Krooninen sairaus

tiivistelmä

etäpesäke johtaa huonoon ennusteeseen kolorektaalisyövässä potilailla, ja on kasvava tarve uusia terapeuttisia kohteita. TMEM16A (ANO1, DOG1 tai TAOS2) on äskettäin tunnistettu kalsiumin aktivoimien kloridikanavan (CACC), ja se on raportoitu olevan yli-ilmentynyt useissa maligniteetit; kuitenkin, sen ilmentymistä ja toimintaa kolorektaalisyövässä (CRC) jää epäselväksi. Tässä tutkimuksessa löysimme ilmaus TMEM16A mRNA ja proteiini korkean metastaattisen potentiaalin SW620, HCT116 ja LS174T soluja, mutta ei ensisijainen HCT8 ja SW480-soluissa, käyttäen RT-PCR, Western blotting ja immunofluoresenssimenetelmällä merkintöjä. Patch-clamp tallenteet havaittu CACC virrat säätelevät solunsisäistä Ca

2+ ja jännite SW620-soluissa. Knockdovvn TMEM16A lyhyen hiusneula-RNA: iden (shRNA) johti tukahduttaminen kasvun, siirtolaisuuden ja invaasion SW620-solujen havaittuna MTT, haavan paranemista ja transwell määrityksissä. Mekanistisesti TMEM16A ehtyminen oli mukana dysregulaatio fosfo-MEK, fosfo-ERK1 /2 ja sykliini D1 ilme. Virtaussytometria-analyysi osoitti, että SW620-soluja estetään G1 S-vaiheeseen solun syklin TMEM16A shRNA ryhmässä verrattuna kontrolliryhmään. Lopuksi tuloksemme osoittavat, että TMEM16A CACC on mukana kasvun, siirtolaisuuden ja invaasio metastaattisen CRC solujen ja annettava näyttöä TMEM16A mahdollisena huumeiden tavoite hoitoon metastasoitunutta kolorektaalisyöpää.

Citation: Sui Y, Sun M Wu F, Yang L, Di W, Zhang G et al. (2014) esto TMEM16A Expression vaimentaa kasvua ja Invasion Human peräsuolen syövän solut. PLoS ONE 9 (12): e115443. doi: 10,1371 /journal.pone.0115443

Editor: Hong Wanjin, Institute of Molecular and Cell Biology, Biopol’ia®, Yhdysvallat

vastaanotettu: 17 kesäkuu 2014; Hyväksytty: 23 marraskuu 2014; Julkaistu: 26 joulukuu 2014

Copyright: © 2014 Sui et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Natural Science Foundation of China (nro 81173109, 31471099, ja 31301179), Kiina Postdoctoral Science Foundation (nro 2014M551198), ja Jilinin maakunnassa terveyden ja perhesuunnittelun komission Project (nro 2014Q024). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on kolmanneksi yleisin maligniteetti maailmanlaajuisesti [1], [2], ja etäpesäkkeiden on ratkaiseva tekijä huonon ennusteen CRC potilaiden [3]. Korjauksilla useita geenin, kuten aktivointi onkogeenien ja inaktivaation tuumorisuppressorigeeneille, osallistuvat etenemistä normaalin paksusuolen epiteelin osaksi adenooma ja osaksi pahanlaatuisia adenokarsinooma [4], [5] on kuitenkin vähän tietoa molekyylitason muutokset antaa sen peräsuolen syövän etäpesäkkeiden [6], [7]. Siksi on tarpeen yksilöidä etäpesäkkeiden liittyviä geenejä ja niiden molekyylitason reitit, jotka voivat tarjota uusia tavoitteita metastaattisen CRC.

kromosomi bändi 11q13 amplikoni on yksi useimmin monistettu alueita ihmisen maligniteettien , kuten pään ja kaulan levyepiteelisyöpä (HNSCC) ja rinta-, virtsarakko- ja ruokatorven syöpä [8]. Analyysi olevien geenien erilainen ekspressio sijaitsee tällä alueella johti tunnistamiseen

TMEM16A

, jota kutsutaan myös

ANO1

(anoctamin-1),

DOG1

( löydettiin mahasuolistrooman kasvaimen proteiini 1),

ORAOV2

(suullinen syöpä yliekspressoidaan 2) ja

TAOS2

(kasvain-monistettu ja yli-ilmentyy sekvenssi 2) [9], [10], [11] , [12], [13]. TMEM16A koostuu 26 eksonia ja sisältää kahdeksan transmembraanisen segaments kanssa N- ja C-päät kohtaavat sytoplasmassa ja reentrant silmukan välissä TM5 ja TM6 mahdollisesti muodostamalla huokosten alueella [14].

TMEM16A on hiljattain osoitettu olevan kalsiumin aktivoimien kloridikanavan [14], [15], [16] ja ilmentyy laajalti eri kudoksissa, mukaan lukien sekretorisen epiteeli, sileän lihaksen, aistihermoilla ja muissa kudoksissa [17], [18]. TMEM16A pelaa monia tärkeitä fysiologisia rooleja valvonnassa epiteelin nesteenkuljetuskyky, verisuonten sileän lihaksen supistumisen, syljeneritys ja ruoansulatuskanavan motiliteetin [19], [20], [21], [22]. Häiriöstä TMEM16A aiheuttaa ihmisen sairauksien, kuten kystinen fibroosi, kohonnut verenpaine, keuhkosairauksien ja ripuli [23], [24], [25]; tyrmäys TMEM16A on embryonically tappava takia tracheomalacia [26].

ilmaus TMEM16A on säädelty useilla syöpiä, kuten HNSCC ja ruokatorven, rinta- ja eturauhassyöpää. Sen yli-ilmentyminen on myös korreloi kehittymistä kaukainen etäpesäke ja huonon ennusteen syöpäpotilaiden HNSCC [27], [28], [29]. Äskettäin TMEM16A on havaittu edistävän HNSCC tuumorigeneesiin ja hyökkäyksen kautta aktivoimalla mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasin (MAPK) signalointireitin. Lisäksi, TMEM16A on raportoitu edistää syövän etenemisessä indusoimalla aktivaatio epiteelin kasvutekijän reseptorin (EGFR) ja kalmoduliinin-riippuvaisen proteiinikinaasin II (CaMK II) ja sen jälkeen aktivoimalla AKT ja MAPK signaloinnin rintasyövän ja HNSCC [30] , [31]. Vaikka TMEM16A ilmentyy kaikkialla ruoansulatuskanavan tukikudosten kasvaimet [32], sen rooli CRC etäpesäke on vähän tutkittu.

Esillä olevassa tutkimuksessa, ensin osoitti ekspressiota TMEM16A kalsiumin aktivoimien kloridikanavia (CaCCs) eri metastatics potentiaali peräsuolen syövän solulinjoissa. Tutkimme lisäksi roolia TMEM16A vuonna SW620-soluissa etäpesäkkeitä ja sen mahdolliset molekyylimekanismin lyhyillä hiusneula-RNA: ita in vitro.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

Ihmisen kolorektaalisyöpää solulinjat HCT8, SW480, SW620, HCT116 ja LS174T-solut saatiin American Type Culture Collection (ATCC). SW480 ja SW620 viljeltiin L15 Medium (sigma, USA). HCT8 ja HCT116 kasvatettiin RPMI 1640 (sigma, USA). LS174T-soluja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (Sigma, USA). Fisher rotan kilpirauhasen (FRT) solut ja FRT transfektoitu stabiilisti ihmisen TMEM16A saatiin Alan Verkman (University of California, San Francisco, CA, USA) [33] ja viljeltiin Coon modifioidussa F12 -alustassa. Kaikki media on täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä. Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2 ja 95% ilmaa.

RNA ja RT-PCR-

Kokonais-RNA uutettiin soluista käyttäen TRIzol -reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) valmistajan esittelyt. Pitoisuus, puhtaus ja eheys RNA mitattiin käyttämällä NanoDrop2000 spektrofotometrillä (Thermo Scientific). Viisisataa nanogrammaa kokonais-RNA: ta käänteistranskriptio cDNA: ksi käyttäen käänteistranskriptaasia kanssa PrimeScriptTM RT reagenssipakkausta (TaKaRa). CDNA-tuotetta käytettiin templaattina PCR-monistukseen: n kokonaistilavuudessa 30 ui, ja PCR-olosuhteet olivat seuraavat: 94 ° C: ssa 5 min, jota seurasi 30 sykliä 94 ° C 30 s; 60 ° C: ssa 30 s; ja 72 ° C: ssa 60 s. Sillä TMEM16A cDNA-monistuksen jälkeen Seuraavia alukkeita käytettiin: sense-aluke, 5′–AACGGGA CCATGCACGGCTT-3 ’; antisense-aluke, 5’–TGTTGTGGTGGTTGCACGGC-3 ’. PCR-tuotteet (424 bp) analysoitiin agaroosigeelielektroforeesilla, ja β-aktiini toimi endogeeninen kontrolli normalisoida ilmaisua tiedot.

Western blotting

Solut pestiin kahdesti jään kylmä fosfaattipuskuroitu suolaliuos (PBS) ja liuotettiin lyysipuskurissa (150 mM NaCl, 20 mM Tris, 5 mM EDTA, pH 7,5, 1% Triton X-100 ja jota oli täydennetty 1 mM PMSF: ää). Jälkeen proteiini määrän näytteitä, jotka sisälsivät 100 ug proteiineja denaturoitiin ja käsiteltiin elektroforeettisesti käyttäen 10% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin sitten PVDF-kalvoja. Kun oli salvattu 5% (w /v) rasvaton maito ja pesu Tris-puskuroitu suolaliuos-Tween-liuosta (TBST), kalvoja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa ensisijainen anti-TMEM16A polyklonaalista vasta-ainetta (Abcam, ab53212; 1:100 ) ja hiiren anti-β-aktiini-vasta-ainetta (Cell Signaling, 1:500), vastaavasti. Kaikki muut ensisijainen vasta ostettu Cell Signaling Technology. Pesun jälkeen blotteja inkuboitiin sekundäärisen vasta-aineen konjugoitu piparjuuriperoksidaasiin (Sigma, 1:5,000) 1 h huoneen lämpötilassa, ja visualisoitiin käyttämällä tehostettua kemiluminesenssi- kittiä (Amersham, Little Chalfont, UK) röntgenfilmille (Millipore Corporation , Billerica, USA).

Immunofluoresenssianalyysi

immunofluoresenssivärjäyksellä tehtiin paikallistaa ilmentymisen TMEM16A. Kolorektaalisyöpä soluja viljeltiin yön yli ensisijainen lasipeitinlevyille (Fisher, USA) ja kiinnitettiin 15 minuutin ajan 4% (w /v) paraformaldehydillä (PFA). Sitten solut huuhdeltiin 3 kertaa PBS: llä 5 minuutin ajan, läpäiseviksi 0,5% Triton X-100 /PBS: ssä 20 minuutin ajan ja sitten inkuboitiin 1 tunnin 3% BSA /PBS blokkausliuoksella. Havaitsemiseksi TMEM16A, soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa 3 tunnin ajan hiiren anti-humaani DOG1 monoklonaalinen vasta-aine (zhongshanjinqiao, Kiina, 1:50), jota seurasi altistus Cy3-konjugoitu anti-hiiri-IgG sekundääristä vasta-ainetta (Sigma; 1 :1,000) 37 ° C: ssa 1 h. Visualisoida tumat, solut värjättiin DAPI (Sigma, St Louis, MO, USA; 40,6- diamino-2-fenyyli), ja peitinlasit kiinnitettiin liukuu mikroskooppipreparaatin haalistumista estävää liuosta (Vector Laboratories, Inc. Burlingame, CA) . Fluoresenssikuvia tutkittiin ja valokuvattiin alle -konfokaalimikroskoopilla (Olympus, Tokio, Japani).

Laastaripuristinmittaukset

Ihmisen peräsuolen syövän solut ympättiin lasipeitinlevyille, ja Laastaripuristinmittaukset suoritettiin käyttämällä EPC10 vahvistin (HEKA, Lambrecht /Pfalz, Saksa) yhdistettynä Patchmaster (HEKA) huoneenlämpötilassa. Pipetit valmistettiin borosilikaattilasi lasikapillaaria mikropipetin avulla vedin (PC-10, NARISHIGE, Japani) ja sitten palo kiillotettu kanssa microforge (MF-900, NARISHIGE, Japani). Vastus pipetit kylvyssä liuos oli 2-5 MQ. Soluja perfusoitiin kylpy, joka sisälsi: 145 mM NaCl, 5 mM KCI, 2 mM MgCI

2, 1 mM CaCl

2, 5 mM glukoosi, 5 mM HEPES ja 20 mM sakkaroosia (pH 7,4 NaOH: lla) . Koko-solu-konfiguraatio, nolla Ca

2+ solunsisäisen sisälsi seuraavat: 146 mM N-metyyli-D-glukamiini kloridi (NMDG-CI), 2 mM MgCI

2, 5 mM EGTA: ta ja 8 mM HEPES (pH 7,4 NMDG). Korkean Ca

2 + pipetin sisälsi 5 mM Ca

2 + -EGTA sijasta EGTA (vapaa Ca

2+ noin 25 uM). Erilaiset vapaa [Ca

2+] liuokset valmistettiin sekoittamalla nolla-Ca

2+ ja korkea-Ca

2+ ratkaisuja. Kenno kiinnitetään tilalta potentiaali (0 mV) ja jännitteet välillä -100-100 mV 20 mV välein. Sillä nurinpäin kokoonpano, pipetin sisälsi: 140 mM NMDG-CI, 2 mM MgCI

2, 5 mM CaCI

2 ja 10 mM HEPES (pH 7,4 NMDG); ja perfuusio sisälsi: 150 mM NMDG-CI, 2 mM MgCI

2, 10 mM EGTA, 8 mM Tris ja 10 mM HEPES (pH 7,4 NMDG). Sen jälkeen, kun tiiviste vastus saavutettu 40 OQ, kalvo irrotettiin, ja kalvojännite pidettiin -50 mV. Tiedot suodatettiin 100 Hz kahdeksan pole Bessel (LPF-8, Warner Instruments, LLC, Hamden, CT, USA), ja digitoidaan tietokoneen näytetiheydellä 500 Hz. Niflumihappo (NFA) ostettiin Sigma-Aldrich. Kaikki nurinpäin patch kokeet suoritettiin käyttäen nopean ratkaisun vaihto perfuusiojärjestelmällä (SF-77B, Warner Instruments). Kuollut aika liuoksen muutos oli 30 ms ja data-analyysi suoritettiin tallenteita, jotka sisältävät koko solut yhdellä kanavalla käyttäen Igor ohjelmistoa kuten aiemmin on kuvattu [34].

RNA-interferenssi

TMEM16A /ANO1 lyhyt hiusneula-RNA (shRNA) ja negatiivisen kontrolli shRNA plasmidi rakennettiin GeneChem Co., Ltd (Shanghai, Kiina). Sivuston siRNA kohdistaminen ihmisen TMEM16A /ANO1 geeni (GenBank NM_018043) oli seuraava: # 1, CGTGTACAAAGGCCAAGTA (1077-1095 nt); ja # 2, CGAAGAAGA TGTACCACAT (837-855 nt). RNA-interferenssi suoritettiin mukaan valmistajan ohjeiden.

Soluproliferaatiomääritys

Solulisääntyminen mitattiin käyttäen MTT-määritystä. Lyhyesti, 5000 solua siirrostettiin kuhunkin 96-kuoppaisen levyn 24 tuntia, transfektoitiin TMEM16A shRNA tai salattu shRNA ja inkuboitiin edelleen 1, 2, 3 ja 4 d, vastaavasti. MTT-reagenssia (10 ui, 500 ng /ml) lisättiin kuhunkin kuoppaan, ja soluja inkuboitiin edelleen 4 tuntia. Sen jälkeen, 150 ui DMSO: ta lisättiin liuottamiseksi formatsaanikiteet. Määrä elinkelpoisten solujen määrä määritettiin käyttäen mitattu absorbanssi 570 nm: ssä mikrolevylukijalla (Thermo Scientific, USA).

In vitro

haavan paranemista

Cell Liikkuvuuden arvioi tyhjästä haava määritys in vitro. Solut ympättiin 6-kuoppaiselle levylle, kunnes konfluentteja, kaavittiin steriilillä, 200 ui kärkeä ja pestiin kahdesti PBS: llä. Inkubaation jälkeen L15, joka sisälsi 1% naudan sikiön seerumia solut valokuvattiin 0 h, 24 h, 48 h tai 72 h ajan käännettyä mikroskooppia (Olympus, Tokio, Japani) suurennoksella 100 x. Nämä kokeet suoritettiin kolmena kappaleena. Väliset etäisyydet haavan reunojen mitattiin valmistui hallitsija, ja suhteellinen tyhjästä leveys määritettiin suhde keskimääräinen leveys hoidossa soluissa verrattuna keskimääräinen leveys hallinnassa soluissa.

Solun maahanmuutto- ja invaasio määritykset

in vitro

syöpäsolujen muuttoliikettä ja invaasiota toimintaa arvioitiin siirtoaltaat, kuten aiemmin on kuvattu, muutoksin [23]. SW620-soluja viljeltiin L15, jossa oli 10% FBS: ää konfluenssiin asti 6-kuoppalevyillä, jotka oli transfektoitu TMEM16A shRNA tai salattu shRNA 24 tuntia, ja sitten ne trypsinoitiin, pestiin ja laskettiin. Solun kulkua, 1 x 10

5 solua 200 ul: ssa väliainetta, jossa 1% FBS ympättiin ylemmässä transwell-insertin sisältävä kammio polykarbonaattisuodatin (6,5 mm halkaisijaltaan, 8 um huokosia, Corning Costar, Corning, NY , USA). L15 (600 ui), jossa oli 10% FBS: ää (kemoattraktantti) lisättiin alempaan kammioon, ja levyjä inkuboitiin 72 tuntia 37 ° C: ssa, 5% CO

2. Solujen valloitusretkeä siirtoaltaat päällystettiin Matrigel. Solut, jotka eivät muuttaneet poistettiin yläosasta transwell suodattimien kaapimalla. Lävistetyn solut kiinnitettiin paraformaldehydillä, värjättiin Coomassie blue ja laskettiin käännettyä mikroskooppia (100-kertainen suurennus). Solujen lukumäärä edustaa maahanmuuton aktiivisuutta.

Cell-syklin analyysi

Kun transfektoimalla solut TMEM16A tai salattu shRNAs 3 d, solut irrotettiin käyttäen trypsiiniä, suspendoitiin kasvualustaan ​​ja laskettiin. Sitten 1 x 10

6-solut pestiin PBS: llä ja kiinnitettiin yön yli 70% (tilavuus /tilavuus) etanolia 4 ° C: ssa. Kun oli pesty kahdesti PBS: llä, solut värjättiin liuoksella, joka sisälsi 50 ug /ml PI: n ja 100 ug /ml RNaasi A: lla 30 minuutin ajan pimeässä huoneenlämmössä. Värjätyt solut analysoitiin virtaussytometrialla (Beckman Coulter, Eepokset XL).

Tilastollinen

Tilastollinen analyysi suoritettiin SPSS -tilasto (versio 17.0), jossa on kaksisuuntaista Studentin

t

-testi.

P

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä. Tiedot ilmoitetaan keskiarvona ±

SD

.

Tulokset

ilmentäminen TMEM16A CRC solulinjoissa

Tässä tutkimuksessa olemme ensimmäinen havaittu

TMEM16A

-mRNA-tasojen RT-PCR: llä koolonsyöpäsolulinjoissa HCT8, SW480, SW620, HCT116 ja LS174T-soluja. Kuten on esitetty kuviossa. 1A 424 emäsparin fragmentti ihmisen

TMEM16A

monistettiin SW620, HCT116 ja LS174T solujen ja positiivinen kontrolli FRT transfektoitu stabiilisti ihmisen

TMEM16A

, mutta ei HCT8, SW480-solut ja negatiivinen kontrolli null-FRT soluissa. Immunoblot-analyysillä käyttäen anti-TMEM16A polyklonaalista vasta tunnistettu noin 110 kDa proteiini bändi SW620, HCT116 ja LS174T soluja (Fig. 1 B). Sitä vastoin TMEM16A proteiini bändi oli poissa SW480 HCT8 ja negatiivinen kontrolli null-FRT soluissa. Olemme edelleen tutki ilmaisun ja solunosasijaintia että TMEM16A proteiinin CRC-soluissa käyttäen immunofluoresenssivärjäyksellä. Immunofluoresenssikoe merkintöjä paljasti, että TMEM16A oli ilmentyy voimakkaasti solukalvon ja plasmassa SW620, HCT116 ja LS174T soluja (S1 Kuva.), Kun taas TMEM16A tuskin havaittiin vuonna HCT8 ja SW480-solut (Fig. 2). Matka-, isogeenisiin malli (SW480 ja SW620 solulinjoja) ihmisen CRC etäpesäkkeiden siirtyminen valittiin myöhempää tutkimusta.

A, RT-PCR paljastaa TMEM16A mRNA ilmaisun SW620, HCT116 ja LS174T soluja, mutta ei HCT8 ja SW480-soluissa. B, TMEM16A proteiinin ilmentymistä HCT8 ja SW480, SW620, HCT116 ja LS174T-solujen havaittiin Western-blottauksella. Null FRT solut toimii negatiivisena kontrollina. FRT-solut, jotka on transfektoitu ihmisen TMEM16A toimimaan positiivisena kontrollina.

Soluja kasvatettiin peitinlaseilla ja värjättiin anti-TMEM16A vasta-aineita. Vasen sarake, anti-TMEM16A immunofluoresenssilla (Cy3, punainen). Keskimmäinen sarake, DAPI värjäys visualisoida ytimiä. Oikea sarake, fuusioitiin kuvat ovat komposiitit anti-TMEM16A immunofluoresenssilla ja DAPI-värjäyksellä (200 x).

toiminnallinen ilmaus TMEM16A kanavan CRC soluissa

validoimiseksi funktionaalisen ekspression TMEM16A kanavan CRC solulinjoissa, suoritimme koko solun patch clamp tallenteet SW480-solujen ja nurinpäin patch clamp tallenteita SW620-solujen. Kuva. 3A esittää perheen virtojen vastauksena jännitteen vaiheet ärsykkeitä, kun läsnä on 1 uM Ca peräisin SW480 solusta. Nykyinen-jännite käyrä (Fig. 3B) osoitti, että kääntyminen potentiaali (V

rev) Tämän nykyinen on noin -50 mV, mutta V

rev kloridi kanavan arvioitiin olevan noin 0 mV käyttäen Nernst yhtälö mukaan solunulkoiseen ja solunsisäiseen CI

-. Tämä tulos osoittaa, että virrat, jotka rekisteröitiin päässä SW480 solua eivät ole peräisin kloridikanavia.

, edustaja koko solun virtojen SW480-soluja aktivoitiin 1 uM Ca. Virrat kirjattiin pitopotentiaalissa 0 mV seurasi sykkivä jännite välillä ± 100 mV: n askelin 20 mV. B, Current-jännite käyrän paneeli A, joka ilmoittaa, että virtaukset eivät ole peräisin kloridikanavia. C, Edustava nykyinen jälki tallennettu peräisin nurinpäin laastari on SW620 solun. CACC nykyinen aikaansaatiin 1 uM Ca

2+, kuten merkitty. Katkoviivat edustavat nollavirran. Kalvo jännite pidettiin -50 mV; ja ylöspäin taipumat ovat kanavan aukko. D, Vakaa nykyinen jälki jälkeen CACC virta paneeli C ajaa alas. E, jatkuva nykyinen tallennus osoittaa aktivoitumisen CaCCs ja sovellusten jännitteen luiskat puuttuessa (a ja c) tai läsnäollessa (b) Ca. Jännite ramppeja: +50 -100 mV ajaksi 2000 ms. F, Current-jännite käyrät etupanelistä E ilmenee tyypillisiä ulospäin oikaisua ominaisuuksia CaCCs. Huomaa, että minimaalinen konduktanssi havaittiin puuttuessa Ca. G ja H, CaCCs virtaukset pienenivät erikseen 100gM elintarvikeviraston ja 50pM T16Ainh-A01.

Inside-out patch clamp kokeita SW620-solujen ilmenee, että kalvo nykyinen riippui kalsiumin ja jännite , jotka ovat tyypillisiä ominaisuuksia endogeenisen CaCCs (Fig. 3C-F). Lisäksi havaitut virtaukset olivat vahvasti inhiboi Cl

– salpaaja niflumihappo (NFA) (Fig. 3G) ja TMEM16A erityisiä estäjä T16Ainh-A01 (Fig. 3H).

lisäsi TEME16A erityisiä estäjä T16Ainh-A01 SW620-solujen ja SW480-solut erikseen, ja havaittiin kasvun muutos näiden solujen 24 tunnin kuluttua. Tulokset osoittivat, että T16Ainh-A01 voisi konkreettisesti vähentää leviämisen SW620-soluissa, mutta ei SW480-soluja (Fig. 4).

Soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla T16Ainh-A01: ssa 24 tuntia, ja solujen elinkyky mitattiin MTT-analyysi. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD (n = 3).

knockdovvn TMEM16A inhiboivat SW620-solujen

paljastaa toimintojen TMEM16A paksusuolen syöpäsoluissa, transfektoimme kaksi TMEM16A shRNA sekvenssit (# 1 ja # 2) osaksi SW620 soluihin vaientaa ilmaus TMEM16A. Western blot tulokset osoittivat, että TMEM16A shRNA # 1 aiheuttama 63,4%: n vähennys TMEM16A proteiinin ilmentymisen ja TMEM16A shRNA # 2 aiheutti 71,7%: n vähennys, verrattuna kontrolliin shRNA. TMEM16A pudotus johti merkittävään muutokseen koko solun kalsiumin aktivoimien kloridi virrat ja immunofluorescene tiheys (Fig. 5).

A, Western blot-analyysi TMEM16A proteiinin ilmentymisen SW620-soluissa, jotka transfektoitiin shRNA # 1 ja # 2. B, Pylväsdiagrammi koottu suhteellisen ekspressiotason TMEM16A proteiinin paneeli A. Expression of TEMEM16A proteiinin normalisoitunut ilmentymistason β-aktiini (n = 3). C, edustaja immunofluence kuvia SW620-solujen näkyvät jälkeen TMEM16A on pudotus mukaan shRNA # 1 ja shRNA # 2, verrattuna ohjaus shRNA (200 x). D, Pylväsdiagrammi yhteenveto huippuvirrat kirjattu 100 mV jännite SW620-soluissa jälkeen TMEM16A pudotettiin verrattuna kontrolli shRNA. ** P 0,01. Kaikki tulokset on esitetty keskiarvona ± SD. E, Kokosolun virtaukset rekisteröitiin SW620 transfektoitujen solujen ohjaus shRNA, shRNA # 1 ja # 2 at pitopotentiaalissa 0 mV seurasi sykkivä jännite välillä ± 100 mV: n askelin 20 mV.

vaikutusten tutkiminen TMEM16A proliferaatioon SW620-soluja, käytettiin kahden shRNA sekvenssit häiritsevät ilmentymisen TMEM16A. MTT-analyysi osoitti, että TMEM16A Knockdown suuresti tukahdutetaan solujen kasvua kerrallaan-riippuvan tavalla kuin verrokkiryhmän shRNA ilmentävien SW620-solujen

in vitro

(Fig. 6).

, kasvua SW620 solut estyi TMEM16A shRNA # 1 ja # 2 verrattuna kontrolliryhmään (keskiarvo ± SD, n = 3, * P 0,05). B, edustaja immunobloteilla vahvistaa knockdovvn TMEM16A. Ctrl, ohjaus.

Suppression muuttoliikkeen ja invaasio SW620-solujen hiljentämällä endogeeninen TMEM16A

edelleen tarkkailla vaikutuksia TMEM16A solun liikkuvuuteen, suoritimme arpeutumisprosessit määrityksissä jälkeen hiljentäminen endogeeninen TMEM16A. Haavan paranemista kuvat osoittivat, että haavan sulkeminen TMEM16A shRNA # 1 ja # 2 solut oli hitaampaa kuin kontrolliryhmässä shRNA käsiteltyjä soluja jälkeen raapiminen solut (Fig. 7). Tämä tulos osoitti, että vapauttaminen TMEM16A viivästynyt haavan paranemisen verrattuna kontrolliryhmään.

, siirtyminen SW620-solujen arvioitiin haavan paranemista määritys läsnä ollessa TMEM16A shRNA # 1 ja shRNA # 2, verrattuna ohjaus shRNA. Edustavat kuvat haavan otettiin 0 h, 24 h, 48 h ja 72 h jälkeen haavoittaen alle 100-kertainen suurennus. B, Pylväsdiagrammeja paneeli A on esitetty. Arvot ovat keskiarvoja ± SD; n = 3; ** P 0,01. Ctrl, ohjaus.

vieressä tarkasteltiin rooleja TMEM16A että etäpesäke SW620-soluissa. TranswellTM muuttoliike ja invaasion määritykset TMEM16A Knockdown soluista tehtiin. Vuonna transwell migraatiokokeessa, numerot transfektoitujen solujen TMEM16A shRNA että tunkeutunut kalvon pitkälti laski verrattuna SW620-soluja, jotka on transfektoitu negatiivisen kontrollin. Tulokset osoittivat myös, että SW620-solut transfektoitu TMEM16A shRNA # 1 ja # 2 näytteillä merkittävästi heikentynyt leviämiskyky. Samoin vastaava rooli TMEM16A shRNA # 1 ja # 2 invasiivisia kyky havaittiin myös rinnakkain invasiivisia määritystä (Fig. 8).

, Migration (ilman matrigeelin) ja invaasio (jossa matrigeelin) on SW620 solut huomattavasti vaimennetaan knockdovvn TMEM16A verrattuna kontrolliryhmään kautta siirtokuoppaan levinneisyys määrityksissä. Non-Siirretyt solut kaavittiin pumpulipuikolla. Solut, jotka tunkeutuivat Transvvell- suodattimet värjättiin Coomassie-sinisellä. Kuvat ovat näytetään. B ja C, Pylväsdiagrammeja paneeli A on esitetty. Arvot ovat keskiarvoja ± SD; n = 3; ** P 0,01. Ctrl, ohjaus.

ehtyminen TMEM16A esti MAPK signaloinnin

Valaistaan ​​molekyylitason mekanismeja, joilla TMEM16A vaikuttamaan ihmisen CRC kasvua ja etäpesäkkeiden, selvitimme korrelaatio TMEM16A sykliini D1 ja MAPK -signalointireitistä. Kuten on esitetty kuviossa. 9, knockdovvn TMEM16A merkittävästi vähentynyt ilmentyminen sykliini D1 ja fosforylaatiota MEK ja ERK1 /2, kun taas se ei vaikuta koko MEK tai ERK1 /2 ekspressiotasoja.

Western blot tulokset osoittavat eston TMEM16A led vähenemiseen fosfo-MEK, fosfo-ERK1 /2 ja sykliini D1. Ctrl, ohjaus.

ehtyminen TMEM16A aiheutti hidastuminen solusyklin kulkue

lisäksi mitataan solusyklin jakautumisen virtaussytometrialla tutkimaan mahdollisia mekanismi TMEM16A säätelyssä CRC solussa leviämisen. Kuten Fig. 10 osoitti, kasvua solun numeron G0 /G1 vaiheen ja lasku solujen määrä G2 /M vaiheessa jälkeen havaittiin endogeeninen TMEM16A joka pudotettiin. Prosenttiosuus G1-vaiheessa olevien solujen in TMEM16A-shRNA # 1-soluja (50,3% ± 1,83) ja TMEM16A-shRNA # 2 solut (51,8 ± 1,13) olivat merkittävästi korkeammat kuin kontrollisolut (33,95 ± 2,05) (P 0,01). Nämä tulokset varmisti, että TMEM16A pudotus johti hidastuminen solusyklin etenemisen SW620-soluissa pidättämällä solut Go /G1 vaiheeseen, joka aiheutti kasvun inhibition TMEM16A shRNA soluja.

A, B ja C, virtaussytometrinen analyysi solusyklin jakautumista SW620-soluja, jotka on transfektoitu ohjaus shRNA, TMEM16A shRNA # 1 ja # 2 vastaavasti 72 tuntia. D, Bar kaavioita suhteellinen osuus solujen osoitti vaiheissa solusyklin jälkeen pudotus on TMEM16A. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD; n = 3; * P 0,05.

Yhdessä tuloksemme osoittavat, että ehtyminen TMEM16A tukahdutti MAPK signalointireitin ja hidastaa etenemistä solusyklin.

Keskustelu

TMEM16A proteiinit äskettäin havaittu muodostavan Ca

2 + aktivoitujen CI

– kanavia, joita ohimenevästi aktivoitiin solunsisäisen kalsiumin [15], [16], [26], [35]. Nämä kanavat on tärkeä rooli epiteelin CI

– eritys, sileän lihaksen supistumisen ja hajuaistin signaalitransduktion [17], [36], [37], [38], [39]. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että TMEM16A on usein yli-ilmentynyt useissa maligniteettien, mukaan lukien SCCHN, ruokatorven syöpä ja maha-suolikanavan strooman tuumorit (GIST) [28], [36], [40]. Kuitenkin ilmaus TMEM16A CRC on edelleen epäselvä.

havainto on ensimmäinen näyttö siitä, että TMEM16A vahvistetaan ja ilmentyy voimakkaasti SW620, HCT116 ja LS174T-soluja, mutta ei HCT8 ja SW480-soluissa. Huomasimme, että TMEM16A proteiini oli noin 110 kD ja joka sijaitsee solukalvon ja plasmassa SW620, HCT116 ja LS174T soluja, mikä on aikaisempien raporttien kanssa yhtäpitävä [39], [41]. Koolonisyöpäsolulinja SW480 on peräisin ensisijaisesti koolonin adenokarsinoomasta peräisin 50-vuotiaan miespotilaan, ja SW620-solut ovat peräisin metastaattinen suoliliepeen imusolmuke saman potilaan. Joten SW620-soluissa on korkea etäpesäke potentiaali verrattuna SW480 soluihin [42]. LS174T ja HCT116 on korkeampi etäpesäke potentiaali kuin HCT8 soluihin [43], [44], [45]. Nämä tulokset osoittavat, että säätely ylöspäin TMEM16A liittyi lisääntynyt potentiaali etäpesäkkeiden viiden CRC solulinjat. Me spekuloida, että muuttaminen TMEM16A ilmaisun liittyi hankintaan aggressiivisempi ominaisuuksia CRC solulinjoissa, mikä aiheuttaa kasvaimia tulla metastaattisen. Suhde TMEM16A ilmaisun ja CRC kasvaimen etenemiseen on edelleen tutkittu enemmän CRC solulinjoissa ja toisessa klinikalla tutkimuksessa.

Koska niiden isogeenisiin ominaisuus, SW480 ja SW620 solulinjoja olla hyvä malli tutkimiseen geneettisen vaihtelussa paksusuolen syövän metastasointiin [46]. Siksi me valitsemme tämän parin solumallin myöhempää tutkimusta.

Elektrofysiologiset näyttöä validoitu että TMEM16A toimii CaCCs sisään SW620-soluissa. Ensinnäkin nykyinen on riippuvainen kalsiumionin sytoplasmassa ja jännitteen (Fig. 3C-F). Lisäksi sekä kloridi salpaaja NFA ja TMEM16A-spesifinen estäjä T16A

inh-A01 [47] voidaan tehokkaasti estää virtaukset tallennettua SW620 solun patch (Fig. 3G, H). Kiinnostavaa kyllä, havaitsimme, että kun solu laastarin leikattiin, The CACC nykyinen laski nopeasti ensin ja sitten tuli suhteellisen vakaana (Fig. 3C, D). Tämä ilmiö osoittaa, että muut proteiinit, kuten kalmoduliinin tai kalmoduliinista riippuvaa kinaasia, saattaa olla mukana säätelyssä TMEM16A CaCCs in SW620-soluissa.

On olemassa todisteita siitä kloridikanavia edistävät kasvaimen kehittymisen ja syövän etenemistä [48] , [49], [50], [51]. TMEM16A CaCCs on viime aikoina raportoitu edistää kasvua ja etäpesäkkeiden HNSCC, eturauhassyövän ja rintasyövän [27], [30], [31]. Yhdenmukaisesti näiden havaintojen, huomasimme, että TMEM16A Knockdown johti tukahduttaminen jakaantumiseen, kulkeutumiseen ja invaasion SW620-solujen. Tuloksemme osoittamaan, että TMEM16A todennäköisesti vaikuttavan kasvainten kehittymiseen ja etäpesäkkeiden korkean metastaattisen potentiaalin CRC. Pieni molekyyli-inhibiittorit, jotka voivat pienentää ilmentymisen TMEM16A voidaan käyttää uusia terapeuttisia lääkkeitä metastaattisen CRC.

Tähän mennessä mekanismi, jolla TMEM16A vaikuttaa paksusuolen syövän pysyi suhteellisen tutkimaton. Lukuisat tutkimukset osoittivat, että ERK-reitin paitsi ohjaa solujen lisääntymistä ja eloonjäämisen, mutta vaikuttaa myös kasvainsolun muuttoliike, invaasiota ja etenemiseen [52], [53], [54]. Viimeaikaiset tutkimukset raportoitu että TMEM16A edistää HNSCC kasvaimen kehittymisen ja syövän etenemistä aktivoimalla MAPK signalointireitille [30]. Siksi olemme keskittyneet opiskelusta suhdetta TMEM16A ja MEK-ERK1 /2 väylän CRC. Muutokset tämän reitin tutkittiin jälkeen TMEM16A ilmentyminen estyi käyttämällä western blotting. Tuloksemme osoittavat, että knockdovvn TMEM16A estivät merkittävästi aktivoinnin MEK ja ERK1 /2. Pohjalta tämän seurauksena olemme edelleen tutkittiin ekspressiota sykliini D1, joka on solusyklin säätelyproteiini, joka liittyy pERK1 /2: n ilmentymisen. Tulokset osoittivat, että ilmentyminen sykliini D1 on positiivisesti liittyy pERK1 /2 ja TMEM16A ilmaisun. Lisäksi virtaussytometria (FCM) määritykset osoittivat, että solusyklin etenemisen G1: stä S-vaiheeseen estyi, mikä vastasi vapauttamiseen sykliini D1 ilmentyminen jälkeen TMEM16A oli tyhjentynyt. Nämä tulokset antavat mahdollinen selitys havaittu esto solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion CRC kun TMEM16A tukahdutettiin ja ilmoitti TMEM16A edistää kasvua ja etäpesäkkeiden CRC mahdollisesti säätelemällä MAPK-reitin.

Yhteenvetona olemme osoittaneet, että ilmentyminen TMEM16A liittyy metastaattisen potentiaalin CRC solulinjoissa.