Krooninen sairaus

tiivistelmä

Colon syöpä käsittää pienen populaation syövän aloittamista kantasolujen (CIC), joka on vastuussa kasvaimen huolto- ja vastustuskykyä -cancer hoitoja, mahdollisesti sallien kasvaimen mieleen kun hoito loppuu. Yhdistelmiä immuuni-hormoniin pohjautuvien hoitojen, kemoterapiaa ja muita syöpälääkkeitä voi olla huomattavaa kliinistä hyötyä hoidettaessa paksusuolen syöpä. Kuitenkin solujen immuuni-pohjainen hoitoja ei ole kokeiltu vielä väestössä paksusuolen CIC. Tässä osoitamme, että hoito pieninä pitoisuuksina yleisesti käytettyjen kemoterapeuttisten aineiden, 5-fluorouracyl ja doksorubisiini, herkistää paksusuolen CIC on Vγ9Vδ2 T-solujen sytotoksisuutta. Vγ9Vδ2 T-solujen sytotoksisuus pitkälti välittämä TRAIL vuorovaikutus DR5 jälkeen NKG2D riippuva tunnustamista paksusuolen CIC tavoitteita. Olemme päätellä, että

in vivo

aktivaation Vγ9Vδ2 T-solujen tai otto- anto

ex-vivo

laajennettu Vγ9Vδ2 T-soluja sopivin väliajoin kemoterapian jälkeen voi merkittävästi lisätä anti-kasvain toimintaa ja edustaa uutta strategiaa paksusuolen syövän immunoterapiassa.

Citation: Todaro M, Orlando V, Cicero G, Caccamo N, Meraviglia S, Stassi G, et al. (2013) Kemoterapia herkistää Colon Cancer käynnistäminen Cells on Vγ9Vδ2 T soluvälitteinen sytotoksisuus. PLoS ONE 8 (6): e65145. doi: 10,1371 /journal.pone.0065145

Editor: Jacques Zimmer, Centre de Recherche Julkinen de la Santé (CRP-Santé), Luxemburg

vastaanotettu 5 maaliskuuta 2013 Hyväksytty 23. huhtikuuta 2013 Julkaistu: 06 kesäkuu 2013

Copyright: © 2013 Todaro et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ on tukenut avustusta Italian valtiovarainministeriön Instruction, University and Research (sopimus nro. 2008L57JXW FD), Italian terveysministeriön (Progetto Ricerca Finalizzata 2007 ”Kantasolut erilaisissa patologisissa tiloissa: innovatiivinen terapeuttisia approches” FD), Istituto Superiore di Sanità Oncoproteomic Projekti 2007-527 /B /3A /3 (GS ja FD) ja University of Palermo. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat julistaa ole taloudellisia tai kaupallisia eturistiriitoja. Vastaava kirjailija, Francesco Dieli, on Academic Editor PLoS One. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Viime vuosina uusia oivalluksia syöpätutkimuksessa ovat ehdottaneet, että kyky aloittaa ja yllä kasvaimen kasvu on ainutlaatuinen ominaisuus pienessä määrässä syöpäsolut stemness ominaisuudet tuumorimassan sisällä, jota kutsutaan ”syöpä kantasolut” (CSCS) tai ”syöpää aloittamista solut” (CIC) [1]. Kemoterapia on edelleen ensisijainen hoito valinta monia kehittyneitä syöpiä ja on sytotoksinen antituumorivaikutuksen läpi erilaisia ​​mekanismeja. Kuitenkin useimmat syövät ovat vastustuskykyisiä nykyisillä lääkkeillä johtuen hitaasta-pyöräily CIC, sijainti näiden solujen hypoksinen markkinaraon [2], [3], ja koska pahanlaatuisia soluja on kyky kehittää mekanismeja vastustaa tai paeta sytotoksista vaikutukset kemoterapiaa [4], joka sisältää säätely ylöspäin useiden ATP-sitova kasetti kuljettajat, aktiivinen DNA-korjaus kapasiteetti ja yli-ilmentyminen anti-apoptoottiset joka aiheuttaa muutoksia signalointireiteissä valvontaan lisääntymistä, erilaistumista ja apoptoosia [5] .

Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että hoito kasvainsolujen kemoterapeuttisten lääkkeiden indusoi tai lisää niiden herkkyyttä sytotoksisuus NK tai T-lymfosyyttejä; Näin ollen, yhdistelmiä soluimmuunivasteiden-hormoniin pohjautuvien hoitojen, kemoterapiaa ja muita syöpälääkkeitä voi olla huomattavaa kliinistä hyötyä hoidettaessa monia muotoja syövän [6].

γδ T-solut ovat erityisen kiinnostavia käytettäväksi tällaisissa Yhdistelmähoitoihin johtuen niiden voimakas anti-kasvain sytotoksisuus ja suhteellinen helppous sukupolven

in vitro

[7]. Ihmisen γδ T-solut voidaan jakaa kahteen populaatioiden perustuu δ ketju ilmaisun [8]: γδ T-solut ilmentävät Vδ1 ketjun useimmiten löytyy limakalvokudoksissa, jossa ne auttavat ylläpitämään epiteelikudos eheys edessä vahinko, infektion tai kasvaimen muutoksen, kun taas γδ T-solut, jotka ilmentävät Vδ2 ketjun pariksi on Vγ9 ketjun (tässä ja tämän jälkeen kutsutaan Vγ9Vδ2 T-solut) ovat vallitsevia perifeerisessä veressä ja toisen imukudoksiin [9]. Vaikka ligandi (t) tunnustettu Vδ1 soluista on tuntematon, Vγ9Vδ2 T-solut tunnistavat ei peptidirakenteinen antigeenien MHC-rajoittamaton mekanismi, tärkeä ominaisuus, joka erottaa ne αβ T-solujen [9]. Erityisesti, Vγ9Vδ2 T-solut tunnistavat phosphoantigens, jotka on tuotettu isoprenoid biosynteesireittejä [10] – [12]. Phosphoantigens eivät stimuloivan fysiologisilla tasoilla, mutta muunnetaan ja infektoituja soluja, tuottavat kohonneita aineenvaihdunnan välituotteita, jotka kykenevät aktivoimaan Vγ9Vδ2 T-solujen [13] – [15]. Niinpä Vγ9Vδ2 T-solut voidaan myös aktivoida kautta epäsuora mekanismi, jonka aminobisfosfo-, lääkeaineryhmän käytetään tiettyjen luusairauksien, jotka estävät farnesyylipyrofosfaatin syntaasia, ja syy kertyminen endogeenisen alkupään aineenvaihduntatuotteiden kuten isopentenylpyrophosphate (IPP) [16 ]. Vγ9Vδ2 T-solut voivat välillisesti edistää immuunipuolustuksen syöpäsoluja vastaan, tuottamalla sytokiinien tyypillistä Th1, Th2 tai Th17 soluihin [17] – [19], tai rajat juttelee dendriittisolujen [20], makrofageissa [21] ja B soluihin [22] – [24]. Lisäksi, Vγ9Vδ2 T-solut suorittaa suoraan voimakas sytotoksinen aktiivisuus syöpäsoluja, mikä välittyy paljon samalla tavalla kuin CD8-T-solujen ja NK-solujen, kautta perforiini /grantsyymi, Fas /FasL, TNF /TNF-R ja TRAIL-perävaunu R reittejä [10].

tässä tutkimuksessa olemme arvioineet synergiaa yhdistämällä kemoterapiaa ja Vγ9Vδ2 T soluvälitteinen sytotoksisuus varten kasvainhoitojen. Erityisesti, kuten paksusuolen CIC: t ovat kestäviä sekä kemoterapeuttisten ja Vγ9Vδ2 T-soluvälitteinen sytotoksisuus, olemme päättäneet, onko kemoterapiaa voidaan käyttää herkistämään paksusuolen CIC tavoitteet Vγ9Vδ2 T-solujen sytotoksisuuden, joka perustuu kolme riviä todisteita: (1) uraauurtava työ Mattarollo ja työtovereiden [25] on osoittanut korkeita sytotoksisuutta kiinteiden kasvainten solulinjat yhdistelmähoidon hyödyntäen Vγ9Vδ2 T-solujen ja kemoterapeuttisten aineiden; (2) IL-17-tuottavien γδ T-solut on ratkaiseva merkitys kemoterapiaindusoitu syöpälääkkeen immuunivasteita hiiren [26]; (3) hoito paksusuolen CIC kanssa bisfosfonaattien tsoledronaattia parantaa niiden herkkyyttä Vγ9Vδ2 T-solujen tappaminen [27].

Osoitamme tässä, että kemoterapeuttiset lääkkeet nykyään käytetään hoitoon paksusuolen syöpäpotilaiden, 5-fluorouracyl ja doksorubisiini, pystyvät herkistää paksusuolen CIC on Vγ9Vδ2 T-soluvälitteinen tappaminen ja osoitamme, että taustalla olevien mekanismien liittyy NKG2D ja TRAIL.

tulokset

Resistance of Colon CIC kemoterapiaan

Olemme aiemmin raportoitu, että paksusuolen syöpä käsittää valtaosa erilaistuneita soluja ja pieni väestö CIC jotka ovat vastuussa kasvaimen käynnistämiseen ja ylläpitoon [28]. Tätä tutkimusta varten varten, me puhdistettu ja lisättyjen paksusuolensyöpä pallojen kirurgisista sirpaleet 5 potilailla, joilla on paksusuolen syöpä. Nämä syövän pallo linjat tunnistettiin ilmaus CD133 ja epiteelin antigeeni ESA, näytetään noudattaminen viljelymaljoihin läsnäollessa seerumin ja myöhemmin erilaistuneet suuri, monikulmainen paksusuolen solut, jotka ilmentävät paksusuolen epiteelin markkereita, kuten villiini, mikä viittaa siihen, että paksusuoli syöpä aloilla säilyy kyky

in vitro

erilaistua suoliston kaltaisia ​​soluja. Tärkeintä on, kun ihonalaisesti NOD /SCID-hiiriin, pieni määrä paksusuolensyöpä palloja, mutta ei alalla käytössään johdettuja erilaistuneita soluja, säilytti kyky muodostaa kasvain, joka muistutti läheisesti ihmisen alkuperäisestä kasvaimesta (tukeminen Kuva S1).

CIC on ominaista korkea vastustuskyky lääkkeille ja yleistä toksiineja, jotka kohdistuvat nopeasti lisääntyviä soluja ja säästäisi hidas jakautuvia soluja, johtuu säätely ylöspäin useiden ATP-sitova kasetti kuljettajat, aktiivinen DNA-korjaus kapasiteetti, yli-ilmentyminen anti-apoptoottisten molekyylien, jotka aiheuttavat muutoksia signalointireittien ohjaamiseksi proliferaatiota, erilaistumista ja apoptoosia [5]. Näin ollen, altistuminen 5 eri paksusuolen CIC linjat (CIC # 1 CIC # 5) 5-FU: ta (2,5 ja 25 ug /ml) (kuvio 1A) tai DXR (0,025 ja 0,25 uM) (kuvio 1 B) 24-72 hrs ollut käytännössä mitään merkittävää sytotoksista vaikutusta, määritettynä PI värjäystä. Korkein annokset 5-FU: ta (250 ug /ml) ja DXR (2,5 uM) aiheutti alhaiset, mutta havaittavissa sytotoksisuus CIC linjojen välillä 15 ± 5%: sta 23 ± 6% (keskiarvo ± SD). Toisaalta, 5-FU: n ja DXR olivat täysin kykenevä tappamaan 3 eriytetty koolonsyöpäsolulinjoissa DLD-1, SW620 ja SW403, ja 2 eriytetty solulinjoissa (CDC # 3 ja CDC # 4), joka saatiin kahdelta potilaalta (P # 3 ja P # 4), jossa muodostuu CIC linjat saatiin myös, ja annoksesta riippuva nousu sytotoksisuuden jopa 85%. Elinkelpoisuuden käsittelemättömien solujen kaikki oli yli 90% (kuviot 1A ja B).

Colon CIC: t, eriytetty koolonsyöpäsolulinjoissa DLD-1, SW620, SW403, CDC # 3 ja CDC # 4 käsiteltiin eri -pitoisuus on 5-FU tai DXR 48 tuntia. Sytotoksisuus (% ± SD) määritettiin aste väheneminen eläviä soluja, joilla on kyky säilyttää CFSE ne sisällä PI (CFSE

korkea PI

-). Näkyy on edustava koe kolmesta.

Kemoterapia herkistää Colon CIC on Vγ9Vδ2 T Cell Sytotoksisuus

Analogisesti vastustuskyky kemoterapia, viisi testattu paksusuolen CIC linjat, olivat myös resistenttejä Vγ9Vδ2 T-soluvälitteinen sytotoksisuus, jopa silloin, kun E: T-suhteella 50:1 käytettiin (kuvio 2A). Huono sytotoksinen vaikutus paksusuolen CIC: t ei ole luontainen piirre Vγ9Vδ2 T-solujen, koska eriytetty koolonsyöpäsolulinjoissa DLD-1, SW620, SW403, CDC # 3 ja CDC # 4 oli tehokkaasti tapettiin kaksi Vγ9Vδ2 T-solulinjojen COLD2 -1 ja COLD2-2 on saatu kahdesta eri paksusuolen syövän potilaille (P # 3 ja P # 4) (kuvio 2A), sekä Vγ9Vδ2 T-solulinjat terveiltä luovuttajilta saatuja (tuloksia ei ole esitetty). Kontrollina, kaikki testatut Vγ9Vδ2 T-solulinjoja ei tappaa normaalia koolonsolulinjassa CCL-241 (kuvio 2A).

(A) Sytotoksisuus prosenttiosuus 2 erilaista Vγ9Vδ2 T-solulinjojen, COLD2-1 ja COLD2-2 saatu 2 potilailla, joilla on paksusuolen syöpä, paksusuolen syövän alalla soluja 5 eri potilaista (CIC # 1 CIC # 5), eriytetään koolonsyöpäsolulinjoissa DLD-1, SW620, SW403, CDC # 3 ja CDC # 4, ja normaalin paksusuolen solulinja CCL-241, on E: T-suhteella 50:1. (B) Kolmen eri kohde paksusuolen CIC (CIC # 2, CIC # 4 ja CIC # 5), käsiteltiin tai ei joko 5-FU: ta (2,5-250 ug /ml) tai DXR (0,025-2,5 uM) 48 tunnin ajan, testattiin niiden herkkyys 2 erilaista Vγ9Vδ2 T-solulinjoja, COLD2-1 ja COLD2-2 saatu 2 sairastuneiden potilaiden paksusuolen syövän ja käytetään E: T-suhteella 20:1. Tulokset osoittavat, sytotoksisuus kasvainkohteita seuraavat 6 tuntia rinnakkaisviljelemällä Vγ9Vδ2 T-solulinjoja. Tiedot ovat keskiarvo prosentteina ± SD 5 eri kokeissa, kukin suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

aiemmissa tutkimuksissa, olemme osoittaneet, että tsoledronaatti herkistää paksusuolensyöpä CIC: t ja Vγ9Vδ2 T-solujen sytotoksisuuden [27]. Kyky Vγ9Vδ2 T-solujen tappaa paksusuolensyöpä CIC arvioitiin sitten käsittelyn jälkeen tavoitteista kemoterapiaa. Edustavia tuloksia on saatu kolmella eri CIC linjat (CIC # 2, CIC # 4 ja CIC # 5) on esitetty kuviossa 2B. Vγ9Vδ2 T-solujen sytotoksisuutta tehostettiin kaikissa tapauksissa esikäsittely kohde CIC kemoterapian kanssa. Yksityiskohtaisesti, lähes täydellinen lyysi CIC linjat johtui yhdistelmä suurinta annosta 5-FU: ta (250 ug /ml) tai DXR (2,5 uM) ja Vγ9Vδ2 T-soluja, solukuolemaan prosenttiosuudet yli 90% E: T- suhde 20:1. Hoito tavoitteet pienemmillä annoksilla kemoterapian (2,5 ja 25 ug /ml 5-FU: n ja 0,025 ja 0,25 uM DXR) johti tehostetun tappamiseen CIC riviä Vγ9Vδ2 T-solujen, mikä osoittaa, että kemoterapia ja Vγ9Vδ2 T-solut ovat lisäaineen aktiivisuutta, vaikka käytetään optimaalinen annoksia.

kemoterapia ylössäätelee DR5 (TRAIL-R2) Death reseptorin ilmentymisen CIC

tulkita molekyylitason mekanismeista kemoterapiaa välittämää herkistää CIC on Vγ9Vδ2 T-solujen sytotoksisuuden, keskityimme ilmaisua mRNA: n koodaavan molekyylejä, joiden tiedetään olevan ligandeja avain aktivoimiseksi reseptorien Vγ9Vδ2 T-solujen ja syöttämällä reseptoreihin, ennen ja jälkeen altistuksen CIC kemoterapian aineita. Kuten kuviossa 3 on esitetty, kaikki nämä molekyylit olivat konstitutiivisesti CIC: t, vaikka ilmaisu jatkuvasti vaihdella kesken eri CIC linjat; kuitenkaan ole suuria eroja havaittiin kaikissa testatuissa CIC linjat HLA-luokan I, ICAM-1, CD155, CD112, MICA /B ja ULPBP1-4 ilmaisun ennen ja jälkeen altistuksen solunsalpaajiin.

RT PCR ilmentymisen koodaavan mRNA: n eri pinta-molekyylien paksusuolen CIC: t on käsitelty tai ei ole joko 5-FU: n (25 ug /ml) tai DXR (0,25 uM) 48 tunnin ajan. Data edustaa keskiarvoja ± SD 4 erillisen kokeen, joista kukin suoritettiin paksusuolensyöpä pallojen 5: stä eri potilaasta (CIC # 1 CIC # 5).

Expression of Fas (CD95), TNF-a R1, DR4 (TRAIL-R1) ja DR5 (TRAIL-R2) ja syöttämällä reseptorien lisättiin useimmissa CIC riviä altistumisen jälkeen kemoterapia-aineiden (kuvio 3), mutta lisääntyneen ekspression Fas, TNF-R1 ja DR4 ei saavuttanut tilastollista merkitys. Suurin ja merkittävä kasvu havaittiin vain DR5 ilmentymisen altistuksen jälkeen CIC 5-FU: n ja, vaikkakin vähemmässä määrin, DXR (kuvio 3). DR5 seuraavat 48 tuntia altistuksen paksusuolen CIC kemoterapian vahvistettiin virtaussytometrialla, kun värjäämällä erityisiä mAb (kuvio 4).

Colon CIC: t käsiteltiin medium, 5-FU (25 ug /ml) tai DXR (0,25 uM) 48 tuntia, pestään huolellisesti ja värjättiin anti-DR5 mAb. Virtaussytometria histogrammit osoittavat DR5. Mean fluoresenssin intensiteetti (MFI) DR5 värjäys ilmoitetaan oikeassa yläkulmassa kunkin paneelin. Katkoviivat esittävät isotyyppikontrolli mAb, kun taas harmaat täytetty histogrammi edustaa anti-DR5 mAb.

tappaminen Kemoterapia saaneista CIC by Vγ9Vδ2 T Cells välittyy NKG2D ja TRAIL

Vγ9Vδ2 T solut hyödyntää erilaisia ​​reittejä varten kasvainsolujen tappamista, jotka tukeutuvat eritystä proinflammatoristen sytokiinien ja proapoptoottiset molekyylien tai solujen kosketuksiin riippuvaista lyysin kautta NK kaltainen tai TCR-riippuvaisia ​​vuorovaikutuksia [9]. Olemme arvioineet vastaavat elimistön tappaa kemoterapiaa-herkistyneet CIC by Vγ9Vδ2 T-solut, yksittäisten estämällä TCR tai NKG2D reseptoreihin. Sytotoksisuus kemoterapiaa esikäsitellyt paksusuolen CIC riviä ja kaksi erilaista Vγ9Vδ2 T-solulinjoja inhiboitui merkittävästi anti-NKG2D mAb, kun taas Vγ9Vδ2 TCR näyttää olevan vähäinen merkitys osoittamien vika anti-CD3- ja anti-pan γδ TCR mAbien estävän sytotoksisuus (kuvio 5). Lisäksi, Vγ9Vδ2 T-solujen tappamisen kemoterapia-herkistyneet tavoitteet arvioitiin, kun läsnä oli mevastatiini, joka estää 3-hydroksi-3-metyyliglutaryyli-CoA-ja estää tsoledronaatti-välitteisen kertyminen endogeenisen phosphoantigens kuin IPP. Mevastatiini eivät estäneet tappaminen kaikkien testattujen kemoterapia-esikäsitelty paksusuolen CIC riviä ja kaksi eri allogeenisen Vγ9Vδ2 T-solulinjoja (kuvio 5), mikä osoittaa, että kemoterapian aiheuttaman herkistymisen CIC: t ja Vγ9Vδ2 T-solun sytotoksisuutta ei perustu mevalonaatin tuotannossa metaboliitteja.

Vγ9Vδ2 T-solulinja COLD2-1 viljeltiin kaksi kemoterapia-käsiteltyjen paksusuolen CIC (CIC # 3 ja CIC # 5) on E: T-suhteella 20:1, läsnä ollessa estää vasta-aineiden γδ TCR, CD3, NKG2D, tai kun läsnä on mevastatiini. Erityiset sytotoksisuuden tasoja saavutetaan Vγ9Vδ2 T-solulinja COLD2-1 olivat 65 ± 11 CIC # 3 ja 71 ± 9 CIC # 5. Tiedot ovat keskiarvo ± SD kahdesta kokeesta suoritettiin kolmena kappaleena. Prosentuaalinen esto anti-NKG2D mAb oli merkittävästi erilainen kuin arvot kaikissa muissa ryhmissä (* p 0,001).

edelleen valaista tappamisen kemoterapia-herkistyneet paksusuolen CIC by Vγ9Vδ2 T-solujen, me yksilöllisesti esti rakeen eksosytoosilla, TNF-α-, perävaunu, ja FasL-välitteisen reittejä. Tappaminen-inhibition kokeet osoittivat, että Vγ9Vδ2 T-solujen sytotoksisuuden kemoterapia-esikäsitellyt paksusuolen CIC tavoitteet inhiboitui merkittävästi anti-DR5-mAb, kun taas mAb: t vastaan ​​DR4, TNF-α, ja FasL, tai käsittelemällä CMA estää rakeen-eksosytoosia reitin, kaikki epäonnistuneet estää. Kuvio 6 esittää edustavia tietoja kahdella Vγ9Vδ2 T-solulinjoja ja kaksi paksusuolen CIC linjat, CIC # 2 ja CIC # 4.

Vγ9Vδ2 T-solulinja COLD2-1 viljeltiin kaksi kemoterapiaa saaneilla paksusuolen CIC ( CIC # 3 ja CIC # 5) on E: T-suhteella 20:1, läsnä ollessa estävien vasta-aineiden TNF-α, FasL (CD95L), TRAIL-reseptorit R1 (DR4) tai R2 (DR5), tai concanamycin (CMA). Erityiset sytotoksisuuden tasoja saavutetaan Vγ9Vδ2 T-solulinja COLD2-1 oli 61 ± 7 CIC # 3 ja 65 ± 12 CIC # 5. Tiedot ovat keskiarvo ± SD suoritettujen kokeiden kolmena kappaleena. Prosentuaalinen esto anti-DR5 ja anti-TRAIL-mAb: t olivat merkittävästi erilaiset kuin arvot kaikissa muissa ryhmissä (* p 0,001).

Keskustelu

Nyt on syntymässä, että syöpä on syntyy populaatio, jotka ilmentävät stemness ominaisuuksia, nimeltään syövän kantasoluja tai syövän-aloitetaan soluja (CIC) [1], [2]. Nämä solut, jotka edistävät vain pienen osan koko kasvain massa, läpi pitkän aikavälin laajentaminen säilyttäen niiden kyky toistaa alkuperäisestä kasvaimesta fenotyyppi, mikä antaa näyttöä itseuudistumiseen ja kasvaimen aloittamista kapasiteetti [1], [ ,,,0],2]. CIC väestö on kestävämpi kuin eriytetty ensisijainen solujen tavanomaisen kemoterapian ja sädehoidon ja oletetun innovatiivisten hoitojen, kuten ne, jotka perustuvat käyttöön TRAIL. Tämä vastareaktioita syyksi on se, että CIC: t ilmentävät monilääkeaineresistenssin geenejä, mukaan lukien korkeat tasot anti-apoptoottisia proteiineja ja ABC (ATP Binding kasetti) kuljettajat tahkoaa huumeet, vaan myös siitä, että kemoterapia tavoitteet jakamalla soluja ja näin ollen epäonnistuu tappaa hitaasti pyöräily CIC [3] – [5].

Data viimeaikaisten kliiniset tutkimukset ovat ehdottaneet, että yhdistämällä kemoterapiaa immunoterapia on selviytymisen etuja kuin pelkkää kemoterapiaa [6], [29], kuten edellä esimerkiksi yhdistämällä kemoterapiaa ja monoklonaalisia vasta-aineita [30] – [32]. Lisäksi on tunnettua, että kemoterapeuttiset lääkkeet voivat herkistää kasvainsolut sytotoksisuuden välittävät CD8, NKT tai Vγ9Vδ2 T-solujen [33] thorugh useita erilaisia ​​mekanismeja, [34]. Olemme kuitenkin äskettäin havainneet, että paksusuolen CIC: t ovat vastustuskykyisiä Vγ9Vδ2 T-solujen sytotoksisuuden, jollei niitä ole herkistetty tsoledronaatti [35]: vastaavasti, olemme nyt testattu mahdollisuutta, että kemoterapeuttisten käytetään tällä hetkellä hoidossa paksusuolen syöpä voi herkistää paksusuolen CIC ja Vγ9Vδ2 T-solujen tappaminen.

alustava testaus sytotoksisuuden paljasti, että analogisesti meidän aiemmin raportoitu tulokset [27], ja monet paksusuolen CIC linjat olivat resistenttejä sytotoksista aktiivisuutta Vγ9Vδ2 T-soluja, mutta esikäsittely alhainen, subletaalit pitoisuuksia kemoterapeuttisten 5-FU ja DXR herkistää CIC tavoitteet Vγ9Vδ2 T-solujen tappaminen, jolloin lisäaine sytotoksisuuden toimintaa.

Vγ9Vδ2 T-solut ovat vuorovaikutuksessa ja tappaa tuumorikohteita thorugh useita erilaisia ​​mekanismeja kuten rae eksosytoosilla, kuoleman reseptori /ligandit vuorovaikutus TNF, TRAILin ja FasL, ja TCR tai NKG2D välittämää tunnustamista phosphoantigens tai stressi-indusoituva molekyylejä, vastaavasti. Kaikki testatut paksusuolen CIC linjat konstitutiivisesti mRNA, joka koodaa HLA-luokan I, ICAM-1, CD155, CD112, MICA /B, ULPBP1-4, Fas (CD95), TNF-R1, DR4 (TRAIL-R1) ja DR5 (TRAIL -R2) molekyylit pinnalla, mutta ilmaus kaikki nämä molekyylit eivät tehneet CIC herkkä Vγ9Vδ2 T-solujen tappaminen. Kuitenkin altistuminen paksusuolen CIC 5-FU ja, vaikkakin vähemmässä määrin DXR, huomattavasti DR5 ilme.

Useat aiemmin julkaistu raportteja kirjallisuudessa ovat osoittaneet, että monet kemoterapeuttiset lääkkeet, kuten 5-FU ja DXR , ylössäätävät DR5 ilme kasvainsolulinjoissa erillisen kudoksen alkuperästä [36] – [42]. Kuitenkin tämä vaikutus on raportoitu eriytetty syöpäsoluja, kun taas, tietojemme mukaan ei ole näyttöä samankaltaisten DR5 säätelyä on CIC. Vai ei kemoterapian aiheuttama DR5 upregulation on rajoitettu paksusuolen CIC: t tai on yleinen ilmiö havaitaan muilla CIC: t on todella tutkitaan.

Olemme kuitenkin havainneet, että Vγ9Vδ2 T-solujen hyväksi eri mekanismeja tappaa CIC tavoitteita, jotka olivat tiukasti riippuvaisia ​​tapa kohde CIC herkistymistä. Riippumatta siitä kemoterapeuttisten tai tsoledronaattia käytettiin herkistää CIC, Vγ9Vδ2 T-solut tappavat näistä tavoitteista oli TCR tai NKG2D välittämä: yhdenmukainen edellisessä raportissa [27] kemoterapia-herkistyneet paksusuolen CIC tapettiin seuraavat NKG2D välittämää tunnustamista ja TRAIL /DR5 vuorovaikutusta, kun taas molemmat mekanismit olivat tarpeettomiksi sen sytotoksisuutta tsoledronaattia-herkistyneet paksusuoli CIC, jotka pääosin tappoivat TCR-välitteisen vuorovaikutuksen ja Perforiinin /grantsyymi reitin.

Aiemmat tutkimukset ovat korosti NKG2D -MICA /B vuorovaikutuksia kasvainsolujen tunnustamista ja tehokkaan sytotoksisen aktiivisuuden Vγ9Vδ2 T-solujen [35] – [44]. Ero NKG2D-välitteisen tunnustamista kemoterapia-herkistyneet paksusuolen CIC: t ja TCR-välitteisen tunnustamista tsoledronaatti-herkistyneet CIC tavoitteita ei voida selittää ero ilmentymistä MICA /B tai ULBPs, koska ei ole 5-FU tai DXR muuttaa ilmentämällä määriä näitä molekyylejä. On todennäköistä, että phosphoantigens tuotanto /ilmentymisen paksusuolen CIC on erittäin alhainen, alle kynnysarvon tarvitaan tehokasta tunnustamista reaktiivinen Vγ9Vδ2 TCR, näin ollen kohteen tunnustamista vain tapahtuu läpi NKG2D: tulokseen, jonka mukaan paksusuolen CIC herkistynyt Vγ9Vδ2 T-solujen sytotoksisuutta altistettaessa sen tsoledronaattia [27], joka tehostaa phosphoantigen keskittymisen ja tuotantoa, tukee tätä mahdollisuutta.

Olemme päätellä, että

in vivo

aktivaation Vγ9Vδ2 T-solujen tai adoptiivista siirtoa

ex vivo

aktivoiduilla Vγ9Vδ2 T-soluja, yhdessä tai pian antamisen jälkeen tiettyjen kemoterapeuttisten voivat merkittävästi lisätä niiden anti-kasvain vaikutuksia. Muita kliinisiä tutkimuksia tarvitaan siis tehokkuuden arvioimiseksi tämän kombinatoorista terapian, mahdollisesti myös uuden γδ T-solu-pohjainen immunoterapeuttinen lähestymistapa, joka

ex-vivo

laajentaminen polyklonaalisten γδ T-solujen seuraa käyttöön CD19-spesifinen kimeerisen antigeenin reseptori tekee niistä bispesifisiä ja tehokkaampi tappamiseen CD19

+ kasvainsolulinjoissa

in vitro

ja ksenografteissa [45].

Materiaalit ja menetelmät

perifeerinen veren ja Colon Cancer näytteitä

ihmisen perifeerisen veren mononukleaarisia soluja (PBMC) ja paksusuolen syöpä kudoksia saatiin noudattaen eettisiä standardeja toimielinkomitea ihmiskokeita potilailta, joille suoritetaan kaksoispisteellä resektio varten paksusuolen adenokarsinooma. Histologinen diagnoosi perustui mikroskooppisia piirteitä karsinoomasoluja määritetään histologinen tyyppi ja laatu. PBMC: t eristettiin paksusuolen syöpäpotilaiden tiheysgradienttisentrifugaatiolla käyttäen Ficoll-Hypaque (Pharmacia Biotech, Uppsala, Ruotsi) ja kryosäilöttiin 80% RPMI 1640 (Life Technologies, Monza, Italia), 10% DMSO: ta (Sigma, St. Louis, MO) ja 10% lämpöinaktivoitua vasikan sikiön seerumia (FCS, Life Technologies).

mukaan Italian sääntöjen (13 artikla asetus nro. 196/03), tämä tutkimus ei edellytä tekijän paikallinen eettinen komitea. Tutkimus suoritettiin mukaisesti periaatteiden Helsingin julistuksen ja kaikkien yksilöiden antoi kirjallinen lupa osallistua.

puhdistus ja kulttuuri CIC

Syöpä kudokset pestiin perusteellisesti suolaliuoksella, joka sisälsi antibiootteja ja inkuboitiin yön yli DMEM /F12 (Life Technologies), joka sisälsi penisilliiniä (500 IU /ml), streptomysiiniä (500 ug /ml) ja amfoterisiini B: tä (1,25 ug /ml) (Life Technologies). Entsymaattinen digestio suoritettiin käyttämällä kollagenaasia (Life Technologies, 1,5 mg /ml) ja hyaluronidaasia (Sigma, 20 ug /ml) DMEM: ssä, joka sisälsi antibiootteja /antimykootteja 1 tunnin ajan. Talteen soluja viljeltiin sitten seerumivapaassa väliaineessa (DMEM /F12), jota oli täydennetty 6 mg /ml glukoosi, 1 mg /ml NaHCO3, 5 mM HEPES, 2 mM L-glutamiinia, 4 ug /ml hepariinia, 4 mg /ml BSA: ta , 10 ng /ml βFGF, 20 ng /ml EGF: ää, 100 ug /ml apotrasferrin, 25 ug /ml insuliinia, 9,6 ug /ml putreskiini, 30 nM natriumseleniitti vedetön ja 20 nM progesteronia (Sigma) lopulliseen konsentraatioon 3 x 10

5 solua /ml. Nämä viljelyolosuhteet valikoida epäkypsiä syöpäsolujen hitaasti lisääntyä, synnyttää, 2-3 kuukauden kuluttua, kasvainsolupinta aggregaatteja, nimeltään ”alalla”. Palloja muodostavan solut voidaan levittävät entsymaattiseen dissosiaa- pallojen (3 mM EDTA, 50 nM DTT PBS: ssä), mitä seurasi uudelleen pinnoitus yksittäisiä soluja ja jäljellä pieniä soluaggregaatteja tuoreen seerumia [28], [46] , [47].

kasvainten muodostumiseen arvioitiin implantoitu ihon alle joko eriteltyä paksusuolensyöpä pallo soluja tai pallo johdetut erilaistuneita soluja [27]. Eriytetty koolonkarsinoomasoluissa linjat DLD-1, SW620 ja SW403 (American Type Culture Collection) saatiin tri Ruggero De Maria ( ”Regina Elena” National Cancer Institute, Rooma, Italia) ja ylläpidettiin DMEM: ssä, joka sisältää antibiootteja ja 10% FCS . Kaikki soluviljelmät suoritettiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2: ssa kosteassa inkubaattorissa.

Anti-kasvain Agents, Antibodies ja reagenssit

kemoterapeuttiset aineet 5-fluorourasiili (5 -FU) ja doksorubisiini (DXR) saatiin Sigma kautta apteekin yliopistollisen sairaalan. Drugs laimennettiin DMSO: hon ja laimennettiin haluttuun pitoisuuksia PBS: ssä ennen käyttöä.

Seuraavat konjugoimattoman, FITC-, PE-, PE-Cy5 tai APC-konjugoidun monoklonaalisia vasta-aineita (mAb: t) on käytetty: anti -TCR Vδ2 (B6, BD Biosciences, San Jose, CA), anti-NKG2D (1D11, eBioscience, San Diego, CA), anti-CD95L (2C101, Vinci Biochem, Firenze, Italia), anti-MICA /B (6D4 , BD Biosciences).

lisäksi seuraava puhdistettu mAb: itä käytettiin myös: anti-CD3 (esto, MEM-57), anti-HLA luokka I monomorphic (MEM-147) prof Vaclav Horejsi (Institute of Molecular Genetics, Praha, Tsekin tasavalta), anti-TCR pannulla γδ (IMMU510, lahja tohtori Marc Bonneville, Institut de Biologie, Nantes, Ranska), anti-TNF-α (Infliksimabi, lahja prof Giovanni Triolo , Dipartimento Biomedico di Medicina Interna e specialistica, Università di Palermo, Palermo, Italia), anti-TRAIL-reseptorit TRAIL-R1 (DR4), TRAIL-R2 (DR5), TRAIL-R3 (LIT, DcR1) ja TRAIL-R4 (TRUNDD , DcR2) kaikki Dr. Henning Walczak (Kasvain Immunology yksikkö, Division of Medicine, Imperial College, Lontoo, Iso-Britannia).

Concanamycin A (CMA) ja mevastatiini ostettiin Sigma, vaikka tsoledronaattia oli Novartis Pharma, Basel, Sveitsi.

Generation of Polyclonal Vγ9Vδ2 T Cell Lines

Polyklonaaliset Vγ9Vδ2 T-solulinjoja muodostettiin ensin rikastaa PBMC: käyttäen γδ T-solujen eristäminen kit (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Saksa), ja sen jälkeen lajittelemalla yhden Vγ9Vδ2 T-solujen kautta FACSAria (BD Biosciences), joilla on erityisiä mAb: illä. Solut (2 x 10

3) viljeltiin sitten kuhunkin kuoppaan pyöreäpohjaisessa, 96-kuoppalevyillä, jotka sisältävät 2 x 10

4 säteilytettyä (40 Gy) allogeenisten PBMC, 2 x 10

3 säteilytetty ( 70 Gy) EBV-transformoituja allogeenisten B-solujen, 0,5 ug /ml PHA: ta (Sigma), ja 200 U /ml rekombinanttia interleukiini 2 (Proleukin, Novartis Pharma). Kasvava linjat laajennettiin 200 U /ml IL-2 ja stimuloitiin uudelleen 2 viikon välein. Yleensä solut kerättiin jälkeen 4-6 viikkoa kulttuurin käytettäväksi funktionaalisia määrityksiä

in vitro

.

Solumyrkkykoe

Target paksusuoli CIC (10

5 cellsml) esi-käsiteltiin 5-FU (2,5-250 ng /ml), DXR (0,025-2,5 uM) tai tsoledronaatti (0,5 uM) 24, 48 tai 72 tuntia. Solut pestiin perusteellisesti PBS: llä ja värjättiin CFSE (Merck, Milano, Italia) seuraavasti: 50 ui CFSE lisättiin 1 ml: aan tavoite alalla solususpensiota (5 x 10

5 solua /ml) PBS: ssä, jolloin saatiin lopullinen pitoisuus 2,5 uM CFSE. Soluja inkuboitiin 10 minuutin ajan 37 ° C: ssa ja sekoitettiin varovasti 5 minuutin välein. Lopussa inkubaation 1 ml FBS: ää, lisättiin solususpensioon pysäyttää Värjäysreaktio ja solut sentrifugoitiin 600 g: ssä 5 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, pestiin kaksi kertaa kylmällä PBS: llä ja suspendoitiin uudelleen seerumia.

Vγ9Vδ2 T-solulinjoja suspendoitiin uudelleen loppukonsentraatiot 10

6 ja 2,5 x 10

6 solua /ml, lisättiin CFSE-värjätty tavoite paksusuolen CIC: t (1 x 10

5 ) ja co-viljelmiä pidettiin 6 tuntia 37 ° C, kun läsnä on 5% CO

2. Lopussa itämisaika, solut pestiin PBS: llä ja värjättiin 20 ui propidiumjodidia (PI, Sigma, 1 ug /ml) 10-15 minuutin ajan jäissä. Lopulta 100 ui kylmää PBS lisättiin ennen hankinnan FACSCalibur sytometrillä (BD Biosciences). Laskenta sytolyyttisen aktiivisuuden perustui aste väheneminen elinkelpoisten kohdesolujen kanssa kyky säilyttää CFSE ne sisällä PI (CFSE

korkea PI

-), mukaan viite [27].

estäminen aineita käytettiin arvioimaan mekanismeja Vγ9Vδ2 T-soluvälitteinen sytotoksisuus paksusuolen CIC. Arvioida osuus mevalonaatin metaboliittien kasvainkohdesoluja käsiteltiin mevastatiini (25 uM 2 h) selektiivisen ylävirtaan estäjä mevalonaatin kautta. Tämän inkubointijakson jälkeen, kohde-solut pestiin, ja Vγ9Vδ2 T-soluja lisättiin, kun läsnä oli 25 uM mevastatiini, on ylläpitää vakio pitoisuus tämän lääkkeen inkubaation aikana, koska sen vaikutus on nopeasti palautuva [27]. Estää perforiini-välitteisen sytotoksisuuden, Vγ9Vδ2 T-soluja inkuboitiin concanamycin A (CMA, 15 nM) 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa, ennen kuin yhdessä viljelemisen tavoite CIC: t, ilman pesua [27].