Krooninen sairaus

tiivistelmä

Aiemmat tutkimuksemme tulokset osoittivat, että molemmat Ras-homologia perheenjäsen C (RhoC) ja IQ-domain GTPaasia aktivoiva proteiini 1 ( IQGAP1) on yli-ilmaistu mahasyövässä kudosten ja solujen, mutta niiden rooli tumorigenensis ei ole käsitelty selkeästi. Tässä raportoimme leviämisen stimuloiva vaikutus RhoC ja IQGAP1 mahalaukun syöpäsolujen ja vuorovaikutus kahden proteiinien säätelyssä leviämisen mahalaukun syöpäsoluja. Plasmidit ja virus-, jotka koodaavat kohde-siRNA ja DNA: ta käytetään muuttamaan ilmentymisen RhoC ja IQGAP1. MTT-menetelmällä ja BrdU käytettiin analysointiin vaikutuksen RhoC ja erilaiset rakenteet IQGAP1 jakautumiseen. Proteiini tasot IQGAP1 ja RhoC solulinjoissa havaittiin Western-blottauksella. Immunofluoresenssi ja Co-immunosaostus määritykset levitettiin tutkia lokalisointi ja sitova välillä RhoC ja IQGAP1. Tulokset osoittivat, että RhoC, IQGAP1 ja C-terminaalinen fragmentti IQGAP1 merkittävästi stimuloi proliferaatiota mahasyövän soluja, ja parannettu ekspressio sykliini E ja sykliini D1. Sen sijaan, vähentäminen endogeenisen IQGAP1 tai RhoC siRNA heikennetty solujen proliferaatiota. Ehtyminen IQGAP1 ilmentymisen siRNA merkittävästi esti proliferatiivista aktiivisuutta konstitutiivisesti aktiivisen RhoC, kun taas RhoC hiljentäminen siRNA ei ollut vaikutusta IQGAP1-indusoitua proliferaatiota mahalaukun syöpäsoluja. Samanaikainen immunosaostus ja Immunofluoresenssimääritykset osoittivat, että RhoC ja IQGAP1 sidottu toisiinsa. Yhteenvetona tulokset viittaavat siihen, että RhoC stimuloi mahalaukun syöpäsolujen rekrytoimalla IQGAP1 efektorina.

Citation: Wu Y, Tao Y, Chen Y, Xu W (2012) RhoC Säätelee leviämisen Mahalaukun syöpäsolut kautta Vuorovaikutus IQGAP1. PLoS ONE 7 (11): e48917. doi: 10,1371 /journal.pone.0048917

Editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Itävalta

vastaanotettu: 26 kesäkuu 2012; Hyväksytty: 02 lokakuu 2012; Julkaistu: 07 marraskuu 2012

Copyright: © 2012 Wu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Specialized Research Fund for Senior henkilöstö Program Jiangsun yliopisto (nro. 11JDG114) ja National Natural Science Foundation of China (nro. 31040002). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Rho GTPaasit voi aiheuttaa tiettyjä solunsisäistä viestintää ja vaikuttaa solujen eri toimintoja, kuten uudelleenjärjestely aktiinisytoskeletonin, geenitranskriptiota, selviytyminen, ja leviämisen [1], [2]. Vaikka kolme Rho isoformia, RhoA, RhoB, ja RhoC, näytteille yli 85% aminohappojen identtisyys, ne antavat eroja funktio soluissa [3]. RhoA ja RhoC proteiinien on osoitettu olevan myönteinen vaikutus leviämisen ja pahanlaatuisiksi [4], [5], [6], kun taas rooli RhoB näissä prosesseissa näyttää olevan eriäviä [7], [8]. Useimmat tutkimukset osoittivat, että RhoC oli useita toimintoja tuumorimetastaasissa, orchestrating toiminta useiden alavirran -efektiboksejamme hajoamista ja jälleenrakentaminen soluväliaineen (ECM). Kuitenkin vielä jonkin verran kiistelyä roolista RhoC säätelyssä solujen lisääntymistä [9], [10], [11], [12]. Tulokset Pile laboratorio osoitti, että RhoA ja RhoC siRNA edustavat tehokkaita työkaluja estämällä syöpäsolujen lisääntymistä, invasiivisuus, ja angiogeneesi sekä

in vitro

ja

in vivo

[9]. Sun

et ai

havaittu, että kasvaimeen injektio RhoA tai RhoC siRNA nude-hiiret voi estää kasvaimen kasvua [13]. Sen sijaan Faried

et al

raportoitu että RhoA edistää kasvaimen kasvua yli RhoC, kun taas RhoC indusoi kaukainen etäpesäke verrattuna RhoA [11], kanssa näitä huomautuksia Clark ja kollegat [14]. Tekemästä tutkimuksesta Ikoma ja kollegat osoittivat, että RhoC ei ollut vaikutusta kasvaimen kasvuun, mutta parantaa metastaattisen luonnetta keuhkosyövän stimuloimalla soluliikkuvuus [10]. Näin ollen lisätutkimuksia tarvitaan tunnistamaan aseman RhoC säätelyssä biologiset aktiivisuudet kasvainsoluissa.

IQ-domain GTPaasia aktivoivia proteiineja (IQGAPs) ovat tärkeitä säätelijöitä solun prosesseja, jotka sisältävät solun tukirangan uudelleenjärjestelyjä solumigraation , leviämisen ja sytokineesiin [15], [16], [17]. IQGAP1 on yksi jäsenistä kolmen liittyvät nisäkkään IQGAPs ja muuttuvat solunsisäisen IQGAP1 ilmentymistä tai toimintaa on raportoitu muuttavan solun toimintaa [17], [18], [19], [20]. Tukirakenteena proteiini, IQGAP1 sitoo useita proteiineja, kuten onkogeenit β-kateniinin ja Src, tuumorisuppressorin E-kadheriinin ja Rho-GTPaasit Cdc42 ja Rac1, ja aiheuttaa muutoksen solun käyttäytymistä, erityisesti syöpäsoluja. Aikaisemmat tutkimus osoitti, että mitä korkeampi ilmaukset RhoC ja IQGAP1 mahasyövän kudoksessa merkittävästi käänteisesti korreloivat erilaistumista mahalaukun syöpäsolujen [21]. Lisäksi proteiini tasot ovat olennaisia ​​myös lisääntymistä ja kulkeutumista syöpäsoluja. Siksi oletamme, että molemmat RhoC ja IQGAP1 voi olla tärkeä rooli syöpäsolujen muutoksen ja lisääntymistä ja on olemassa mahdollinen yhdistys niiden välillä. Esillä olevassa tutkimuksessa tutkimme vaikutus RhoC ja erilaiset rakenteet IQGAP1 syövän solujen lisääntymisen ja solusyklin liittyviä proteiineja. Tutkimme myös suhdetta kahden molekyylin yhteishaussa siRNA häiriöitä ja virusinfektio tekniikkaa.

(A) Western blot -analyysi RhoC ilmentymisen BGC-823-solut infektoitiin Ad-RhoC-V14. (B) suhteellisen leviämisen aktiivisuus BGC-823-solut infektoitiin Ad-RhoC-V14 tutkittiin MTT-määrityksellä. (* P 0,05 verrattuna Ad-LacZ ryhmä). (C) proteiini ilmentymistä RhoC in BGC-823 transfektoitujen solujen RhoC siRNA. (D) kaatamalla of RhoC estivät leviämisen BGC-823-solut (MTT-määritys, * P 0,05, verrattuna ohjaus siRNA ryhmä). Tiedot ovat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta kukin suoritettiin kaksinkertaisina.

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit

mahasyöpä solulinjat BGC-823 [ ,,,0],22] ja Afrikkalainen vihreän apinan munuaisen fibroblastisolulinjat COS-7 toimittivat Institute of Cell Biology (Shanghai, Kiina). The Green Fluorescent Protein (GFP) plasmidin ja solujen transfektioreagenssi Lipofec- tamin’ia ™ 2000 oli Invitrogen (Carlsbad, CA); Plasmidit, jotka koodaavat Flag merkitty IQGAP1 (pFlag-IQGAP1), Flag merkitty IQGAP1 C-terminaalinen fragmentti (pFlag-IQGAP1-C), ja lippu merkitty IQGAP1 N-terminaalinen fragmentti (pFlag-IQGAP1-N), ja adenovirusvektorit, jotka koodaavat β-galaktosidaasi (pAd-LacZ), konstitutiivisesti aktiivisen muodon RhoC (pAd-RhoC-V14), täyspitkä IQGAP1 (pAd-IQGAP1), ja C-terminaalinen fragmentti IQGAP1 (pAd-IQGAP1-C) olivat ystävällisiä lahja Dr. Gerry Boss ja Dr. Renate Pilz University of California, San Diego, USA. Ihmisen EGF, BrdU, hiiren anti-BrdU-vasta-ainetta, DNaasi I, MTT, Hoechst 33342, FITC- ja Cy3-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineet olivat yhtiöltä Sigma (St. Louis, MO). Anti-IQGAP1 vasta-ainetta (vastaan ​​N-terminaalinen fragmentti, 314-422 aa), anti-RhoA-vasta-ainetta, anti-IgG-vasta-ainetta, anti-CDK1 /CDK2-vasta-aine, lyhyen häiritseviä RNA: ita (siRNA) ja RhoC ja negatiivinen kontrolli oli Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Rho C siRNA on poolin 3 kohdespesifisen 20-25 nt siRNA: t on suunniteltu kaataa geeniekspression sekvenssit seuraavasti: Sarja1, aistimaan 5′-CUACUGUCUUUGAGAACUAtt-3’and antisense 5′-UAGUUCUCAA- AGACAGUAGtt-3 ”; sequence2, sense 5′-GCAGGAAGACUAUGAUCGAtt-3 ’ja antisense 5′-UCGAUCAUAGUCUUCCUGCtt-3′; sequence3, sense 5’-CAC- ACCAGCACUUUAUACAtt-3 ’ja antisense 5′-UGUAUAAAGUGCUGGUGUG- tt-3’. Anti-IQGAP1 vasta-ainetta (vastaan ​​C-terminaalinen fragmentti, joka vastaa aminohappoja 863-1657 ihmisen IQGAP1) oli Millipore (Bedford, MA). Anti-RhoC vasta-aine oli peräisin Abcam (Cambridge, MA). Anti-sykliini B vasta-aine oli peräisin Bioworld Technology (St. Louis Park, MN). Anti-sykliini D1-aineelle että anti-sykliini E-vasta olivat Boster (Wuhan, Kiina). SiRNA varten IQGAP1 syntetisoitiin Qiagen (Valencia, CA), kohdesekvenssi oli IQGAP1 5′-AAGTTCTACGGGAAGTAATTG-3 ’(5058-5078 bp). (HRP) konjugoitua sekundääristä vasta-ainetta oli Rockland Immunochemicals (Gilbertsville, PA). Protein G Plus /Protein A-agaroosi oli peräisin Calbiochem (San Diego, CA). Elektrokemiluminesenssin (ECL) reagenssit olivat Milliporesta (Billerica, MA). Kaikkien käytettävien reagenssien tässä tutkimuksessa olivat analyyttistä laatua.

(A) Western blot-analyysi IQGAP1 ilmaisun mahasyövän solussa BGC-823 linjat tartunnan Ad-LacZ, Ad-IQGAP1-C, Ad-IQGAP1- N tai Ad-IQGAP1. (B) In MTT-määritystä, IQGAP1-C ja IQGAP1 yli ilmentyminen solujen molemmat ovat enemmän leviämisen aktiivisuus kuin kontrolliryhmässä (* P 0,05, verrattuna Ad-LacZ ryhmä). (C) proteiini ilmentymisen taso IQGAP1 mahasyövän solulinjassa BGC-823 transfektoitu IQGAP1 siRNA. (D) lisääntyminen BGC-823-solut transfektoitu IQGAP1 siRNA tutkittiin MTT: llä. (* P 0,05, verrattuna ohjaus siRNA ryhmä). (E) BGC-823-solut transfektoitiin lyhytaikaisesti plasmideilla Flag-IQGAP1, Flag-IQGAP1-C, tai Flag-IQGAP1-N 48 tuntia. Western blotting osoitti ilmentymistä IQGAP1, IQGAP1-N, ja IQGAP1-C konstrukteja BGC-823 solulinjoissa. Yhtä suuret määrät solulysaattia kustakin ryhmästä ladattu ja blotattiin anti-IQGAP1 vasta-aineita (vastaan ​​C-terminaalinen fragmentti tai N- terminaalinen fragmentti). (F) BrdU määritystä käytettiin analyysiin solujen lisääntymisen. Edustavat kuvat BGC-823 solut, jotka ilmentävät ilmoitettu IQGAP1 konstruktit värjättiin vasta-aineita BrdU (toinen paneelit punainen) ja Hoechst 33342 varten ytimet (ensimmäinen paneeli, sininen). Prosenttiosuus solujen BrdU-inkorporaatio laskettiin. Keskiarvo ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta on esitetty (* P 0,05).

Cell Culture, transfektio ja Infection

BGC-823 ja COS-7-soluja viljeltiin 1 x Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine (DMEM), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) 37 ° C: ssa, 5% CO

2-ilmakehässä. Elatusaine vaihdettiin joka toinen päivä ja solut olivat osa-viljeltiin konfluenssiin. Transfektioon, solut olivat osa-viljeltiin päivää ennen prosessia ja transfektio mahalaukun syövän solujen plasmidit tai siRNA: lla suoritettiin valmistajan ohjeiden. Infektion, 293A-solut transfektoitiin adenovirusvektoreiden pAd-LacZ, pAd-RhoC-V14, pAd-IQGAP1 ja pAd-IQGAP1-C, ja tuottamat viruspartikkelit solut otettiin talteen ja monistettiin. Virukset nimettiin Ad-LacZ, Ad-RhoC-14, Ad-IQGAP1 ja Ad-IQGAP1-C vastaavasti, ja niitä käytettiin infektoimaan BGC-823 soluja. Päivänä ennen infektiota, BGC-823-soluja tuoreeltaan ympättiin 70-80% konfluenssiin ja tartunnan menetelmä suoritettiin valmistajan ohjeita toinen päivä.

(A) proteiini ekspressiotasot IQGAP1 , IQGAP1-C ja RhoC in BGC-823 soluja. BGC-823-soluja transfektoitiin ohimenevästi IQGAP1 siRNA tai RhoC siRNA: ssa 24 tuntia. Transfektoidut solut myöhemmin infektoitiin Ad-RhoC-V14, Ad-IQGAP1-C tai Ad-IQGAP1 lisää 48 tuntia, minkä jälkeen Western blottauksella. (B) RhoC väheneminen ei merkittävästi vaikuta IQGAP1 tai IQGAP1-C indusoi BGC-823-soluja. (C) Äänenvaimennusjärjestelmä on IQGAP1 siRNA selvästi esti RhoC aiheuttaman soluproliferaation BGC-823 soluja. (MTT-määritys, * P 0,05; ** P 0,01). Tiedot ovat keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta kukin suoritettiin kahtena kappaleena.

Western-blottaus

Viljellyt solut pestiin kolme kertaa PBS: ssä ja lyysattiin RIPA-puskurilla (50 mM Tris HCl: lla, pH 7,4, 1% (v /v) Triton X-100, 1 mM EDTA, 1 mM leupeptiini, 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, 10 mM NaF, 1 mM Na-

3Vo

4). Yhtä suuret määrät proteiinia, erotettiin 8% tai 12% SDS-PAGE mukaisen proteiinin molekyylipaino. Primaaristen vasta-aineiden inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa, ja vastaavat sekundääriset vasta-aineet, inkuboitiin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Kolme pesua suoritettiin TBS /T jokaisen vasta-inkubaation. ECL reagensseja käytettiin osoittamaan positiivista bändejä kalvolle.

(A) BGC-823-solut infektoitiin Ad-IQGAP1, Ad-IQGAP1-C tai Ad-RhoC-V14 48 tuntia, ja Western blot käytettiin analysoimaan ilmaisuja sykliini E, sykliini D1 sykliini B ja CDK. (B) BGC-823-solut transfektoitiin IQGAP1 siRNA tai RhoC siRNA 72 tuntia, ja ilmauksia sykliini E, sykliini D1, sykliini B ja CDK analysoitiin Western-blottauksella. (C) proteiini ilmauksia sykliini E, sykliini D1, sykliini B ja CDK in BGC-823-soluja, jotka transfektoitiin väliaikaisesti IQGAP1 siRNA tai RhoC siRNA 24 h ja sen jälkeen tartunnan Ad-RhoC-V14, Ad-IQGAP1-C tai Ad-IQGAP1 ylimääräisiä 48 tuntia (tulokset Western blotting).

MTT-määritys

0,5-1 x 10

3cells 150 ui väliainetta levytettiin vuonna kuoppa 96-kuoppaisilla levyillä. Kiinnittymisen jälkeen, solut infektoitiin vastaavat adenovirus 48 tuntia, tai transfektoitu siRNA 72 tuntia, vastaavasti. Yhdistelmässä ryhmät, solut transfektoitiin siRNA kohdistamista RhoC tai IQGAP1 24 tuntia ja infektoitiin sitten Ad-IQGAP1-C /Ad-IQGAP1 tai Ad-RhoC-V14 vielä 48 tuntia 37 ° C: ssa, 5% CO

2. Viljellyt solut pestiin PBS: llä, käsiteltiin 20 pl MTT: tä (0,5 mg /ml), ja sitten inkuboitiin 37 ° C: ssa 1 h. Väliaine poistettiin ja 100 ui dimetyylisulfoksidia (DMSO), lisättiin kuhunkin kuoppaan. Absorbanssi määritettiin 490 nm: ssä käyttäen mikrolevylukijaa. Kaikki määritykset suoritettiin kolmena kappaleena.

(A) BGC-823-solut kasvavat 100 mm levyt lyhytaikaisesti koinfektoidun Ad-IQGAP1 ja Ad-RhoC-V14, tai Ad-IQGAP1-C ja Ad RhoC-V14: ssa 48 tuntia. Solut hajotettiin ja yhtä suuret määrät lysaattia proteiinia immunosaostettiin (IP) anti-RhoC, anti-IQGAP1 vasta-aineiden tai isotyypin IgG. Kokosolulysaatti käytettiin proteiinin lisäämisen valvonta. (B) BGC-823-solut transfektoitiin edellä adenovirus 24-48 h, ja kolokalisaation RhoC ja IQGAP1 soluissa määritettiin Immunofluoresenssimikroskopia käyttäen anti-RhoC ja anti-IQGAP1 vasta-aineita. Tumat värjättiin Hoechst 33342 (sininen). (C) COS-7-solut ohimenevästi infektoitu samanaikaisesti Ad-IQGAP1-C /Ad-IQGAP1 ja Ad-RhoC-V14: ssa 48 tuntia. Solut käynnissä sama Co-IP kuvatun. (D) COS-7-solut transfektoitiin edellä adenovirusvektorien 24-48 h, ja kolokalisaation RhoC ja IQGAP1 soluissa osoitettiin Immunofluoresenssi. Tiedot edustavat kolmesta itsenäisestä kokeesta samanlaisin tuloksin.

BrdU

DNA synteshastighet mitattiin BrdU immunofluoresenssillä. Kylvö solujen määrä säädettiin saavuttamiseksi tiheys 70-80% konfluenssiin päivänä transfektion. Plasmidi pFlag-IQGAP1, pFlag-IQGAP1-C tai pFlag-IQGAP1-N on kotransfektoitiin GFP-plasmidi, BGC-823-soluihin käyttämällä Lipofec- tamin’ia ™ 2000 kuten edellä on kuvattu. 24 h transfektion jälkeen, solut pidettiin seerumin puutteessa yön yli, käsiteltiin 200

μ

M BrdU ja inkuboidaan noin 16 tuntia. Sitten solut pestiin PBS: llä, kiinnitettiin juuri valmistettu 4% (v /v) paraformaldehydillä huoneenlämpötilassa 10 min, ja läpäiseviksi 0,5% (v /v) Triton X-100, jonka jälkeen inkuboitiin DNaasi I (0,5 U /ul) 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Soluja inkuboitiin primäärisen vasta-aineen vastaan ​​BrdU yön yli 4 ° C, minkä jälkeen Cy3-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen kanssa 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Lopuksi ytimet olivat vasta Hoechstilla 33342 15 minuuttia, huuhdeltiin PBS: lla kolme kertaa ja visualisoitiin fluoresenssimikroskopialla. Kukin määritys suoritettiin quadruplet ja toistettiin kolme kertaa.

Kun RhoC stimuloi solun ulkopuolisen tai intracelluar signaaleja, se sitoutuu tukirakenteen proteiinin IQGAP1, vaikuttaa ilmentyminen solusyklin liittyviä proteiineja, kuten sykliini D1 ja sykliini B, vaikuttaa G1-S siirtymät solusyklin, ja sitten aiheuttaa muutoksen solujen lisääntymisen. Signaalitransduktiomekanismia tapahtuma, jonka kautta IQGAP1 vaikuttaa ilmaus sykliini vielä selvittämättä.

Co-immunosaostus

Tutkitaan vuorovaikutusta RhoC ja IQGAP1, COS-7 ja BGC -823 solut infektoitu samanaikaisesti Ad-IQGAP1 tai Ad-IQGAP1-C, ja Ad-RhoC-V14: ssa 48 tuntia ja sitten lyysattiin RIPA-puskurilla, kuten on kuvattu. Vasta-aine RhoC, IQGAP1 tai isotyyppiä IgG käytettiin immunosaostukseen, vastaavasti. Immunosaostumat analysoitiin Western blottauksella, kuten edellä, käyttäen anti-RhoC tai anti-IQGAP1-vasta-aine.

Immunofluoresenssimikroskopia

soluja kasvatettiin Pääliliuskat kiinnitetty juuri valmistettu 4% (v /v ) paraformaldehydillä PBS: ssä 15 min, läpäiseviksi 0,3% Triton X-100 PBS: ssa 10 min, ja blokattiin 3% (w /v) naudan seerumialbumiinia (BSA) PBS: ssä. Varten Immunofluoresenssi, soluista Pääliliuskat peräkkäin inkuboitiin kanin polyklonaalisen vasta-aineen vasten IQGAP1 4 ° C: ssa yön yli, FITC-konjugoitua vuohen anti-kani-IgG: tä 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, hiiren monoklonaalinen vasta-aine RhoC 2 tuntia huoneenlämpötilassa, ja lopuksi vuohen anti-hiiri-IgG, joka oli konjugoitu Cy3 1 h RT: ssä. Kolmen pesun tehtiin jokaisen vasta-aineen inkubaation jälkeen. Tumat vasta Hoechstilla 33342. Tuloksena havaittiin fluoresenssimikroskoopilla kootaan CCD-kameralla (Leica).

Tilastollinen analyysi

Aineisto analysoitiin kahden tailed ANOVA tai Opiskelijan

t

-testi SPSS-tilasto-ohjelmalla, ja ilmaistaan ​​keskiarvoina ± keskihajonta (SD).

P

0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

RhoC edistänyt leviämisen BGC-823 solut

Vaikutus RhoC soluproliferaatioon oli myös tutkittu. BGC-823-solut infektoitiin adenoviruksella, joka koodaa konstitutiivisesti aktiivinen RhoC ja solujen lisääntyminen havaittiin MTT-määrityksellä. Tulokset osoittivat, että RhoC myös edistänyt leviämisen mahasyövän solujen BGC-823. Yli-ilmentyminen RhoC-V14 BGC-823-solujen aiheuttama 48,7%: n nousu solujen lisääntymisen (Fig. 1A ja B). Samaan aikaan ehtyminen RhoC siRNA vähentänyt leviämisen BGC-823 solun 43,1% (Fig. 1 C ja D).

IQGAP1 Tehostettu leviämisen estämiseksi BGC-823 solut

(1) tulokset MTT-analyysi.

arvioimiseksi osuus IQGAP1 joukkotuhoaseiden leviämisen, MTT-määritystä käytettiin havaitsemaan elinkelpoisuuden mahasyövän solulinjan BGC-823. Tulokset osoittivat, että verrattuna kontrollisolujen (Ad-LacZ ryhmä), korkea ekspressio C-terminaalinen fragmentti IQGAP1 (Ad-IQGAP1-C-ryhmä) tai täyspitkää IQGAP1 (Ad-IQGAP1 ryhmä) solujen lisääntymisen tehostuneen 116% ja 39%, vastaavasti (

*

P 0,05,

*

P 0,05, Fig. 2A ja B). Sitä vastoin N-terminaalinen fragmentti IQGAP1 ei ole mitään selvää vaikutusta solujen lisääntymistä. Toisaalta, häiriötä IQGAP1 ilmaisun kanssa siRNA vähensi solujen lisääntymistä 43%, verrattuna negatiiviseen kontrolliin (

*

P 0,05, Fig. 2C ja D). Nämä tulokset osoittivat, että IQGAP1 pystyi nopeuttaa solujen lisääntymistä; aktiivinen domeeni sijaitsi C-terminaalinen fragmentti proteiinin.

(2) Tulokset BrdU.

BrdU tuotti kuvio vasteen samanlainen kuin havaittiin MTT-analyysi. Expression of Flag-IQGAP1 ja Flag-IQGAP1-C merkittävästi edistänyt DNA-synteesin tasolle lähes 1-Flod ja 2-kertainen kuin mitä havaittiin Flag-D1 (* P 0,05, * P 0,05, Fig. 2E ja F) , kun taas IQGAP1-N eivät osoittaneet vaikutuksia DNA-synteesin, mikä viittaa siihen, että IQGAP1 eri säätelee DNA-synteesin kautta eri aloilla.

Association välillä RhoC ja IQGAP1 in stimuloimaan BGC-823 solut

(1) RhoC ja IQGAP1 ei vaikuttanut ilmaisua toisiinsa.

edellä olevat tulokset viittaavat vahvasti siihen, että sekä RhoC ja IQGAP1 osaltaan leviämisen BGC-823-soluja. Selventämiseksi mahdollista yhteyttä välillä RhoC ja IQGAP1 säätelyssä solujen proliferaatiota, me ensin selvitettävä, jos IQGAP1 ja RhoC vaikuttaa niiden ilmentymistä toisiinsa. BGC-823-solut transfektoitiin siRNA on pudotus ilmentymisen RhoC tai IQGAP1, ja sitten infektoitiin adenoviruksella, joka koodaa IQGAP1, IQGAP1-C tai konstitutiivisesti aktiivinen RhoC vastaavasti. Western blotting levitettiin havaita, onko muuttamalla ilmentymistä ja toimintaa yhden proteiinin voivat vaikuttaa ilmentymisen toisen proteiinin tai ei. Tulokset osoittivat, että lisäämällä eksogeeninen tai pudotus endogeenisen IQGAP1 tai IQGAP1-C, ei vaikuta RhoC ilmaisua. Vastaavasti lisäämällä konstitutiivisesti aktiivinen RhoC tai häiriöitä endogeenisen RhoC ei vaikuttanut ekspressioon IQGAP1 tai IQGAP1-C (Fig. 3A).

(2) IQGAP1 oli efektori RhoC stimuloinnissa solujen lisääntymisen.

MTT-määritystä käytettiin selvittämään suhde RhoC ja IQGAP1 in stimuloimaan. Tulokset osoittivat, että RhoC-siRNA ei ollut ilmeistä vaikutusta proliferaatioon aiheuttama IQGAP1 (** P 0,01, Fig. 3B). Kuitenkin ehtyminen IQGAP1 ilmentymisen siRNA estetty leviäminen aiheuttama ilmaus konstitutiivisesti aktiivisen RhoC (* P 0,05, ** P 0,01, Fig. 3C). Tämä osoitti, että prosessin aikana stimuloimaan BGC-823-solut, RhoC vaaditaan osallistumista IQGAP1. Lisäksi koska RhoC vaikutuksesta tarvitaan IQGAP1 kun IQGAP1: n vaikutus ei edellytä RhoC, RhoC voi olla ylävirtaan IQGAP1 ja lähti IQGAP1 efektorina.

vaikutus RhoC ja IQGAP1 on Expression of Cell Cycle liittyvät proteiinit

varmistamiseksi edelleen leviämisen stimuloiva vaikutus RhoC ja IQGAP1 ja tutkia mahdollinen mekanismi, jonka avulla nämä proteiinit säätelevät solujen proliferaatiota, käytimme Western blottauksella ekspression havaitsemiseksi solun syklin liittyvien proteiinien soluissa, joita käsiteltiin menetelmiä lisäämällä tai vähentämällä RhoC ja IQGAP1. Tulokset osoittivat, että kasvu RhoC ja IQGAP1 stimuloi ilmentymistä sykliini E ja sykliini D1, mutta sillä ei ollut vaikutusta ilmentymisen sykliini B ja CDK1 /2. Toisaalta, lasku RhoC ja IQGAP1 inhiboi ilmentymistä sykliini E ja sykliini D1. Samaan aikaan, kun on kyse RhoC hiljentämiseltä siRNA, lisäämällä IQGAP1 tai IQGAP1-C edelleen parantaa ilmentymistä sykliini E ja sykliini D1 (Fig. 4). Opinnäytetyöt Tulokset osoittivat, että RhoC ja IQGAP1 voisi säädellä leviämisen kautta muuttamalla ilmaus solusyklin related protein ja aiheuttaa enemmän soluja syöttää S-vaiheeseen.

RhoC ja IQGAP1 Co-lokalisoitu ja Bound toisiaan Cells

Immunofluoresenssi- ja Co-immunosaostus menetelmää sovellettiin tutkia edelleen mahdollisia sitovia välillä RhoC ja IQGAP1. Sekä BGC-823 ja COS-7-solut infektoitu samanaikaisesti Ad-IQGAP1 ja Ad-RhoC-V14 tai Ad-IQGAP1-C ja Ad-RhoC-V14 48 tuntia, ja kokosolulysaattia immunosaostettiin anti-RhoC vasta-aine, ja tutkittiin vasta-ainetta IQGAP1 tai immunosaostettiin anti-IQGAP1-vasta-aineen ja tutkittiin vasta-ainetta RhoC, vastaavasti. Tulokset osoittivat RhoC ja IQGAP1 sidottu toisiinsa, ja C-terminaalinen fragmentti IQGAP1 kuin sitoutumispaikan RhoC (Fig. 5A ja C). Lisäksi immunofluoresenssimäärityksellä paljasti, että IQGAP1 jaettiin pääasiassa solulimassa, jossa se yhteistyössä paikallistaa RhoC (Fig. 5B ja D).

Keskustelu

Hallitsematon syöpäsolun leviämisen edellyttää koordinoitua ja säädeltyä toiminto monien proteiinien [23], [24], [25], [26]. Sen vuoksi on tärkeää tutkia mekanismi, miten näiden proteiinien vuorovaikutusta säätelyssä syövän solujen proliferaatiota. Aikaisemmat tulokset ovat dokumentoineet, että ilmaus IQGAP1 ja RhoC korotettiin mahasyövän kudoksissa ja syövän solulinjoissa [21]. Tasosta ilmaisuja oli merkittävä korrelaatio huono erilaistumista mahasyövän. Kuitenkin, se ei ole täysin selvää, onko IQGAP1 ja RhoC liittyy proliferaatiota in tumorigenensis. Tässä tutkimuksessa ilmentymistason IQGAP1 ja RhoC sekä niiden biologista toimintaa mahasyövässä solulinjassa BGC-823 sopeutettiin infektion adenoviruksen konstruktioita tai transfektio plasmidi-DNA tai siRNA. Leviämisen solun jälkeen tutkittiin käyttämällä BrdU ja MTT-menetelmällä. Tulokset osoittivat, että konstitutiivisesti aktiivinen RhoC merkittävästi edistänyt proliferaatioaktiivisuuden mahasyövän solulinjan BGC-823, ja ehtyminen RhoC siRNA esti piirteitä. Tutkimustiedot ovat osoittaneet, että RhoC oli tärkeä rooli solujen vaeltamiseen ja etäpesäkkeiden [27], [28], [29], [30], [31], mutta oli joitakin ristiriitaisuuksia siitä RhoC säädellä muutosprosessi ja leviämisen kasvainsoluissa [27], [29], [32]. Tuloksemme osoittamaan, että RhoC ei ole lisääntymistä stimuloi mahalaukun syöpäsoluja. Tämä on hyödyllistä selvittämisessä rooli RhoC säätelyssä syöpäsolujen lisääntymistä.

Tuloksemme osoittivat, että samanlainen RhoC, yli-ilmentyminen eksogeenisen IQGAP1 ja IQGAP1-C myös edistänyt leviämisen BGC-823-solut, ottaa huomioon, että pudotus endogeenisen IQGAP1 vaimenee leviämisen kyky solun, joka osoittaa, että IQGAP1 myös edistää soluproliferaatiota asetuksen. Ottaen huomioon, että molemmat RhoC ja IQGAP1 ovat säätelijänä syöpäsolujen lisääntymistä ja niiden ilmaisuja korreloivat voimakkaasti, olemme edelleen tutkitaan toiminnallisen yhdistyksen välillä RhoC ja IQGAP1. Tulokset osoittivat, että BGC-823-solujen knock-down of IQGAP1 ilmaisun, infektio adenovirus, joka koodaa konstitutiivisesti aktiivinen RhoC ei stimuloida aktiivisuutta enää; kun taas BGC-823-solujen knock-down of RhoC ilmaisun, yli-ilmentyminen IQGAP1 tai IQGAP1-C kautta infektoimalla solut adenovirus koodaavat vastaavia DNA aiheuttivat vielä korkeampi proliferaatioaktiivisuuden. Tämä osoitti, että RhoC ajoi kasvaimen leviämisen kautta IQGAP1, erityisesti kautta C-terminaalinen fragmentti IQGAP1. Tämä toiminnallinen assosiaatio RhoC ja IQGAP1 tuki lisäksi samanaikainen immunosaostus ja Immunofluoresenssi. Nämä tulokset viittaavat siihen, RhoC otti IQGAP1 efektorina säätelyssä syöpäsolujen lisääntymistä, heittää uusi vihje suhteesta näiden proteiinien.

ensisijaisesti tutkia loppupään mekanismi, jonka avulla RhoC /IQGAP1 säätelevät leviämisen mahalaukun syöpäsolujen olemme tutkineet vaikutusta RhoC /IQGAP1 ilmenemistä solusyklin liittyviä proteiineja, mukaan lukien sykliini E, sykliini D1, sykliini B: n ja sykliiniriippuvaisen kinaasi (CDK). Tulokset osoittivat, että sekä RhoC ja IQGAP1 stimuloi ilmentymistä sykliini E ja sykliini D1, mutta sillä ei ollut vaikutusta ilmentymiseen sykliini B ja CDK. Leviämisen eukaryoottisolut ohjataan tiettyihin kohtiin solusyklissä, erityisesti ensimmäinen väli vaiheen (G1) DNA-synteettinen vaihe (S) ja toinen väli vaiheen (G2) ja mitoosin (M) siirtymiä. Joista, G1-S siirtymät on merkittävä asetuksen pisteen solusyklin. Sykliini D1 ja sykliini E ohjata solun etenemisen edistämällä G1-S-vaiheen solusyklin. Tuloksemme ehdotti, että kun RhoC aktivoitiin solunulkoisia tai solunsisäisiä signaalia, se sitoutuu IQGAP1 ja sitten vaikutti ilmaus solusyklin liittyviä proteiineja suoraan tai välillisesti jonkin epäselvä signaalitransduktion vaiheita, mikä saattaa johtaa muutokseen solun etenemisen ja leviämisen (Fig. 6).

Yhteenvetona nämä tiedot nykyisessä tutkimuksessa, yhdessä aiemmin julkaistu tietoja [21], tukevat olettamusta, että RhoC osallistuu sekä muuttoliike ja leviämisen mahalaukun syöpäsoluja. IQGAP1 osallistuu myös säätelyyn syöpäsolujen lisääntymistä kuin alavirtavaikuttajainhibiittorit RhoC. Nämä tiedot voivat loistaa valoa kehittämiseen terapeuttisia lähestymistapoja mahasyövän.

Kiitokset

Kiitämme Dr Gerry Boss ja tohtori Renate Pilz University of California, San Diego, CA, USA: ssa sellaista lahjoja adenoviruksen konstruktioita.