rikastuvat väestön alhainen proteasomiaktiivisuus, ZsGreen-positiivisten ja -negatiivisilla solut myös lajiteltiin 96-kuoppalevylle, ja pallojen lukumäärä muodostettiin 100 lajiteltu solut laskettiin, ZsGreen-positiiviset solut sekä A549 ja H1299 solulinjoissa oli tilastollisesti merkitsevästi suurempi palloja muodostavan kapasiteetin verrattuna ZsGreen-negatiiviset solut (Fig.6C).

. Taajuus ZsGreen solujen A549 ja H1299 yksikerrosviljelmissä. B. taajuus ZsGreen solujen A549 ja H12199 johdettu kasvaimen aloilla kartuttamalla ZsGreen-cODC, ja näin alhainen proteasomiaktiivisuus ilmoitetaan. C. määrä palloja, jotka on muodostettu ZsGreen positiivinen ja ZsGreen negatiivisia soluja lajittelun jälkeen virtaussytometrillä 96-kuoppaisille levyille. ZsGree-positiivisten ja -negatiivisilla solut lajiteltiin 96-kuoppalevylle (100cells /kuoppa), kun viljeltiin kasvaimen alalla mediassa 2 viikkoa; määrä muodostunut aloilla laskettiin. Opiskelijan pariksi, ja kaksisuuntainen t-testit suoritettiin, *** p 0,001 (kolme toistoa per koe).

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet että: 1) yhdenmukaisia ​​aiempien näyttöä [11], CSC kaltaisia ​​soluja ei esiinny keuhkosyöpä; 2) sekä SP ja NSP solut muodostavat kasvain palloja yhtä usein, mikä olisi osoitus itseuudistumisen CSC kaltaisia ​​soluja molemmissa ryhmissä; 3) keuhko CSC kaltaisia ​​soluja voidaan kasvattaa seerumivapaassa media; ja 4) pieni 26S-proteasomin aktiivisuus liittyy keuhko CSC kaltaisia ​​soluja. Syöpä kantasolu hypoteesin ennustaa, että SP jae pitäisi pystyä uudistumaan sekä SP ja NSP jakeet taas NSP jakeen vain voi uudistaa itse itseään [28]. Mielenkiintoista, tässä esitetyt tulokset osoittavat, että sekä SP ja NSP jakeet on kyky täysin uudistua molemmat jakeet. Sama toteamus on havaittu myös C6 gliooman ja Daoy varhaissolukasvaimesta solulinjoissa, jossa molemmat jakeet kykenivät uudelleenmuodostamaan vanhempien solu väestöstä [16], [33]. Esillä olevassa tutkimuksessa, SP soluilla kasvain pallomainen kasvu, klassisen

in vitro

määrityksessä itseuudistumisen potentiaali, mikä vahvistaa aikaisempia havaintoja, SP-soluissa näyttää varsi kaltainen aktiivisuus [34]. Kuitenkin, NSP-solut pystyivät myös muodostaa kasvaimen palloja taajuudella, joka on verrattavissa SP-soluissa.

CD133 (ihmisen prominin-1), viiden transmembraanidomeeni glykoproteiini, tunnistettiin alun perin solun pinta-antigeenin läsnä CD34

+ Veren kantasolut. Äskettäin CD133 näkyi oletetun pintamerkkiaine syövän kantasoluja monien kiinteiden kasvainten, kuten aivokasvain [35], eturauhassyöpä [36], paksusuolen syöpä [8], munasarjasyöpä [37] ja keuhkosyövän [11] . Erittäin alhainen runsaus CD133

+ tai Oct3 /4

+ oleviin soluihin, vaikeuttaa eristää näissä potilasryhmissä. Tutkimuksessamme osoitamme, että rikastamista CD133

+ /okt 3/4

+ solujen

in vitro

seerumittomassa kulttuuri on mahdollista.

Jo pitkään on ollut tiedossa ettei jokainen kasvainsolun on kasvain-aloitetaan solun, ja täten miljoonia kasvainsolujen vaaditaan usein elinsiirron uusi kasvain olemassa olevaa. Esillä olevassa tutkimuksessa, ksenograftin kasvaimen kasvua nude-hiirissä tapahtui injektoimalla 10000 kasvaimen alalla solujen, mutta ei injektoimalla yhtä monta yksikerrossoluissa. Nämä kasvaimet oli suuret ytimet merkittävässä nucleoli ja tumavärjäystä of β-kateniinin, joka osoittaa mahdolliset aktivoinnin Wnt reitin. Nuclear kertyminen β-kateniinin [38] on osoitettu olevan rooli säätelyssä kantasolujen itseuudistumisen [31], [39].

kemoterapeuttisia lääkkeitä, kuten sisplatiini ja ifosfamidi [19], ovat tiedetään tappavan suurimman kasvainten alaspäin säätäminen ubikitiini-proteasomin riippuvainen proteolyysin [20]. Ne kuitenkin myös johtaa etenemiselle CSCS [18].