Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kolesteroli sisältö voi vaihdella selvästi normaalin ja syöpä solut, joissa kohonneet syöpäsoluissa. Täällä tutkimme kolesteroli sitomista metyyli-β-syklodekstriini (MCD), ja huokosten muodostumisen kanssa ostreolysin A /pleurotolysin B (OLYA /PlyB) proteiinikompleksi, joka sitoutuu kolesterolia /sfingomyeliini-rikas membraanidomeeneja. Arvioimme vaikutukset elinkelpoisuudesta T24 invasiivisia ja RT4 noninvasive ihmisen Uroteelisyöpäsolujen ja normaalin sian urothelial (NPU) soluja. Kolesterolipitoisuus korreloivat voimakkaasti syöpään transformaatio, kuten korkein T24 korkealaatuisia invasiivisen Uroteelisyöpäsolujen, ja matalin NPU soluissa. MCD indusoi näkyvä solukuoleman T24 soluja, kun taas OLYA /PlyB hoito johti huomattavasti vähentynyt elinkelpoisuus RT4 huonolaatuisen noninvasive syöpä soluja. Biokemialliset ja transmissioelektronimikroskopia analyysit paljastivat, että MCD ja OLYA /PlyB indusoi nekroottisen solukuoleman näissä syöpäsoluissa, kun taas elinkelpoisuus NPU solujen ei vaikuttanut merkittävästi jompikumpi hoito. Voimme päätellä, että MCD on myrkyllistä T24 korkealaatuisesta invasiivisen Uroteelisyöpäsolujen, ja OLYA /PlyB varten RT4 heikompilaatuisen invasiivisen Uroteelisyöpäsolujen, ja kumpikaan ei ole myrkyllinen NPU soluja. Kolesteroli ja kolesterolin /sfingomyeliini-rikas kalvo domeeneja Uroteelisyöpäsolujen muodostavat siten selektiivinen terapeuttinen kohde poistaminen Uroteelisyöpäsolujen.

Citation: Resnik N, Repnik U, Kreft ME, Sepčić K, Macek P, Turk B, et ai. (2015) Highly Selective Anti-Cancer aktiivisuus kolesterolia Interacting Agents metyyli-β-syklodekstriini ja Ostreolysin A /Pleurotolysin B Protein Complex uroteelisyöpäsoluilla. PLoS ONE 10 (9): e0137878. doi: 10,1371 /journal.pone.0137878

Editor: Marie-Claude Potier, Institut du Cerveau et de la Mølle, FRANCE

vastaanotettu: 02 joulukuu 2014; Hyväksytty: 24 elokuu 2015; Julkaistu: 11 syyskuu 2015

Copyright: © 2015 Resnik et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat Slovenian Research Agency (https://www.arrs.gov.si/en/agencija), avustukset P3-0108, P1-0207, P1- 0140, ja J1-4305. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

useimmissa eukaryoottisissa soluissa solukalvoon kolesterolin pitoisuus on peräti 90% solun kolesterolin [1,2]. Kolesteroli on olennainen membraanikomponentti, ja se vaikuttaa kalvo rakenne ja toiminta, mukaan lukien kalvo sujuvuus ja kalvo proteiinin aktiivisuutta [3,4,5]. Yhdessä sfingomyeliini, kolesteroli kertyy membraanidomeeneja joita kutsutaan kalvo lauttoja. Erityinen lipidi- ja proteiinikokoomukset näistä kolesterolia /sfingomyeliini-rich membraanidomeeneja ovat sekaantuneet monilla keskeisillä signaalireitteihin liittyy solujen kasvuun, muuttoliike ja apoptoosin [6,7].

Kolesteroli aineenvaihdunta on tiukasti säänneltyä, säilyttää asianmukainen kolesterolin pitoisuus terveissä soluissa. Kliiniset ja kokeelliset todisteet viittaavat siihen, että häiriöt kolesterolin aineenvaihduntaan voi olla tärkeitä rooleja cancerogenesis ja kasvainten kehittymistä (tarkistetaan [8,9]). Tällaisia ​​häiriöitä on osoitettu useissa maligniteettien [10,11,12], ja kolesteroli aineenvaihduntatuotteita voi edistää tai estää syöpien [13]. Kohonnut kolesterolipitoisuus on havaittu invasiivisen [10,14,15] ja invasiivisia [16] syöpäsoluja, ja nämä kolesteroli korotukset voivat moduloida kalvoon lautta dynamiikka ja lauttaa liittyvä koordinointi eri signalointireittien syöpäsoluissa [17].

kolesterolipitoisuutta syöpäsolujen yleensä lisättävä säätely ylöspäin 3-hydroksi-3-metyyliglutaryylikoentsyymi (HMG) -CoA reduktaasin, sääntely entsyymi kolesterolin synteesiä, mikä johtaa yhtyminen kalvon lautat, ja voi stimuloida syöpää reittejä [18]. Omega-3-monityydyttymättömiä rasvahappoja, estää HMG-CoA-reduktaasin ja on anticancerogenic ominaisuudet indusoimalla solujen kuolion tai apoptoosin [19,20]. Muita tunnettuja anticancerogenic lipidejä, jotka häiritsevät kalvo-lautta toimintojen kautta kolesterolin homeostaasiin ovat alkylphospholipids, kuten edelfosiini [21]. George ja Wu ehdotti, että merkitys kalvon-lautan koostumus ja eheys solujen elinkelpoisuuden ja lisääntymistä on solutyyppispesifisten johtuen hienosäätämällä signalointi polkuja, jotka voivat johtaa solukuolemaan tai solujen eloonjäämistä [22]. Siksi kolesterolia ja membraanidomeeneja ovat potentiaalisia kohteita lauttaa-häiritsevää aineita, vaikuttaa soluproliferaatioon ja elinkelpoisuus. Sytotoksisia vaikutuksia tällaisten aineiden voi johtaa ainakin kolme muotoa solukuoleman: apoptoosia, autophagic solukuolemaa, ja kuolion [18,23,24]. Kolesterolin väheneminen metyyli-β-syklodekstriini (MCD), joka sitoo solukalvoon kolesteroli, tekee melanoomasoluja herkkiä apoptoosin [25] ja laukaisee apoptoosin rinta- ja eturauhassyövän solulinjoissa, joissa on runsas kalvo lautat [18].

keinotekoinen ja biologisia kalvoja, kolesteroli /sfingomyeliini-rikas membraanidomeeneja voidaan leimata kanssa ostreolysin A /pleurotolysin B proteiinikompleksi (OLYA /PlyB) sekä erittäin selektiivisesti ja suurella affiniteetilla [26,27]. Olya ja PlyB tuotetaan sienen

osterivinokas

, ja ne koota osaksi huokosia muodostavaa kompleksi jossa kukin proteiinien on erityinen rooli. Olya toimii kalvoon sitova komponentti, ja se sitoo yksinomaan membraanidomeeneja jotka rikastettu Sfingomyeliinin ja sterolit [26,27,28,29]. Tämä sitoutuminen voi rekrytoida PlyB kalvon pintaan nähden, jolloin muodostuu 13-kertainen transmembraaninen huokosia, jolloin kukin alayksikkö koostuu PlyB molekyylin, joka on sijoitettu kalvoon sitoutuneen OLYA dimeeri [26,30].

vuorovaikutus OLYA kolesterolia /sfingomyeliinin kalvoilla on erittäin osuuskunta suhteessa kalvoon kolesterolia yläpuoliselle ~ 30 mooli-%: iin [28]. Kun Olya on otettu palvelukseen kyseisiin kalvoihin, ja jos pitoisuus OLYA /PlyB on riittävän korkea, PlyB on huokosia muodostava aktiivisuus [31]. Esikäsittelyssä solujen joko MCD tai sfingomyelinaasia dramaattisesti kumoaa sitoutumisen OLYA [27] (ja OLYA /PlyB [3,32]) ja kalvoja eri solujen.

Parhaan tietoa, ei ole ollut raportteja rooli kalvon kolesterolin mahdollisena kohteena hoitoon virtsarakon syöpä. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme tutkineet, onko urothelial solujen eri vaiheissa syöpä muutosta, ja myös transformoimattomina normaalin sian urothelial (NPU) solut, eroavat herkkyys kolesterolia vuorovaikutuksessa aineet mukaan erot niiden kolesterolitasoa. Voit tarkistaa vaikutuksen mahdollisten lajien välinen vaihtelu kolesterolipitoisuuden, mittasimme kolesterolipitoisuuden myös invasiivisia ja noninvasive hiiren urothelial solulinjat. Vertasimme herkkyyttä MCD ja OLYA /PlyB of T24 ihmisen Uroteelisyöpäsolujen (kuten korkea-asteen invasiivisen urothelial karsinooma malli), RT4 ihmisen Uroteelisyöpäsolujen (kuten heikompilaatuisen invasiivisen papillaarinen karsinooma malli), ja NPU soluja, jotka morfologisesti ja fysiologisesti muistuttavat läheisesti normaalia ihmisen uroteeliin [33,34,35]. Otimme hyödyntää ainutlaatuisia mekanismin OLYA /PlyB proteiinikompleksi sallia, toisaalta, tehokas immunoleimaus kolesterolia /Sfingomyeliinin rikastetun membraanidomeeneja [3,32,36], ja toisaalta, ohjattu huokosia muodostumista näillä aloilla [28,29,32]. Tutkimuksemme osoittaa, että nämä T24 ja RT4 ihmisen Uroteelisyöpäsolujen on selvästi suurempi herkkyys sekä kolesterolin sitominen MCD ja pore-muodostuksen Olya /PlyB verrattuna transformoimattomissa NPU soluja. Lisäksi nämä tiedot tarjoavat uuden ja erittäin selektiivinen lähestymistapa hoitoon hengenvaarallisten urothelial metastasoitunut soluja ja eniten usein invasiivisen virtsarakon syövän soluissa.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljelmät

ihmisen virtsarakossa T24 ja RT4 syöpäsolulinjoissa (ATCC, Manassas, VA, USA) ja hiiren virtsarakossa, NUC-1 ja g /g-solut (ystävällinen lahja prof de Boer, Leiden University Medical Center, The Alankomaissa [37]) viljeltiin pitkälle Dulbeccon modifioidussa Eaglen elatusaineessa (A-DMEM) /F12 (1: 1), 5% vasikan sikiön seerumia (FCS), 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä (verrokkiravintoalusta syövän urothelial solut) 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2.

Toissijainen viljelmät NPU solujen viidennestä kahdenteentoista kohtia valmistettiin kuten aiemmin on kuvattu [33,38, 39]. NPU-soluja viljeltiin MCDB153 (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Saksa) /A-DMEM (1: 1), 2,5% FCS: ää, 0,1 mM fosfoetanoliamiini (Sigma), 0,5 ug /ml hydrokortisonia, 5 ug /ml insuliinia (Sigma ), 4 mM glutamax, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä (kontrolli väliaine normaaleille urothelial solut). Elatusaineet ja täydennykset ostettiin Invitrogen (Wien, Itävalta), ellei toisin mainita.

metyyli-β-syklodekstriini ja OLYA /PlyB hoidot

metyyli-β-syklodekstriini (MCD) oli liuotetaan ohjaus väliaineessa (syöpää tai normaali urothelial solut) käyttäen kolesteroliton FCS (Thermo Scientific Hyclone, Logan, UT, USA) sijasta FCS kolesteroli.

seosta, OLYA /PlyB (moolisuhde 9 : 1) valmistettiin tuoreesta itiöemiä on

P

.

ostreatus

kuten aiemmin on kuvattu [26,40]. Ennen solun Hoidon OLYA /PlyB laimennettiin kolesteroliton vertailualustassa (syöpää tai normaali urothelial solut). Kalvoon lauttaa merkintöjä, joka on nonlytic pitoisuus OLYA /PlyB (2,5 ug /ml) levitettiin urothelial solujen kanssa 1 h ja 3 h 37 ° C: ssa. Tutkimuksiin cytotoxity, OLYA /PlyB käytettiin 30 ug /ml, 1 tunnin ja 3 tunnin ajan 37 ° C: ssa.

Yhteensä solun kolesterolin pitoisuus

T24, RT4, NUC-1 ja g /g-solut ympättiin 1 x 10

4 solua /cm

2, ja NPU soluja 1 x 10

5 solua /cm

2, ja kasvatettiin ohjaus keskipitkällä 100% konfluenssiin. T24, RT4 ja NPU soluja käsiteltiin myös 7 mM MCD: ssa 6 tuntia, ja 250 ui solususpensiot valmistettiin. Lipidit uutettiin 200 ui näitä solususpensioita, seuraten menetelmää, Bligh ja Dyer [41]. Nämä rasva-uutteet kuivattiin N

2, ja lipidit liuotettiin 50 ul: aan isopropyylialkoholia. Kvantifiointi vapaan kolesterolin näissä lipidiuutteita perustui käyttöön kolesterolioksidaasi ja kytkentä tuotetun vetyperoksidin kanssa 4-hydroksibentsoehappoa ja 4-aminopyridiiniä kanssa peroksidaasin reaktio. Quinoneimine väriaine, joka on muodostettu tuloksena peroksidaasin määrä määritettiin 560 nm: ssä (Konelab kolesteroli sarjat, Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA). Kokonaisproteiinia pitoisuudet määritettiin 50 ui solususpensiota alikvootit käyttäen Bradfordin menetelmällä [42]. Koko solun kolesterolin pitoisuus annetaan ug kolesterolia /mg solun proteiinia.

OLYA ja HMG-CoA-reduktaasin immunolabelings ja fluoresenssin intensiteetti mittauksista

T24 ja RT4 soluja viljeltiin peitinlaseilla ja NPU soluissa 0,4 um huokoista kalvoja (BD Falcon, Pharmingen, San Diego, CA, USA). Sillä Olya immunoleimaus, soluja inkuboitiin 2,5 ug /ml OLYA /PlyB 30 min ajan 37 ° C: ssa. Sitten solut pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja kiinnitettiin 4% formaldehydiä (FA) 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa. 30 min estämisen 2% naudan seerumin albumiinia (BSA) 37 ° C: ssa, soluja inkuboitiin kanin polyklonaalisen anti OLYA vasta-aineita (1: 2500) 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa, pestiin sitten PBS: llä ja inkuboitiin Alexa Fluor 488-konjugoidulla anti-kaniini-vasta-aineilla (1: 600, Molecular Probes, Eugene, OR, USA) 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa. HMG-CoA-reduktaasin immunoleimaus, solut kiinnitettiin 4% FA: ssa 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa, ja laittaa salpaus 2% BSA: ta 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Sitten soluja inkuboitiin kanin anti HMG-CoA-reduktaasin polyklonaalisia vasta-aineita (1: 200, Merck Millipore 09-356) 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa, pestiin PBS: llä ja inkuboitiin Alexa Fluor 488-konjugoidulla anti-kaniini-vasta-aineita 30 min 37 ° C: ssa.

solut asennettu Vectashield, joka sisälsi 4,6-diamino-2-fenyyli (DAPI; Vector Laboratories, Burlingamme, CA, USA) ja analysoitiin fluoresenssimikroskopialla (AxioImager Z1) öljykannulla-immersio-objektiivi (63 × öljy /NA 1,40), ja jossa on ApoTome laite optisella osassa sukupolvi. Kuvat hankittiin käyttäen AxioVision ohjelmaa (Carl Zeiss, Saksa).

Analysoimme 13-20 kuvaa per viljelyolosuhdetta ja mitataan keskimääräisen vihreän fluoresenssin voimakkuutta kohti näkökentän (AxioVision ohjelma). Kuvat otettiin samaan valotusajan (469 ms) kullekin soluviljelmissä kunnossa.

Immunoblottausmääritys analyysi

jälkeen MCD hoito, solut hajotettiin 2 mM EDTA, 150 mM NaCl , 100 mM Tris, 1% Triton X-100, 1 mM aprotiniini, 1 mM phenylmethanesulfonylfluoride, ja 1 mM Na-

3Vo

4, 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Yhtä suuret määrät proteiinia (20 ug) erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille, joita tutkitaan sitten kanin anti-LC3 polyklonaalisia vasta-aineita (1: 1000, MBL, PM036), kanin anti-PARP-polyklonaalista vasta-aineita (1: 1000; Roche Life Science, 11835238001), ja kanin anti-β-aktiini polyklonaalisia vasta-aineita (1: 1000, Sigma, A2066). Piparjuuri-peroksidaasi-konjugoitua anti-kanin polyklonaalista sekundaarisia vasta-aineita (1: 1000; Sigma) todettiin käyttäen tehostettua kemiluminesenssitekniikalla (Pierce ECL Western blotting alustan, Thermo Scientific).

mittaus kaspaasiaktiivisuus

kaspaasi aktiivisuus määritettiin mittaamalla pilkkomalla asetyyli-Asp-Glu-Val-Asp-7-amino-4-trifluorimetyylikumariinia (Ac-DEVD-AFC; Bachem, Bubendorf, Sveitsi) on käsittelemätön (kontrolli) ja MCD käsiteltyä T24, RT4, ja NPU soluja kuten aiemmin on kuvattu [43]. Positiivisen kontrollin kaspaasin aktivaatio, RT4 solut altistettiin UV-säteilyä 30 s apoptoosin indusoimiseksi, ja sen jälkeen inkuboitiin vielä 6 tuntia. DEVD-ase aktiivisuus mitattiin käyttäen mikrolevyn lukijaa (Safire; Tecan, Mannedorf, Sveitsi). Alkunopeudet reaktioiden laskettiin ja ne on esitetty suhteellisina fluoresoiva yksikköä sekunnissa (RFU /s).

Virtaussytometria

käsitelty ja käsittelemätön urothelial soluja viljeltiin 24-kuoppalevyillä (1 x 10

5 solua /kuoppa) ja kasvatettiin konfluenssiin varten MCD ja OLYA /PlyB hoitoja. Kerätyt solut inkuboitiin anneksiini V-PE-reagenssia (BD Biosciences, Pharmingen, San Diego, CA, USA) ja 0,2 ug /ml propidiumjodidia (PI; Sigma) kantavassa solut analysoitiin anneksiini V-PE ja PI fluoresenssi FACSCalibur -virtaussytometriä ja CellQuest ohjelmisto (molemmat Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). Me syrjitty Fraktioiden elinkelpoisten (anneksiini V negatiivinen ja PI negatiivinen), varhainen apoptoottinen (anneksiini V positiivinen, PI negatiivinen), ja kuolleet (PI positiivinen) solupopulaatioiden. Kolme itsenäistä koetta suoritettiin, ja jokainen suoritetaan kahtena kappaleena.

Transmissioelektronimikroskopia

Soluja käsiteltiin MCD ja OLYA /PlyB ja käsittelemättömät solut kiinnitettiin 2,5% glutaraldehydillä kakodylaattipuskurissa 3 tuntia 4 ° C: ssa. Pesun jälkeen soluja inkuboitiin 1% OsO

4 ja 3% K

4Fe (CN)

6, joka on valmistettu kakodylaattipuskurissa, 1 h huoneen lämpötilassa. Sitten 0,3% thiocarbohydrozide in kakodylaattipuskurissa, lisättiin 5 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Pesun jälkeen 1% OsO

4 lisättiin 20 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Sitten solut dehydratoidaan ja upotettiin Epon (Serva, Heidelberg, Saksa). Ultraohuet leikkeet värjättiin uranyyliasetaatilla ja lyijyn sitraatti (molemmat Merck, Darmstadt, Saksa). Nämä kohdat tutkittiin transmissioelektronimikroskopia (TEM) käyttäen Phillips CM100 elektronimikroskoopilla.

Tilastot

Tiedot esitetään keskiarvoina ± keskivirhe kahden tai kolmen itsenäisen kokeen, joista kukin suoritettiin kaksin- tai kolminkertainen, ja arvioitiin käyttäen Opiskelijan t-testejä, ja yksisuuntainen ANOVA tai Kruskal-Wallisin yksisuuntaisella varianssi. Jossa pareittain useita vertailut tarvitaan, Holm-Sidak menetelmää tai Dunnin menetelmä käytettiin (Sigma Plot ohjelmisto, Systat Software Inc, CA, USA). P-arvot 0,05 katsottiin olevan tilastollisesti merkitsevä. Pearsonin korrelaatiokerroin kolesterolipitoisuutta ja HMG-CoA-proteiinin ilmentyminen on laskettu (Microsoft Office Excel).

Tulokset

Kolesteroli pitoisuus on suurempi invasiivisen Uroteelisyöpäsolujen verrattuna invasiivisen urothelial soluihin ihmisen ja hiiren peräisin

ihmisen urothelial solujen analyysi kolesterolisisältöä paljasti korkeimman tason T24 invasiivisia Uroteelisyöpäsolujen, jotka olivat huomattavasti alhaisempi RT4 invasiivisen Uroteelisyöpäsolujen, ja matalin NPU soluissa ( 28,0 ± 0,51; 22,9 ± 1,3; 16,6 ± 1,9 ug kolesterolia /mg solun proteiinia, tässä järjestyksessä; kuvio 1A). Oli positiivinen korrelaatio kolesterolipitoisuutta ja HMG CoA-proteiinin ilmentymisen, laskettuna Pearsonin korrelaatiokerrointa ollessa r = 0,945 mitattuna keskimääräinen intensiteetti immunofluoresenssilla (kuvio 1 B). Tämä immunofluoresenssimenetelmällä oli korkein T24-soluissa ja pienin NPU soluissa.

. Kvantifiointi kolesterolipitoisuuden invasiivisia T24 ihmisen ja NUC-1 hiiren soluissa, in noninvasive RT4 ihmisen ja g /G hiiren soluja ja NPU soluissa. B. Edustavia optinen osa HMG-CoA reduktaasin immunoleimaus (vihreä) in T24, RT4 ja NPU soluja. DAPI tumavärjäystä nähdään myös (sininen). Mittaviivat 20 um. C. kvantifiointi keskimääräinen intensiteetti HMG-CoA-immunofluoresenssi T24, RT4 ihmisen soluja ja NPU-soluja, kuten on esitetty (B). A, C. Tiedot ovat keskiarvoja ± keskivirheet kolmen itsenäisen kokeen. NS, ei merkittävää; * P 0,05, ** p 0,005.

Koska nämä transformoimattomissa NPU solut ovat peräisin siasta, arvioida tahansa lajien välisiä eroja kolesterolipitoisuus, analysoimme kolesterolin pitoisuus invasiivisia ja noninvasive urothelial solut hiirestä peräisin. Tässä testasimme NUC-1 ja g /G urothelial soluja, jotka heijastavat eri vaihetta vuonna urothelial cancerogenesis hiirissä [37]. NUC-1 solut ovat tuumorigeenisemmiksi ja invasiivisia, ja sellaisina ne tarjoavat läheinen verrattuna T24 ihmisen soluja, ja g /G hiiren urothelial solut ovat noninvasive, ja ovat siten verrattavissa RT4 ihmisen soluihin. Kolesterolin pitoisuus invasiivisia NUC-1-soluissa oli merkittävästi suurempi kuin ei-invasiivisen g /G-soluista (26,3 ± 1,5; 21,8 ± 1,4 ug kolesterolia /mg solun proteiinia, vastaavasti, kuvio 1A). Toisaalta, kolesterolin pitoisuus T24 ihmisen ja NUC-1 hiiren invasiivisia urothelial solut eivät eroa merkittävästi, kuten myös nähty, että kolesterolin pitoisuus RT4 ihmisen ja g /G hiiren invasiivisen urothelial soluja. Nämä tulokset osoittavat, että sisältö kolesteroli on käänteinen korrelaatio taso uroteelisyöpä muutosta (kuvio 1A).

MCD indusoi ajasta riippuvia ja annoksesta riippuvaa kuolema Uroteelisyöpäsolujen

vaikutus MCD hoidon solujen elinkelpoisuus tutkittiin käyttämällä anneksiini V ja PI värjäytymistä yhdessä virtaussytometrialla analysointia. Edustaja pistekuvioita kuvassa 2A osoittavat T24, RT4 ja NPU solujen näytteitä käsiteltiin 7 mM MCD 6 tuntia, ja nämä ovat mukana määrällisesti vaikutuksia eri pitoisuuksilla MCD (3, 5, 7 mM) haki lisäämiseksi inkubointia kertaa (1, 3, 6 h). 3 mM MCD, tai ei vain vähäisiä vaikutuksia elinkykyisyyksiä havaittiin kaikissa kolmessa solutyypeissä, riippumatta inkubaatioajan (kuvio 2A).

. Vasen: Edustavia dot tonteista virtaussytometria analyysi T24, RT4 ja NPU soluja kasvatettiin valvontaa median ja sen jälkeen 7 mM MCD hoito 6 tuntia. Anneksiini V-PE ja PI käytettiin syrjiä elinkelpoisia (double negatiivinen), varhainen apoptoottinen (single anneksiini V positiivinen) ja kuolleet (PI positiivinen) soluja. Oikea: kvantifiointi solun elinkelpoisuuden päässä virtaussytometria analyysi T24, RT4 ja NPU soluissa, sen jälkeen 3 mM, 5 mM, ja 7 mM MCD hoitoja 1 h, 3 h ja 6 h. B. kvantitointi solun kolesterolin ehtyminen T24, RT4 ja NPU solujen jälkeen 7 mM MCD hoito 6 tuntia. Tiedot ovat keskiarvoja ± keskivirheet kahden mittauksen kolmesta itsenäisestä kokeesta. * P 0,05, ** p 0,005, *** p 0,001.

T24 soluja, jotka olivat herkkiä MCD näistä kolmesta solutyyppien, solujen elinkelpoisuuden merkittävästi vähentää, kun 5 mM ja 7 mM MCD hoito 3 h, 92% ja 89%, vastaavasti. Kuusi tuntia hoidon jälkeen elinkelpoisuus laskettiin edelleen 77% 5 mM MCD ja vain 47% 7 mM MCD (kuvio 2A). Vuonna RT4 soluissa, ainoa merkittävä väheneminen elinkelpoisuutta laajalla MCD pitoisuuksien ja inkubaatioaikojen oli 6 h 7 mM MCD (82%; kuvio 2A). Vielä pienempi vaikutus havaittiin NPU soluja, jossa vain hoidon 7 mM MCD 6 h osoitti vähäistä laskua solujen elinkelpoisuuden (92%; kuvio 2A). Kun verrataan T24 ja RT4-solujen, vaikutus 6-h hoito 7 mM MCD solujen elinkelpoisuus oli tilastollisesti pienempi NPU-soluissa (kuvio 2A). Lisäksi voimme todeta, että kuoleminen, PI positiiviset solut olivat anneksiini V: negatiivinen tai positiivinen, kun taas asukkaan yhden anneksiini V-positiivisia soluja ei koskaan näkyvästi, mikä viittaa siihen, että solukuolema on nekroottinen sijaan apoptoottinen (kuvio 2A).

Mielenkiintoista on, sen jälkeen kun 7 mM MCD hoito 6 h, kokonaiskolesteroli pitoisuus T24, RT4, ja NPU solut laskettiin verrattuna vastaaviin käsittelemättömiin soluihin, 86%, 57%, ja 29%, vastaavasti ( kuvio 2B).

analyysi solujen elinkelpoisuuden osoitti siten, että laajuus sytotoksisuuden MCD kasvoi pitoisuus ja hoidon kestosta. Edelleen määritellä nämä erilaiset herkkyydet MCD käsittelyyn näiden kolmen urothelial soluja, solu- morfologia analysoitiin jälkeen 7 mM MCD hoito, jossa vähentää merkittävästi solujen elinkelpoisuus nähtiin. T24-soluja käsiteltiin 7 mM MCD: ssa 3 h, ja RT4 solut, joita käsiteltiin 7 mM MCD: ssa 6 tuntia, tuli pyöristetty ja ovat heikosti kiinnittyneet (kuvio 3). T24 soluja irrottaa jälkeen 7 mM MCD hoito 6 h (kuvio 3). Laajuus solun pyöristäminen oli voimakkainta T24-soluissa, ja vähemmän selvä RT4 ja NPU solujen, ne ovat vain vähäisiä morfologiset vaikutuksia havaittiin. Nämä tiedot korreloivat hyvin solukuoleman analyysi.

T24, RT4 ja NPU-soluja (kuten) oli hoidettu (kontrolli) tai käsiteltiin 7 mM MCD: ssa 3 h ja 6 h, ja sitten tutkitaan alle käänteinen mikroskoopilla. Cell pyöristäminen oli solutyypissä riippuvat (T24 RT4 NPU) ja ajasta riippuva (kontrolli 3 h 6 h). T24 ja RT4 solujen muuttuneesta luonteesta tasainen ja monikulmainen (kontrolli) ja pallomaisia ​​(T24 soluja, 3 h, 6 h hoito; RT4 soluja, 6 h hoito; arrowheads). Mitta-asteikko, 20 um.

Kaikissa tapauksissa, joissa PI-positiivista värjäytymistä osoittaa, että solujen elinkelpoisuus väheni johtuen kuolion, Mikroskooppitutkimus analyysi TEM lisätodisteita nekroottisen solukuoleman (kuvio 4) . Plasma limakalvojen T24 ja RT4 solujen jälkeen 7 mM MCD hoitoon 6 tunnin oli revennyt ja sytoplasman julkaistiin, vaikka ydin- kirjekuori säilyi ennallaan (kuvio 4). Kuitenkin NPU-solut eivät osoittaneet mitään ominaisuudet kuolion jälkeen MCD jälkeen (kuvio 4).

T24, RT4 ja NPU solut olivat käsittelemättömiä (kontrolli) tai käsiteltiin 7 mM MCD: ssa 6 tuntia, ja sitten käsitellään TEM . Nekroottinen muutoksia havaittiin yksittäisissä T24-soluissa (tähti) ja RT4 soluja, kuten plasma-kalvo häiriöt (nuolenpäät) ja vapautuminen solun sisällön. NPU solut säilyi ennallaan jälkeen MCD hoidon, jossa glycocalyx edelleen läsnä (avoimet nuolenpäät). n, ydin. Mittaviivat 1 um.

tarkemmin tutkia osallistuminen apoptoosin jälkeen MCD käsittelyn kaspaasien aktivaatio analysoitiin. Seuraamalla katkaisua fluorogeenisen Ac-DEVD-AFC substraatti ei ole merkittävää kaspaasin aktivaatio havaittiin, kun 6 h inkubaation 3 mM, 5 mM tai 7 mM MCD joko T24, RT4 tai NPU soluja. (Kuva 5A). Olimme myös pysty havaitsemaan kaspaasin aktivaatio soluissa inkuboitiin 5 ja 7 mM MCD 6 tuntia immunoblottauksella PARP p85-fragmentti (kuvio 5B), joka on valmistettu aktivoitu kaspaasien [44]. Vertailun vuoksi UV-säteilyn aiheuttama pilkkomista sekä DEVD peptidin ja PARP-proteiinin T24 ja RT4 soluja. Puute kaspaasin aktivaatio yhdessä ilman anneksiini V-signaalin ja Mikroskooppitutkimus muutokset ominaisuus kuolion yhdessä ehdotti, että MCD hoito urothelial solujen laukeaa nekroottisen sijaan apoptoottista solukuolemaa.

T24, RT4 ja NPU-soluja käsiteltiin 3 mM (A), 5 mM (A) tai 7 mM (AC) MCD 6 tuntia. A. kaspaasiaktiivisuus mittauksia Ac-DEVD-AFC pilkkominen ei ilmennyt mitään kasvua kaspaasiaktiivisuus. Positiiviset kontrollit (UV 30s) osoitti apoptoosiin liittyvä kaspaasi toiminta indusoituu T24 ja RT4 solut 6 h. B. Immunoblottaus analyysi ei näytä pilkkominen täyspitkän PARP (120 kDa), osaksi 85 kDa: n fragmentti. C. immunoblottaus analyysi ei osoittanut muuntaminen LC3-I (18 kDa) ja LC3-II (16 kDa). Aktiini käytettiin lastaus ohjaus. Tiedot ovat keskiarvoja ± keskivirhe kolmena mittauksissa.

Western blottaus T24, RT4 ja NPU solujen käsittelyn jälkeen 7 mM MCD 6 h ei havaittu muuntamista LC3-I LC3-II (kuvio 5C). Tämä osoitti, että MCD ei indusoinut autophagy. Lisäksi havainto T24, RT4 ja NPU solujen TEM ei paljastunut tyypillistä autophagic rakenteita, kuten kaksinkertainen kalvovesikkeleiden tai autophagosomes (kuvio 4).

OLYA /PlyB-hoito indusoi nekroosin Uroteelisyöpäsolujen

OLYA /PlyB käytettiin kahta eri sovelluksissa. Nonlytic pitoisuus OLYA /PlyB (2,5 ug /ml) käytettiin label kolesterolia /sfingomyeliini-rikas domeenit solukalvojen (kuvio 6C), ja lyyttisen konsentraatio (30 ug /ml) levitettiin läpäiseviksi solukalvojen. Näkyvin OLYA immunoleimaus (vasta-aineita vastaan ​​nostetut OLYA vastaavasti) nähtiin RT4 soluja ja paljastaa kvantifiointiin OLYA fluoresenssin (kuvio 6C). Tämä Olya merkinnät oli tasaisempi koko solukalvon sisään RT4 soluissa. Sen sijaan Olya jakelu T24-soluissa oli vähemmän tasainen, ja sen jakautuminen oli epäjatkuva. Merkinnöistä NPU solut osoittivat vähemmän OLYA-positiivisten solujen, joka merkittävästi poikkeaa T24 ja RT4 soluja (kuvio 6C).

. Edustaja jakelu PI värjäytymisen T24, RT4 ja NPU-soluja käsiteltiin 30 ug /ml Oly /PlyB 1 tunti. Avoin histogrammit edustavat käsittelemättömiä soluja, kun taas täytetyt histogrammit tarkoittavat OLYA /PlyB käsiteltyjä soluja. Prosenttiosuudet Elävien ja kuolleiden solujen näkyvät vasemmalla ja oikealla puolella histogrammien, vastaavasti. B. elinkelpoisuus T24, RT4 ja NPU soluissa 1-h ja 3-h käsittelyt 30 ug /ml OLYA /PlyB, määritettynä virtaussytometrialla analysointia. Tiedot ovat keskiarvoja ± SE kahden mittauksen kahdesta itsenäisestä kokeesta. C. immunoleimaus kolesterolin /Sfingomyeliinin rikas kalvo verkkotunnuksia urothelial solujen Olya. Päällekkäisten kuva optisten osien läpi koko solut edustavat laajuutta ja jakautumista OLYA immunomerkatut kolesteroli /sfmgomyeliini rikas kalvo verkkotunnuksia T24, RT4 ja NPU soluja. Green, Olya-merkinnät; sininen, DAPI värjäytymistä ytimeksi. Mittaviivat 20 um. C. Kvantifiointi OLYA immunoleimaus esitetään fluoresenssin voimakkuuden keskiarvo per näkökentän (mielivaltaisina yksikköinä, A.U.). * P 0,05, ** p 0,005, *** p 0,001.

Solun elinkelpoisuus jälkeen 1-h ja 3-h käsittelyt 30 ug /ml OLYA /PlyB oli analysoitiin virtaussytometrialla. Solun elinkykyisyyksiä jälkeen 30 ug /ml OLYA /PlyB hoitoja 1 h ja 3 h määritettiin kuten edellä, virtaussytometrialla analysointia. Kuten anneksiini-V merkintöjä oli negatiivinen kaikissa soluissa, fraktiot PI-positiivisia (eli kuollut) ja PI-negatiivisia soluja määritettiin kuten on esitetty tyypillinen histogrammit esitetään kuviossa 6A. Sen jälkeen, kun 30 ug /ml OLYA /PlyB hoito 1 tunti, solujen elinkelpoisuus T24-solujen oli merkittävästi laskenut 75% (p 0,005), ja sen jälkeen 3-h, 65% (p 0,001). Vastaavasti, solun elinkelpoisuus RT4-solujen laski 58% (p 0,001) 1 h, vaikka tämä ei muuttanut edelleen, että 3-h hoito. Sitä vastoin solujen elinkelpoisuus NPU soluja ei vaikuttanut merkitsevästi 30 ug /ml OLYA /PlyB hoitoja joko 1 h tai 3 h (kuvio 6B). Kaikkien näiden kolmen solutyyppien testattu, erot elinvoimaisten solujen välillä 30 ug /ml OLYA /PlyB hoitoja 1 h ja 3 h eivät saavuttaneet merkitystä. Tulokset immunoleimaus kolesterolin /Sfingomyeliinin rikas kalvo verkkotunnukset OLYA olivat mukaisesti analyysi solujen elinkykyä.

Necrotic solukuolema T24 ja RT4 soluja jälkeen 30 ug /ml OLYA /PlyB hoito 1 h oli merkitty PI-positiivisia soluja (kuvio 6A) ja niiden ominaisuus Mikroskooppitutkimus muutokset (Kuva 7). Näiden solujen näkyvin muutokset nähtiin lisääntynyt plasman-kalvon läpäisevyyttä ja vuoto solulimassa sekä organelle turvotusta (Kuva 7). Äärirakenteessa NPU soluja ei vaikuttanut 30 ug /ml OLYA /PlyB hoito 1 h, nämä valvonta ja käsitellyt solut näytetään samanlainen morfologia ja ehjä solukalvon (Kuva 7).

T24, RT4 ja NPU-soluja käsiteltiin 30 ug /ml OLYA /PlyB 1 h ja käsiteltiin sitten TEM. RT4 ja T24 soluissa näkyy menetyksen kalvon eheyden (nuolenpäät), vapautumista sytoplasmaan, ja organelle turvotus (tähdet), jotka osoittavat solunekroosia. Äärirakenteessa käsiteltyjen NPU solujen muistuttaa käsittelemättömän NPU solujen runsasta glycocalyx (avoimet nuolenpäät). n, ydin. Mittaviivat 1 pm.

Keskustelu

Virtsarakon syöpä on neljänneksi yleisin syöpä diagnoosi miehillä [45]. Kuitenkin, koska korkea toistumisen määrä ja tarve jatkuvaan invasiivisia seurantaan, sillä on korkein eliniän hoitokustannukset potilasta kohden kaikista syövistä [46]. Todellakin, jopa 70% potilaista on paikallisen uusiutumisen jälkeen rakkoon kemoterapiaa tai immunoterapiaa [47]. On todennäköistä, että alhainen kovettumisnopeus johtuu mikrometastaattisessa sairaus, joka voidaan saada aikaan silloin, kun höyläysleikkaus tai cystectomy, joka johtaa uusiutumisen urothelial kasvaimia tai etäpesäkkeitä imusolmukkeissa, luut, keuhko, iho ja maksa [48]. Lisäksi kuolleisuus johtuu pääasiassa invasiivisia, metastaattinen urothelial karsinoomien jotka tulevat vastustuskykyisiksi kemoterapiaa.